Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

تصنيع صفيف متعدد المكروية الخلوية اصطناعية

Published: September 7, 2018 doi: 10.3791/57377

Summary

توضح هذه المقالة منهجية مفصلة لإعداد مجموعة متعدد المكروية خلوية اصطناعية (ماكمي) عن التلاعب الفائق الفيزيائية والكيميائية العظة محاكاة في فيفو ميكرونفيرونمينتس الخلوية وإلى تحديد البيئة المثلى الخلوية للخلايا الجذعية البشرية pluripotent (هبسكس) مع خلية واحدة التنميط.

Abstract

ميكرونفيرونمينتس الخلوية تتكون من مجموعة متنوعة من الرموز، مثل عوامل النمو ومصفوفات خارج الخلية والتفاعلات بين الخلايا. هذه الرموز هي مدبرة جيدا وذات أهمية حاسمة في تنظيم وظائف الخلية في نظام معيشة. على الرغم من أن عددا من الباحثين حاولوا التحقيق في العلاقة بين العوامل البيئية والوظائف الخلوية المرجوة، ما زال غير معروف. هذا إلى حد كبير بسبب عدم وجود منهجية سليمة لتقليد هذه الرموز البيئية في المختبر، وفي نفس الوقت اختبار منبهات بيئية مختلفة في الخلايا. هنا، نحن تقرير منصة متكاملة من القنوات موائع جزيئية ومجموعة نانوفيبير، يليها تحليل خلية واحدة عالية-المحتوى، لبحث تعمل الخلايا الجذعية التي غيرت بعوامل بيئية متميزة. وللتدليل على تطبيق هذا النظام الأساسي، تركز هذه الدراسة على تعمل ذاتيا تجديد الخلايا الجذعية البشرية pluripotent (هبسكس). نقدم هنا، إجراءات إعداد مصفوفة نانوفيبير وهيكل موائع جزيئية في تلفيق صفيف متعدد المكروية الخلوية الاصطناعية (ماكمي). وعلاوة على ذلك، يتم وصف الخطوات الإجمالية من خلية واحدة التنميط، خلية تلطيخ مع عدة علامات مضيئة ومتعددة الأسفار التصوير، والتحليلات الإحصائية،.

Introduction

البشرية pluripotent الخلايا الجذعية (هبسكس)1،2 الذاتي تجديد غير محدود، وتفرق في مختلف الأنسجة الأنساب، التي يمكن أن تحدث ثورة في تطوير الأدوية والعلاجات المستندة إلى الخلية، وهندسة الأنسجة والطب التجديدي 3 , 4 , 5 , 6-أطباق الثقافة العامة ولوحات ميكروتيتير، ومع ذلك، ليست مصممة لتمكين التلاعب الخلية الجسدية والكيميائية الدقيقة على المستوى الخلوي مع طائفة من نانو إلى الصغرى-متر، وعامل حاسم لتوسيع الخلوية، التجديد الذاتي، والتمايز. ولمعالجة هذا العيب، حققت الدراسات أدوار ميكرونفيرونمينتس الخلوية في تنظيم قرارات مصير الخلية و وظائف الخلية4. في السنوات الأخيرة، أجريت عددا متزايداً من الدراسات لإعادة بناء ميكرونفيرونمينتس الخلوية في المختبر7،8. وقد أنشأت عمليات تصنيع نانو والصغرى هذه ميكرونفيرونمينتس من خلال التلاعب بالمواد الكيميائية9،10،11،،من1213، 14،15،،من1617 و المادية18،،من1920 العظة البيئية. وحتى الآن، لم ترد تقارير التحقيق بصورة منهجية الآليات الكامنة لمنبهات البيئية الكيميائية والفيزيائية في الخلية-مصير القرارات والمهام داخل منصة واحدة.

وهنا، نقدم استراتيجية تقوم على أساس مبادئ تصميم بسيط إنشاء منصة فحص قوية (الشكل 1). أولاً، يمكننا وصف الإجراء تطوير منهاج عمل موحد لإنشاء ميكرونفيرونمينتس الخلوية تنوعاً، الاصطناعية باستخدام مصفوفة نانوفيبير وبنية موائع جزيئية: صفيف متعدد اصطناعية الخلوية المكروية (ماكمي) (الشكل 1ألف و 2 ألف). يحتوي الصفيف نانوفيبير 12 ميكرونفيرونمينتس مختلفة في تركيبات مختلفة من المواد نانوفيبير والكثافة. واستخدمت اليكتروسبينينج لاختلاق النانو. المواد نانوفيبير، مثل البوليستيرين (PS)21، بوليميثيلجلوتاريميدي (بمجي)22و23من الجيلاتين (GT)، صممت لاختبار خواصها الكيميائية، التي قد تؤثر على التصاق الخلايا والحفاظ على بلوريبوتينسي ( الشكل 2ب). كانت تتفاوت كثافة نانوفيبير بتغيير الوقت اليكتروسبينينج وتم تعريف النانو التي تم إنشاؤها وفقا لهذه الكثافة (الفلبينية، مع د = إكسلوو/منخفض/منتصف/عالي). يتكون هيكل موائع جزيئية من بولي دايمثيل سيلوكسان (PDMS) إيواء 48 خلية ثقافة الدوائر، والذي يمكن وضعه على طول قياسي أبعاد ميكروسكوبية 96-جيدا. PDMS بوليمر متوافق حيويا وتبديل الغاز تستخدم عموما لاختلاق أجهزة موائع جزيئية24. كل قناة موائع جزيئية قد صمم ليكون 700 مكم واسعة و 8.4 ملم بوقت طويل وكان مداخل اثنين في الحواف (الجدول 1). الدوائر بارتفاعات مختلفة (250، 500، و 1000 ميكرومتر) للتلاعب الأولية البذر خلية الكثافة (0.3 و 0.6 1.2 × 105 خلايا/سم2)، التي قد ترتبط بالبقاء على قيد الحياة، والانتشار، والتفريق بين هبسكس25 (الشكل 2-ج). عدد الخلايا في المصنف إلى غرفة تتناسب مع كثافة العمود فوق أرضية الغرفة، وهكذا الخلية الأولى بذر الكثافة كان يسيطر عليها إدخال تعليق الخلية نفسها في دوائر الثقافة مع ارتفاعات مختلفة. جميع قنوات مصممة لتكون ≥ 250 ميكرون عالية26 التقليل من آثار التوتر المنخفض الأكسجين27 وإجهاد القص28 في الخلايا. يتم اختصار قناة آفاق من 250 و 500 و 1000 ميكرومتر هنا ك XCD مع X = منخفض، منتصف، وعالية، على التوالي. تم تقصير في البيئات مع كثافة نانوفيبير متميزة وكثافة البذر الخلية الأولى ك "الكثافة density_Cell Material_NF" (مثلاً، GT_HighNF_HighCD: بيئة تتسم بالكثافة GT النانو وخلية أولية عالية-البذر الكثافة).

وفي وقت لاحق، نحن تصف كيفية إجراء تحليلات خلية واحدة التحقيق بصورة منتظمة في سلوك الخلية استجابة للعوامل البيئية (الشكل 1ب). كإثبات لمفهوم، حددنا البيئة الخلوية الأمثل لتجديد هبسك المتمتعة بالحكم الذاتي، ومهمة رئيسية ل صيانة (الشكل 1ب) هبسك29. الخلوي المستندة إلى الصور، متبوعاً بالتحليلات الإحصائية، يسمح للتفسير الكمي الفردية الاستجابات المظهرية الخلوية للبيئات الخلوية. من بين مجموعة متنوعة من الوظائف الخلوية، تقدم هذه الورقة إجراء مفصل تحديد الشروط المثلى للحفاظ على هبسك الذاتي تجديد.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-تلفيق الصفيف ماكمي

ملاحظة: يتم سرد جميع المواد والمعدات في "الجدول المواد".

  1. إعداد أقنعة لمجموعة نانوفيبير والعفن لهيكل موائع جزيئية
    1. إنشاء صور ثلاثية الأبعاد (3D) للاقنعة المستخدمة للمصفوفات نانوفيبير وقوالب لهياكل موائع جزيئية باستخدام حزم برامج الرسومات 3D الكمبيوتر (الجدول 1).
      ملاحظة: قراءة الصور الثلاثية الأبعاد وطباعته باستخدام طابعة ثلاثية الأبعاد. وقد أقنعة المطبوعة والعفن نفس الأبعاد مع الصور الثلاثية الأبعاد المحددة باستخدام برامج الرسومات في خطوة 1.1.1.
    2. طباعة أقنعة والعفن بناء على هذه التصاميم باستخدام طابعة 3D.
      ملاحظة: في هذا البروتوكول، وكان طابعة حبر نفاثة تشبه 3D مع الراتنج الأشعة فوق البنفسجية المستخدمة30. دقة الطابعة هي 635 × 400 نقطة في البوصة و 15 ميكرون في X، Y و Z، على التوالي، ومع ذلك، X الفعلية، القرار Y كان تقريبا أقل بأربع مرات.
  2. نانوفيبير-صفيف الإعداد (3 الشكلA)
    1. إعداد حلول البوليمر اليكتروسبينينج.
      1. تمييع السائل بمجي 13% مع رباعي هيدرو الفوران بنسبة 9% (w/v)22.
      2. حل ز 0.08 من PS (عدد متوسط الوزن الجزيئي (بالمليون): 130,000) في21من THF:dimethylformamide (نسبة حجم 1:1)، وإضافة THF:dimethylformamide تحقيق حجم ما يصل إلى 1 مل النهائي (8% (w/v) ملاحظة: الحل).
      3. حل 0.1 غرام من جي تي في المياه: حمض الخليك: إيثيل اسيتات (نسبة حجم 1:1.6:2.1)، وإضافة المياه: حمض الخليك: إيثيل اسيتات لتحقيق حجم ما يصل إلى 1 مل النهائي (10% (w/v) GT الحل) كوصف23،31.
    2. استخدام ماغي اﻷخرق آلة، بإيداع طبقة رقيقة من البلاتين بسمك 5-شمال البحر الأبيض المتوسط على البوليستيرين (PS) اللوح الأساس (127.7 × 85.5 ملم)، الذي يعمل بوصفه كاثود في الإعداد اليكتروسبينينج.
    3. تحميل كل حل البوليمر في محقن 5 مل مزودة بإبرة حادة 23-ز الفولاذ المقاوم للصدأ.
    4. والربط حقنه بالإبرة في مضخة المحاقن مع 12-سم إلى جانب جامع للجهاز اليكتروسبينينج.
    5. الاتصال إبرة حقنه لإمدادات طاقة عالية الجهد، ومجموعة لتطبيقها على 11 كيلوفولت.
    6. تعيين معدل الضخ 0.2 مل/ساعة.
    7. الحفاظ على درجة الحرارة والرطوبة في 30 درجة مئوية و < 30% (v/v).
    8. وضع القناع على اللوح الأساس إعدادها في الخطوة 1.2.2.
    9. اختﻻق النانو على اللوح الأساس من خلال الثقوب للقناع بكثافات مختلفة عن طريق تغيير الوقت اليكتروسبينينج (مثلاً، 20، 60 و 90 و 180 s).
    10. إزالة القناع من اللوح الأساس.
      ملاحظة. يمكن رش الإيثانول في النانو GT اليكتروسبون قبل إزالة القناع لتجنب تقشير قبالة النانو GT جنبا إلى جنب مع القناع.
    11. كرر الخطوة 1.2.4-1.2.10 حتى انتهاء تصنيع نانوفيبير--الصفيف.
    12. ضع الصفيف nanofiber في مجفف عند 25 درجة مئوية ح 16 تتبخر المذيبات المتبقية.
    13. GT التشعب النانو مع 0.2 M 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) كاربودييميدي هيدروكلوريد (تنمية الصادرات) و 0.2 م ن-هيدروكسيسوكسينيميدي (NHS) في الإيثانول عند 25 درجة مئوية ل 4 ح23.
    14. شطف النانو GT مرتين مع الإيثانول 99.5% (v/v) والفراغ-جاف عند 25 درجة مئوية ح 16.
  3. تصنيع هياكل موائع جزيئية (الشكل 3ب)
    1. مزيج ز 2 لعلاج عامل و 20 غراما من قاعدة PDMS PDMS (01:10 الوزن نسبة؛ بريبدمس). 24
    2. صب الخليط قبل PDMS على العفن ملفقة في الخطوة 1.2.
    3. إزالة الغاز المخلوط قبل PDMS في مجفف لمدة 30 دقيقة.
    4. علاج PDMS قبل الخليط في فرن عند 65 درجة مئوية ح 16.
  4. صفائف "الجمعية ماكمي" (الشكل 3ب)
    1. تقشر الهيكل PDMS الشفاء في خطوة 1.3.4 من العفن ونظيفة مع الإيثانول 70% (v/v).
    2. علاج الغلاف الجوي كورونا التصريف في الجانب السفلي من الهيكل PDMS32.
      ملاحظة: في هذا البروتوكول، تبرأ الإكليل على كامل سطح الطبقة 3 أو 4 مرات مع جهاز تفريغ كورونا "مفيد". استعيض عن الأكسجين البلازما العلاج مع الغلاف الجوي كورونا التفريغ لتغيير أدهيسيفينيس السطحية.
    3. تجميع الهيكل PDMS مع مجموعة نانوفيبير بسرعة.
    4. فرن-خبز عند 65 درجة مئوية لمدة يومين.

2-تحميل هيسكس في "صفيف ماكمي"

  1. للثقافة الروتينية H9 البشرية الخلايا الجذعية الجنينية (هيسكس)، والحفاظ على خلايا خالية من كرة كيميائيا تعريف الثقافة المتوسطة هبسك صيانة33 تستكمل مع 10 ميكرون روك Y-27632 المانع34 (المسمى هبسك المتوسطة) في ثقافة خلية 35 ملم طبق مغلف بغشاء الطابق السفلي جل مصفوفة (MG).
  2. مرور خلايا كل 4 إلى 7 أيام باستخدام حوزتي مثل التربسين المؤتلف.
  3. تعقيم مجموعة ماكمي مع الإيثانول 99.5%، قبل التحميل إلى الدوائر لمدة 10 دقائق، ثم قم بإزالة في الإيثانول. كرر هذه الخطوة 3 مرات.
  4. إدخال ميليلتر 12 ملغ، 10 ميكروغرام/مل فيترونيكتين (VN)، و 0.1% (w/v) جي تي في مراقبة الثقافة الدوائر، واحتضان الدوائر في 37 درجة مئوية ح 1 معطف لهم على السطوح غرفة.
    ملاحظة: في هذا البروتوكول، اختيرت ملغ، VN، و GT كمرجع بروتينات التصاق الخلايا والثقافة. سبب ملغ و VN المصفوفات زراعة الخلايا القياسية المستخدمة للحفاظ على هبسك الذاتي تجديد، أنها تستخدم كعناصر إيجابية؛ طلاء GT ثنائي الأبعاد (2DGT) أو غير طلاء (NC) استخدمت كعناصر سلبية.
  5. إدخال هبسك قبل حرارة متوسطة في جميع الدوائر من الصفيف ماكمي. احتضان الدوائر لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  6. أغسل H9 هيس مثقف على طبق 35 ملم مع دببس، إضافة 0.5 مل من حوزتي مثل التربسين المؤتلف إلى الطبق واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة ونضح بعناية في supernatants مختلطة بحوزتي فقط.
    ملاحظة: في خطوة طموح، لا يتم فصل الخلايا.
  7. فور إضافة هبسك المتوسطة، بلطف الاستغناء عن المتوسط ضد سطح الطبق مرارا وتكرارا فصل الخلايا ونقل الخلايا المنفصلة إلى أنبوب مخروطي 15 مل.
  8. الطرد المركزي في 200 غ س للحد الأدنى 3 Aspirate المادة طافية وتعليق الخلايا في متوسط هبسك المعالجون مسبقاً.
  9. إدخال 12 ميليلتر من تعليق خلية (1.2 × 106 خلايا مليلتر) في كل دائرة من دوائر موائع جزيئية.
    ملاحظة: إدخال الخلايا إلى غرفة واحدة من آخر باستخدام ميكروبيبيتي. نظراً لأن عدد الخلايا في المصنف إلى الدوائر تتناسب مع كثافة العمود أعلاه الكلمة الدائرة، يمكن التحكم في كثافة البذر الخلية الأولى حتى ولو استخدمت عينات من نفس الخلية تعليق. ضمان بيبيتينج ويتم ذلك برفق. إزالة الزائدة المتوسطة من الدوائر باستخدام عصا القطن ذات الرؤوس بعد التحميل. الصفيف ماكمي متوافق مع مختبر استخداماً الماصات والنظم المؤتمتة ماصة، وأنه لا يتطلب أي معدات خاصة.
  10. تغيير هبسك المتوسطة كل ح 12 والثقافة لمدة 4 أيام.
    ملاحظة: وحدات تخزين ثابتة من الوسط (1.6 و 3.2 و 6.4 ميليلتر) يتم الاحتفاظ باستخدام الدوائر ذات أحجام مختلفة. خلايا الثقافة تحت شرط ثابت لتقليل إجهاد القص باستثناء تبادل ال35،مستنبت الخلية36.

3-الكمية التنميط خلية واحدة

  1. على لوحة تلوين الخلية نيون
    ملاحظة:
    لتحليل التغيرات المظهرية الذاتي تجديد هبسكس، هذا البروتوكول المحدد علامات المظهرية الرئيسية الثلاثة لهذا البروتوكول: OCT4، 2-5-اثينيل '--ديوكسيوريديني (إيدو)، و"الخامس أنيكسين"، لقياس حالة بلوريبوتينسي، والانتشار، والمبرمج ، على التوالي (الشكل 2ب). 4 ', 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI) يستخدم لتحديد نواة الخلية. OCT4 أحد العوامل الحاسمة النسخ من بلوريبوتينسي.
    1. احتضان هيسكس H9 في صفائف ماكمي في المتوسط هبسك تكملة مع 10 ميكرون إيدو ألكاين في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    2. بعد الغسل بربط annexin المخزن المؤقت (10 ملم حبيس (درجة الحموضة 7.4)، 140 ملم كلوريد الصوديوم، 2.5 مم كاكل2)، وصمة عار الخلايا مع برتقالي الفلورسنت Annexin صبغ المتقارن الخامس في 20 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
    3. إصلاح الخلايا في برنامج تلفزيوني مع بارافورمالدهيد 4% (v/v) في 20 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ومن ثم يشطف الخلايا مع برنامج تلفزيوني مرتين.
    4. بيرميبيليزي الخلايا باستخدام برنامج تلفزيوني مع 0.3% (v/v) X-100 تريتون في 20 درجة مئوية ح 16.
      ملاحظة: بارافورمالدهيد يضعف السندات بين لوحة قاعدة بلاستيكية وهيكلا موائع جزيئية PDMS. وهكذا، يمكن أيضا إجراء مفرزة طبقة PDMS من الصفيف في خطوة 3.2.1 الحق بعد هذه الخطوة.
    5. احتضان خلايا في رد فعل على أساس تريس المخزن المؤقت مع أزيد صبغ الأحمر نيون في 20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    6. احتضان الخلايا بحجب المخزن المؤقت (برنامج تلفزيوني مع مصل الماعز العادي 5% (v/v)، المصل حمار عادي 5% (v/v)، 3% (w/v) ألبومين المصل البقري، 0.1% (v/v) توين-20، و 0.1% (w/v) ن-دوديسيل-β-د-مالتوسيدي) في 4 درجات مئوية عن ح 16.
    7. احتضان في برنامج تلفزيوني مع 0.5% (v/v) حل X-100 تريتون والبشرية جسم OCT3/4 (الماوس IgG) في 4 درجات مئوية عن ح 16.
    8. احتضان في المخزن المؤقت حظر مع الماوس المضادة مفتش (H + L) حمار المسمى صبغ أخضر-فلوري في 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.
    9. احتضان في برنامج تلفزيوني مع DAPI في 20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    10. استبدال DAPI برنامج تلفزيوني مع برنامج تلفزيوني.
    11. الحفاظ على الصفيف ماكمي عند 4 درجة مئوية لحين الحصول على الصور.
  2. التقاط صور (الرقم 4)
    1. تقشر الهيكل PDMS موائع جزيئية من الصفيف ماكمي.
    2. إزالة برنامج تلفزيوني المتبقية من الصفيف ماكمي وتطبيق والغليسيرول 90%(v/v) في برنامج تلفزيوني على الخلايا ووضع كوفيرسليبس فوق الخلايا الملون.
    3. تعيين اللوحة رأسا على مرحلة المجهر المقلوب الأسفار.
    4. الحصول على الصور الملونة 12-بت تلقائياً باستخدام كافة مكونات محركات (المرحلة والمرشحات، مصراع، وأنظمة التركيز) التي كانت تسيطر عليها مجهر برامج التصوير.
      ملاحظة. في هذا البروتوكول، ويتم ضبط مرات التعرض للوصول إلى القرب من قيم الكثافة القصوى (أعلى كثافة بكسل: 4096)، لكنها لا تشبع، لكل صورة، DAPI، OCT4، أنيكسين الخامس، وايدو.
  3. معالجة الصور الموجهة بالحاسوب والأسفار إشارة التحديد الكمي (الرقم 5)
    ملاحظة:
    هو إجراء تحليل صورة الخلية التالية استناداً إلى أسلوب تم وصفه مسبقاً37.
    1. تحويل الصور الملونة إلى تدرج الرمادي.
    2. حساب قيمة عتبة واحدة لكل صورة DAPI مع أسلوب أوتسو، وتصنيف بكسل أعلى من العتبة الأمامية وأدناه كخلفية. تأكد من تطابق القيمة المقدمة لشدة الفلورسنت DAPI.
      ملاحظة: عملية تحليل الصورة يحتوي على 5 خطوات؛ تحديد الكائنات الأولية في DAPI الصور، وتحديد الكائنات الثانوية في OCT4، أننيكسين الخامس، والصور إيدو، على التوالي، وقياس كثافة الكائن. ويوفر الشكل 3 صور واجهة المستخدم الرسومية (GUI) على الإعداد لمعالجة الصور.
    3. قياس كثافة الفلورسنت OCT4 وايدو على كل صورة.
    4. تحديد منطقة ملطخة "أننيكسين الخامس" مع أسلوب الدعوة، وقياس شدة الفلورسنت.
  4. 3.4. تحليل إحصائية لتصور فردية تعمل الخلوية في تصوير خلية واحدة
    1. تطبيع كثافات الفلورسنت الإدخال لكل علامة المظهرية بالتوسيط وتحجيم هذه المتغيرات لإعطائها وزنا متساويا.
    2. إجراء تحليل لخريطة (SOM) التنظيم الذاتي باستخدام بيئة برمجيات الحوسبة الإحصائية والرسومات كما هو موضح بالدراسات السابقة38،39.
      1. إنشاء 25 سوم العقد مع المميزة الأربعة "codebook ناقلات" المقابلة لشدة الفلورسنت أربع علامات، DAPI، إيدو، و "الخامس أننيكسين"، و OCT4.
      2. تعيين الخلايا الفردية في كل المكروية لعقدة "فوز" (معظم مماثلة)، والأرض كتواتر الخلية، موجبة ناقلات codebook العقدة الفائزة يتم تحديثها باستخدام متوسط مرجح، حيث الوزن هو معدل التعلم (هنا، 0.05 ك افتراضي).
        ملاحظة: حذف البيانات من الدوائر التي تحتوي على خلايا أقل من 1,000 لأن مجموعات البيانات التي تحتوي على بعض الخلايا ولم تقدم نتائج سوم إحصائيا ذات الصلة.
    3. القيام بتجميع التسلسل الهرمي غير خاضعة للرقابة مع القيم سوم-عقده استخدام أسلوب الربط في المتوسط بناء على ارتباط بيرسون من برامج تجميع40.
    4. تقدم بيانات التجميع في وجهات النظر ديندروجرام و heatmap41.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

صفائف ماكمي: التصميم والتصنيع: في تركيبة مع تكنولوجيا نانوفيبير، قمنا باستخدام موائع جزيئية خلية ثقافة وفحص التقنيات المستخدمة سابقا لتحديد الظروف المثلى هبسك الذاتي تجديد أو التمايز35،36 (الشكل 1). وهذا أيضا مناسبة لإنشاء الاختبارات المستندة إلى الخلية الفائق قوية نظراً لدقة يمكن السيطرة عليها وقابلة للتوسيع42،،من4344خلية دوائر الثقافة والظروف. هنا، قد أعد الصفيف nanofiber طريقة ترسيب nanofiber بسيطة، اليكتروسبينينج مع أقنعة طباعة 3D. كانت مختلقة الجزء موائع جزيئية مع قالب طباعة 3D لتصميم هيكل الدائرة من خلال العديد من التجارب والأخطاء بسهولة. الصفيف ماكمي شيد بواسطة الجمع بين الجزأين والوارد بيئات 48، توفير الرموز الفيزيائية والكيميائية الحيوية المختلفة بتركيبات مختلفة من كلا ECMs nanofiber (3 أنواع من المواد نانوفيبير وكثافات مختلفة 4 أو مراقبة 4 مصفوفة البروتينات) والتفاعلات خلية (نطاقات 3 كثافة البذر الخلية الأولى) كما هو مبين في الشكل 2.

تقييم الآثار الشاملة لخصائص نانوفيبير والكثافة الخلوية على تعمل هيس: بعد زراعة الخلايا في صفيف ماكمي وتلطيخ على لوحة نيون (الشكل 6A)، أجريت قياسات خلية واحدة مع الصور المكتسبة. لمقارنة التجانس والتباين في مستويات التعبير لأربع علامات المظهرية في كل مجموعة من البيانات، يستخدم هذا البروتوكول سوم تحليل38،39، التي تقوم بتحويل مجموعات البيانات عالية ثلاثي الأبعاد، مولتيباراميتريك في خرائط 2D منخفضة ثلاثي الأبعاد. جدير بالذكر أن تم حذف نتائج مصفوفات PS النانو و 2DGT من هذا التحليل نظراً لأن معظم الخلايا لم تتقيد. وعلاوة على ذلك، مستبعدة من هذا التحليل كانت تلك التجارب مع القرص المضغوط منخفضة حيث الخلايا لم تكن كافية مباشرة (مثلاً، جوكستاكريني) أو تفاعلات غير المباشرة (باراكريني) البقاء على قيد الحياة. وبعد تحليل سوم، أجرى التجميع الهرمي غير خاضعة للرقابة للعقد سوم لجميع العينات التي تم تحليلها (الشكل 6ب). بالنظر إلى ارتفاع ديندروجرام الكتلة، الاختلافات المظهرية سمح لنا بتصنيف العينات إلى ثلاث مجموعات: المجموعة الأولى، معظمها لمنافذ عينة ويتألف من GT النانو، و MG_HighCD، و VN_HighCD؛ المجموعة الثانية من العينات التي تحتوي على GT النانو (GT_XLow و MidNF_MidCD)، MG_MidCD، أو VN_MidCD؛ وفي المجموعة الثالثة، جميع العينات التي PMGI_NF.

لدراسة الفروق بين المجموعات، قمنا بفحص عينة واحدة من كل مجموعة (الشكل 6ج؛ المجموعة i-GT_MidNF_HighCD، والفريق الثاني-GT_MidNF_MidCD، والفريق الثالث-PMGI_MidNF_HighCD). فيما يتعلق بالإشارات OCT4، أظهرت جميع الفئات تعبير أعلى مقارنة بملغ (MG_MidCD). المجموعة التي كانت تتميز بارتفاع إيدو إشارات، مشيراً إلى أن معظم خلايا كانت تنتشر بنشاط. وهكذا، ميكرونفيرونمينتس في المجموعة التي اتسمت بشروط مناسبة لصيانة هبسك سبب هبسكس غير متمايزة عادة ما تنتشر سريعاً عندما كانت مراحل دورة الخلية فجوة تقصير45،46.

GT_MidNF_HighCD و GT_MidNF_MidCD تتميز كثافة تحميل الخلية الأولى متميزة. خلية أولية عالية الكثافة زادت الفرص الخلايا للتفاعل مع الخلايا المجاورة، مما عزز البقاء على قيد الحياة وانتشار47. نجا خلايا المصنف كثافة أولية غير كافية (3.0 × 104 خلايا/سم2) لا نمت خلال الفترة التجريبية (4 أيام). ولذلك، نحن لم تدمج هذه العينات في تحليل سوم؛ وكانت أرقام الخلية تحت عتبة من الخلايا الحية 1000/الدائرة. وصنفت الخلايا على السقالات 2DGT أيضا كمجموعة خلايا الثاني؛ لا تدعم هذه الشروط هبسك الذاتي تجديد48. تم فقدان إشارة إيدو الخلايا GT_MidNF_MidCD ومستويات Annexin الخامس كانت زيادة طفيفة، مما يشير إلى أن الخلايا قد فقدت ستيمنيس بهم وأصبحت تدريجيا أبوبتوتيك. PMGI_MidNF_HighCD، الذي يمثل ميكرونفيرونمينتس تتألف من مصفوفات nanofiber بمجي، أظهرت وجود اختلافات كبيرة في OCT4 وإشارات إيدو بالمقارنة مع الشروط الأخرى.

Figure 1
الشكل 1 . فحص استراتيجية لتحديد ميكرونفيرونمينتس الخلوية الأمثل لتنظيم الوظائف الخلوية. (أ) نظرة عامة على عناصر الصفيف متعدد الخلوي اصطناعية المكروية (ماكمي). الصفيف يتكون من جزأين رئيسيين: أسرة nanofiber منقوشة على ركيزة القاعدية (صفيف nanofiber) ومن بولي دايمثيل سيلوكسان (PDMS)-على أساس هيكل موائع جزيئية. الصفيف ماكمي غير قادرة على إعداد ECMs nanofiber مع مجموعة متنوعة من الميزات (أي مواد نانوفيبير والكثافة) وخلية مختلفة البذر الكثافة. يتميز الهيكل PDMS موائع جزيئية الصفيف ماكمي الثلاثة موائع جزيئية-قناة مرتفعات (250، 500، و 1000 ميكرومتر) لتنظيم كثافة البذر الخلية الأولى. (ب) أثر ميكرونفيرونمينتس الخلوي في الخلية تعمل يتم تقييمها كمياً مقايسة خلية واحدة المستندة إلى الصور باستخدام وتحليل البيانات الإحصائية بخريطة التنظيم الذاتي (SOM) متبوعاً بتجميع التسلسل الهرمي. هذا الرقم هو مقتبس من مرجع49 بإذن من إيلي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 . تصميم الصفيف ماكمي. (أ) النفقات العامة ولقطات زاوية مرتفعة من الصفيف بأكمله ماكمي والرسم التخطيطي التصوري لقناة موائع جزيئية (أزرق فاتح) على مصفوفة نانوفيبير (الوردي). وتتألف كل قناة مكم 700 واسعة ودائرة الثقافة طويلة 8.4 ملم ومداخل اثنين لإدخال المتوسطة والخلايا. (ب) مقارنة بين أحجام الخلايا ومصفوفات نانوفيبير. المرتفعات من الخلايا ونانوفيبير أسرة تتراوح من 1-3 ميكرون و 0.05-5.0 ميكرومتر، على التوالي. (ج) مقطع عرضي لكل قناة موائع جزيئية مع ارتفاع 250/500/1000 ميكرومتر. يتم تمثيل الخلايا ونانوفيبير أسرة كدوائر زرقاء وخطوط أورانج، على التوالي. كل غرفة بنفس العرض والطول لكن ارتفاعات مختلفة (250 و 500 و 1000 ميكرومتر)، وكان حجم الدائرة كل 1.6 و 3.2 و 6.4 ميليلتر، على التوالي. مستطيل منقط أسود في الشكل 2ج يدل الرقم 2ب. الرقم 2 هو مقتبس من مرجع49 بإذن من إيلي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3 . تلفيق صفيف ماكمي. (أ) تصنيع مجموعة نانوفيبير. الزخرفة مصفوفات نانوفيبير متعددة على اللوح الأساس كان يؤديها اليكتروسبينينج المعدلة باستخدام مجموعة من أقنعة تحمل الثقوب منقوشة. وأجرى البلاتين-طلاء لتسهيل ترسب نانوفيبير في اللوح الأساس بلاستيك. الأقنعة مع أنماط ثقب متميزة أعدها طابعة 3D. بعد إخفاء منطقة المغلفة بالبلاتين من اللوحة، تم وضع مجموعة لوحة قناع على الشاشة جمع، وأجرى اليكتروسبينينج العادية. وشكلت النانو الأولية في مواقف المغلفة بحزب العمال على اللوحة من خلال الثقوب في القناع. كانت ملفقة أسرة nanofiber إضافية على اللوحة باستبدال القناع الموجودة وتكرار هذا الإجراء. (ب) تصنيع هيكل موائع جزيئية. العفن طباعته باستخدام طابعة ثلاثية الأبعاد مع الراتنج الأشعة فوق البنفسجية على شكل طبقة PDMS الجهاز موائع جزيئية. بعد صب، الصفيف ماكمي تم تجميعها عن طريق ربط طبقة موائع جزيئية المستندة إلى PDMS مع مجموعة تنشيط سطح نانوفيبير. الرقم 3 هو مقتبس من مرجع49 بإذن من إيلي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4 . صور لواجهات المستخدم الرسومية (GUI) للحصول على الصور المجهرية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الشكل 5 . صور لواجهات المستخدم الرسومية (GUI) لمعالجة لخلية واحدة phenotyping الصور موجهة بالكمبيوتر- عملية تحليل الصورة يحتوي على 5 خطوات؛ (أ) تحديد هوية الكائنات الأولية في DAPI الصور وتحديد الهوية (ب-د) من الكائنات الثانوية في OCT4، أننيكسين الخامس والصور إيدو، على التوالي، وقياس كثافة الكائن. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 6
الرقم 6 . فينوتيبينج وتصنيف تعمل هيسكس H9 تم تعديلها من قبل عوامل ميكرونفيرونمينتال. صور هيسكس H9 مثقف في عالية الكثافة نثر البذور الأولى في النانو الجيلاتين (GT) (GT_HighNF_HighCD)، إيممونوفلوريسسينت (A) ملطخة بثلاث علامات المظهرية الخلوية (OCT4، بلوريبوتينسي؛ إيدو، تكاثر الخلايا؛ أنيكسين الخامس، المبرمج) و DAPI لنواة الخلية. (ب) heatmap وديندروجرامس تجميع التسلسل الهرمي غير خاضعة للرقابة. ميكرونفيرونمينتس اختبار صنفت إلى ثلاث مجموعات مع السمات المميزة، استناداً إلى أوجه التشابه في تعمل. الفريق الأول وشملت GT النانو، و MG_HighCD، و VN_HighCD. الفريق الثاني يتألف من عينات النانو GT (GT_XLow و MidNF_MidCD)، MG_MidCD، أو VN_MidCD. تم تجميع جميع العينات التي PMGI_NF في الفريق الثالث. في heatmap، تشير الألوان الوردي والأزرق إلى الترددات العالية والمنخفضة الخلوية في مؤامرات العد سوم، على التوالي. (ج) توزيع مستويات التعبير كمياً علامة الخلايا 1000 في عينة واحدة من كل مجموعة (المجموعة i-GT_MidNF_HighCD، والفريق الثاني-GT_MidNF_MidCD، والفريق الثالث-PMGI_MidNF_HighCD). وأشير إلى مقاييس النسبة المئوية الخامسة والعشرين والخامسة والسبعين كحدود مربع. شعيرات تمتد إلى 1.5 مرة نطاق المجال من مقاييس النسبة المئوية في الخامسة والعشرين والخامسة والسبعين. تم تكرار تجارب ثلاث مرات لكل مجموعة. الرقم 6 أ-ج مقتبس من مرجع49 بإذن من إيلي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الاسم طول القناة (مم) عرض قناة (ميكرومتر) قناة الارتفاع (ميكرومتر) مدخل/مخرج القطر (ميكرومتر) مدخل/مخرج الارتفاع (ميكرومتر) طول القالب (مم) قالب العرض (مم) العفن الارتفاع (مم)
العفن 8.4 700 250/500/1000 800 3000 127.76 85.48 14.35
الاسم سمك (ميكرومتر) ثقب الطول (مم) ثقب العرض (مم) قناع الطول (مم) قناع العرض (مم) العفن الارتفاع (مم) صف الإزاحة (مم) عمود الإزاحة (مم)
قناع 1000 6 5 123.5 80.2 14.35 11.24 14.38

الجدول 1. أبعاد العفن لهيكل موائع جزيئية وقناع للزخرفة نانوفيبير.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هذا البروتوكول يوضح طريقة الفحص الأولى ﻹنشاء نظام ثقافة قوية للصيانة هبسكس المؤهلين. أولاً، يمكننا وصف كيفية إعداد برنامج يضم ECMs الاصطناعية المتنوعة وخلية البذر الكثافة باستخدام جهاز موائع جزيئية متكاملة مع مجموعة نانوفيبير، الصفيف ماكمي. الكمية، والثاني يستند إلى صورة وحيدة الخلية phenotyping كان يؤديها50 لتقييم نتائج الخلوية الفردية والسلوكيات التي غيرت من ملامح البيوكيميائية والفيزيائية الحيوية المتميزة. في هذا البروتوكول، تميزت البيئة تتكون من نانوفيبير جي تي وبروتينات ECM التحكم الإيجابي في حالة ارتفاع الخلية الأولى بذر الكثافة بميزات دولة غير متمايزة؛ الانتشار السريع45 ومستقر OCT4 التعبير51. وأشارت هذه الملاحظة إلى أن الآليات الجزيئية التي تتصل "المصفوفة خارج الخلية الخلية" والتفاعلات "خلية" يمكن أن تؤثر على بلوريبوتينسي هبسكس.

يمكن تخصيص هذه الاستراتيجية لتناسب الغرض الخاص بالمستخدم. على سبيل المثال، يمكن ضبط التلاعب بالخلية والإنتاجية لمجموعة متنوعة من الإعدادات التجريبية بإعادة تصميم أشكال وأنماط من هيكل موائع جزيئية. كطريقة أخرى لتحسين الإنتاجية، صممت مداخل ومخارج ومواقف كل دائرة وفقا لمعيار الميكروسكوبية لوحات 96-جيدا، وتوحيد المجتمع للعلوم "الجزيئية البيولوجية"؛ وهكذا، يمكن استخدام عبوة سائل روبوتية الآلي للفرز الفائق. لمواصلة النظر في هذه الآلية الجزيئية بشأن "تفاعلات الخلية-إدارة المحتوى في المؤسسة"، يمكن إجراء ميكرونفيرونمينتس الخلوية مصطنعة لتقليد في فيفو شروط أكثر دقة عن طريق تعديل كيميائيا النانو مع إشارات الجزيئات52 .

حتى الآن، معظم المنصات المتقدمة للفحص الخلوي ميكرونفيرونمينتس تهدف إلى فحص العوامل القابلة للذوبان (مثل عوامل النمو والمركبات الكيميائية)42،،من4344، ولكن لا nanofiber ECMs نظراً إلى صعوبات في الجمع بين تقنيات تصنيع متميزة. على سبيل المثال، تنتج فجوة صغيرة بين بنية موائع جزيئية واللوح الأساس ورقة نانوفيبير ويؤدي بهم الترابط غير المستقرة، التي تنتج في التلوث المتبادل بين العينات المختلفة بسبب مزيج متوسط الثقافة مع آخر غرفة واحدة من خلال الفجوة الصغيرة. لدينا أسلوب جديد يسهل تصنيع بسيطة ودقة مصفوفات نانوفيبير في مواقع محددة، ويسمح الربط المباشر مع اللوح الأساس، مما يمنع الربط غير مستقرة والتلوث عبر. وعلاوة على ذلك، بعض منصات53 متكاملة مع ميكروفلويديكس ومصفوفات نانوفيبير كان موجوداً للتلاعب المنهجي من الإشارات الكيميائية والمادية على حد سواء للتحقيق في آثارها على وظائف الخلية، لأن التكنولوجيات اللازمة التكامل كانت متطورة للغاية. لدينا التنميط خلية واحدة مع الصفيف ماكمي يمكن تنفيذها مع جهاز يمكن بلوغه بسهولة وتقنيات بسيطة ويحمل إمكانيات كبيرة للاستخدام في البيئات الخلوية للنمذجة التنموية وخلية الدراسات البيولوجية واكتشاف المخدرات/ الفحص.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

لا شيء.

Acknowledgments

ونحن نشكر الأستاذ أ. ناكاتسوجي في إيسيمس، جامعة كيوتو، لتوفير حقوق دإط الخلايا. ونشكر أيضا ماروياما ألف الأستاذ في "معهد طوكيو للتكنولوجيا" لدعمه في استخدام مجهر القوة الذرية. سخاء قدم التمويل من "الجمعية اليابانية" "تعزيز العلوم" (JSPS؛ 22350104، 23681028، 25886006، و 24656502)؛ كما تم توفير التمويل "الطاقة الجديدة" ومنظمة تطوير التكنولوجيا الصناعية (نيدو) و "مؤسسة علوم الحياة تيرومو". WPI-إيسيمس معتمد من قبل في العالم رئيس الوزراء الدولي أبحاث المركز مبادرة (WPI)، ووزارة التربية والتعليم، والثقافة والرياضة، والعلوم والتكنولوجيا (يأمرون)، اليابان. جزء من هذا العمل يدعمه مركز تكنولوجيا النانو جامعة كيوتو ومرفق تجهيز نانو داريجا في "مشروع منصة تقنية النانو" تحت رعاية يأمرون، اليابان.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Polystyrene (PS) Sigma #182435 Average Mw: 290,000, average Mn: 130,000
Polymethylglutarimide (PMGI) MicroChem G113113
Gelatin (GT) Sigma G2625 From porcine skin, type A
Sylgard 184 silicone elastomer kit Doe Corning Toray #1064291 PDMS curing agent and silicone elastomer base are components of this kit.
OpenSCAD This is a free 3D computer graphics software (http://www.openscad.org/) used for designing the mold of the microfluidic device.
AutoCAD 2014 Autodesk This is a 3D computer graphics software (https://www.autodesk.com/products/autocad/overview) used for design of the mask used on nanofiber-array preparation.
3D printer, AGILISTA-3000 Keyence
UV-curable resin, AR-M2 Keyence This is used for 3D printing by Agilista.
Acetic acid Sigma #338826 ≥99.99%
Ethyl acetate Sigma #270989 Anhydrous, 99.8%
Tetrahydrofuran (THF) Sigma #401757
MSP-30T Vacuum Device Magnetron sputtering machine
Nunc OmniTray Thermo Fisher Scientific #242811 This is a polystyrene baseplate on which the nanofiber array is created. This plate size is typically 127.7 x 85.5 mm. 
Gun-type corona discharge machine Shinko Electric & Instrumentation CFG-500 This handy device is used to generate corona for activation of the bottom surface of the PDMS layer at step 1.5 "Assembly of the MACME arrays" in the protocol.
5 mL syringe Terumo SS-05SZ
Stainless-steel blunt needle (23-gauge) Nipro #2166 Outside diameter and length are 0.6 and 32 mm, respectively.
High-voltage power supply TechDempaz
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide, hydrochloride Dojindo W001
N-Hydroxysuccinimide Sigma #56480
Matrigel hESC-Qualified Matrix Corning #354277 This protein is refered as basement membrane gel matrix in the protocol.
CellAdhere Vitronectin, Human, Solution STEMCELL Technologies #07004
TeSR-E8 STEMCELL Technologies #05940 Feeder-free, xeno-free culture medium for maintenance of human ES and iPS cells
Y-27632 Wako Pure Chemical Industries #253-00513
TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red Thermo Fisher Scientific #12605028 This ia a recombinant trypsin-like protease for dissociation of adherant mammalian cells.
Click-iT EdU Imaging Kit with Alexa Fluor 647 Azides Thermo Fisher Scientific C10086 The fluorescent labeling of proliferating cells in on-plate fluorescent staining was performed along the product manual of this kit.
Annexin V, Alexa Fluor 594 conjugate Thermo Fisher Scientific A13203
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Thermo Fisher Scientific D1306
Oct-3/4 Antibody (C-10) Santa Cruz Biotechnology sc-5279
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (DyLight 488) abcam ab96875 This is a secondary antibody used in on-plate fluorescent cell staining.
ECLIPSE Ti-E Nikon This is an inverted fluorescence microscope equipped with a CFI Plan Fluor 4×/0.13 N.A. objective lens (Nikon), CCD camera (ORCA-R2, Hamamatsu), mercury lamp (Intensilight, Nikon), XYZ automated stage (Ti-S-ER motorized stage with encoders, Nikon), and filter cubes for four fluorescence channels (DAPI, GFP HYQ, TRITC, Cy5; Nikon)
NIS-Elements Advanced Research Nikon This is a microscope imaging software used for automatic image acquisition.
CellProfiler, Version 2.1.0 This is a free open software for cell image analysis (http://cellprofiler.org/).
R SOM analysis is performed by kohonen package of this software. This is freely available (https://www.r-project.org/).
Cluster 3.0 This is the open source clustering software (http://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster/software.htm). Unsupervised hierarchical clustering is performed with this software.
Java TreeView This open source software (http://jtreeview.sourceforge.net/) is used to visualize clustering data as a heatmap and a dendrogram.
H9 human embryonic stem cell WiCell Stem Cell Bank WA09

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  2. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  3. Ameen, C., et al. Human embryonic stem cells: Current technologies and emerging industrial applications. Crit Rev Oncol Hematol. 65 (1), 54-80 (2008).
  4. Nishikawa, S., Goldstein, R. A., Nierras, C. R. The promise of human induced pluripotent stem cells for research and therapy. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (9), 725-729 (2008).
  5. Robinton, D. A., Daley, G. Q. The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy. Nature. 481 (7381), 295-305 (2012).
  6. Sartipy, P., Bjorquist, P., Strehl, R., Hyllner, J. The application of human embryonic stem cell technologies to drug discovery. Drug Discovery Today. 12 (17-18), 688-699 (2007).
  7. Discher, D. E., Mooney, D. J., Zandstra, P. W. Growth factors, matrices, and forces combine and control stem cells. Science. 324 (5935), 1673-1677 (2009).
  8. Joyce, J. A., Pollard, J. W. Microenvironmental regulation of metastasis. Nat Rev Cancer. 9 (4), 239-252 (2009).
  9. Danhier, F., Feron, O., Preat, V. To exploit the tumor microenvironment: Passive and active tumor targeting of nanocarriers for anti-cancer drug delivery. J Control Release. 148 (2), 135-146 (2010).
  10. Murphy, W. L., McDevitt, T. C., Engler, A. J. Materials as stem cell regulators. Nat Mater. 13 (6), 547-557 (2014).
  11. Patel, A. K., et al. A defined synthetic substrate for serum-free culture of human stem cell derived cardiomyocytes with improved functional maturity identified using combinatorial materials microarrays. Biomaterials. 61, 257-265 (2015).
  12. Zhang, R., et al. A thermoresponsive and chemically defined hydrogel for long-term culture of human embryonic stem cells. Nat Commun. 4, (2013).
  13. Anderson, D. G., Putnam, D., Lavik, E. B., Mahmood, T. A., Langer, R. Biomaterial microarrays: rapid, microscale screening of polymer-cell interaction. Biomaterials. 26 (23), 4892-4897 (2005).
  14. Celiz, A. D., et al. Discovery of a Novel Polymer for Human Pluripotent Stem Cell Expansion and Multilineage Differentiation. Adv Mater. 27 (27), 4006-4012 (2015).
  15. Hansen, A., et al. High-Density Polymer Microarrays: Identifying Synthetic Polymers that Control Human Embryonic Stem Cell Growth. Adv Healthcare Mater. 3 (6), 848-853 (2014).
  16. Mei, Y., et al. A high throughput micro-array system of polymer surfaces for the manipulation of primary pancreatic islet cells. Biomaterials. 31 (34), 8989-8995 (2010).
  17. Saha, K., et al. Surface-engineered substrates for improved human pluripotent stem cell culture under fully defined conditions. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (46), 18714-18719 (2011).
  18. Bettinger, C. J., Langer, R., Borenstein, J. T. Engineering substrate topography at the micro- and nanoscale to control cell function. Angew Chem Int Ed Engl. 48 (30), 5406-5415 (2009).
  19. McMurray, R. J., et al. Nanoscale surfaces for the long-term maintenance of mesenchymal stem cell phenotype and multipotency. Nat Mater. 10 (8), 637-644 (2011).
  20. Sun, Y., Jallerat, Q., Szymanski, J. M., Feinberg, A. W. Conformal nanopatterning of extracellular matrix proteins onto topographically complex surfaces. Nat Methods. 12 (2), 134-136 (2015).
  21. Nitanan, T., et al. Effects of processing parameters on morphology of electrospun polystyrene nanofibers. Korean J Chem Eng. 29 (2), 173-181 (2012).
  22. Liu, L., et al. Chemically-defined scaffolds created with electrospun synthetic nanofibers to maintain mouse embryonic stem cell culture under feeder-free conditions. Biotechnol Lett. 34 (10), 1951-1957 (2012).
  23. Liu, L., et al. Nanofibrous gelatin substrates for long-term expansion of human pluripotent stem cells. Biomaterials. 35 (24), 6259-6267 (2014).
  24. Kamei, K., et al. Phenotypic and transcriptional modulation of human pluripotent stem cells induced by nano/microfabrication materials. Adv Healthcare Mater. 2 (2), 287-291 (2013).
  25. Peerani, R., et al. Niche-mediated control of human embryonic stem cell self-renewal and differentiation. EMBO J. 26 (22), 4744-4755 (2007).
  26. Yamamoto, K., et al. Fluid shear stress induces differentiation of Flk-1-positive embryonic stem cells into vascular endothelial cells in vitro. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 288 (4), 1915-1924 (2005).
  27. Charati, S. G., Stern, S. A. Diffusion of gases in silicone polymers: Molecular dynamics simulations. Macromolecules. 31 (16), 5529-5535 (1998).
  28. Prado-Lopez, S., et al. Hypoxia promotes efficient differentiation of human embryonic stem cells to functional endothelium. Stem Cells. 28 (3), 407-418 (2010).
  29. Yanagihara, K., et al. Prediction of Differentiation Tendency Toward Hepatocytes from Gene Expression in Undifferentiated Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cells and Development. 25 (24), 1884-1897 (2016).
  30. Kamei, K., et al. 3D printing of soft lithography mold for rapid production of polydimethylsiloxane-based microfluidic devices for cell stimulation with concentration gradients. Biomed Microdevices. 17 (2), (2015).
  31. Song, J. H., Kim, H. E., Kim, H. W. Production of electrospun gelatin nanofiber by water-based co-solvent approach. J Mater Sci Mater Med. 19 (1), 95-102 (2008).
  32. Owen, M. J., Smith, P. J. Plasma Treatment of Polydimethylsiloxane. J Adhes Sci Technol. 8 (10), 1063-1075 (1994).
  33. Chen, G. K., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nat Methods. 8 (5), 424-476 (2011).
  34. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25 (6), 681-686 (2007).
  35. Kamei, K., et al. An integrated microfluidic culture device for quantitative analysis of human embryonic stem cells. Lab Chip. 9 (4), 555-563 (2009).
  36. Kamei, K., et al. Microfluidic image cytometry for quantitative single-cell profiling of human pluripotent stem cells in chemically defined conditions. Lab Chip. 10 (9), 1113-1119 (2010).
  37. Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7 (10), 100 (2006).
  38. Kohonen, T. Self-Organized Formation of Topologically Correct Feature Maps. Biol Cybern. 43 (1), 59-69 (1982).
  39. Wehrens, R., Buydens, L. M. C. Self- and super-organizing maps in R: The kohonen package. J Stat Softw. 21 (5), 1-19 (2007).
  40. Eisen, M. B., Spellman, P. T., Brown, P. O., Botstein, D. Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (25), 14863-14868 (1998).
  41. Saldanha, A. J. Java Treeview--extensible visualization of microarray data. Bioinformatics. 20 (17), 3246-3248 (2004).
  42. Du, G. S., Fang, Q., den Toonder, J. M. J. Microfluidics for cell-based high throughput screening platformsd-A review. Anal Chim Acta. 903, 36-50 (2016).
  43. Huang, S. B., et al. An integrated microfluidic cell culture system for high-throughput perfusion three-dimensional cell culture-based assays: effect of cell culture model on the results of chemosensitivity assays dagger. Lab Chip. 13 (6), 1133-1143 (2013).
  44. Wang, B. L., et al. Microfluidic high-throughput culturing of single cells for selection based on extracellular metabolite production or consumption. Nat Biotechnol. 32 (5), 473 (2014).
  45. Becker, K. A., et al. Self-renewal of human embryonic stem cells is supported by a shortened G1 cell cycle phase. J Cell Physiol. 209 (3), 883-893 (2006).
  46. Neganova, I., Lako, M. G1 to S phase cell cycle transition in somatic and embryonic stem cells. J Anat. 213 (1), 30-44 (2008).
  47. Fox, V., et al. Cell-cell signaling through NOTCH regulates human embryonic stem cell proliferation. Stem Cells. 26 (3), 715-723 (2008).
  48. Xu, C., et al. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 19 (10), 971-974 (2001).
  49. Kamei, K., et al. Microfluidic-Nanofiber Hybrid Array for Screening of Cellular Microenvironments. Small. 13 (18), (2017).
  50. Sun, J., et al. A Microfluidic Platform for Systems Pathology: Multiparameter Single-Cell Signaling Measurements of Clinical Brain Tumor Specimens. Cancer Res. 70 (15), 6128-6138 (2010).
  51. Theunissen, T. W., Jaenisch, R. Molecular Control of Induced Pluripotency. Cell Stem Cell. 14 (6), 720-734 (2014).
  52. Yoo, H. S., Kim, T. G., Park, T. G. Surface-functionalized electrospun nanofibers for tissue engineering and drug delivery. Adv Drug Del Rev. 61 (12), 1033-1042 (2009).
  53. Dixon, J. E., et al. Combined hydrogels that switch human pluripotent stem cells from self-renewal to differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (15), 5580-5585 (2014).

Tags

الهندسة الحيوية، 139 مسألة، موائع جزيئية، نانوفيبير، والخلايا الجذعية الجنينية، المكروية الخلوية، والتنميط، الذاتي تجديد خلية واحدة
تصنيع صفيف متعدد المكروية الخلوية اصطناعية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mashimo, Y., Yoshioka, M., Tokunaga, More

Mashimo, Y., Yoshioka, M., Tokunaga, Y., Fockenberg, C., Terada, S., Koyama, Y., Shibata-Seki, T., Yoshimoto, K., Sakai, R., Hakariya, H., Liu, L., Akaike, T., Kobatake, E., How, S. E., Uesugi, M., Chen, Y., Kamei, K. i. Fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment Array. J. Vis. Exp. (139), e57377, doi:10.3791/57377 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter