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Cancer Research

Deteção de alta sensibilidade de Micrometastases gerado pelo Organoids GFP de Lentivirus-transfectadas cultivadas de um Tumor de cólon derivado de paciente

doi: 10.3791/57374 Published: June 14, 2018

Summary

Para permitir a detecção altamente sensível do câncer colorretal humano divulgação células (CRC) colonizar os tecidos, mostramos aqui um protocolo para transdução eficiente de particulas de Lentivirus de proteína verde fluorescente (GFP) em células de organoides CRC PDX-derivado antes da sua injeção em ratos destinatários, com a observação microscópica de estéreo-fluorescência.

Abstract

Apesar dos avanços atuais no tratamento do câncer colorretal humano (CRC), poucas terapias radicais são eficazes para as fases finais da CRC. Para superar este desafio clínico, modelos de rato de enxerto heterólogo tumor usando linhas de células de carcinoma humano há muito estabelecidos e muitas mouse transgênicos foram desenvolvidos modelos com tumores como modelos pré-clínicos. Eles imitam parcialmente as características de carcinomas humanos, mas muitas vezes não conseguem recapitular os principais aspectos da malignidade humana, incluindo a invasão e metástase. Assim, modelos alternativos que melhor representam a progressão maligna no CRC humana há muito aguardados.

Aqui mostramos geração de xenografts tumor derivado de paciente (PDXs) implantação subcutânea de pequenos fragmentos CRC cirurgicamente dissecado de um paciente. O cólon PDXs desenvolver e histopatologicamente assemelham-se a CRC no paciente. No entanto, alguns micrometastases espontâneas são detectáveis em secções transversais convencionais de afetados órgãos distantes no modelo PDX. Para facilitar a detecção de disseminação metastática para órgãos distantes, nós extraídas as células do tumor organoides os cólon PDXs na cultura e eles infectados com lentivirus GFP antes da injeção no altamente imunodeficientes Shi-NOD/scid IL2Rγnulo Ratos (NOG). Orthotopically injetado PDX-derivado CRC organoides células consistentemente positivo de tumores primários de forma de GFP em ratos do destinatários. Além disso, a desenvolver espontaneamente micrometastatic colônias expressando GFP notavelmente são detectadas nos pulmões destes ratos por microscopia de fluorescência. Além disso, intrasplenic injeção de CRC organoids frequentemente produz colonização hepática. Tomados em conjunto, estas descobertas indicam GFP-rotulados células de organoides CRC PDX-derivado para ser visualmente detectável durante um processo de várias etapas denominadas cascata de invasão-metástase. Os protocolos descritos incluem o estabelecimento de PDXs de CRC humana e cultura 3D das correspondentes CRC organoides células transfectadas por particulas de Lentivirus de GFP.

Introduction

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Câncer colorretal (CRC) é a segunda causa principal de mortes de câncer em todo o mundo1. A resposta insuficiente a terapias convencionais de pacientes com estágio avançado da doença indica a ineficácia das tentativas de curar radicalmente CRCs. Para desenvolver abordagens terapêuticas mais eficazes, se estabeleceram vários modelos pré-clínicos rato de câncer que imitam as características dos CRCs. Várias linhas de célula CRC foram amplamente utilizadas para gerar xenografts tumor devido a sua comodidade e facilidade de manipulação. Cultura a longo prazo de linhas de células de câncer, no entanto, muitas vezes provoca a seleção de populações de células únicas que são bastante proliferativa sob uma condição de determinada cultura, assim, resultando em resultados não-confiáveis e limitações cruciais em drogas pré-clínicos desenvolvimento.

Sem ser cultivadas em vitro, xenografts tumor derivado de paciente (PDXs) também foram gerados pela implantação em modelos animais de tecidos humanos do CRC cirurgicamente dissecados de pacientes2,3,4. PDXs são amplamente reconhecidos como sintetizando as principais características histopatológicas e alterações genéticas originalmente presente em tumores de pacientes de que elas derivam. Além disso, organoids derivado de paciente tumor composto de células de tumor aglomerados foram estabelecidos pela cultura sob condições 3D que imitam pròxima as propriedades biológicas dos tumores original5,6. Estes organoids do tumor também foram aplicadas para triagem de drogas de alta produtividade, permitindo assim terapias personalizadas para ser projetado5. No entanto, marcadamente heterogêneas populações CRC são assumidas como para estar presente dentro de um tumor em massa. Populações particulares CRC seletivamente podem proliferar e expandir durante a série in vivo e in vitro de passagens de PDX e tumor organoids, respectivamente. Isso pode também permitir que os perfis de expressão de gene global e epi/genética status dos CRCs afetados para mudar, assim resultando em mínima semelhança com a CRC parental.

Paciente-derivado organoids CRC e aqueles extraídos do cólon humano não cancerosos, projetado para o porto de combinações de mutações oncogênicas também têm sido empregadas para investigar as principais características das células de tumor humano exemplificadas pela invasão do tumor e metástases 6,7,8,9. No entanto, a incidência muito baixa de metástases espontâneas decorrentes da implantação ortotópico de paciente-derivado CRC em camundongos imunodeficientes, tornou difícil estudar o processo de várias etapas da cascata invasão-metástase que inclui locais invasão, intravasation, transporte na corrente sanguínea, extravasamento e colonização de órgãos distantes4,10. Micrometastasis como representado pela deposição de células de tumor de ≤ 2 mm, formado por paciente-derivado CRC organoids, tem sido negligenciado frequentemente na análise histopatológica de seções de órgãos distantes afetados em modelos experimentais de rato. Visualização das micrometastases espontânea também foi mínimo na vivo devido à dificuldade de introduzir eficientemente marcadores fluorescentes em células tumorais de organoides antes da sua injeção no destinatários ratos. Neste estudo, nós desenvolvemos um protocolo eficiente transduce lentivirus GFP em células de organoides PDX-derivado CRC na cultura 3D antes da injeção em ratos destinatários e para permitir a detecção altamente sensível, empregando microscopia de fluorescência-estéreo, de sua colonização de órgãos diferentes para a forma micrometastases.

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Protocol

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O paciente fornecidos escrito consentimento informado e o projeto foi aprovado pelo Comitê de ética de pesquisa da faculdade de Medicina Universidade de Juntendo. Os experimentos de rato também foram aprovados pelo Comitê de ética em pesquisa Animal da faculdade de medicina Juntendo.

1. estabelecimento de CRC PDXs em camundongos imunodeficientes

Procedimentos experimentais para estabelecer PDXs CRC (etapa 1) estão descritos na figura 1A.

  1. Prepare o tecido primário de CRC imediatamente após a ressecção cirúrgica do tumor do paciente.
  2. Lave o tecido primário de CRC por agitação suave várias vezes em 30 mL de fosfato estéril gelada tampão salino (PBS) em um tubo cónico de 50 mL e mantê-lo no gelo.
  3. Coloque o tecido sobre um prato de Petri de 10 cm usando uma pinça estéril, remover as áreas de necrose tão extensivamente quanto possível, usando uma tesoura esterilizada e cortar os tecidos de tumores sólidos em pequenos pedaços (5 x 5 x 5 mm3 no tamanho) usando lâminas de barbear estéril.
    Nota: Áreas de necrose são frequentemente mais branca, mais macio e mais friável que as áreas circundantes.
  4. Coloque os pedaços pequenos de tumor usando uma pinça estéril em 2 mL de PBS estéril gelada sobre uma placa de 6.
  5. Raça de 6 ratos week-old Shi-NOD/scid IL2Rγ nulos (NOG) altamente imunodeficientes grátis condições patógeno específico e livregerm.
  6. Anestesiar os ratos com isoflurano inalação usando o dispositivo de anestesia por inalação de animais pequenos e desinfectar a pele com álcool 70%. Garantir a taxa normal e a profundidade da respiração e a ausência de um reflexo de pitada de dedo do pé para anesthetization adequada. Vet pomada sobre os olhos é uma opção, para evitar ressecamento ocular enquanto sob anestesia.
  7. Esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos usando a esterilização com calor seco e em seguida, usar essas ferramentas para todos os procedimentos para evitar infecções de ferida em ratos do destinatários.
  8. Coloque o mouse anestesiado em posição na bancada do laboratório. Faça uma pequena incisão na parte inferior dos flancos direito e esquerdos do mouse destinatário para gerar bolsos subcutâneos para um implante de tecido com uma tesoura esterilizada. Tome cuidado para não perfurar a membrana peritoneal. Deve haver pequeno sangramento com este procedimento.
  9. Delicadamente mergulhe acima preparado fragmentos de tumor em 50 µ l de artificial da matriz extracelular e implante-os então na parte inferior dos bolsos subcutâneos direito e esquerdos.
  10. Sutura da incisão com clipes de ferida em ratos submetidos a procedimentos cirúrgicos. Certifique-se de que os tecidos de tumor implantados estão localizados a alguma distância da incisão sob a pele.
    Nota: Em conformidade com a minimização de procedimentos cirúrgicos, não há tratamentos para a dor pós-operatória e infecção foram administrados neste estudo.
  11. Coloque o mouse sobre uma almofada quente e manter a posição reclinada esternal até suficiente consciência seja restaurada. Uma vez totalmente recuperado e sentar-se sobre as quatro patas, os ratos podem ser retornados para jaulas em casa. Para evitar a predação, não permitem criação com animais não operado na mesma jaula.
  12. Verificar se há vazamento de sutura e confirmar que os ratos estão em condição estável no dia seguinte, no grupo tratado cirurgicamente. Verifique os ratos para sinais de doença e medir o tamanho do tumor em cada rato, uma vez por semana, empregando pinças.

2. dissecação do CRC PDXs de ratos

Procedimentos experimentais para dissecação de CRC PDXs (etapa 2) estão descritos na figura 1B.

  1. Permitir que o tumor a crescer por via subcutânea para ~ 1 cm3 em tamanho, que normalmente leva cerca de 1 – 3 meses.
  2. Anestesiar o mouse com isoflurano inalação usando o dispositivo de anestesia por inalação de animais pequenos e desinfectar a pele com álcool 70%.
  3. Coloque o mouse em posição na bancada do laboratório. Faça uma incisão na pele, expor o tumor e Retire cuidadosamente a pele do tumor com uma tesoura esterilizada. Após a remoção do tumor, coloque-o sobre um prato de Petri de 10 cm e remover quaisquer regiões grosseiramente necróticas do tumor e, em seguida, lave duas vezes com 5 mL de PBS.
    Nota: Áreas de necrose são frequentemente mais branca, mais macio e mais friável que as áreas circundantes.
  4. Coloque o tumor no gelo e dividi-lo igualmente em pelo menos 4 peças para diferentes aplicações, incluindo 1) a cultura de organoides CRC, 2) transplantação em ratos secundários, exame 3) histológico e 4) congelamento e armazenamento dos fragmentos do tumor.
    1. Para geração de organoids o CRC, coloque o tecido do tumor sólido sobre um prato de petri de 6cm contendo 1 mL de PBS estéril. Mantenha o tecido no gelo até o processamento (etapa 3).
    2. Para estabelecer o modelo PDX para CRC humano, passagem a PDXs CRC fresco em um rato secundário. Corte o tecido do tumor em pedaços pequenos (5 x 5 x 5 mm3 no tamanho) usando lâminas de barbear estéril e delicadamente mergulhe estes fragmentos de tecido 50 µ l de artificial da matriz extracelular. Em seguida, implante esses fragmentos nas partes inferiores dos bolsos subcutâneos direito e esquerdos do mouse NOG, conforme descrito na etapa 1.8 – 1.11.
    3. Para análise histológica, consertar as amostras em 5 mL de formol tamponado neutro de 10% em um tubo cônico de 15 mL, à temperatura ambiente por 2 dias.
    4. Para criopreservação, cortar o tecido do tumor em pedaços pequenos (5 x 5 x 5 mm3 em tamanho) e mergulhar suavemente as amostras em 500 µ l de célula congelamento solução em tubos de cryovial de 1-1,5 mL. Em seguida, transferi o tubo para um freezer-80 ° C.

3. extração de PDXs para a suspensão de células para a cultura de organoides CRC

Procedimentos experimentais para dissociação de CRC PDXs (etapa 3) estão descritos na figura 1B.

  1. Lugar do tumor de preparado acima (passo 2.4.1) fragmentos em uma placa de Petri de 10 cm.
  2. Picar os fragmentos usando lâminas de barbear estéril e transferi-los para um tubo cônico de 15 mL, contendo 8 mL de soro fetal bezerro de 10% (FCS)-médio (DMEM modificado águia de Dulbecco) com 80 µ l de caldo de enzima colagenase (ver Tabela de materiais).
  3. Fechar o tubo firmemente e envolva a tampa com o parafilm para evitar fugas. Para dissociar os fragmentos de tumor picada para a suspensão de eritrócitos, agite-o suavemente, durante 2 h a 37 ° C. Note que ainda haverá muitos fragmentos de tecido não digerido restante no tubo.
  4. Centrifugar o tubo a 300 x g por 5 min a 4 ° C e remover o sobrenadante. Resolver o centrifugado com 10 mL de 10% FCS-DMEM tornar a suspensão de eritrócitos.
  5. Para eliminar os restos de tecido não digerida, filtre a suspensão celular duas vezes usando o filtro de célula de 40 µm conjunto em um tubo cónico de 50 mL. Em seguida, centrifugar o escoamento x g por 5 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante e manter a pelota no gelo.

4. geração do CRC Organoids cultivadas na matriz extracelular Artificial

Procedimentos experimentais para a cultura de organoides CRC de PDXs do cólon (etapa 4) estão descritos na figura 1B.

  1. Estabelecer um meio de cultura apropriado para o organoids PDX-derivado CRC (ver Tabela de materiais, "CRC organoides meio de cultura") empregando meios descritos anteriormente para humano cólon organoids11.
  2. Aplicar 150 µ l de artificial da matriz extracelular (ver Tabela de materiais) por bem sobre uma placa de 12 no gelo e então ele incube por 30-60 min em um 37 ° C, 5% CO2 incubadora para solidificar os géis.
  3. Suspenda o centrifugado da etapa 3.5 com meio de cultura de organoides CRC (da etapa 4.1) com 5% de FCS para conseguir o ajuste de 3 x 105 células/mL. Em seguida, as sementes 1 mL do meio na artificial extracelular matriz-revestido chapa preparada na etapa 4.2. e incubar durante uma noite a 37 ° C abaixo de 5% de CO2. Use um hemocytometer para contagem do número de células tumorais, incluindo células únicas e clusters multicelulares (um grupo de células aderentes) na suspensão de célula.
    Nota: FCS 5% é usado para saciar a atividade enzimática residual de colagenase neste estudo.
  4. Recolher cuidadosamente o meio de cultura, incluindo as células que têm retirado a artificial placa revestida de matriz extracelular em um 1,5 mL de flutuação centrifugar o tubo no dia seguinte e centrifugar-a 1.400 x g durante 5 min. Em seguida, remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 70 µ l de matriz extracelular artificial no gelo.
  5. Para aumentar a viabilidade celular CRC, sobrepor a tumor que contém a célula artificial da matriz extracelular para o tumor organoides células anexado à artificial placa revestido de matriz extracelular e incubam por 30 min em um 37 ° C, 5% CO2 incubadora para solidificar o revestimento artificial da matriz extracelular. Em seguida, incube-com 1 mL de meio de cultura CRC organoides celulares com FCS de 1% a 37 ° C abaixo dos 5% CO2.
  6. Altere o meio de cultura em dois dias. Como os CRC organoids encher o meio, pode tornar-se necessário alterar o meio diariamente.

5. geração e enriquecimento de particulas de Lentivirus de GFP

Procedimentos experimentais para geração e enriquecimento de particulas de Lentivirus de GFP (etapa 5) estão descritos na Figura 1.

  1. Cultura de células HEK293T com Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 médio contendo 10% FCS e preparar seis pratos de 10 cm (2 x 106 células por prato) para o seguinte procedimento do transfection.
  2. Para transfeccao por prato, preparar 500 µ l da mistura incluindo 20 µ l do reagente de transfeccao em DMEM com um vetor de PRRL-GFP (5 µ g)12 e dois plasmídeos de Lentivirus de embalagem, tais como pCMV-VSV-G (1 µ g) e pCMV-dR8.2 dvpr (5 µ g), em uma estéril 1,5 mL microtubo. Manter a mistura à temperatura ambiente por 20 min e depois cobri-la em todos os pratos de 10 cm e incube-os por 18 h.
  3. Remover o meio, adicionar 5 mL de meio fresco de FCS-RPMI 1640 de 10% para cada prato e deixar em repouso por 24 h.
  4. Coletar o meio condicionado de cada prato em um tubo de centrífuga de 50 mL e armazenar um total de 30 mL do meio da 4 ° C durante a noite. Adicionar 5 mL do fresco RPMI 1640 para cada prato e deixar em repouso por 24 h.
  5. Colete o meio condicionado de cada prato em um tubo de centrífuga de 50 mL e manter, no total, 30 mL do meio no gelo. Em seguida, descarte as células.
  6. Filtro 60 mL do meio (da etapa 5.4 – 5.5) através de um filtro de 0,45 µm para remover as células e dividir esta quantidade em doze tubos de centrífuga de polipropileno de 5 mL por ultracentrifugação.
  7. Para concentrar o vírus, centrifugue-los usando um rotor de balde oscilante (ver Tabela de materiais) a 85.327 x g durante 1,5 h a 4 ° C.
  8. Remova imediatamente o meio. Para resolver o sedimento concentrado vírus, coloque 250 µ l de F-12 de mistura do nutriente Ham (F12) / meio DMEM sem FCS em cada um dos doze tubos e mantê-lo em 4 ° C durante a noite. Note-se que o vírus da pelota é muitas vezes invisível.
  9. Pipete suavemente o meio para coletar 3 mL de concentrado 5 x GFP lentivirus estoque, no total, presumivelmente incluindo particulas de Lentivirus de GFP com 108 transducing unidades / mL (TU/mL). Em seguida, armazene os doze microtubos de 1,5 mL (incluindo 250 µ l por tubo) sob condições estéreis a-80 ° C por até um ano. Preparem-se muitas pequenas alíquotas da solução original para evitar vários ciclos de descongelamento de congelamento.

6. rotulagem das células de organoides CRC com GFP particulas de Lentivirus cultivadas na matriz extracelular Artificial

Procedimentos experimentais para rotulagem as células de organoides CRC com lentivirus GFP (etapa 6) estão descritos na Figura 1.

  1. Permitir que o CRC organoids preparado na etapa 4.6 a crescer sem interferência por 7-10 dias e colhê-las mecanicamente com uma espátula de célula estéril e depois transferi-los para um microtubo de 1,5 mL.
    Nota: O crescimento da CRC organoids na cultura depende da natureza dos tumores originais de pacientes. Evite o supercrescimento de organoids o CRC, mantendo-os na confluência de 60 – 70% antes da transferência a um rácio de divisão de 1:2 para um novo artificial extracelular matriz-12-bem placa revestida.
  2. Centrifugue o microtubo para 3 min a 1.400 x g, remover o meio de cultura e resolver o centrifugado em 500 µ l de PBS tocando suave.
  3. Centrifugue o microtubo para 3 min a 1.400 x g e eliminar PBS.
  4. Para dissociar o aderente organoids CRC, adicionar 500 µ l de uma solução de desprendimento de célula de proteolíticas e collagenolytic enzimas para a célula da pelota no tubo e misturá-lo tocando suave. Em seguida, deixe os tubos de se contentar em 10 min à temperatura ambiente.
  5. Pipetar muito suavemente a suspensão de células com um adicional 500 µ l de 1% FCS-DMEM várias vezes em um microtubo de 1,5 mL para aproximadamente dissociar as células. Geração de células únicas do CRC organoids pipetando dura reduz acentuadamente viabilidade celular. Assim, é essencial para deixar a massa de células visualmente detectável na suspensão de células pipetando suavemente em um microtubo de 1,5 mL.
  6. Centrifugar a suspensão de eritrócitos para 3 min a 1.400 x g e remover o sobrenadante.
  7. Resolver o centrifugado com uma mistura da 100 µ l de 5 x GFP estoque de lentivirus (> 108 TU/mL) e 400 µ l do meio de cultura de organoides CRC em um microtubo de 1,5 mL por suave tocando para ajustar a uma concentração de 5 x 105 dissociada de células tumorais por 500 µ l . Use um hemocytometer para contagem do número de células tumorais, incluindo células individuais e grupos de células na suspensão de célula, como descrito acima (passo 4.3).
  8. Prepare uma artificial extracelular matriz-revestido 12 placa, conforme descrito na etapa 4.2. Em seguida, coloque a 500 µ l de suspensão de células preparada na etapa de 6,7 na placa e deixá-lo por 18 h a 37 ° C abaixo dos 5% de CO2.
  9. Colete o médio com as células flutuantes retiradas da placa de revestido de matriz extracelular artificial em um tubo de centrifugação de 1,5 mL. -Centrifugar a 1.400 x g e então remover o sobrenadante e ressuspender o pellet em 70 µ l de matriz extracelular artificial no gelo.
  10. Para aumentar a viabilidade celular CRC, sobrepor a tumor que contém a célula artificial da matriz extracelular para o tumor organoids anexado à artificial extracelular matriz-12-bem placa revestida, conforme descrito na etapa 4.5. Em seguida, incubar a placa por 30 min em um 37 ° C, 5% CO2 incubadora para solidificar o revestimento artificial da matriz extracelular e então cultura com 1 mL de meio de cultura de organoides CRC com FCS de 1% a 37 ° C abaixo dos 5% de CO2.
  11. Observe as células de 3 dias após a infecção sob um microscópio de fluorescência para confirmar a quase 100% de positividade GFP devido ao uso de uma alta concentração de particulas de Lentivirus (ver Figura 2A).
  12. Cultura do CRC organoids por períodos de 7 a 10 dias para expandir o crescimento de células antes da injeção em ratos destinatários.

7. geração de metástases por GFP-etiquetado CRC Organoids em ratos do destinatários

Procedimentos experimentais para geração de metástases usando o GFP-rotulados CRC organoids (passo 7) estão descritos na Figura 1.

  1. Para dissociar o GFP-etiquetado CRC organoids para a suspensão de eritrócitos, colhê-las mecanicamente com uma espátula de célula estéril e transferi-los para um microtubo de 1,5 mL, conforme descrito acima (passo 6.1).
  2. Centrifugue o microtubo para 3 min a 1.400 x g, remover o meio de cultura e resolver o centrifugado em 500 µ l de PBS tocando suave.
  3. Centrifugue o microtubo para 3 min a 1.400 x g e eliminar PBS.
  4. Sobreposição de 500 µ l da solução de desprendimento de célula para o centrifugado no tubo e misture batendo suave. Então, deixe a mistura de pé durante 10 minutos à temperatura ambiente para dissociar enzimaticamente o aderente organoids CRC, conforme descrito acima (passo 6.4).
  5. Pipetar muito suavemente a suspensão de células com um adicional 500 µ l de 1% FCS-DMEM várias vezes em um microtubo de 1,5 mL para aproximadamente dissociar as células, como descrito acima (passo 6.5). Geração de células únicas do CRC organoids pipetando dura reduz acentuadamente viabilidade celular. Assim, embora a massa de células visualmente detectável na suspensão de células pipetando suavemente em um microtubo de 1,5 mL.
  6. Centrifugar a suspensão de eritrócitos para 3 min a 1.400 x g e remover o sobrenadante.
  7. Para estabelecer um modelo do rato de metástase espontânea de CRC PDXs:
    1. Prepare uma suspensão de células, incluindo células de 5 x 105 em 50 µ l de PBS com 50% da matriz extracelular artificial por rato. Manter a suspensão no gelo antes de usar. Use um hemocytometer para contar as células de câncer, como indicado no ponto 4.3.
    2. Anestesiar um mouse com isoflurano inalação usando o dispositivo de anestesia por inalação de animais pequenos e desinfectar a pele com álcool 70%, como indicado no ponto 1.6.
    3. Coloque o mouse NOG em posição supina na bancada do laboratório. Segure a mucosa retal com pinça estéril e delicadamente puxá-la do ânus. Então, imediatamente injetar a suspensão de células preparada na etapa 7.7.1 para a submucosa retal do mouse utilizando uma seringa (tamanho da agulha: 22 G). Rotineiramente, 4-6 ratos por grupo são usados para avaliar os resultados.
  8. Para estabelecer um modelo experimental de metástase de PDXs CRC:
    1. Prepare uma suspensão de células de organoides CRC incluindo 4 x 104 células em 50 µ l de PBS por rato. Manter a suspensão no gelo antes de usar. Use um hemocytometer para contar as células cancerosas (passo 4.3).
    2. Anestesiar um mouse com isoflurano inalação usando o dispositivo de anestesia por inalação de animais pequenos e desinfectar a pele com álcool 70%, como indicado no ponto 1.6.
    3. Coloque o mouse NOG anestesiado em posição na bancada do laboratório. Faça uma pequena incisão na parte inferior do flanco esquerdo e em seguida, corte o peritônio para expor cuidadosamente o baço usando uma pinça e tesoura esterilizada. Alcance do tecido adiposo anexado ao baço com pinça estéril, então lentamente injete 50 µ l de suspensão de célula (preparada como acima, passo 8.1) para o baço. Certifique-se de que a suspensão de eritrócitos é injectada adequadamente sem fugas para o exterior, do baço. Rotineiramente, 4 ratos por grupo são usados para avaliar os resultados.
  9. Coloque todos os ratos em uma almofada quente após a cirurgia e manter em uma posição reclinada esternal até que seja restaurada a consciência suficiente, conforme descrito na etapa 1.11. Uma vez que os ratos têm totalmente recuperado, devolvê-los para suas gaiolas em casa. Para evitar a predação, não permitem criação com animais não operado na mesma jaula.
  10. Verificar se há vazamento de sutura e confirmar que os ratos estão vivos, no grupo tratado cirurgicamente, no dia seguinte. Verifique os ratos para sinais de doença e medida tamanhos de tumor, empregando pinças, em todos os ratos de uma vez por semana.
  11. Observe os ratos para detectar metástases espontânea (por períodos de até 2,5 meses) e metástases experimentais (1 mês) após a injeção.
  12. Sacrifica os ratos através de anestesia e deslocamento cervical nos dias indicados. Disse tumores primários e vários tecidos, incluindo o fígado e pulmões. Coloque os tumores dissecados e órgãos em 5 mL de PBS gelado em um prato de Petri de 10 cm e armazená-los no gelo.
  13. Para detectar células de organoides CRC GFP-positivo, observe os tecidos dissecados sob um microscópio de fluorescência-estéreo. Adquirir imagens com uma câmera CCD e preparar usando software de processamento de imagem padrão.

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Representative Results

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Um adenocarcinoma colorretal primário diagnosticado como moderadamente diferenciado tinha sido ressecado cirurgicamente de um mulher de 76 anos com classificação TNM, estágio IIIa, seguida de quimioterapia pós-operatória. O principal CRC immunohistochemically de células coradas positivo para antígeno carcinoembryonic, Ki-67, pan-cytokeratin e E-caderina. Peças do tumor ressecado também por via subcutânea foram implantadas em ratos NOG para gerar o modelo PDX de cólon. Células de organoides CRC então foram extraídas para cultura de tecidos de PDX o cólon, que tinha desenvolvido por via subcutânea nestes ratos. Os CRC organoids eram capazes de consistentemente formando agrupamentos multicelulares durante uma série de passagens em artificial da matriz extracelular. Como organoids de tumor histologicamente e geneticamente refletem a natureza de tumores primários de pacientes5,6, procurou-se desenvolver um modelo de mouse que permitiria na vivo deteção de células de organoides CRC com alta sensibilidade durante a disseminação metastática. Para atingir este objetivo, o CRC organoids foram infectados com lentivirus GFP, resultando assim em quase todos os organoids mostrando muito brilhante GFP (Figura 2A). Estes organoids foram então injetado orthotopically e intrasplenically em ratos NOG secundários antes da deteção de células GFP-positivo em órgãos distantes sob um microscópio de fluorescência. Observamos a formação de tumores primários de GFP-positivo no site ortotópico em todos os quatro ratos examinados (Figura 2B, à esquerda). Além disso, metástases microscópicas foram encontrados nos pulmões de ratos de três dos quatro examinados em 2,5 meses depois ortotópico injeções (Figura 2B, médio). Além disso, observaram-se metástases hepáticas em resposta a injeção intrasplenic em todos os quatro ratos examinados em 1 mês após as injeções (Figura 2B, direita).

Tomados em conjunto, estas descobertas indicam que fluorescência de alta resolução de GFP em células de organoides CRC PDX-derivado permite a sua detecção em micrometastases espontânea e aqueles desenvolvidos experimentalmente, em órgãos distantes, quando introduzido no destinatário ratos. Esta detecção de alta sensibilidade da divulgação PDX-derivado CRC organoids na vivo também oferece um modelo versátil, não apenas para estudar a biologia das metástases de tumor, mas também para o desenvolvimento de terapias alvo no cenário pré-clínicos.

Figure 1
Figura 1: representação esquemática da geração de metástases pelo PDX-derivado CRC organoids rotulado com lentivirus GFP em camundongos NOG. (A) implantação de pequenos pedaços de tecido o CRC, por via subcutânea em ratos NOG (etapa 1). O tecido CRC cirurgicamente dissecado do paciente foi cortado em pedaços e implantado subcutaneamente em ratos NOG. s.c.: implantação subcutânea. (B) geração de CRC organoids dissociada PDXs (etapa 2 – 4). Os xenografts CRC desenvolvidos foram picado (passo 2) e transferido para um tubo de 15 mL contendo meio de cultura, incluindo a colagenase (etapa 3). Após a incubação com agitação lenta, a suspensão de eritrócitos CRC foi filtrada (etapa 3). Então, a suspensão de células de organoides no meio de organoides CRC foi semeado em uma placa de revestido de matriz extracelular artificial e incubado durante a noite numa incubadora de CO2 (passo 4). As células de organoides CRC anexadas à matriz extracelular artificial foram também revestidas com artificial adicional da matriz extracelular e incubadas numa incubadora de CO2 (passo 4). s.c.: implantação subcutânea. (C) geração de CRC organoids transfectadas por particulas de Lentivirus de GFP antes empregando injeção em ratos destinatários (passo 5 – 7). As Particulas de Lentivirus de GFP foram geradas em um título elevado (passo 5). Os PDX-derivado CRC organoids crescidos na matriz extracelular artificial foram diretamente colhidas com um raspador de célula e transferidos para um microtubo (etapa 6). Após a centrifugação, o centrifugado foi re-suspenso em PBS. A suspensão foi centrifugada e o centrifugado foi dissociado. Então, a suspensão de células de organoides CRC foi incubada com estoque de vírus GFP em meio de cultura de organoides CRC na artificial extracelular matriz-revestido placa durante a noite em uma incubadora de CO2 (etapa 6). As células de organoides CRC anexadas à matriz extracelular artificial foram revestidas com artificial adicional da matriz extracelular e incubadas numa incubadora de CO2 para solidificar o revestimento artificial da matriz extracelular (etapa 6). Os CRC organoids então foram cultivados por períodos de 7 a 10 dias para expandir o crescimento celular (etapa 6). Para desenvolver um modelo de metástase espontânea, dissociado 5 x 105 CRC organoides células marcadas com GFP suspendido em 50 µ l de PBS com 50% da matriz extracelular artificiais foram injetadas orthotopically ratos NOG (etapa 7). Para gerar um modelo experimental de metástase, 4 x 104 CRC organoides as células portadoras de GFP em 50 µ l de PBS foram injetadas intrasplenically ratos NOG (etapa 7). o.t.: injeção ortotópico, i.s.: injeção intrasplenic. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: visualização de alta resolução de GFP detectada no culto GFP-etiquetado CRC organoids, tumores primários e micrometastases. (A) quase 100% dos cultos organoids CRC são GFP positiva. As imagens foram captadas usando um microscópio de fluorescência-estéreo. Barra de escala = 250 µm. (B) GFP-positividade no tumor primário e micrometastases no pulmão e no fígado. A suspensão de eritrócitos de organoides dissociada do GFP-expressando CRC foi injetada a submucosa rectal (inj. o.t.) de ratos NOG. A maioria das células tumorais é mostrada para ser positivo para as boas práticas agrícolas no tumor primário. GFP-positivo micrometastases colonizar os pulmões (indicados por uma seta) também são mostrados. Além disso, GFP-positivo micrometastases são detectados no fígado (indicado por uma seta), quando a suspensão de células intrasplenically foi injectada (inj. i.s.) em ratos. Barra de escala = 500 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

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Embora o modelo CRC PDX tem sido amplamente utilizado para estudar o crescimento do tumor primário, se este modelo também é aplicável para investigar a metástase do tumor ainda não foi totalmente elucidado. Metástases espontâneas também foram mal detectáveis no fígado e pulmões de vários comunicados cólon PDX de modelos de4,10. Para detectar micrometastases com alta sensibilidade, desenvolvemos um protocolo para transducing particulas de Lentivirus de GFP em CRC PDX-derivado organoids antes da sua ortotópico e injeções intravenosas em camundongos destinatários. Digno de nota, fomos capazes de mostrar que esse método permite a detecção altamente sensível de CRC organoides-derivado micrometastases, formando ambos espontaneamente e experimentalmente, em órgãos distantes.

Passos críticos dentro do protocolo incluem manutenção formação esferoide intacto sem indução de anoikis sobre a matriz extracelular artificial pipetando suavemente o CRC organoids durante a série de passaging. A preparação de partículas de lentivirus foram concentrados por ultracentrifugação também é importante para alcançar a quase 100% GFP positividade de CRC organoids. Além disso, é recomendável que a GFP-etiquetado CRC organoids ser injetado dentro de 10 a 14 dias no destinatários ratos. Excessivamente longos períodos para expansão da organoids CRC após infecção podem favorecer a seleção de organoids de GFP-expressando fracamente.

A injeção de CRC organoids para a submucosa retal de ratos NOG mostrou sua disseminação metastática para os pulmões, embora não no fígado, presumivelmente através da veia cava inferior. Para gerar metástases hepáticas espontaneamente, injeção de CRC organoids no cólon com laparotomia seria necessário13.

Note-se que a incidência de linfomas de células B na ocasião é maior em camundongos imunodeficientes NOG, implantados com tecidos incluindo linfócitos, infectados com o vírus Epstein-Barr Oncovírus, de pacientes humanos14. Assim, é razoável recomendar que se os emergentes tumores originam o CRC implantado humana ser determinado através da realização de imuno-histoquímica utilizando marcadores de célula humanas da CRC, como antígeno carcinoembryonic e cytokeratin 20.

Como nós investigamos CRC organoids derivado de um único paciente, mais amostras de um maior número de pacientes precisa ser examinado para generalizar nossas descobertas no futuro. Se o implantado PDX-derivado CRC organoids mostrar crescimento mínimo no site ortotópico e raramente forma metástases em locais distantes, os investigadores são incentivados a considerar extraindo CRC organoids de diferentes PDXs paciente-derivado.

A detecção altamente sensível de GFP-etiquetado micrometastasis alcançado com esse método encoraja-nos não só a investigar várias questões biológicas não resolvidas sobre a transição da micrometastasis para macrometastasis, formação do do estroma nicho para a colonização metastática e aquisição de resistência às drogas, mas também para avaliar as eficácias de romance drogas anti-câncer empregando PDX-rolamento animais como modelos pré-clínicos.

O GFP-baseado FACS-classificação de viver CRC organoids extraídos de sites primários e distantes também tem potencial para permitir exames de baseada em célula único das expressões do gene, bem como os perfis epigenéticos e metabolómica, de um tumor. Tais achados bem podem levar a elucidação dos mecanismos moleculares subjacentes a disseminação metastática do CRC organoids.

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Disclosures

Os autores não têm nenhum potenciais conflitos de interesse a divulgar.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado pelo Juntendo University Young Investigator Award (2013, 2014 e 2015) a Yo, o prêmio de projeto conjunto (2013 e 2014) para K. M. e concede em auxílio para a investigação científica do Ministério da educação, cultura, esportes, ciência e Tecnologia, Japão (16 15625 K a K. Y. e 16K 15598 para M.G.). Somos especialmente gratos a todos os membros do Dept. de Coloproctological cirurgia e Patologia Molecular para discussões úteis e suporte técnico. Agradecemos também Dr. Hiroyuki Konno (Universidade de Hamamatsu escola medicina) e Dr. Hideki Kitajima (Universidade Internacional da saúde e bem-estar) pela generosa orientação técnica nos procedimentos cirúrgicos para implantação ortotópico em ratos e Dr. Yoshitaka hipopótamo (Chiba Cancer Center) para aconselhamento técnico sobre como realizar a cultura de organoides do tumor.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NOD/Shi-scid IL2Rγ null (NOG) mice The Central Institute for Experimental Animals,Kanagawa, Japan Breed 6-week-old male mice under germ-free and specific pathogen-free conditions
wound clips
2×10mm
Natsume manufacturing, Japan #C-21-S Autoclave before use
Hamilton syringe
needle size:22 gauge
Tokyo Science, Japan Disinfect with 70% alcohol and sterile PBS.
6-well plate BMBio #92006
12-well plate BMBio #92412
15ml conical tube Sumitono Bakelite MS-57150
50ml conical tube Sumitomo Bakelite MS-57500
microtube Eppendorf #0030120086 Autoclave before use
Hemocytometer Erma #03-202-1
40μm cell strainer Corning #352340
Matrigel basement membrane matrix Corning #354234 Store aliqupts at -20°C.
Place on ice until use
Collagenase type 1 Sigma #C1030 150 mg/ml collagenase type1 in 1×PBS. Store aliqupts at -20°C for up to 1 year
Accutase Innovate Cell Technologies #5V2623A Store at 4°C.
DMEM/F-12 with GlutaMAX™ Gibco #10565018 Store at 4°C. Warm at 37°C before use
Cell banker 1plus ZENOAQ #628 Store at 4°C. Use within 1 month
Penicillin Gibco #15140122 Store at 4°C. Use within 1 month
Streptomycin Gibco #15140122 Store at 4°C. Use within 1 month
hEGF PEPROTECH #AF-100-15 Store at -20°C. Add to medium on same day as use
Y27632, a ROCK inhibitor Wako #253-00591 Store at -20°C. Add to medium on
same day as use
Culture medium Gibco DMEM/F-12 with GlutaMAX™ supplement supplemented with 5% FBS, 100 U/ml penicillin and 100 µg/ml streptomycin.
Store at 4°C. Use within 1 month.
CRC organoid culture medium
with 1% or 5% FCS
DMEM/F-12 with GlutaMAX™ supplement (Gibco #10565018) supplemented with 1% or 5% FCS, 100 U/ml penicillin, 100 µg/ml streptomycin, 2 ng/ml hEGF and 10 µM Y27632, a ROCK inhibitor.
Store at 4°C. Use within 1 month.
the FuGENE 6 transfection regent Roche 11814 443001
Minisart 0.45 µm filter Sartorius stedim 17598-K
5 ml polypropylene centrifuge tubes Beckman Coulter 326819
PRRL-GFP vector Gift from Dr. Robert A. Weinberg
pCMV-VSV-G Gift from Dr. Robert A. Weinberg
pCMV-dR8.2 dvpr Gift from Dr. Robert A. Weinberg
the SW55Ti swinging bucket rotor Beckman Coulter
a Zeiss Axioplan 2 stereo-fluorescence microscope Zeiss

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References

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Deteção de alta sensibilidade de Micrometastases gerado pelo Organoids GFP de Lentivirus-transfectadas cultivadas de um Tumor de cólon derivado de paciente
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Okazawa, Y., Mizukoshi, K., Koyama, Y., Okubo, S., Komiyama, H., Kojima, Y., Goto, M., Habu, S., Hino, O., Sakamoto, K., Orimo, A. High-sensitivity Detection of Micrometastases Generated by GFP Lentivirus-transduced Organoids Cultured from a Patient-derived Colon Tumor. J. Vis. Exp. (136), e57374, doi:10.3791/57374 (2018).More

Okazawa, Y., Mizukoshi, K., Koyama, Y., Okubo, S., Komiyama, H., Kojima, Y., Goto, M., Habu, S., Hino, O., Sakamoto, K., Orimo, A. High-sensitivity Detection of Micrometastases Generated by GFP Lentivirus-transduced Organoids Cultured from a Patient-derived Colon Tumor. J. Vis. Exp. (136), e57374, doi:10.3791/57374 (2018).

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