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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Alta sensibilidad detección de micrometástasis de GFP Lentivirus-transduced organitas cultivados de un Tumor de Colon paciente derivado

Published: June 14, 2018 doi: 10.3791/57374
Automatic Translation
1,2, 1,2, 2,4, 5, 1, 1, 1, 3, 2, 1, 2
1Department of Coloproctological Surgery, Juntendo University Faculty of Medicine, 2Department of Molecular Pathogenesis, Juntendo University Faculty of Medicine, 3Atopy Research Center, Juntendo University Faculty of Medicine, 4Department of Oral Pathobiological Science and Surgery, Tokyo Dental College, 5Department of Gastroenterology, Juntendo University Faculty of Medicine

Summary

Para permitir la detección altamente sensible de lo cáncer colorrectal humano difundiendo células (CRC) colonizando los tejidos, aquí mostramos un protocolo para la transducción eficiente de partículas lentivirales proteína fluorescente verde (GFP) en células de organoides derivados de PDX CRC antes de su inyección en ratones receptores, con observación en el microscopio estéreo-fluorescencia.

Abstract

A pesar de avances en el tratamiento del cáncer colorrectal (CRC), muy pocas terapias radicales son efectivas para las etapas finales de la Convención. Para superar este desafío clínico, modelos de ratón tumores xenoinjerto usando muchos Ratón transgénico han desarrollado modelos con tumores y líneas celulares de carcinoma humano de larga trayectoria como modelos preclínicos. Parcialmente mímico las características de los carcinomas humanos, pero a menudo no recapitular los aspectos clave de las malignidades humanas incluyendo la invasión y metástasis. Por lo tanto, modelos alternativos que mejor representan la progresión maligna en el CCR humano han sido esperados durante mucho tiempo.

Mostramos en la presente generación de xenoinjertos tumorales derivados del paciente (PDXs) mediante implantación subcutánea de pequeños fragmentos CRC disecados quirúrgico de un paciente. El colon PDXs desarrollar e histopathologically se asemejan a la CRC en el paciente. Sin embargo, pocos micrometástasis espontáneas son perceptibles en perfiles convencionales de afectados órganos distantes en el modelo PDX. Para facilitar la detección de diseminación metastásica a órganos distantes, extrae las células tumorales de organoide de las PDXs colon en cultura e infectados con lentivirus GFP antes de la inyección en altamente inmunodeficientes Shi/NOD-scid IL2Rγ null Ratones (NOG). Orthotopically inyectan derivados de PDX CRC organoide de células constantemente forma tumores primarios positivos para GFP en ratones receptores. Por otra parte, espontáneamente desarrollando micrometastásica colonias expresando GFP se detectan principalmente en los pulmones de los ratones por microscopía de fluorescencia. Por otra parte, intrasplenic inyección de CRC organoides con frecuencia produce colonización hepática. Tomados en conjunto, estos resultados indican GFP-labelled CRC derivados de PDX organoide células ser visualmente perceptible durante un proceso de varios pasos como la cascada de metástasis invasión. Los protocolos descritos incluyen el establecimiento de PDXs de CRC humana y cultura 3D de las celdas correspondientes de organoide CRC transduced por partículas lentivirales GFP.

Introduction

Cáncer colorrectal (CCR) es la segunda causa de muertes de cáncer en todo el mundo1. La insuficiente respuesta a las terapias convencionales de pacientes con enfermedad en estadio avanzado indica la ineficacia de los intentos de curar radicalmente CRCs. Para el desarrollo de enfoques terapéuticos más eficaces, se han establecido varios modelos de ratón preclínico de cáncer que imitan las características de la CRC. Varias líneas celulares CRC se han utilizado ampliamente para generar xenoinjertos tumorales debido a su comodidad y facilidad de manipulación. Cultura a largo plazo de líneas celulares de cáncer, sin embargo, a menudo provoca la selección de las poblaciones de célula única que son absolutamente proliferativa bajo una condición particular de la cultura, lo que resulta en resultados poco fiables y limitaciones cruciales en el preclínico de drogas desarrollo.

Sin ser cultivadas en vitro, xenoinjertos tumorales derivados del paciente (PDXs) también se han generado por la implantación en modelos animales de tejidos humanos de CRC quirúrgicamente disecados de pacientes2,3,4. PDXs son ampliamente reconocidos como recapitula las principales características histopatológicas y alteraciones genéticas originalmente presentan en los tumores de los pacientes de los cuales fueron derivados. Por otra parte, organoides derivados del paciente tumor compuesto por células tumorales racimos fueron establecidos por la cultura en condiciones 3D que mímico de cerca las propiedades biológicas de los tumores originales5,6. También se aplicaron estos organoides de tumor para detección de drogas de alto rendimiento, lo que permite terapias personalizadas ser diseñado5. Sin embargo, marcadamente heterogénea población de CRC se asume para estar presente dentro de un tumor masa. Particular poblaciones de CRC pueden selectivamente proliferan y ampliar durante la serie en vivo y en vitro de pasajes de organoides PDX y tumor, respectivamente. Esto puede permitir también los perfiles de expresión génica global y estado epi/genética de lo CRC afectado al cambio, lo que resulta en un mínimo parecido con el CRC parental.

CRC organoides derivados del paciente y los extraídos de colon humano benigno dirigido al puerto de combinaciones de mutaciones oncogénicas también han sido empleados para investigar las características distintivas de las células tumorales humanas ejemplificadas por la invasión tumoral y metástasis 6,7,8,9. Sin embargo, la muy baja incidencia de metástasis espontánea que surjan de implantación ortotópica de CRC derivados del paciente en ratones inmunodeficientes, ha hecho más difícil estudiar el proceso de varios pasos de la cascada de metástasis invasión que incluye local invasión, intravasación, transporte en el torrente sanguíneo, la extravasación y la colonización de órganos distantes4,10. Micrometástasis como representaron por la deposición de células de tumor ≤2 mm, forman por organoides derivados del paciente de la CRC, a menudo pasado por alto en el análisis histopatológico de las secciones de órganos distantes afectadas en modelos experimentales de ratón. Visualización de micrometástasis espontánea también ha sido mínima en vivo debido a la dificultad de introducir eficientemente marcadores fluorescentes en las células del tumor organoide antes de su inyección en ratones receptores. En este estudio, hemos desarrollado un protocolo para transducir eficazmente lentivirus GFP en células de organoides derivados de PDX CRC en 3D cultura antes de la inyección en ratones receptores y para permitir la detección altamente sensible, empleando microscopía de fluorescencia de estéreo de su colonización de los diferentes órganos en forma de micrometástasis.

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Protocol

La paciente proporcionó consentimiento de informado escrita y el proyecto fue aprobado por el Comité de ética de investigación de la Facultad de medicina de la Universidad de Juntendo. Los experimentos de ratón también fueron aprobados por el Comité de ética de investigación Animal de la Facultad de medicina de Juntendo.

1. establecimiento de CRC PDXs en ratones inmunodeficientes

Procedimientos experimentales para el establecimiento de CRC PDXs (paso 1) se describen en la figura 1A.

  1. Preparar el tejido primario de CRC inmediatamente después de la resección quirúrgica del tumor del paciente.
  2. Lave el tejido primario de CRC por agitación suave varias veces en 30 mL de fosfato estéril helada tampón salino (PBS) en un tubo cónico de 50 mL y mantener en hielo.
  3. Coloque el tejido en un plato de Petri de 10 cm con pinzas estériles, quitar las zonas necróticas tan ampliamente como sea posible usando tijeras estériles y cortar los tejidos de tumor sólido en trozos pequeños (5 x 5 x 5 mm3 en tamaño) con hojas de afeitar estériles.
    Nota: Las áreas necróticas son a menudo más blanco, más suave y más friable que las áreas circundantes.
  4. Coloque las piezas pequeñas del tumor con pinzas estériles en 2 mL de PBS estéril helada en una placa de 6 pozos.
  5. Raza 6 semanas de edad IL2Rγ Shi/NOD-scid null (NOG) altamente ratones inmunodeficientes bajo condiciones libres de patógenos específicos y libre–germen–.
  6. Anestesiar los ratones con inhalación isoflurano con el aparato de anestesia de inhalación de animales pequeños y desinfectar la piel con etanol al 70%. Asegurar la tarifa normal y la profundidad de la respiración y la ausencia de un reflejo del pellizco del dedo del pie para anestesia adecuada. Veterinario ungüento en los ojos es una opción, para evitar la sequedad ocular bajo anestesia.
  7. Esterilizar todas las herramientas quirúrgicas mediante esterilización con calor seco y luego usar estas herramientas para todos los procedimientos para prevenir las infecciones de la herida en ratones receptores.
  8. Coloque el ratón anestesiado en una posición prona sobre la mesa de laboratorio. Hacer una pequeña incisión en la parte inferior de los flancos derecho e izquierdos del ratón receptor para generar bolsillos subcutáneos para la implantación de tejido con tijeras estériles. Tenga cuidado de no para perforar la membrana peritoneal. Debe haber poco sangrado con este procedimiento.
  9. Suavemente de la inmersión anterior preparado fragmentos de tumor en 50 μl de matriz extracelular artificial y luego los implantes en la parte inferior de los bolsillos subcutáneos derecha e izquierdas.
  10. Sutura de la incisión con clips de herida en los ratones sometidos a procedimientos quirúrgicos. Asegúrese de que los tejidos de tumor implantado se encuentran a cierta distancia de la incisión debajo de la piel.
    Nota: Según minimizando los procedimientos quirúrgicos, no hay tratamientos para el dolor post quirúrgico y la infección fueron administrados en este estudio.
  11. Coloque el ratón sobre una almohadilla caliente y mantener la posición decúbito esternal hasta que se restablece la conciencia suficiente. Una vez totalmente recuperado y puede sentarse en las cuatro patas, los ratones pueden devolverse a sus jaulas hogar. Para evitar la depredación, no permiten la cría con animales no operados en la misma jaula.
  12. Comprobar estanqueidad de la sutura y confirmar que los ratones están en condiciones estables al día siguiente, en el grupo tratado quirúrgicamente. Compruebe los ratones para detectar signos de enfermedad y medir el tamaño del tumor en cada ratón, una vez por semana, empleando pinzas.

2. disección de CRC PDXs de ratones

Procedimientos experimentales para la disección de CRC PDXs (paso 2) se detallan en la figura 1B.

  1. Permitir que el tumor creciendo subcutáneamente a ~ 1 cm3 de tamaño, que generalmente toma aproximadamente de 1 a 3 meses.
  2. Anestesiar el ratón con inhalación isoflurano con el aparato de anestesia de inhalación de animales pequeños y desinfectar la piel con etanol al 70%.
  3. Coloque el ratón en una posición prona sobre la mesa de laboratorio. Haga una incisión en la piel, exponer el tumor y separar con cuidado la piel del tumor utilizando tijeras estériles. Después de quitar el tumor, coloque sobre un plato de Petri de 10 cm y eliminar regiones totalmente necróticas del tumor, luego enjuague dos veces con 5 mL de PBS.
    Nota: Las áreas necróticas son a menudo más blanco, más suave y más friable que las áreas circundantes.
  4. Coloque el tumor en hielo y dividir igualmente en al menos 4 partes para diferentes aplicaciones incluyendo 1) la cultura de organoide CRC, 2) transplante en ratones secundarios, 3) histológica examinación y 4) de congelación y conservación de los fragmentos del tumor.
    1. Para la generación de los organoides de la CRC, coloque el tejido de tumor sólido en un plato de petri de 6 cm que contiene 1 mL de PBS estéril. No tejido en hielo hasta su procesamiento (paso 3).
    2. Para establecer el modelo PDX para CRC humano, paso el fresco PDXs CRC en un ratón secundario. Cortar el tejido del tumor en trozos pequeños (5 x 5 x 5 mm3 en tamaño) con hojas de afeitar estériles y sumergir suavemente estos fragmentos de tejido en 50 μl de matriz extracelular artificial. Entonces, implantar estos fragmentos en la parte inferior de los bolsillos subcutáneos derecho e izquierdos del ratón NOG, tal como se describe en el paso 1.8, 1.11.
    3. Para el análisis histológico, fijar las muestras en 5 mL de formalina tamponada neutra 10% en un tubo cónico de 15 mL a temperatura ambiente por 2 días.
    4. Para la criopreservación, cortar el tejido del tumor en trozos pequeños (5 x 5 x 5 mm3 en tamaño) y suavemente sumergir las muestras en 500 μl de la solución en tubos de cryovial de 1 a 1,5 mL de congelación de la célula. Luego, transferir el tubo a un congelador de-80 ° C.

3. extracción de PDXs en la suspensión celular para la cultura de organoide CRC

Procedimientos experimentales para disociación de CRC PDXs (paso 3) se detallan en la figura 1B.

  1. Lugar arriba (paso 2.4.1) tumor preparado los fragmentos en una placa de Petri de 10 cm.
  2. Pique los fragmentos utilizando cuchillas de afeitar estériles y transferir a un tubo cónico de 15 mL con 8 mL de suero de ternera fetal 10% (FCS)-medio (DMEM modificado Eagle de Dulbecco) con 80 μl del stock de enzima colagenasa (véase Tabla de materiales).
  3. Cierre el tubo herméticamente y envuelva la tapa con parafilm para evitar fugas. Para disociar los fragmentos de tumor picada en la suspensión de células, agítelo suavemente durante 2 h a 37 ° C. Nota que todavía habrá muchos fragmentos de tejido no digerido permanecen en el tubo.
  4. Centrifugar el tubo a 300 x g durante 5 min a 4 ° C y eliminar el sobrenadante. Resolver el sedimento celular con 10 mL de 10% FCS-DMEM a hacer la suspensión de células.
  5. Para eliminar restos de tejido no digerida, filtrar la suspensión de células dos veces con el colador de la célula de 40 μm en un tubo cónico de 50 mL. Luego, centrifugar el paso a 300 x g durante 5 min a 4 ° C. Quite el sobrenadante y mantener el diábolo en el hielo.

4. generación de los organoides CRC cultivadas en matriz extracelular Artificial

Procedimientos experimentales para el cultivo de organoide CRC de las colon PDXs (paso 4) se describen en la figura 1B.

  1. Establecer un medio de cultivo adecuado para los organoides derivados de PDX CRC (véase Tabla de materiales, "el medio de cultivo de organoide CRC") empleando medios anteriormente descritos para humanos colon organitas11.
  2. Aplicar 150 μL de matriz extracelular artificial (véase Tabla de materiales) por así en una placa de 12 pozos en el hielo y luego lo incube durante 30-60 min a 37 ° C, 5% CO2 incubadora para solidificar el gel.
  3. Suspender el sedimento celular del paso 3.5 con el medio de cultivo de organoide CRC (del paso 4.1) con 5% FCS para lograr ajuste a 3 x 105 células/mL. Entonces, la semilla 1 mL del medio en la artificial placa de recubrimiento de matriz extracelular preparado en el paso 4.2. e incubar durante la noche a 37 ° C debajo del 5% CO2. Utilizar un hemocitómetro para contar el número de células del tumor como las células y agrupaciones multicelulares (un grupo de células adherentes) en la suspensión de células.
    Nota: 5% FCS se utiliza para calmar la actividad enzimática residual de colagenasa en este estudio.
  4. Recoger cuidadosamente el medio de cultivo, incluyendo flotando células que se han separado de la artificial extracelular placa revestida de matriz, en un 1,5 mL tubo de centrífuga en el día siguiente y centrifugue a 1.400 x g durante 5 minutos. A continuación, quite el sobrenadante y Resuspenda el sedimento en 70 μl de matriz extracelular artificial en hielo.
  5. Para aumentar la viabilidad celular CRC, superponer el tumor que contiene células artificiales matriz extracelular en el organoide de tumor células conexión a la placa de recubrimiento de matriz extracelular artificial e incuban 30 min a 37 ° C, 5% CO2 incubadora para solidificar la capa de matriz extracelular artificial. Luego, incubar con 1 mL el CRC organoide de la célula del medio de cultivo con FCS de 1% a 37 ° C bajo 5% CO2.
  6. Cambiar el medio de cultivo cada dos días. Como los organoides CRC llenan el medio, puede ser necesario cambiar el medio cada día.

5. generación y enriquecimiento de partículas lentivirales de GFP

Procedimientos experimentales para la generación y enriquecimiento de partículas lentivirales GFP (paso 5) se describen en la figura 1.

  1. Las células HEK293T con Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medio con 10% FCS de la cultura y preparar seis platos de 10 cm (2 x 106 células por plato) para el siguiente procedimiento de transfección.
  2. Para transfección por plato, prepare 500 μl de la mezcla incluyendo dos plásmidos de embalaje lentivirales, pCMV-VSV-G (1 μg) como dvpr pCMV-dR8.2 (5 μg), de 1,5 mL estéril y 20 μl del reactivo de transfección en DMEM con un vector PRRL-GFP (5 μg)12 microtubo. Mantener la mezcla a temperatura ambiente durante 20 minutos y recubrimiento en cada uno de los platos de 10 cm e incubar de 18 h.
  3. Quitarlo del medio, añadir 5 mL de 10% FCS-RPMI 1640 medio fresco a cada plato y dejar reposar durante 24 h.
  4. Recoger el medio condicionado de cada plato en un tubo de centrífuga de 50 mL y almacenar un total de 30 mL de medio a 4 ° C durante la noche. Añadir 5 mL de la 1640 RPMI fresco en cada plato y dejar reposar durante 24 h.
  5. Recoger el medio condicionado de cada plato en un tubo de centrífuga de 50 mL y, en total, 30 mL del medio en el hielo. A continuación, deseche las células.
  6. Filtro 60 mL del medio (desde el paso 5.4-5.5) a través de un filtro de 0.45 μm para eliminar las células y dividir esta cantidad en 12 tubos de centrífuga de polipropileno de 5 mL por ultracentrifugación.
  7. Para concentrar virus, centrifugar utilizando un rotor oscilante de cubo (véase Tabla de materiales) en 85.327 x g durante 1,5 h a 4 ° C.
  8. Retire inmediatamente el medio. Para resolver la pelotilla de virus concentrado, colocar 250 μl de mezcla de nutriente Ham F-12 (F12) y medio DMEM sin FCS en cada uno de los doce tubos mantener a 4 ° C durante la noche. Tenga en cuenta que el virus de la pelotilla es a menudo invisible.
  9. Pipetee suavemente el medio para recoger 3 mL del concentrado 5 x GFP lentivirus stock, en total, probablemente incluyendo partículas lentivirales GFP con 10 unidades transductoras de8 por el mL (TU/mL). A continuación, guarde los doce microtubos de 1,5 mL (incluyendo 250 μl por tubo) bajo condiciones estériles a-80 ° C por hasta un año. Preparar muchas pequeñas alícuotas de la solución original para evitar múltiples ciclos de descongelación de congelación–.

6. etiquetado de CRC organoide células GFP partículas lentivirales cultivadas en matriz extracelular Artificial

Procedimientos experimentales para el etiquetado de las células de organoide CRC con lentivirus GFP (paso 6) se describen en la figura 1.

  1. Permita que el CRC organitas preparado en el paso 4.6 para crecer sin interferencia por 7 – 10 días y cosechar mecánicamente utilizando un raspador celular estéril y luego transferirlos en un microtubo de 1.5 mL.
    Nota: El crecimiento de organoides de la CRC en la cultura depende de la naturaleza de los tumores originales de los pacientes. Evitar crecimiento excesivo de los organoides de la CRC, al mantener en confluencia de 60 – 70% antes de la transferencia en una proporción de 1:2 split en un nuevo artificial extracelular matriz recubierta 12-bien plato.
  2. Centrifugue el microtubo de 3 min x 1.400 g, quitar el medio de cultivo y resolver el precipitado de células en 500 μl de PBS dando suaves golpecitos.
  3. El microtubo de 3 min a 1.400 x g de centrífuga y eliminar PBS.
  4. Para disociar el adherente organitas CRC, Añadir 500 μl de una solución de separación celular de proteolítica y enzimas colagenolíticas a la celda de pellets en el tubo y mezclan dando suaves golpecitos. Luego, dejar los tubos a 10 min a temperatura ambiente.
  5. Pipetee suavemente la suspensión de células con un adicional de 500 μl de 1% FCS-DMEM varias veces en un microtubo de 1.5 mL aproximadamente disociar las células. Generación de las células de los organoides de la CRC mediante pipeteo áspero marcadamente reduce la viabilidad de las células. Por lo tanto, es indispensable dejar la masa de células visualmente perceptible en la suspensión de células mediante pipeteo muy suavemente en un microtubo de 1.5 mL.
  6. Centrifugar la suspensión celular por 3 min a 1.400 x g y eliminar el sobrenadante.
  7. Resolver el precipitado de células con una mezcla de 100 μl del stock de lentivirus de 5 x GFP (> 108 TU/mL) y 400 μL de medio de cultivo de organoide CRC en un microtubo de 1.5 mL golpeando suave para ajustar a una concentración de 5 x 105 disociar las células del tumor por 500 μl . Utilizar un hemocitómetro para contar el número de células del tumor, incluyendo las células y grupos de células en la suspensión de células, como se describe anteriormente (paso 4.3).
  8. Preparar una artificial extracelular matriz placa revestida de 12 pozos, como se describe en el paso 4.2. Luego, coloque 500 μl de la suspensión preparada en el paso de 6.7 en la placa y dejarla por 18 h a 37 ° C en 5% CO2.
  9. Recoja el medio con las células flotantes separadas de la placa de recubrimiento de matriz extracelular artificial en un tubo de centrifugación de 1,5 mL. Centrifugue a 1.400 x g y luego quite el sobrenadante y Resuspenda el sedimento en 70 μl de matriz extracelular artificial en hielo.
  10. Para aumentar la viabilidad celular CRC, superponer el tumor que contiene células artificiales matriz extracelular en los organoides del tumor a la artificial extracelular matriz placa revestida de 12 pozos, como se describe en el paso 4.5. A continuación, incubar la placa por 30 min a 37 ° C, 5% CO2 incubadora para solidificar el recubrimiento de la matriz extracelular artificial y luego la cultura con 1 mL de medio de cultivo de organoide CRC con FCS de 1% a 37 ° C en 5% CO2.
  11. Observar las células en 3 días después de la infección en un microscopio de fluorescencia para confirmar casi 100% de positividad GFP debido al uso de un alto título de partículas lentivirales (ver figura 2A).
  12. Cultura el organitas CRC por períodos de 7 a 10 días para ampliar el crecimiento de la célula antes de la inyección en ratones receptores.

7. generación de metástasis por CRC GFP marcado organitas en ratones receptores

Procedimientos experimentales para la generación de metástasis mediante el CRC GFP-labelled organoides (paso 7) se describen en la figura 1.

  1. Para disociar el organitas CRC GFP marcado en la suspensión de células, cosechar mecánicamente utilizando un raspador celular estéril y transferir en un microtubo de 1.5 mL, como se describe anteriormente (paso 6.1).
  2. Centrifugue el microtubo de 3 min x 1.400 g, retire el medio de cultivo y resolver el precipitado de células en 500 μl de PBS dando suaves golpecitos.
  3. El microtubo de 3 min a 1.400 x g de centrífuga y eliminar PBS.
  4. Superposición de 500 μl de la solución de separación celular en el precipitado de células en el tubo y mezclar dando suaves golpecitos. Entonces, dejar la situación de la mezcla durante 10 minutos a temperatura ambiente enzimático disociar las organitas adherente de la CRC, como se describe anteriormente (paso 6.4).
  5. Pipetee suavemente la suspensión de células con un adicional de 500 μl de 1% FCS-DMEM varias veces en un microtubo de 1.5 mL aproximadamente disociar las células, como se describe anteriormente (paso 6.5). Generación de las células de los organoides de la CRC mediante pipeteo áspero marcadamente reduce la viabilidad de las células. Por lo tanto, dejar la masa de células visualmente perceptible en la suspensión de células mediante pipeteo muy suavemente en un microtubo de 1.5 mL.
  6. Centrifugue la suspensión de células durante 3 minutos a 1.400 g de x y eliminar el sobrenadante.
  7. Establecer un modelo de ratón de metástasis espontáneas de PDXs CRC:
    1. Preparar una suspensión de células incluyendo 5 x 105 células en 50 μl de PBS con 50% matriz extracelular artificial por ratón. Mantener la suspensión en el hielo antes de usarlo. Utilizar un hemocitómetro para recuento de las células de cáncer, como se indica en el paso 4.3.
    2. Anestesiar un ratón con inhalación isoflurano con el aparato de anestesia de inhalación de animales pequeños y desinfectar la piel con etanol al 70%, como se indica en el paso 1.6.
    3. Coloque el mouse de rompope en una posición supina sobre la mesa de laboratorio. Agarre la mucosa rectal con pinzas estériles y tire suavemente en el ano. A continuación, inyectar inmediatamente la suspensión preparada en el paso 7.7.1 en la submucosa rectal del ratón utilizando una jeringa (tamaño de la aguja: 22 G). Habitualmente, se utilizan 4 a 6 ratones por grupo para evaluar los resultados.
  8. Establecer un modelo experimental de metástasis de PDXs CRC:
    1. Preparar una suspensión de células de organoide CRC incluyendo 4 x 104 células en 50 μl de PBS por ratón. Mantener la suspensión en el hielo antes de usarlo. Utilizar un hemocitómetro para recuento de las células de cáncer (paso 4.3).
    2. Anestesiar un ratón con inhalación isoflurano con el aparato de anestesia de inhalación de animales pequeños y desinfectar la piel con etanol al 70%, como se indica en el paso 1.6.
    3. Coloque el ratón NOG anestesiado en una posición prona sobre la mesa de laboratorio. Hacer una pequeña incisión en la parte inferior del flanco izquierdo y luego se corta el peritoneo para exponer cuidadosamente el bazo utilizando pinzas y tijeras estériles. Sujete el tejido graso atado bazo con una pinza estéril, luego lentamente inyectar 50 μl de la suspensión celular (preparada como se indica arriba, paso 8.1) en el bazo. Asegúrese de que la suspensión de células se inyecta correctamente sin salida hacia el exterior, del bazo. Habitualmente, se utilizan 4 ratones por grupo para evaluar los resultados.
  9. Coloque todos los ratones en una almohadilla caliente después de la cirugía y mantener en una posición decúbito esternal hasta que se restablece la conciencia suficiente, como se describe en el paso 1.11. Una vez que los ratones han recuperado plenamente, devolverlos a sus jaulas hogar. Para evitar la depredación, no permiten la cría con animales no operados en la misma jaula.
  10. Comprobar estanqueidad de la sutura y confirmar que los ratones están vivos, en el grupo tratado quirúrgicamente, al día siguiente. Compruebe los ratones para detectar signos de enfermedad y medir tamaños de tumor, con pinzas, en todos los ratones una vez por semana.
  11. Observar los ratones para detectar metástasis espontánea (por períodos de hasta 2,5 meses) y metástasis experimental (1 mes) después de la inyección.
  12. Sacrificar a los ratones mediante anestesia y dislocación cervical en los días indicados. Diseccionar los tumores primarios y varios tejidos incluyendo el hígado y los pulmones. Lugar los tumores disecados y órganos en 5 mL de PBS helado en un plato de Petri de 10 cm y guardarlos en hielo.
  13. Para detectar células de GFP-positivas CRC organoide, observar los tejidos disecados bajo un microscopio de fluorescencia de estéreo. Adquirir imágenes con una cámara CCD y preparar utilizando software de procesamiento de imágenes estándar.

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Representative Results

Un adenocarcinoma colorrectal primaria diagnosticada como moderado distinguido había sido resecado quirúrgicamente de una hembra de año 76 con clasificación de TNM, estadio IIIa, seguida de quimioterapia postoperatoria. La principal convención células immunohistochemically mancharon el positivo para Ki-67, cacerola-cytokeratin, el antígeno carcinoembrionario y E-cadherina. Piezas del tumor resecado fueron implantados también por vía subcutánea en ratones NOG para generar el modelo PDX de colon. CRC organoide células fueron extraídas luego de cultivo de tejidos de lo PDX de colon que había desarrollado por vía subcutánea en los ratones. Los organoides CRC fueron capaces de constantemente formando agrupaciones multicelulares durante una serie de pasajes en matriz extracelular artificial. Como organoides tumor histológico y genético reflejan la naturaleza de los tumores primarios de pacientes5,6, intentamos desarrollar un modelo de ratón que permitiría en vivo detección de CRC organoide células con alta sensibilidad durante la diseminación metastática. Para lograr este objetivo, organitas CRC fueron infectados por lentivirus de la GFP, lo que resulta en casi todos los organoides mostrando muy luminoso GFP (figura 2A). Estos organoides entonces eran inyectados orthotopically y intrasplenically en ratones NOG secundarios antes de la detección de células GFP-positivas en órganos distantes bajo un microscopio de fluorescencia. Observamos la formación de tumores primarios de GFP-positivas en el sitio de orthotopic en todas cuatro ratones examinados (figura 2B, izquierda). Por otra parte, se encontraron metástasis microscópicas en los pulmones de los ratones de tres de cada cuatro en 2.5 meses después de las inyecciones ortotópico (figura 2B, media). Además, las metástasis del hígado se observaron en respuesta a la inyección de intrasplenic en todos los cuatro ratones examinados en 1 mes después de las inyecciones (figura 2B, derecha).

Tomados en conjunto, estos resultados indican que la alta resolución fluorescencia de GFP en células de organoides derivados de PDX CRC permite su detección de micrometástasis espontánea y las desarrolladas experimentalmente, en órganos distantes, cuando introduce en recipiente ratones. Esta detección de alta sensibilidad de la difusión derivados del PDX CRC organitas en vivo también ofrece un modelo no sólo para el estudio de la biología de la metástasis del tumor, sino también para el desarrollo de terapias dirigidas en el ámbito preclínico.

Figure 1
Figura 1: representación esquemática de la generación de metástasis por el organoides derivados de PDX CRC con lentivirus GFP en ratones NOG. (A) implantación de pequeños trozos del tejido CRC por vía subcutánea en ratones NOG (paso 1). El tejido CRC disecado quirúrgico del paciente fue cortado en pedazos e implantado subcutáneamente en ratones NOG. s.c.: implantación subcutánea. (B) generación de CRC organitas disociada PDXs (paso 2 – 4). Los xenoinjertos CRC desarrollados eran picada (paso 2) y transfieren a un tubo de 15 mL que contiene el medio de cultivo incluyendo colagenasa (paso 3). Tras la incubación con agitación lenta, la suspensión de células de CCR fue filtrada (paso 3). Entonces, la suspensión de organoide celular en el medio de organoide CRC era sembrada en una placa de recubrimiento de matriz extracelular artificial y se incubó toda la noche en un incubador de CO2 (paso 4). Las células de organoide CRC adjunta a la matriz extracelular artificial fueron también recubiertas con matriz extracelular artificial adicional e incubadas en un incubador de CO2 (paso 4). s.c.: implantación subcutánea. (C) generación de CRC organitas transduced por partículas lentivirales GFP antes de emplear la inyección en ratones receptores (paso 5 – 7). Las partículas lentivirales de GFP se generaron en un título alto (paso 5). Los organoides CRC PDX-derivado en matriz extracelular artificial directamente cosechadas con un raspador celular y transferidos en un microtubo (paso 6). Después de la centrifugación, el precipitado celular se resuspendió en PBS. La suspensión celular se centrifugó y se disoció el precipitado de células. Entonces, la suspensión de células de organoide CRC se incubó con la acción de virus GFP en el medio de cultivo de organoide CRC en la placa revestida de matriz extracelular artificial durante la noche en un incubador de CO2 (paso 6). Las células de organoide CRC adjunta a la matriz extracelular artificial fueron recubiertas con matriz extracelular artificial adicional e incubadas en un incubador de CO2 para solidificar el recubrimiento de la matriz extracelular artificial (paso 6). Los organoides CRC entonces fueron cultivadas por períodos de 7 a 10 días para ampliar el crecimiento de la célula (paso 6). Para desarrollar un modelo de metástasis espontáneas, las disociadas 5 x 105 CRC organoide células con GFP suspendido en 50 μl de PBS con 50% matriz extracelular artificial fueron inyectadas orthotopically en ratones NOG (paso 7). Para generar un modelo experimental de metástasis, 4 x 104 células de organoide CRC etiquetadas con GFP en 50 μl de PBS fueron inyectadas intrasplenically en ratones NOG (paso 7). o.t.: inyección de orthotopic, i.s.: intrasplenic inyección. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: visualización de alta resolución de GFP en cultivadas CRC GFP marcado organoides, tumores primarios y micrometástasis. (A) casi 100% de organoides CRC cultivadas son GFP positiva. Las imágenes fueron capturadas utilizando un microscopio de fluorescencia de estéreo. Barra de escala = 250 μm. (B) GFP-positividad en el tumor primario y micrometástasis en los pulmones y el hígado. La suspensión de células disociada de GFP-expresando CRC organoide fue inyectada en la submucosa rectal (inyección de o.t.) de ratones NOG. La mayoría de las células tumorales se muestra positivas para la GFP en el tumor primario. También se muestran micrometástasis GFP-positivas colonizar los pulmones (indicados por una flecha). Por otra parte, se detectan micrometástasis GFP-positivas en el hígado (indicado por una flecha), cuando la suspensión de células fue inyectada intrasplenically (inyección de i.s.) en ratones. Barra de escala = 500 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Aunque el modelo PDX CRC ha sido ampliamente empleado para estudiar el crecimiento del tumor primario, si este modelo es también aplicable a la investigación de metástasis del tumor ha no aún se han aclarado completamente. Metástasis espontáneas también fueron apenas detectables en el hígado y los pulmones de varios divulgados colon PDX modelos4,10. Para detectar micrometástasis con alta sensibilidad, hemos desarrollado un protocolo para la transducción de partículas lentivirales GFP en organoides derivados de PDX CRC antes de su trasplante orthotopic del y las inyecciones intravenosas en ratones receptores. De nota, fuimos capaces de demostrar que este método permite la detección altamente sensible de CRC organoides derivados micrometástasis, ambos formando espontáneamente y experimentalmente, en órganos distantes.

Pasos críticos en el protocolo incluyen mantener la formación esferoide intacto sin inducción de anoikis en la matriz extracelular artificial transfiriendo suavemente las organitas CRC durante la serie passaging. La preparación de partículas de lentivirus de alto título concentrado por ultracentrifugación también es importante para lograr el casi 100% GFP de positividad de CRC organitas. Por otra parte, se recomienda inyectar el organitas CRC GFP marcado dentro de 10 – 14 días en ratones receptores. Períodos excesivamente largos para la expansión de los organoides CRC después de la infección pueden favorecer la selección de débil organitas GFP-expresando.

La inyección de organoides de la CRC en la submucosa rectal de ratones NOG demostró su diseminación metastática en los pulmones, aunque no en el hígado, probablemente a través de la vena cava inferior. Para generar espontáneamente las metástasis del hígado, inyección de organoides CRC en el colon con laparotomía sería necesaria13.

Tenga en cuenta que en ocasiones aumenta la incidencia de linfomas de células B en ratones inmunodeficientes NOG implantados con los tejidos, incluyendo los linfocitos, infectados con el virus de Epstein-Barr oncovirus, de pacientes humanos14. Por lo tanto, es razonable recomendar que si los emergentes tumores originan el CRC humano implantado determinado mediante la realización de inmunohistoquímica con marcadores de célula humanos CRC, como el antígeno carcinoembrionario y el cytokeratin 20.

Como investigamos CRC organoides derivados solamente un paciente, más muestras de un mayor número de pacientes tendría que ser examinado para generalizar nuestros resultados en el futuro. Si el implante organoides derivados de PDX CRC muestran crecimiento mínimo en el sitio de orthotopic y rara vez forma metástasis a sitios distantes, se anima a los investigadores a considerar extraer CRC organoides de diferentes derivados del paciente PDXs.

La alta sensibilidad detección de micrometástasis de GFP marcado conseguido este método nos anima no sólo a investigar varias cuestiones biológicas sin resolver con respecto a transición de micrometástasis a macrometastasis, formación de la estroma nichos para la colonización metastásica y adquisición de resistencia a los medicamentos, sino también para evaluar la eficacia de nuevos fármacos contra el cáncer mediante el empleo de animales PDX-teniendo como modelos preclínicos.

La GFP FACS-clasificación basada de la vida CRC organitas extraídos de sitios primarios y distantes también tienen el potencial para permitir exámenes basadas en celdas individuales de las expresiones de genes, así como los perfiles epigenéticos y metabolómico de un tumor. Tales resultados pueden conducir al esclarecimiento de los mecanismos moleculares subyacentes difusión metastásica de los organoides de la CRC.

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Disclosures

Los autores no tienen posibles conflictos de interés que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por el Juntendo University investigador premio joven (2013, 2014 y 2015) años, el Premio de proyecto conjunto (2013 y 2014) a M. K. y convocatoria de ayudas para la investigación científica desde el Ministerio de educación, cultura, deportes, ciencia y Tecnología, Japón (16 15625 K a K. Y. y 16K 15598 a M.G.). Estamos especialmente agradecidos a todos los miembros del Dpto. de cirugía Coloproctological y Patología Molecular para discusiones útiles y soporte técnico. También agradecemos Dr. Hiroyuki Konno (Hamamatsu University Schoolof Medicine) y el Dr. Hideki Kitajima (Universidad Internacional de salud y bienestar) generosa orientación técnica en los procedimientos quirúrgicos para la implantación ortotópica en ratones y Dr. Yoshitaka Hippo (centro del cáncer Chiba) para asesoramiento técnico sobre la realización de la cultura de organoide de tumor.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NOD/Shi-scid IL2Rγ null (NOG) mice The Central Institute for Experimental Animals,Kanagawa, Japan Breed 6-week-old male mice under germ-free and specific pathogen-free conditions
wound clips
2×10mm		 Natsume manufacturing, Japan #C-21-S Autoclave before use
Hamilton syringe
needle size:22 gauge		 Tokyo Science, Japan Disinfect with 70% alcohol and sterile PBS.
6-well plate BMBio #92006
12-well plate BMBio #92412
15ml conical tube Sumitono Bakelite MS-57150
50ml conical tube Sumitomo Bakelite MS-57500
microtube Eppendorf #0030120086 Autoclave before use
Hemocytometer Erma #03-202-1
40μm cell strainer Corning #352340
Matrigel basement membrane matrix Corning #354234 Store aliqupts at -20°C.
Place on ice until use
Collagenase type 1 Sigma #C1030 150 mg/ml collagenase type1 in 1×PBS. Store aliqupts at -20°C for up to 1 year
Accutase Innovate Cell Technologies #5V2623A Store at 4°C.
DMEM/F-12 with GlutaMAX™ Gibco #10565018 Store at 4°C. Warm at 37°C before use
Cell banker 1plus ZENOAQ #628 Store at 4°C. Use within 1 month
Penicillin Gibco #15140122 Store at 4°C. Use within 1 month
Streptomycin Gibco #15140122 Store at 4°C. Use within 1 month
hEGF PEPROTECH #AF-100-15 Store at -20°C. Add to medium on same day as use
Y27632, a ROCK inhibitor Wako #253-00591 Store at -20°C. Add to medium on
same day as use
Culture medium Gibco DMEM/F-12 with GlutaMAX™ supplement supplemented with 5% FBS, 100 U/ml penicillin and 100 µg/ml streptomycin.
Store at 4°C. Use within 1 month.
CRC organoid culture medium
with 1% or 5% FCS		 DMEM/F-12 with GlutaMAX™ supplement (Gibco #10565018) supplemented with 1% or 5% FCS, 100 U/ml penicillin, 100 µg/ml streptomycin, 2 ng/ml hEGF and 10 µM Y27632, a ROCK inhibitor.
Store at 4°C. Use within 1 month.
the FuGENE 6 transfection regent Roche 11814 443001
Minisart 0.45 µm filter Sartorius stedim 17598-K
5 ml polypropylene centrifuge tubes Beckman Coulter 326819
PRRL-GFP vector Gift from Dr. Robert A. Weinberg
pCMV-VSV-G Gift from Dr. Robert A. Weinberg
pCMV-dR8.2 dvpr Gift from Dr. Robert A. Weinberg
the SW55Ti swinging bucket rotor Beckman Coulter
a Zeiss Axioplan 2 stereo-fluorescence microscope Zeiss

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References

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Cancer Research número 136 CRC humano xenoinjertos tumorales derivados del paciente (PDXs) etiquetados de GFP tumor derivado de PDX organitas transducción lentivirales micrometástasis cultura 3D
Alta sensibilidad detección de micrometástasis de GFP Lentivirus-transduced organitas cultivados de un Tumor de Colon paciente derivado
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Okazawa, Y., Mizukoshi, K., Koyama, Y., Okubo, S., Komiyama, H., Kojima, Y., Goto, M., Habu, S., Hino, O., Sakamoto, K., Orimo, A. High-sensitivity Detection of Micrometastases Generated by GFP Lentivirus-transduced Organoids Cultured from a Patient-derived Colon Tumor. J. Vis. Exp. (136), e57374, doi:10.3791/57374 (2018).

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