Summary
För att möjliggöra mycket känslig detektion av sprida mänskliga kolorektal cancer (CRC) celler kolonisera vävnader, visar vi häri ett protokoll för effektiv transduktion av grönt fluorescerande protein (GFP) lentiviral partiklar i PDX-derived CRC organoid celler före sin injektion i mottagarens möss, med stereo-fluorescens mikroskopisk observation.
Abstract
Trots nuvarande framsteg inom behandling av mänskliga kolorektal cancer (CRC) är några radikala behandlingar effektiva för sena stadier av CRC. För att övervinna detta kliniska utmaningen, tumör xenograft musmodeller med väletablerade mänskliga cancer cellinjer och många transgena musmodeller med tumörer har utvecklats som prekliniska modeller. De efterliknar delvis funktionerna i mänskliga carcinom, men misslyckas ofta med att sammanfatta de viktigaste aspekterna av mänsklig maligniteter inklusive invasion och metastasering. Således, alternativa modeller som bättre representerar den malign progressionen i mänskliga CRC har varit efterlängtade.
Vi visar häri generation av patientderiverade tumör xenograft (PDXs) av subkutan implantation av små CRC fragment kirurgiskt dissekeras från en patient. Kolon PDXs utveckla och histopatologiskt likna CRC hos patienten. Men är några spontana micrometastases detekterbara i konventionella tvärsnitt av påverkade avlägsna organ i PDX-modellen. För att underlätta upptäckt av metastatisk spridning till avlägsna organ, vi extraherade organoid tumörcellerna från de kolon PDXs i kultur och smittade dem med GFP lentivirus före injektion i starkt nedsatt immunförsvar nicka/Shi-scid IL2Rγnull (NOG) möss. Orthotopically injiceras PDX-derived CRC organoid celler konsekvent form primära tumörer positivt för god Jordbrukarsed i mottagarens möss. Dessutom utvecklar spontant micrometastatic kolonier uttrycker GFP upptäcks särskilt i lungorna hos dessa möss genom fluorescensmikroskopi. Dessutom producerar intrasplenic injektion av CRC organoids ofta nedsatt colonization. Sammantaget tyder dessa fynd GFP-märkta PDX-derived CRC organoid celler att upptäckas visuellt under en process kallas invasion-metastaser kaskad. Beskrivna protokollen omfattar upprättandet av PDXs på mänskliga CRC och 3D kultur av motsvarande CRC organoid celler sensorik av GFP lentiviral partiklar.
Introduction
Kolorektal cancer (CRC) är den näst vanligaste orsaken till cancer dödsfall världen över1. Den otillräckligt svaren på konventionell behandling av patienter med framskriden sjukdom visar hur ineffektiva försök att radikalt bota CRC. För att utveckla mer effektiva behandlingsmetoder, har olika prekliniska musmodeller av cancer som efterliknar det som kännetecknen CRC fastställts. Olika CRC cellinjer har använts att generera tumör xenograft på grund av sin bekvämlighet och enkelhet av manipulation. Långtidsodling av cancer cellinjer, som dock ofta orsakar urval av unika cellpopulationer som är ganska proliferativ under en viss kultur tillstånd, vilket resulterar i opålitliga utfall och avgörande begränsningar i prekliniska drog utveckling.
Utan att vara odlade i vitro, har patientderiverade tumör xenograft (PDXs) också genererats genom implantering i djurmodeller av mänskliga CRC vävnader kirurgiskt dissekeras från patienter2,3,4. PDXs är allmänt erkänd som går igenom de viktigaste histopatologiska funktionerna och genetiska förändringar finns ursprungligen i tumörer av patienterna från vilken de härrör. Dessutom består patientderiverade tumör organoids av tumör cell kluster fastställdes genom kultur 3D villkor som nära härmade biologiska egenskaper för den ursprungliga tumörer5,6. Dessa tumör organoids tillämpades även på hög genomströmning drogkontroll, vilket gör att anpassade behandlingar vara utformade5. Dock markant heterogena CRC populationer antas vara närvarande inom en tumör massa. Viss CRC populationer kan selektivt föröka sig och expandera under in vivo och in vitro- serien av passager av PDX och tumör organoids, respektive. Detta kan också den övergripande gen uttryck profiler och epi/genetiska status för drabbade CRC ändra, vilket resulterar i minimal likhet med föräldrarnas CRC.
Patientderiverade CRC organoids och de extraherade från noncancerous mänskliga colon konstruerad till hamnen kombinationer av onkogena mutationer har också använts för att undersöka kännetecken för mänskliga tumörceller som exemplifieras av tumör invasionen och metastas 6,7,8,9. Dock har den mycket låga förekomsten av spontana metastaser uppkommer ortotop implantation av patientderiverade CRC i nedsatt immunförsvar möss, gjort det svårt att studera utgångsämnet processen i invasion-metastaser kaskad som inkluderar lokala invasion, intravasation, transport i blodomloppet, extravasering och koloniseringen av avlägsna organ4,10. Micrometastasis som representeras av tumör cell nedfall av ≤2 mm, bildas av patientderiverade CRC organoids, har ofta förbisetts på histopatologisk analys av sektioner från påverkade avlägsna organ i experimentell musmodeller. Visualisering av spontana micrometastases har också varit minimal i vivo på grund av svårigheten att effektivt införa fluorescerande markörer i tumörceller organoid före deras injektion i mottagarens möss. I denna studie utvecklade vi ett protokoll att effektivt transduce GFP lentivirus i PDX-derived CRC organoid celler i 3D kultur före injektion i mottagarens möss och tillåta mycket känslig detektion, anställa stereo-fluorescensmikroskopi, av deras koloniseringen av olika organ till formuläret micrometastases.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Patienten gett skriftligt informerat samtycke och projektet har godkänts av en forskningsetisk kommitté av Juntendo universitet fakulteten. De mus experiment godkändes också av de djur forskningsetisk kommitté av den Juntendo medicinska fakulteten.
1. inrättande av CRC PDXs i nedsatt immunförsvar möss
Experimentella rutiner för fastställande av CRC PDXs (steg 1) beskrivs i figur 1A.
- Förbereda den primära CRC vävnaden omedelbart efter kirurgisk resektion av tumören från patienten.
- Tvätta den primära CRC vävnaden vaggning flera gånger i 30 mL av iskall sterila fosfat buffrad saltlösning (PBS) i en 50 mL konisk tub och hålla det på is.
- Placera vävnaden på en 10 cm petriskål med steril pincett, ta bort de nekrotiska områdena så stor utsträckning som möjligt med hjälp av steril sax och klippa solid tumör vävnader små bitar (5 x 5 x 5 mm3 i storlek) med sterila rakblad.
Obs: Nekrotiska områden är ofta vitare, mjukare och mer luckert än de omgivande områdena. - Placera små bitar av tumören med hjälp av steril pincett i 2 mL iskallt steril fosfatbuffrad Koksaltlösning på en 6-bra platta.
- Föder upp 6 veckor gamla nicka/Shi-scid IL2Rγ null (NOG) starkt nedsatt immunförsvar möss villkor germ–gratis och specifik patogen–gratis.
- Söva möss med isofluran inandning med hjälp av små djur inandning anestesi enheten och desinfektera huden med 70% etanol. Säkerställa normal takt och djup andning och avsaknad av en tå nypa reflex för korrekt anesthetization. Vet salva på ögonen är ett alternativ, att förhindra okulär dryness medan under narkos.
- Sterilisera alla kirurgiska verktyg med torr värme sterilisering och sedan använda dessa verktyg för alla förfaranden för att förhindra sårinfektioner i mottagarens möss.
- Placera den sövda mus i en utsatt position på bänken laboratorium. Göra ett litet snitt på de nedre delarna av höger och vänster flanken av mottagarens musen att generera subkutan fickor för vävnad implantation med steril sax. Se till att inte punktera peritoneal membran. Det bör finnas lite blödning med detta förfarande.
- Försiktigt doppa ovan beredda tumör fragment till 50 µL av konstgjorda extracellulär matrix och sedan implantat dem in i de nedre delarna av höger och vänster subkutan fickorna.
- Sutur snittet med såret klipp i möss som genomgår kirurgiska ingrepp. Kontrollera att de implanterade tumörvävnad är placerade på ett visst avstånd från snittet under huden.
Obs: I enlighet med att minimera kirurgiska ingrepp, gavs inga behandlingar för postoperativ smärta och infektion i denna studie. - Placera musen på en varm pad och upprätthålla sternala recumbent position tills tillräckligt medvetande återställs. När fullt återställd och kunna sitta på alla fyra ben, kan mössen återlämnas till sina hem burar. För att undvika predation, låt inte avel med icke manövrerade djur i samma bur.
- Kontrollera om suturen läckage och bekräfta att möss är i stabilt tillstånd nästa dag i kirurgiskt behandlade gruppen. Kontrollera möss för tecken på sjukdom och mäta storleken på tumören i varje mus, en gång i veckan, anställa bromsok.
2. dissekering av CRC PDXs från möss
Experimentella rutiner för dissekering av CRC PDXs (steg 2) sammanfattas i figur 1B.
- Kan tumören växa subkutant till ~ 1 cm3 i storlek, som vanligtvis tar ca 1 – 3 månader.
- Söva musen med isofluran inandning med hjälp av små djur inandning anestesi enheten och desinfektera huden med 70% etanol.
- Placera musen i en utsatt position på bänken laboratorium. Incisionsfilm huden, utsätta tumören och lossa försiktigt huden från tumören med steril sax. Efter avlägsnande av tumören, placera den på en 10 cm petriskål och ta bort eventuella grovt nekrotisk regioner från tumören, skölj sedan två gånger med 5 mL PBS.
Obs: Nekrotiska områden är ofta vitare, mjukare och mer luckert än de omgivande områdena. -
Placera tumören på is och dela det lika i minst 4 delar för olika applikationer inklusive (1) den CRC organoid kulturen, 2) transplantation till sekundära möss, 3) Histologisk undersökning och 4) frysning och lagring av tumör fragment.
- För generationen av den CRC organoids, placera fast tumörvävnad på en 6 cm petriskål innehållande 1 mL steril fosfatbuffrad Koksaltlösning. Hålla vävnaden på is tills bearbetning (steg 3).
- För att etablera PDX modellen för mänskliga CRC, passagen den färska CRC-PDXs in en sekundär musen. Tumörvävnad, skuren i små bitar (5 x 5 x 5 mm3 i storlek) med sterila rakblad och försiktigt doppa dessa vävnad fragment i 50 µL av konstgjorda extracellulärmatrix. Sedan implantatet dessa fragment i de nedre delarna av höger och vänster subkutan fickorna NOG musen, som beskrivs i steg 1,8 – 1.11.
- För histologisk analys, fixa proverna i 5 mL 10% neutral buffrad formalin i en 15 mL koniska rör i rumstemperatur i 2 dagar.
- För frysförvaring, skär tumörvävnad i små bitar (5 x 5 x 5 mm3 i storlek) och försiktigt doppa proverna i 500 µL av cell frysning lösning i 1-1,5 mL cryovial rör. Överför sedan röret till-80 ° C frys.
3. utvinning av PDXs in cellsuspensionen för CRC Organoid kulturen
Experimentella rutiner för dissociationen av CRC PDXs (steg 3) beskrivs i figur 1B.
- Plats ovan (steg 2.4.1) beredd tumören fragment på en 10 cm petriskål.
- Finhacka de fragment som använder sterila rakblad och överföra dem till en 15 mL koniska rör innehållande 8 mL 10% fetalt kalvserum (FCS)-Dulbeccos modifierade örnens Medium (DMEM) med 80 µL av kollagenas enzym lager (se Tabell för material).
- Stäng röret ordentligt och vira den gemensamma jordbrukspolitiken med parafilm att förhindra läckage. För att separera malet tumör fragment i cellsuspension, skaka den försiktigt i 2 timmar vid 37 ° C. Observera att det fortfarande kommer att finnas många fragment av osmält vävnad kvar i röret.
- Centrifugera röret vid 300 x g i 5 minuter vid 4 ° C och ta bort supernatanten. Lösa cellpelleten med 10 mL 10% FCS-DMEM att göra cellsuspension.
- För att eliminera osmält vävnad skräp, filtrera cellsuspensionen två gånger med 40 µm cell silen på en 50 mL konisk tub. Sedan Centrifugera genomströmmande vid 300 x g under 5 minuter vid 4 ° C. Avlägsna supernatanten och hålla pelleten på is.
4. generering av den CRC Organoids odlade på konstgjorda extracellulär Matrix
Experimentella rutiner för CRC organoid kulturen av de kolon PDXs (steg 4) sammanfattas i figur 1B.
- Upprätta ett odlingsmedium som är lämplig för den PDX-derived CRC organoids (se Tabell för material, ”CRC organoid odlingssubstratet”) sysselsätter media som tidigare beskrivits för mänskliga kolon organoids11.
- Tillsätt 150 µL av konstgjorda extracellulär matrix (se Tabell för material) per brunn på en 12-well platta på is och sedan Inkubera det i 30-60 min i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator stelna gelerna.
- Centrifugerade cell från steg 3.5 med CRC organoid odlingssubstratet (från steg 4.1) med 5% FCS att uppnå anpassning till 3 x 105 celler/mL. Sedan, utsäde 1 mL av medlet på den konstgjorda extracellulära matrix-belagd plattan som bereddes i steg 4,2. och inkubera över natten vid 37 ° C under 5% CO2. Använd en hemocytometer för att räkna antalet tumörceller inklusive enstaka celler och flercelliga kluster (en grupp av vidhäftande celler) i cellsuspension.
Obs: 5% FCS används för att släcka den resterande enzymaktiviteten av kollagenas i denna studie. - Samla omsorgsfullt odlingsmediet, inklusive flytande celler som har lossnat från konstgjorda extracellulära matrix-belagd plattan, i en 1,5 mL Centrifugera röret följande dag och centrifugera det 1400 x g i 5 min. Ta sedan bort supernatanten och resuspendera pelleten i 70 µL av konstgjorda extracellulär matrix på is.
- För att öka CRC cellernas viabilitet, overlay tumör cell-innehållande artificiella extracellulärmatrix på den tumör organoid celler bifogas konstgjorda extracellulära matrix-belagd plattan och inkubera i 30 min i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator att stelna den konstgjorda extracellulärmatrix beläggningen. Sedan, inkubera det med 1 mL av den CRC organoid cellodlingsmedium med 1% FCS vid 37 ° C under 5% CO2.
- Ändra odlingssubstratet varannan dag. Som de CRC organoids fylla medium, kan det bli nödvändigt att ändra mediet dagligen.
5. generation och anrikning av GFP Lentiviral partiklar
Experimentella rutiner för generation och anrikning av GFP lentiviral partiklar (steg 5) beskrivs i figur 1 c.
- Kultur HEK293T celler med Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium innehållande 10% FCS och förbereda sex 10 cm rätter (2 x 106 celler per maträtt) för följande transfection förfarandet.
- För transfection per maträtt, förbereda 500 µL av blandningen inklusive 20 µL av transfection reagens i DMEM med PRRL-GFP vektor (5 µg)12 och två lentiviral förpackning plasmider, såsom pCMV-VSV-G (1 µg) och pCMV-dR8.2 dvpr (5 µg), i en steril 1,5 mL mikrorör. Förvara blandningen i rumstemperatur i 20 min och sedan täcka över den på varje av de 10-cm rätterna och inkubera dem 18 h.
- Ta bort mediet, tillsätt 5 mL av färsk 10% FCS-RPMI 1640 medium till varje maträtt och låt stå i 24 timmar.
- Samla det luftkonditionerade mediet från varje maträtt i en 50 mL centrifugrör och lagra totalt 30 mL mediet vid 4 ° C över natten. Tillsätt 5 mL av den färska RPMI 1640 på varje maträtt och låt stå i 24 timmar.
- Samla in luftkonditionerade mediet från varje maträtt i en 50 mL centrifugrör och hålla, i totalt 30 mL medium på is. Sedan, kasta cellerna.
- Filtrera 60 mL av medium (från steg 5,4 – 5.5) genom ett 0,45 µm filter bort cellerna och dela denna kvantitet i tolv 5 mL polypropylen centrifugrör för ultracentrifugering.
- För att koncentrera virus, Centrifugera dem med en svängig hink rotor (se Tabell för material) vid 85,327 x g i 1,5 h vid 4 ° C.
- Omedelbart ta bort medlet. Att lösa den koncentrera virus pelleten, placera 250 µL av näringsämne Hams blandning F-12 (F12) / DMEM medium utan FCS i varje av de tolv rör och bibehålla den vid 4 ° C över natten. Observera att viruset pellet är ofta osynlig.
- Pipettera försiktigt mediet för att samla in 3 mL koncentrerad 5 x GFP lentivirus beståndet, totalt, förmodligen inklusive GFP lentiviral partiklar med 108 transducing enheter per mL (TU/mL). Sedan, lagra de tolv 1,5 mL mikrorör (inklusive 250 µL per rör) under sterila förhållanden vid-80 ° C i upp till ett år. Laga många små delprover av den ursprungliga lösningen att undvika flera frysa–tö cykler.
6. märkning av CRC Organoid celler med GFP Lentiviral partiklar odlade på konstgjorda extracellulär Matrix
Experimentella rutiner för märkning CRC organoid cellerna med GFP lentivirus (steg 6) beskrivs i figur 1 c.
- Låt den CRC organoids bereddes i steg 4,6 att växa utan inblandning i 7 – 10 dagar och skörda dem mekaniskt med en steril cell skrapa och sedan överföra dem i en 1,5 mL mikrorör.
Obs: Tillväxten av CRC organoids i kulturen beror på arten av de ursprungliga tumörerna från patienter. Undvika överväxt av den CRC organoids, genom att bibehålla dem på 60 – 70% confluence tidigare att överföra i förhållandet 1:2 split på nya konstgjorda extracellulära matrix-belagd 12-väl plåt. - Centrifugera i mikrorör för 3 min vid 1400 x g, ta bort odlingsmediet och lösa cellpelleten i 500 µL av PBS av mild avlyssning.
- Centrifugera i mikrorör för 3 min vid 1400 x g och eliminera PBS.
- För att separera den vidhäftande CRC-organoids, tillsätt 500 µL av en cell avlossning lösning av proteolytiska och collagenolytic enzymer till cellen pellet i röret och blanda det genom skonsam avlyssning. Sedan lämna rören för att nöja sig med 10 min i rumstemperatur.
- Mycket försiktigt Pipettera cellsuspension med en ytterligare 500 µL av 1% FCS-DMEM flera gånger i en 1,5 mL mikrorör till ungefär separera celler. Generation av enstaka celler från den CRC organoids av hårda pipettering minskar påtagligt cellernas viabilitet. Därför är det viktigt att lämna massa celler synliga i cellsuspension av mycket försiktigt pipett i ett 1,5 mL mikrorör.
- Centrifugera cellsuspensionen i 3 min vid 1400 x g och avlägsna supernatanten.
- Lösa cellpelleten med en blandning av de 100 µL av 5 x GFP lentivirus lager (> 108 TU/mL) och 400 µL av CRC organoid odlingssubstratet i en 1,5 mL mikrorör genom skonsam att trycka att anpassa sig till en koncentration av 5 x 105 dissocierade tumörceller per 500 µL . Använd en hemocytometer för att räkna antalet tumörceller, inklusive enstaka celler och grupper av celler i cellsuspension, som beskrivits ovan (steg 4,3).
- Förbereda en konstgjord extracellulära matrix-belagd 12-well platta, som beskrivs i steg 4,2. Sedan placera 500 µL cellsuspension bereddes i steg 6,7 på plattan och lämna den för 18 h vid 37 ° C under 5% CO2.
- Samla in mediet med flytande cellerna lossnat från konstgjorda extracellulära matrix-belagd plattan i ett 1,5 mL centrifugering rör. Centrifugera det 1400 x g och sedan avlägsna supernatanten och resuspendera pelleten i 70 µL av konstgjorda extracellulär matrix på is.
- För att öka CRC cellernas viabilitet, överlagra tumör cell-innehållande artificiella extracellulärmatrix på den tumör organoids bifogas konstgjorda extracellulära matrix-belagd 12-väl plattan, som beskrivs i steg 4,5. Nästa, inkubera plattan för 30 min i en 37 ° C, 5% CO2 incubator att stelna konstgjorda extracellulärmatrix beläggning och sedan kultur det med 1 mL CRC organoid odlingssubstrat med 1% FCS vid 37 ° C under 5% CO2.
- Iaktta cellerna på 3 dagar efter infektion i fluorescens Mikroskop till bekräfta nästan 100% god Jordbrukarsed positivitet på grund av användning av en hög titer av lentiviral partiklar (se figur 2A).
- Kultur den CRC organoids för perioder av 7 – 10 dagar att expandera celltillväxt före injektion i mottagarens möss.
7. generation av metastaser av GFP-märkta CRC Organoids i mottagarens möss
Experimentella rutiner för generering av metastaser använder den GFP-märkta CRC organoids (steg 7) beskrivs i figur 1 c.
- För att separera den GFP-märkta CRC organoids in cellsuspension, skörda dem mekaniskt med en steril cell skrapa och överföra dem i en 1,5 mL mikrorör, som beskrivits ovan (steg 6.1).
- Centrifugera i mikrorör för 3 min vid 1400 x g, ta bort odlingsmediet och lösa cellpelleten i 500 µL av PBS av mild avlyssning.
- Centrifugera i mikrorör för 3 min vid 1400 x g och eliminera PBS.
- Overlay 500 µL av cell avlossning lösningen på cellpelleten i röret och blanda genom skonsam att trycka. Sedan lämna den blandningen stå i 10 min i rumstemperatur att enzymatiskt sära den vidhäftande CRC-organoids, som beskrivs ovan (steg 6,4).
- Mycket försiktigt Pipettera cellsuspension med en ytterligare 500 µL av 1% FCS-DMEM flera gånger i en 1,5 mL mikrorör till ungefär dissociera cellerna, som beskrivits ovan (steg 6,5). Generation av enstaka celler från den CRC organoids av hårda pipettering minskar påtagligt cellernas viabilitet. Alltså, lämna massa celler synliga i cellsuspension av mycket försiktigt pipett i ett 1,5 mL mikrorör.
- Centrifugera cellsuspensionen i 3 min vid 1400 x g och avlägsna supernatanten.
-
Upprätta en spontan metastaser musmodell av CRC PDXs:
- Förbered en cellsuspension inklusive 5 x 105 celler i 50 µL av PBS med 50% konstgjorda extracellulärmatrix per mus. Behålla punktskatteuppskovet på is före användning. Använd en hemocytometer för inventering av cancerceller, som anges i steg 4,3.
- Söva en mus med isofluran inandning med hjälp av små djur inandning anestesi enheten och desinfektera huden med 70% etanol, som anges i steg 1,6.
- Plats NOG musen i ryggläge på bänken laboratorium. Greppa rektal slemhinnan med steril pincett och dra försiktigt ut det ur anus. Sedan, genast injicera cellsuspensionen bereddes i steg 7.7.1 till rektal submucosa av musen med en spruta (nål storlek: 22 G). Rutinmässigt, används 4 – 6 möss per grupp för att utvärdera resultaten.
-
Upprätta en experimentell metastaser modell av CRC PDXs:
- Förbered en CRC organoid cellsuspension inklusive 4 x 104 celler i 50 µL av PBS per mus. Behålla punktskatteuppskovet på is före användning. Använd en hemocytometer för inventering cancerceller (steg 4,3).
- Söva en mus med isofluran inandning med hjälp av små djur inandning anestesi enheten och desinfektera huden med 70% etanol, som anges i steg 1,6.
- Placera sövda NOG musen i en utsatt position på bänken laboratorium. Göra ett litet snitt på den nedre delen av den vänstra flanken och sedan klippa bukhinnan att noggrant utsätta mjälte med steril sax och pincett. Grepp som fettvävnad bifogas mjälte med steril pincett, injicera sedan långsamt 50 µL cellsuspension (beredd enligt ovan, steg 8,1) i mjälten. Vara säker på att cellsuspensionen injiceras korrekt utan yttre läckage, från mjälten. Rutinmässigt, används 4 möss per grupp för att utvärdera resultaten.
- Placera alla möss på en varm pad efter operation och underhåll i en sternala recumbent position tills tillräckligt medvetande återställs, som beskrivs i steg 1.11. När mössen har återhämtat sig helt, återföra dem till deras hem burar. För att undvika predation, låt inte avel med icke manövrerade djur i samma bur.
- Kontrollera för suturen läckage och bekräfta att möss är levande, i kirurgiskt behandlade gruppen, nästa dag. Kontrollera möss för tecken på sjukdom och mäta tumör storlekar, anställa bromsok, i alla möss en gång i veckan.
- Iaktta möss att upptäcka spontana metastaser (för perioder på upp till 2,5 månader) och experimentella metastaser (1 månad) efter injektion.
- Offra möss via anestesi och cervikal dislokation på de angivna dagarna. Dissekera primära tumörer och olika vävnader inklusive lever och lungor. Placera dissekerade tumörer och organ i 5 mL iskallt PBS på en 10 cm petriskål och lagra dem på isen.
- För att upptäcka GFP-positiv CRC organoid celler, iaktta dissekerade vävnader i stereo-fluorescens Mikroskop. Hämta bilder med en CCD-kamera och förbereda med standard bildbehandling programvara.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En Primär kolorektal adenokarcinom diagnostiserades som måttligt differentierade hade varit kirurgiskt resected från en 76 år gammal kvinna med TNM-klassifikationen, steg IIIa, följt av postoperativ kemoterapi. Den primära CRC celler immunohistochemically färgade positivt för carcinoembryonalt antigen, Ki-67, pan-cytokeratin och E-cadherin. Bitar av opererande tumören var också subkutant implanteras i NOG möss att generera kolon PDX modellen. CRC organoid celler extraherades sedan för vävnadsodling från den kolon PDX som hade framkallat subkutant i dessa möss. De CRC organoids kunde konsekvent bildar flercelliga kluster under en serie av passager på konstgjorda extracellulärmatrix. Som tumör organoids histologiskt och genetiskt återspegla arten av primära tumörer från patienter5,6, försökte vi utveckla en musmodell som skulle tillåta i vivo upptäckt av CRC organoid celler med hög känslighet under metastatisk spridning. För att uppnå detta mål, var CRC organoids infekterade med GFP lentivirus, vilket resulterar i nästan alla organoids visar mycket ljusa GFP (figur 2A). Dessa organoids var sedan injiceras orthotopically och intrasplenically i sekundära NOG möss innan upptäckt av GFP-positiva celler i avlägsna organ i fluorescens Mikroskop. Vi observerade bildandet av GFP-positiv primära tumörer på webbplatsen ortotop i alla fyra möss undersökte (figur 2B, vänster). Dessutom hittades mikroskopiska metastaser i lungorna av tre av fyra möss undersökte 2,5 månader efter ortotop injektioner (figur 2B, i mitten). Dessutom observerades levermetastaser svar på intrasplenic injektion i alla fyra möss undersökas vid 1 månad efter injektionerna (figur 2B, höger).
Sammantaget tyder dessa fynd på att högupplösta GFP fluorescens på PDX-derived CRC organoid celler tillåter deras upptäckt i både spontan micrometastases och de som framkallas experimentellt, i avlägsna organ, när införs i mottagaren möss. Hög känslighet identifiering i sprida PDX-derived CRC organoids i vivo erbjuder också en mångsidig modell inte bara för att studera biologi tumör metastaser, men också för att utveckla riktade behandlingar i prekliniska miljö.
Figur 1: Schematisk bild av generation av metastaser av den PDX-derived CRC organoids märkt med GFP lentivirus i NOG möss. (A) implantering av små bitar av CRC vävnad subkutant i NOG möss (steg 1). CRC vävnaden kirurgiskt dissekeras från patienten var skuren i bitar och implanteras subkutant i NOG möss. s.c.: subkutan implantation. (B) Generation av CRC organoids skiljas från PDXs (steg 2 – 4). De utvecklade CRC xenograft var malet (steg 2) och överföras till en 15 mL tub som innehåller odlingssubstratet inklusive kollagenas (steg 3). Efter inkubation med långsam agitation var CRC cellsuspension filtrerade (steg 3). Sedan var organoid cellsuspensionen i CRC organoid medium seedade på en konstgjord extracellulära matrix-belagd plattan och inkuberas över natten i en CO2 inkubator (steg 4). CRC organoid cellerna bifogas konstgjorda extracellulärmatrix var också belagda med ytterligare konstgjord extracellulära matrix och inkuberas i en CO2 inkubator (steg 4). s.c.: subkutan implantation. (C) Generation av CRC organoids sensorik av GFP lentiviral partiklar före anställa injektion i mottagarens möss (steg 5 – 7). GFP lentiviral partiklarna genererades på en hög titer (steg 5). De PDX-derived CRC organoids odlas på konstgjorda extracellulär matrix var direkt skördas med en cell skrapa och överföras till ett mikrorör (steg 6). Efter centrifugering var cellpelleten åter svävande i PBS. Cellsuspension var centrifugeras och cellpelleten var separerade. Sedan, den CRC organoid cellsuspensionen var inkuberas med GFP virus lager i CRC organoid odlingsmediet på konstgjorda extracellulära matrix-belagd plattan över natten i en CO2 inkubator (steg 6). CRC organoid cellerna bifogas konstgjorda extracellulärmatrix var belagda med ytterligare konstgjord extracellulära matrix och inkuberas i en CO2 inkubator stelnar den konstgjorda extracellulärmatrix beläggningen (steg 6). De CRC organoids odlades då för perioder av 7 – 10 dagar att expandera celltillväxt (steg 6). För att utveckla en spontan metastaser modell, var de dissocierade 5 x 105 CRC organoid celler märkta med GFP upphängd i 50 µL av PBS med 50% konstgjorda extracellulärmatrix injiceras orthotopically i NOG möss (steg 7). Generera en experimentell metastaser modell, var de 4 x 104 CRC organoid celler märkta med god Jordbrukarsed i 50 µL av PBS intrasplenically injiceras NOG möss (steg 7). o.t.: ortotop injektion, i.s.: intrasplenic injektion. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: högupplöst av GFP visualisering upptäcks i odlade GFP-märkta CRC organoids, primära tumörer och micrometastases. (A) nästan 100% av odlade CRC organoids är god Jordbrukarsed positiva. Bilderna var tagna med stereo-fluorescens Mikroskop. Skalstapeln = 250 µm. (B) GFP-positivitet i primärtumör och micrometastases i lungor och lever. Dissocierade GFP-uttryckande CRC organoid cellsuspensionen injicerades i den rektala submucosa (o.t. inj.) NOG möss. Majoriteten av tumörceller är visat sig vara positivt för god Jordbrukarsed i den primära tumören. GFP-positiva micrometastases kolonisera lungorna (indikeras av en pil) visas också. Dessutom GFP-positiva micrometastases upptäcks i levern (indikeras av en pil), när cellsuspension var intrasplenically injiceras (i.s. inj.) i möss. Skalstapeln = 500 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Även om den CRC PDX-modellen har varit allmänt anställd att studera primär tumörtillväxt, om denna modell är också tillämpliga på utreda tumör metastaser har inte ännu helt klarlagd. Spontan metastaser var också knappt detekterbara i lever och lungor av olika rapporterade kolon PDX modeller4,10. För att upptäcka micrometastases med hög känslighet, utvecklade vi ett protokoll för transducing GFP lentiviral partiklar i PDX-derived CRC organoids före sin ortotop och intravenösa injektioner i mottagarens möss. Notera kunde vi visa att den här metoden tillåter mycket känslig detektion av CRC organoid-härledda micrometastases, bildar både spontant och experimentellt, i avlägsna organ.
Kritiska steg inom protokollet omfattar att upprätthålla intakt sfäroid bildandet utan induktion av anoikis på konstgjorda extracellulärmatrix genom att försiktigt pipettering den CRC organoids under passaging serien. Beredning av hög titer lentivirus partiklar koncentrerad genom ultracentrifugering är också viktigt för att uppnå det nästan 100% god Jordbrukarsed positivitet av CRC organoids. Det rekommenderas dessutom att den GFP-märkta CRC organoids injiceras inom 10 – 14 dagar i mottagarens möss. Alltför långa perioder för expansion av den CRC organoids efter infektion kan gynna urval av svagt GFP-uttryckande organoids.
Injektion av CRC organoids till rektal submucosa NOG möss visade sin metastatisk spridning till lungorna, men inte in i levern, troligen på grund av den sämre vena cava. Generera levermetastaser spontant genom vore injektion av CRC organoids i tjocktarmen med laparotomi krävs13.
Observera att incidensen av B-cellslymfom är ibland ökat NOG nedsatt immunförsvar möss implanteras med vävnader, inklusive lymfocyter, infekterade med Epstein-Barr oncovirus, från mänskliga patienter14. Det är därför rimligt att rekommendera att om de framväxande tumörerna kommer från implanterade mänskliga CRC bestämmas genom att utföra immunhistokemi med mänskliga CRC cell märkpennor, såsom carcinoembryonalt antigen och cytokeratin 20.
När vi undersökte CRC organoids härrör från endast en patient, skulle fler prover från ett större antal patienter behöva undersökas för att generalisera våra resultat i framtiden. Om den implanterade PDX-derived CRC organoids uppvisar minimal tillväxt på webbplatsen ortotop och sällan bildar metastaser på avlägsna platser, utredare uppmuntras att överväga utvinna CRC organoids från olika patientderiverade PDXs.
Mycket känslig detektion av GFP-märkta micrometastasis uppnås med denna metod uppmuntrar oss inte bara att ytterligare undersöka flera olösta biologiska frågor angående övergången av micrometastasis till macrometastasis, bildandet av den stromal nisch för metastaserande colonization och förvärvet av läkemedelsresistens, men också att utvärdera efficacies av novel anti-cancer läkemedel genom att använda PDX-bärande djur som prekliniska modeller.
GFP-baserade FACS-sortering av levande CRC organoids extraheras från primära och avlägsna platser har också potential att tillåta enstaka cell-baserad undersökningar av genuttryck, liksom de epigenetiska och metabolomiska profilerna, av en tumör. Sådana slutsatser kan väl leda till klarläggande av de molekylära mekanismerna bakom metastatisk spridning av den CRC organoids.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga potentiella intressekonflikter avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av den Juntendo universitet Young Investigator Award (2013, 2014 och 2015) till Y.O., gemensamma projekt tilldelningen (2013 och 2014) till K. M. och beviljar i-stöd för vetenskaplig forskning från ministeriet för utbildning, kultur, sport, vetenskap och Teknik, Japan (16K 15625 till Y. K. och 16K 15598 att M.G.). Vi är särskilt tacksamma till alla medlemmar av inst. för Coloproctological kirurgi och molekylär patologi för användbar diskussioner och teknisk support. Vi tackar också Dr Hiroyuki Konno (Hamamatsu universitet Schoolof läkemedel) och Dr. Hideki Kitajima (internationella universitet för hälsa och välfärd) för generösa teknisk vägledning i de kirurgiska ingrepp för ortotop implantering i möss och Dr. Yoshitaka Hippo (Chiba Cancer Center) för teknisk rådgivning om utför tumör organoid kulturen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NOD/Shi-scid IL2Rγ null (NOG) mice | The Central Institute for Experimental Animals,Kanagawa, Japan | Breed 6-week-old male mice under germ-free and specific pathogen-free conditions | |
| wound clips 2×10mm |
Natsume manufacturing, Japan | #C-21-S | Autoclave before use |
| Hamilton syringe needle size:22 gauge |
Tokyo Science, Japan | Disinfect with 70% alcohol and sterile PBS. | |
| 6-well plate | BMBio | #92006 | |
| 12-well plate | BMBio | #92412 | |
| 15ml conical tube | Sumitono Bakelite | MS-57150 | |
| 50ml conical tube | Sumitomo Bakelite | MS-57500 | |
| microtube | Eppendorf | #0030120086 | Autoclave before use |
| Hemocytometer | Erma | #03-202-1 | |
| 40μm cell strainer | Corning | #352340 | |
| Matrigel basement membrane matrix | Corning | #354234 | Store aliqupts at -20°C. Place on ice until use |
| Collagenase type 1 | Sigma | #C1030 | 150 mg/ml collagenase type1 in 1×PBS. Store aliqupts at -20°C for up to 1 year |
| Accutase | Innovate Cell Technologies | #5V2623A | Store at 4°C. |
| DMEM/F-12 with GlutaMAX™ | Gibco | #10565018 | Store at 4°C. Warm at 37°C before use |
| Cell banker 1plus | ZENOAQ | #628 | Store at 4°C. Use within 1 month |
| Penicillin | Gibco | #15140122 | Store at 4°C. Use within 1 month |
| Streptomycin | Gibco | #15140122 | Store at 4°C. Use within 1 month |
| hEGF | PEPROTECH | #AF-100-15 | Store at -20°C. Add to medium on same day as use |
| Y27632, a ROCK inhibitor | Wako | #253-00591 | Store at -20°C. Add to medium on same day as use |
| Culture medium | Gibco | DMEM/F-12 with GlutaMAX™ supplement supplemented with 5% FBS, 100 U/ml penicillin and 100 µg/ml streptomycin. Store at 4°C. Use within 1 month. |
|
| CRC organoid culture medium with 1% or 5% FCS |
DMEM/F-12 with GlutaMAX™ supplement (Gibco #10565018) supplemented with 1% or 5% FCS, 100 U/ml penicillin, 100 µg/ml streptomycin, 2 ng/ml hEGF and 10 µM Y27632, a ROCK inhibitor. Store at 4°C. Use within 1 month. |
||
| the FuGENE 6 transfection regent | Roche | 11814 443001 | |
| Minisart 0.45 µm filter | Sartorius stedim | 17598-K | |
| 5 ml polypropylene centrifuge tubes | Beckman Coulter | 326819 | |
| PRRL-GFP vector | Gift from Dr. Robert A. Weinberg | ||
| pCMV-VSV-G | Gift from Dr. Robert A. Weinberg | ||
| pCMV-dR8.2 dvpr | Gift from Dr. Robert A. Weinberg | ||
| the SW55Ti swinging bucket rotor | Beckman Coulter | ||
| a Zeiss Axioplan 2 stereo-fluorescence microscope | Zeiss |
References
- Siegel, R., Desantis, C., Jemal, A. Colorectal cancer statistics, 2014. CA Cancer J Clin. 64 (2), 104-117 (2014).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discov. 4 (9), 998-1013 (2014).
- Aparicio, S., Hidalgo, M., Kung, A. L. Examining the utility of patient-derived xenograft mouse models. Nat Rev Cancer. 15 (5), 311-316 (2015).
- Puig, I., et al. A personalized preclinical model to evaluate the metastatic potential of patient-derived colon cancer initiating cells. Clin Cancer Res. 19 (24), 6787-6801 (2013).
- van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
- Fujii, M., et al. A Colorectal tumor organoid library demonstrates progressive loss of niche factor requirements during tumorigenesis. Cell Stem Cell. 18 (6), 827-838 (2016).
- Fumagalli, A., et al. Genetic dissection of colorectal cancer progression by orthotopic transplantation of engineered cancer organoids. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (12), E2357-E2364 (2017).
- O'Rourke, K. P., et al. Transplantation of engineered organoids enables rapid generation of metastatic mouse models of colorectal cancer. Nat Biotechnol. 35 (6), 577-582 (2017).
- Roper, J., et al. In vivo genome editing and organoid transplantation models of colorectal cancer and metastasis. Nat Biotechnol. 35 (6), 569-576 (2017).
- Kuo, T. H., et al. Liver colonization competence governs colon cancer metastasis. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (26), 12085-12089 (1995).
- Onuma, K., et al. Genetic reconstitution of tumorigenesis in primary intestinal cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (27), 11127-11132 (2013).
- Onder, T. T., et al. Loss of E-cadherin promotes metastasis via multiple downstream transcriptional pathways. Cancer Res. 68 (10), 3645-3654 (2008).
- Cespedes, M. V., et al. Orthotopic microinjection of human colon cancer cells in nude mice induces tumor foci in all clinically relevant metastatic sites. Am J Pathol. 170 (3), 1077-1085 (2007).
- Fujii, E., et al. Characterization of EBV-related lymphoproliferative lesions arising in donor lymphocytes of transplanted human tumor tissues in the NOG mouse. Exp Anim. 63 (3), 289-296 (2014).
