Summary
I denne artikel beskrives den detaljerede metode til at forberede en multipleksede kunstige cellulære mikromiljø (MACME) array for høj overførselshastighed manipulation af fysiske og kemiske cues efterligner i vivo cellulære microenvironments og til identificere den optimal cellulære miljø for humane pluripotente stamceller (hPSCs) med enkelt-celle profilering.
Abstract
Cellulære microenvironments består af en række stikord, som vækstfaktorer, ekstracellulære matricer og intercellulære interaktioner. Disse signaler er godt orkestreret og er afgørende i regulerer cellefunktioner i et levende system. Selv om en række forskere har forsøgt at undersøge sammenhængen mellem miljøfaktorer og ønskede cellulære funktioner, stadig meget ukendt. Dette er hovedsagelig på grund af manglen på en korrekt metode til at efterligne sådanne miljømæssige stikord i in vitro, og samtidig tester forskellige miljømæssige stikord på celler. Her rapporterer vi en integreret platform af mikrofluid kanaler og en nanofiber array, efterfulgt af high-indhold single-celle analyse, for at undersøge stamceller fænotyper ændret af forskellige miljøfaktorer. For at demonstrere anvendelsen af denne platform, fokuserer denne undersøgelse på fænotyper af selvstændig fornyelse humane pluripotente stamceller (hPSCs). Vi præsenterer her, forberedelse procedurer for en nanofiber vifte og mikrofluid struktur i fabrikation af en multipleksede kunstige cellulære mikromiljø (MACME) array. Derudover er overordnede trin af encellede profilering, celle farvning med flere fluorescerende markører, flere fluorescens imaging og statistiske analyser, beskrevet.
Introduction
Humane pluripotente stamceller (hPSCs)1,2 selvstændige forny ubegrænset og differentiere sig til forskellige væv slægter, som kunne revolutionere udvikling af lægemidler, celle-baserede behandlinger, vævsmanipulering og regenerativ medicin 3 , 4 , 5 , 6. generel kultur retter og mikrotiter plader, men er ikke designet til at aktiverer præcise fysiske og kemiske celle manipulation på cellulært niveau med vifte af nano - til mikro-meter, som er en kritisk faktor for cellulære ekspansion, selvfornyelse og differentiering. For at løse denne ulempe, har undersøgelser undersøgt roller af cellulære microenvironments i reguleringen af celle-skæbne beslutninger og celle funktioner4. I de senere år er et stigende antal undersøgelser blevet gennemført for at rekonstruere cellulære microenvironments in vitro-7,8. Nano - og mikro-fabrication processer har etableret disse microenvironments gennem manipulation af kemiske9,10,11,12,13, 14,15,16,17 og fysiske18,19,20 miljømæssige stikord. Indtil nu var der ingen rapporter til systematisk undersøge de underliggende mekanismer i kemiske og fysiske miljømæssige stikord på celle-skæbne beslutninger og funktioner inden for en enkelt platform.
Her introducerer vi en strategi baseret på enkle designprincipper til at etablere en robust screening platform (figur 1). Først, vi beskriver proceduren udvikling af en integreret platform for at skabe alsidig, kunstige cellulære microenvironments ved hjælp af en nanofiber array og en mikrofluid struktur: The multipleksede kunstige cellulære mikromiljø (MACME) array (Figur 1A og 2A). Nanofiber matrix har 12 forskellige microenvironments i forskellige kombinationer af nanofiber materialer og tætheder. Electrospinning blev brugt til at fremstille nanofibers. Nanofiber materialer såsom polystyren (PS)21, polymethylglutarimide (PMGI)22og gelatine (GT)23, var designet til at teste deres kemiske egenskaber, som kan påvirke celle vedhæftning og vedligeholdelse af pluripotency ( Figur 2B). Nanofiber tætheder blev varieret ved at ændre electrospinning tid og de genererede nanofibers blev defineret ifølge deres tætheder (DNF, med D = XLow/lav/Mid/High). Mikrofluid struktur er sammensat af Polydimethylsiloxan (PDMS) husly 48 cellekultur kamre, som kan placeres langs 96-brønd mikrotiterplade standard dimensioner. PDMS er et biokompatibelt og gas-udskiftelige polymer generelt bruges til at fremstille mikrofluid enheder24. Hver mikrofluid kanal blev designet til at være 700-µm wide og 8,4-mm lang og havde to fjorde på sine kanter (tabel 1). Afdelingerne havde forskellige højder (250, 500 og 1000 µm) til at manipulere de oprindelige celle-seeding tætheder (0,3 og 0,6 1,2 × 105 celler/cm2), som kan korrelere med overlevelse, spredning og differentiering af hPSCs25 (Figur 2C). Antallet af celler seedede i et kammer er proportional med kolonnen tæthed over salen gulvet, og dermed første celle såning tæthed blev kontrolleret ved at indføre den samme cellesuspension i kultur kamre med forskellige højder. Alle kanaler blev designet til at være ≥ 250 µm høje26 at minimere virkningerne af lav-oxygen spænding27 og shear stress28 på cellerne. Kanalen højder af 250, 500 og 1000 µm er forkortet her som XCD med X = Low, Mid, og høj, henholdsvis. Miljøer med distinct nanofiber tætheder og første celle-seeding tætheder blev forkortet som "Material_NF density_Cell tæthed" (f.eks. GT_HighNF_HighCD: et miljø præget af high-density GT nanofibers og høj oprindelige celle såning tæthed).
Efterfølgende, beskriver vi, hvordan du udføre én celle analyser til systematisk undersøge celle adfærd som reaktion på miljømæssige faktorer (figur 1B). Som en proof-of-concept identificeret vi den optimal cellulære miljø for hPSC selvfornyelse, hvilket er en vigtig funktion for hPSC vedligeholdelse (figur 1B)29. Billed-baserede flowcytometri, efterfulgt af statistiske analyser, giver mulighed for kvantitativ tolkning af individuelle cellulære fænotypiske svar til cellulære miljøer. Blandt en række cellulære funktioner indeholder dette white paper en detaljeret procedure for at identificere de optimale betingelser for at opretholde hPSC selvfornyelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. fremstilling af MACME Array
Bemærk: Alle materialer og udstyr er angivet i tabellen materialer.
-
Fremstilling af masker til en nanofiber array og en form for en mikrofluid struktur
- Oprette tre-dimensionelle (3D) billeder af masker anvendes til nanofiber arrays og forme til mikrofluid strukturer ved hjælp af 3D-computergrafik softwarepakker (tabel 1).
Bemærk: 3D-billeder er læse og trykt af en 3D-printer. Trykte masker og skimmel har de samme dimensioner med 3D billeder defineret ved hjælp af grafik software på trin 1.1.1. - Udskrive masker og en skimmel, baseret på disse designs ved hjælp af en 3D-printer.
Bemærk: I denne protokol var en ink-jet-lignende 3D printer med UV-helbredes harpiks brugte30. Printeropløsningen var 635 × 400 dpi og 15 µm i X, Y og Z, henholdsvis, men den faktiske X, Y opløsning var cirka fire gange lavere.
- Oprette tre-dimensionelle (3D) billeder af masker anvendes til nanofiber arrays og forme til mikrofluid strukturer ved hjælp af 3D-computergrafik softwarepakker (tabel 1).
-
Nanofiber-array forberedelse (figur 3A)
- Forberede electrospinning polymer løsninger.
- Fortynd 13% PMGI væske med tetrahydrofuran af 9% (w/v)22.
- Opløse 0,08 g af PS (nummer-gennemsnitlig molekylvægt (Mn): 130.000) i THF:dimethylformamide (1:1 volumen ratio)21, og tilføje THF:dimethylformamide at bringe volumen op til den endelige 1 mL (8% (w/v) PS løsning).
- Opløses 0,1 g af GT i vand: eddikesyre syre: ethylacetat (1:1.6:2.1 volumen ratio), og tilsæt vand: eddikesyre syre: ethylacetat at bringe volumen op til den endelige 1 mL (10% (w/v) GT løsning) som beskrevet23,31.
- Bruge en magnetron sputtering maskine, deponere et platinum tyndt med en 5-nm tykkelse på en polystyren (PS) sokkel (127.7 × 85,5 mm), der fungerer som en katode i opsætningen af electrospinning.
- Læg hver polymer løsning i en 5-mL sprøjten udstyret med en 23-G rustfrit stål stump kanyle.
- Sted og anker sprøjte med kanyle på sprøjten pumpe med 12 cm ud over samler af electrospinning enhed.
- Tilsluttes en høj spænding strømforsyning sprøjte nål, og sat til at anvende på 11 kV.
- Indstille den pumpe sats af 0,2 mL/h.
- Holde temperatur og fugtighed på 30 ° C og < 30% (v/v).
- Sæt masken på bundpladen forberedt på trin 1.2.2.
- Fremstil nanofibers på bundpladen gennem hullerne i maske med forskellige tætheder ved at ændre electrospinning tid (f.eks. 20, 60, 90 og 180 s).
- Fjerne masken fra bundpladen.
Bemærk. Ethanol kan sprayes på electrospun GT nanofibers før du fjerner masken for at undgå skrælning off GT nanofibers sammen med masken. - Gentag trin 1.2.4-1.2.10 indtil afslutningen af nanofiber-array fabrikation.
- Placer nanofiber array i en ekssikkator ved 25 ° C efter 16 h til at fordampe de resterende opløsningsmiddel.
- Crosslink GT nanofibers med 0,2 M 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochlorid (EDC) og 0,2 M N-hydroxysuccinimide (NHS) i ethanol ved 25 ° C til 4 h23.
- Skyl GT nanofibers to gange med 99,5% (v/v) ethanol og vakuum-tør ved 25 ° C efter 16 h.
- Forberede electrospinning polymer løsninger.
-
Fremstilling af mikrofluid strukturer (figur 3B)
- Bland 2 g af PDMS hærdning agent og 20 g af PDMS base (1:10 vægt ratio; Pre-PDMS). 24
- Hæld pre-PDMS blandingen på formen fabrikeret i trin 1.2.
- Nedtrapning gas pre-PDMS blandingen i en ekssikkator i 30 min.
- Helbrede pre-PDMS blandingen i en ovn ved 65 ° C i 16 h.
-
Samling af MACME arrays (figur 3B)
- Skrælle den PDMS struktur helbredt på trin 1.3.4 fra formen og ren med 70% (v/v) ethanol.
- Behandle atmosfæriske corona decharge på den nederste side af PDMS struktur32.
Bemærk: I denne protokol, er corona afladet på hele overfladen af lag 3 eller 4 gange med en "Handy" corona decharge apparater. Ilt plasma behandling blev erstattet med atmosfærisk corona decharge til at ændre den overflade klæbeevne. - Samle PDMS struktur med matrixen nanofiber hurtigt.
- Ovn-Bages ved 65° C i 2 dage.
2. ilægning hESCs i MACME Array
- Til den rutinemæssige kultur af H9 humane embryonale stamceller (hESCs), opretholde celler i xeno-fri kemisk definerede næringssubstrat til hPSC vedligeholdelse33 suppleret med 10 µM Y-27632 ROCK hæmmer34 (opkaldt hPSC medium) i en 35-mm cellekultur fad belagt med basalmembranen gel matrix (MG).
- Passage celler hver 4 til 7 dage ved hjælp af en rekombinant trypsin-lignende protease.
- Sterilisere en MACME array med 99,5% ethanol, af indlæsning i kamre i 10 min, og fjern derefter ethanolen. Gentag dette trin 3 gange.
- Indføre 12 µL af MG, 10 µg/mL vitronectin (VN), og 0,1% (w/v) GT i kontrol kultur kamre, og Inkuber kamre ved 37 ° C i 1 time til at belægge dem på kammer overflader.
Bemærk: I denne protokol, blev MG, VN og GT valgt som reference proteiner for celle vedhæftning og kultur. Fordi MG og VN er standard cellekultur matricer benyttes for at opretholde hPSC selvfornyelse, bruges de som positive kontroller; to-dimensionelle GT belægning (2DGT) eller ikke-belægning (NC) blev brugt som negative kontroller. - Indføre pre varmede hPSC medium i alle afdelinger af MACME array. Inkuber kamre i 30 minutter ved 37 ° C.
- Vaske H9 menneskelige stamceller kulturperler på en 35 mm fad med DPBS, tilsættes 0,5 mL af en rekombinant trypsin-lignende protease til fadet og der inkuberes ved 37 ° C i 1 min og Aspirér omhyggeligt kun analysere blandet med protease.
Bemærk: På trinnet aspiration er cellerne ikke løsrevet. - Straks tilføje hPSC medium, forsigtigt substratet mod parabol overfladen gentagne gange at adskille celler og overføre de fritliggende celler til en 15 mL konisk slange.
- Der centrifugeres ved 200 x g i 3 min. aspirat supernatanten og suspendere celler i en pre varmede hPSC medium.
- Indføre 12 µL af cellesuspension (1,2 × 106 celler/mL) i hver mikrofluid kammer.
Bemærk: Introducere celler til et kammer fra en anden ved hjælp af en mikropipette. Fordi antallet af celler seedet til afdelingerne er proportional med kolonnen tæthed over salen gulvet, kan den første celle-seeding tæthed kontrolleres, selv om prøver fra samme cellesuspension blev brugt. Sikre pipettering gøres forsigtigt. Fjern overskydende medium fra kamre ved hjælp af en bomuld tippes pind efter lastning. Matrixen MACME er kompatibel med både almindeligt anvendte laboratorium pipetter og automatiseret pipette systemer, og det kræver ikke nogen særligt udstyr. - Ændre hPSC medium hver 12 h og kultur i 4 dage.
Bemærk: Konstante mængder af medium (1,6, 3.2 og 6,4 µL) vedligeholdes ved hjælp af afdelingerne med forskellige størrelser. Kultur celler under en statisk tilstand til at minimere shear stress bortset fra udveksling af celle næringssubstratet35,36.
3. kvantitative encellede profilering
-
Plade fluorescerende celle farvning
Bemærk: for at analysere fænotypiske forandringer af selvstændige forny hPSCs, denne protokol valgt tre vigtige fænotypiske markører for denne protokol: OCT4, 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU), og Annexin V, til at måle status for pluripotency, spredning og apoptose , henholdsvis (figur 2b). 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) bruges til at identificere cellekerner. OCT4 er en af de kritiske transkriptionsfaktorer for pluripotency.- Inkuber H9 hESCs i MACME arrays i hPSC medium suppleret med 10 µM EdU alkyn ved 37 ° C i 30 min.
- Efter vask med annexin binding buffer (10 mM HEPES (pH 7,4), 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCl2), pletten celler med en orange-fluorescerende farvestof-Annexin V konjugat ved 20 ° C i 15 min.
- Fix celler i PBS med 4% (v/v) PARAFORMALDEHYD ved 20 ° C i 15 min, og derefter skylles celler med PBS to gange.
- Permeabilize celler ved hjælp af PBS med 0,3% (v/v) Triton X-100 ved 20 ° C i 16 h.
Bemærk: PARAFORMALDEHYD svækker bånd mellem en plast bundplade og en PDMS mikrofluid struktur. Udstationering af laget PDMS fra array på trin 3.2.1 kan således også udføres lige efter dette trin. - Inkuber celler i Tris-baserede reaktion buffer med et rødt-fluorescerende farvestof indeholder ved 20 ° C i 30 min.
- Inkuber celler i blokerende buffer (PBS med 5% (v/v) normal ged serum, 5% (v/v) normal æsel serum, 3% (w/v) bovin serumalbumin, 0,1% (v/v) Tween-20, og 0,1% (w/v) N-dodecyl-β-D-maltoside) ved 4 ° C for 16 h.
- Inkuber i PBS med 0,5% (v/v) Triton X-100 løsning og menneskelige OCT3/4 antistof (mus IgG) ved 4 ° C for 16 h.
- Inkuber i blokerende buffer med grønt-fluorescerende farvestof-mærket æsel anti-mus IgG (H + L) ved 37 ° C i 60 min.
- Der inkuberes i PBS med DAPI ved 20 ° C i 30 min.
- Erstatte PBS-DAPI med PBS.
- Bevare matrixen MACME ved 4 ° C indtil billede erhvervelse.
-
Billed tilegnelse (figur 4)
- Skrælle PDMS mikrofluid struktur fra matrixen MACME.
- Fjern de resterende PBS fra matrixen MACME, anvende 90%(v/v) glycerol i PBS til cellerne og placere coverslips over de farvede celler.
- Sæt pladen op og ned på scenen i en inverteret fluorescens mikroskop.
- Erhverve 12-bit Farvebilleder automatisk ved hjælp af alle motoriserede komponenter (fase, filtre, lukker og fokus systemer), der blev styret af et mikroskop imaging software.
Bemærk. I denne protokol, eksponering tidspunkter er justeret for at nå i nærheden af maksimal intensitetsværdier (højeste pixel intensitet: 4096), men ingen mætning, for hvert billede, DAPI, OCT4, Annexin V og EdU.
-
Computer-styrede billedbehandling og fluorescens signal kvantificering (figur 5)
Bemærk: følgende celle billedanalyse udføres baseret på en tidligere beskrevne metode37.- Konvertere farvebilleder til gråtoner.
- Beregne en enkelt grænseværdi for hver DAPI billede med metoden Otsu og klassificere pixels tærskel som forgrund og nedenfor som baggrund. Sikre, at forgrundsviden værdi svarer til fluorescerende intensiteten af DAPI.
Bemærk: Billede analyse proces indeholder 5 trin; identifikation af primære objekter i DAPI billeder, identifikation af sekundære genstande i OCT4, Annexin V og EdU billeder, henholdsvis, og måling af objektet intensitet. Figur 3 indeholder billeder af anskuelighed brugergrænseflade (GUI) om fastsættelse af billedbehandling. - Måle de fluorescerende intensiteter i OCT4 og EdU på hvert billede.
- Identificere regionen farves med Annexin V med formeringsmetode og kvantificere de fluorescerende intensitet.
-
3.4. den statistiske analyse at visualisere individuelle cellulære fænotyper på én celle imaging
- Normalisere de input fluorescerende intensiteter af hver fænotypiske markør af centrering og skalering disse variabler for at give dem samme vægt.
- Udføre selvorganiserende kort (SOM) analyse ved hjælp af en Softwaremiljø for statistisk databehandling og grafik som beskrevet af tidligere undersøgelser38,39.
- Oprette 25 SOM noder med karakteristiske fire "Hawari vektorer" svarende til de fluorescerende intensiteter af fire markører, DAPI, EdU, Annexin V og OCT4.
- Tildele individuelle celler i hver mikromiljø til en "vindende" (mest lignende) node, og plot som celle frekvens, hvorefter Hawari vektorer af noden vindende opdateres ved hjælp af et vægtet gennemsnit, hvor vægten er læring sats (her, 0,05 som standard).
Bemærk: Udelad data fra kamre, der indeholder mindre end 1.000 celler, fordi datasæt indeholdende et par celler ikke giver statistisk relevante SOM resultater.
- Udføre uovervåget hierarkisk klynger med i as-node værdier ved hjælp af metoden gennemsnit-koblingen baseret på Pearson korrelation af en klyngedannelse software40.
- Gøre klyngedannelse dataene i dendrogram og heatmap udsigt41.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
MACME arrays: Design og produktion: I kombination med nanofiber teknologi brugte vi mikrofluid cellekultur og screeningsteknikker ansat tidligere at identificere optimale betingelser for hPSC selvfornyelse eller differentiering35,36 (figur 1). Dette er velegnet til oprettelse af robust høj overførselshastighed cellebaserede assays, fordi den celle kultur kamre, og betingelser er netop styrbar og kan udvides42,43,44. Her, blev matrixen nanofiber udarbejdet af en enkel nanofiber deposition metode, electrospinning med 3D-trykt masker. Mikrofluid del blev fabrikeret med en 3D-trykt mug kan nemt designe strukturen afdeling gennem mange forsøg og fejl. Matrixen MACME blev bygget ved at kombinere de to dele og indeholdt 48 miljøer, giver forskellige biofysiske og biokemiske stikord af forskellige kombinationer af begge nanofiber ECMs (3 typer af nanofiber materialer og 4 forskellige tætheder eller 4 kontrol matrix proteiner) og celle-celle interaktioner (3 serier af oprindelige celle-seeding tæthed) som vist i figur 2.
Evaluering af overordnede virkninger af nanofiber egenskaber og cellulære tæthed på menneskelige stamceller fænotyper: Efter cellekultur på en MACME array og på plade fluorescerende farvning (fig. 6A), encellede målinger blev udført med de erhvervede billeder. Til sammenligning af homogenitet og heterogenitet af udtryk niveauer for de fire fænotypiske markører i hvert datasæt, anvendes denne protokol SOM analyse38,39, som konverterer high-dimensionelle, multiparametric datasæt ind lavdimensional 2D kort. Navnlig var resultaterne af PS nanofibers og 2DGT matricer udeladt fra denne analyse i betragtning af at de fleste celler ikke kunne placeres. Derudover blev udelukkes fra denne analyse disse eksperimenter med lav CD hvor celler ikke har nok direkte (f.eks. juxtacrine) eller indirekte (paracrine) interaktioner at overleve. Efter SOM analyse, ukontrollerede hierarkisk klyngedannelse blev udført for alle analyserede prøver (fig. 6B) SOM noder. Ved at overveje højde af klyngen dendrogram, de fænotypiske forskelle tillod os at kategorisere prøverne i tre grupper: gruppe i, de fleste af prøven nicher bestående af GT nanofibers, MG_HighCD og VN_HighCD; Gruppe ii, prøver som indeholder GT nanofibers (GT_XLow og MidNF_MidCD), MG_MidCD eller VN_MidCD; og gruppe iii, alle PMGI_NF prøver.
For at undersøge forskelle blandt grupperne, undersøgte vi en repræsentativ prøve fra hver gruppe (figur 6C; Gruppe i-GT_MidNF_HighCD, gruppe ii-GT_MidNF_MidCD, og gruppe iii-PMGI_MidNF_HighCD). Med hensyn til OCT4 signaler viste alle grupper en højere udtryk end for MG (MG_MidCD). Gruppen jeg var kendetegnet ved høj EdU signaler, der angiver, at de fleste celler aktivt prolifererende. Således forkortet microenvironments i gruppe jeg blev karakteriseret som betingelser egnet til hPSC vedligeholdelse fordi udifferentierede hPSCs typisk formere sig hurtigt når cellecyklus gap faser var45,46.
GT_MidNF_HighCD og GT_MidNF_MidCD er kendetegnet ved deres særskilte indledende celle-lastetæthed. Høj oprindelige celle tætheder øget celler muligheder for at interagere med tilstødende celler, der forbedrede deres overlevelse og spredning47. Celler seedede på en utilstrækkelig indledende tæthed (3,0 × 104 celler/cm2) hverken overlevede eller voksede i løbet af forsøgsperioden (4 dage). Derfor, vi ikke indarbejde disse prøver i SOM analyse; celle numre var under afskæringen af 1000 levende celler/kammer. 2DGT stilladser cellerne blev også kategoriseret som gruppe ii celler; disse forhold understøtter ikke hPSC selvfornyelse48. GT_MidNF_MidCD celler EdU signal var tabt og Annexin V niveauer blev lidt forhøjet, der angiver, at cellerne havde mistet deres stemness og havde efterhånden apoptotiske. PMGI_MidNF_HighCD, som repræsenterer microenvironments bestående af PMGI nanofiber matricer, viste de større variationer i OCT4 og EdU signaler i forhold til de andre betingelser.
Figur 1 . Screening strategi for at identificere optimal cellulære microenvironments for at regulere cellulære funktioner. (A) oversigt over komponenterne i matrixen multipleksede kunstige cellulære mikromiljø (MACME). Matrixen består af to hoveddele: nanofiber senge mønstret på en basal substrat (nanofiber array) og en Polydimethylsiloxan (PDMS)-baseret mikrofluid struktur. Matrixen MACME er i stand til at forberede nanofiber ECMs med en bred vifte af funktioner (dvs. nanofiber materialer og tætheder) og forskellige celle såning tætheder. PDMS mikrofluid struktur af matrixen MACME indeholder tre mikrofluid-kanalen højder (250, 500 og 1000 µm) til at regulere den oprindelige celle-seeding tæthed. (B) virkningen af cellulære microenvironments på celle fænotyper vurderes kvantitativt ved hjælp af en afbildningsbaseret encellede analyse og statistiske dataanalyse af selvorganiserende kort (SOM) efterfulgt af hierarkisk klyngedannelse. Dette tal var tilpasset fra reference49 med tilladelse fra Wiley. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 . Design af matrixen MACME. (A) Overhead og høj-vinkel skud af matrixen hele MACME og den begrebsmæssige diagram af en mikrofluid kanal (lyseblå) på en nanofiber matrix (lyserød). Hver kanal består af en 700 µm bred og 8.4 mm lang kultur kammer og to fjorde for indførelsen af medium og celler. (B) sammenligning af størrelserne på cellerne og nanofiber matricer. Højderne af celler og nanofiber senge spænder fra 1-3 µm og 0,05-5,0 µm, henholdsvis. (C) et tværsnit af hver mikrofluid kanal med 250/500/1000 µm højde. Celler og nanofiber senge er repræsenteret som blå cirkler og orange linjer, henholdsvis. Hvert kammer har samme bredde og længde men forskellige højder (250, 500 og 1000 µm), og hver afdeling volumen var 1,6, 3.2 og 6,4 µL, henholdsvis. Den sort punkteret rektangel i figur 2C betegner figur 2B. Figur 2 var tilpasset fra reference49 med tilladelse fra Wiley. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 . Fabrikation af MACME array. (A) fabrikation i en nanofiber array. Mønster flere nanofiber matricer på en sokkel blev udført af modificerede electrospinning ved hjælp af et sæt af masker forsynet med mønstrede huller. Platinum-belægning blev udført for at lette nanofiber depositionen på en plastik sokkel. Masker med særskilte hul-mønstre blev udarbejdet af en 3D-printer. Efter maskering af området platin-belagt af pladen, plade-maske sæt blev sat på skærmbilledet samling, og normal electrospinning blev udført. De første nanofibers blev dannet ved Pt-belagt positioner på pladen gennem hullerne i masken. Yderligere nanofiber senge var fabrikeret på pladen ved at erstatte den eksisterende maske og gentage proceduren. (B) fremstilling af en mikrofluid struktur. Formen Udprintet af en 3D-printer med UV-helbredes harpiks formet PDMS lag af mikrofluid enhed. Efter støbning, var MACME array samlet ved at knytte et PDMS-baserede mikrofluid lag med en overflade-aktiveret nanofiber array. Figur 3 var tilpasset fra reference49 med tilladelse fra Wiley. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 . Billeder af grafiske brugergrænseflader (GUI) til mikroskopisk billede erhvervelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 . Billeder af grafiske brugergrænseflader (GUI) af computer-styrede billedbehandling for encellede fænotyper. Billede analyse proces indeholder 5 trin; (A) identifikation af primære objekter i DAPI billeder, (B-D) identifikation af sekundære genstande i OCT4, Annexin V og EdU billeder, henholdsvis, og måling af objektet intensitet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6 . Fænotyper og klassificering af fænotyper af H9 hESCs ændret af microenvironmental faktorer. (A) immunfluorescent billeder af H9 hESCs kulturperler på høje indledende seeding tæthed på gelatine (GT) nanofibers (GT_HighNF_HighCD), farves med tre cellulære fænotypiske markører (OCT4, pluripotency; EdU, celleproliferation; Annexin V, apoptose) og DAPI for cellekerner. (B) en heatmap og dendrograms af ukontrollerede hierarkisk klyngedannelse. De testede microenvironments var inddeles i tre grupper med karakteristiske træk baseret på ligheder i fænotyper. Gruppen jeg inkluderet GT nanofibers, MG_HighCD og VN_HighCD. Gruppe ii bestod af prøver af GT nanofibers (GT_XLow og MidNF_MidCD), MG_MidCD eller VN_MidCD. Alle PMGI_NF prøver var grupperet i gruppe iii. I heatmap angive pink og blå farver høje og lave cellulære frekvenser i SOM Grev parceller, henholdsvis. (C) Distribution af kvantificerede markør udtryk niveauer af 1000 celler i en repræsentativ prøve fra hver gruppe (gruppe i-GT_MidNF_HighCD, gruppe ii-GT_MidNF_MidCD, og gruppe iii-PMGI_MidNF_HighCD). 25 og 75 percentiler blev angivet som boks grænser. Knurhår udvide til 1,5 gange det interkvartil udvalg fra de 25 og 75 percentiler. Forsøgene blev gentaget tre gange for hver gruppe. Figur 6 A-C blev tilpasset fra reference49 med tilladelse fra Wiley. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Navn | Kanal længde (mm) | Kanal bredde (μm) | Kanal højde (μm) | Indløb/udløb diameter (μm) | Indløb/udløb højde (μm) | Skimmel længde (mm) | Skimmel bredde (mm) | Skimmel højde (mm) |
| Skimmel | 8.4 | 700 | 250/500/1000 | 800 | 3000 | 127.76 | 85.48 | 14.35 |
| Navn | Tykkelse (μm) | Hul længde (mm) | Hul bredde (mm) | Maske længde (mm) | Maske bredde (mm) | Skimmel højde (mm) | Række Offset (mm) | Kolonne Offset (mm) |
| Maske | 1000 | 6 | 5 | 123,5 | 80,2 | 14.35 | 11.24 | 14.38 |
Tabel 1. Dimensioner af formen for en mikrofluid struktur og maske for et nanofiber mønster.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol viser den første screeningsmetode for at etablere en robust kultur system til vedligeholdelse af kvalificerede hPSCs. Første gang, vi beskrevet hvordan du forbereder en platform, byder forskellige kunstige ECMs og celle såning tætheder ved hjælp af en mikrofluid enhed integreret med en nanofiber array, MACME array. Andet, kvantitative image-baserede encellede fænotyper blev udført50 til at vurdere individuelle cellulære resultater og adfærd ændres af forskellige biokemiske og biofysiske funktioner. I denne protokol, var miljø bestående af GT nanofiber og positiv kontrol ECM proteiner i stand af høje oprindelige celle såning tæthed kendetegnet ved funktioner af en udifferentieret stat; hurtig spredning45 og stabil OCT4 udtryk51. Dette observation indiceret, molekylære mekanismer vedrørende "celle-ekstracellulære matrix" og "celle-celle" interaktioner kan påvirke pluripotency af hPSCs.
Denne strategi kan tilpasses passer til brugerens formål. For eksempel, kan celle manipulation og overførselshastighed justeres for en række eksperimentelle indstillinger ved re-designe figurer og mønstre i strukturen mikrofluid. Som en anden måde for overførselshastighed forbedring, er hvert kammer indsugnings- og udstødningsporte holdninger designet som pr mikrotiterplade standard af 96-brønd plader, standardiseret af samfundet biomolekylære videnskaber; således kan en automatiseret robot flydende dispenser bruges til high throughput screening. For at yderligere for at undersøge den molekylære mekanisme vedrørende "Celle-ECM interaktioner", kan de kunstige cellulære microenvironments gøres til mere præcist efterligne i vivo betingelser ved kemisk ændring af nanofibers med signalering molekyler52 .
Til dato, har de fleste platforme udviklet til screening af cellulære microenvironments været rettet mod screening opløselige faktorer (fx vækstfaktorer og kemiske forbindelser)42,43,44, men ikke nanofiber ECMs grund vanskeligheder med at kombinere de forskellige fabrication teknikker. For eksempel, en nanofiber ark producerer en lille kløft mellem en mikrofluid struktur og en sokkel og forårsager deres ustabile limning, hvilket resulterer i krydskontaminering mellem forskellige prøver, fordi overfladekultur blandes med en anden afdeling en gennem det lille hul. Vores nye metode letter enkel og præcis fabrikation af nanofiber matricer på bestemte steder og giver deres direkte limning med sokkel, hvilket forhindrer både ustabile limning og krydskontaminering. Derudover få platforme53 integreret med mikrofluidik og nanofiber matricer har været tilgængelige for systematisk manipulation af både kemiske og fysiske signaler til at undersøge deres effekter på cellefunktioner, fordi teknologier nødvendige for integration var meget sofistikeret. Vores encellede profilering med MACME array kan udføres med en let opnåelige apparater og enkle teknikker og rummer et stort potentiale for brug i modellering cellulære miljøer for udviklingsmæssige og celle biologiske undersøgelser og drug discovery / screening.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
Vi takker Prof. N. Nakatsuji på iCeMS, Kyoto University, for at give humane ES-celler. Vi takker også Prof. A. Maruyama på Tokyo Institute of Technology for hans støtte i brugen af atomic force microscope. Finansiering blev generøst leveret af Japan samfund til fremme af videnskab (JSP'ER; 22350104, 23681028, 25886006 og 24656502); finansieringen blev også leveret af den nye energi og industrielle teknologi udvikling Organization (NEDO) og Terumo Life Science Foundation. WPI-iCeMS understøttes af verden Premier International Research Center initiativ (WPI), Ministeriet for uddannelse, kultur, sport, videnskab og teknologi (MEXT), Japan. En del af dette arbejde blev støttet af Kyoto University nanoteknologi Hub og AIST Nano-behandlingsanlæg i "Nanotechnology Platform projekt" sponsoreret af MEXT, Japan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polystyrene (PS) | Sigma | #182435 | Average Mw: 290,000, average Mn: 130,000 |
| Polymethylglutarimide (PMGI) | MicroChem | G113113 | |
| Gelatin (GT) | Sigma | G2625 | From porcine skin, type A |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Doe Corning Toray | #1064291 | PDMS curing agent and silicone elastomer base are components of this kit. |
| OpenSCAD | This is a free 3D computer graphics software (http://www.openscad.org/) used for designing the mold of the microfluidic device. | ||
| AutoCAD 2014 | Autodesk | This is a 3D computer graphics software (https://www.autodesk.com/products/autocad/overview) used for design of the mask used on nanofiber-array preparation. | |
| 3D printer, AGILISTA-3000 | Keyence | ||
| UV-curable resin, AR-M2 | Keyence | This is used for 3D printing by Agilista. | |
| Acetic acid | Sigma | #338826 | ≥99.99% |
| Ethyl acetate | Sigma | #270989 | Anhydrous, 99.8% |
| Tetrahydrofuran (THF) | Sigma | #401757 | |
| MSP-30T | Vacuum Device | Magnetron sputtering machine | |
| Nunc OmniTray | Thermo Fisher Scientific | #242811 | This is a polystyrene baseplate on which the nanofiber array is created. This plate size is typically 127.7 x 85.5 mm. |
| Gun-type corona discharge machine | Shinko Electric & Instrumentation | CFG-500 | This handy device is used to generate corona for activation of the bottom surface of the PDMS layer at step 1.5 "Assembly of the MACME arrays" in the protocol. |
| 5 mL syringe | Terumo | SS-05SZ | |
| Stainless-steel blunt needle (23-gauge) | Nipro | #2166 | Outside diameter and length are 0.6 and 32 mm, respectively. |
| High-voltage power supply | TechDempaz | ||
| 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide, hydrochloride | Dojindo | W001 | |
| N-Hydroxysuccinimide | Sigma | #56480 | |
| Matrigel hESC-Qualified Matrix | Corning | #354277 | This protein is refered as basement membrane gel matrix in the protocol. |
| CellAdhere Vitronectin, Human, Solution | STEMCELL Technologies | #07004 | |
| TeSR-E8 | STEMCELL Technologies | #05940 | Feeder-free, xeno-free culture medium for maintenance of human ES and iPS cells |
| Y-27632 | Wako Pure Chemical Industries | #253-00513 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red | Thermo Fisher Scientific | #12605028 | This ia a recombinant trypsin-like protease for dissociation of adherant mammalian cells. |
| Click-iT EdU Imaging Kit with Alexa Fluor 647 Azides | Thermo Fisher Scientific | C10086 | The fluorescent labeling of proliferating cells in on-plate fluorescent staining was performed along the product manual of this kit. |
| Annexin V, Alexa Fluor 594 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A13203 | |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Oct-3/4 Antibody (C-10) | Santa Cruz Biotechnology | sc-5279 | |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (DyLight 488) | abcam | ab96875 | This is a secondary antibody used in on-plate fluorescent cell staining. |
| ECLIPSE Ti-E | Nikon | This is an inverted fluorescence microscope equipped with a CFI Plan Fluor 4×/0.13 N.A. objective lens (Nikon), CCD camera (ORCA-R2, Hamamatsu), mercury lamp (Intensilight, Nikon), XYZ automated stage (Ti-S-ER motorized stage with encoders, Nikon), and filter cubes for four fluorescence channels (DAPI, GFP HYQ, TRITC, Cy5; Nikon) | |
| NIS-Elements Advanced Research | Nikon | This is a microscope imaging software used for automatic image acquisition. | |
| CellProfiler, Version 2.1.0 | This is a free open software for cell image analysis (http://cellprofiler.org/). | ||
| R | SOM analysis is performed by kohonen package of this software. This is freely available (https://www.r-project.org/). | ||
| Cluster 3.0 | This is the open source clustering software (http://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster/software.htm). Unsupervised hierarchical clustering is performed with this software. | ||
| Java TreeView | This open source software (http://jtreeview.sourceforge.net/) is used to visualize clustering data as a heatmap and a dendrogram. | ||
| H9 human embryonic stem cell | WiCell Stem Cell Bank | WA09 |
References
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Ameen, C., et al. Human embryonic stem cells: Current technologies and emerging industrial applications. Crit Rev Oncol Hematol. 65 (1), 54-80 (2008).
- Nishikawa, S., Goldstein, R. A., Nierras, C. R. The promise of human induced pluripotent stem cells for research and therapy. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (9), 725-729 (2008).
- Robinton, D. A., Daley, G. Q. The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy. Nature. 481 (7381), 295-305 (2012).
- Sartipy, P., Bjorquist, P., Strehl, R., Hyllner, J. The application of human embryonic stem cell technologies to drug discovery. Drug Discovery Today. 12 (17-18), 688-699 (2007).
- Discher, D. E., Mooney, D. J., Zandstra, P. W. Growth factors, matrices, and forces combine and control stem cells. Science. 324 (5935), 1673-1677 (2009).
- Joyce, J. A., Pollard, J. W. Microenvironmental regulation of metastasis. Nat Rev Cancer. 9 (4), 239-252 (2009).
- Danhier, F., Feron, O., Preat, V. To exploit the tumor microenvironment: Passive and active tumor targeting of nanocarriers for anti-cancer drug delivery. J Control Release. 148 (2), 135-146 (2010).
- Murphy, W. L., McDevitt, T. C., Engler, A. J. Materials as stem cell regulators. Nat Mater. 13 (6), 547-557 (2014).
- Patel, A. K., et al. A defined synthetic substrate for serum-free culture of human stem cell derived cardiomyocytes with improved functional maturity identified using combinatorial materials microarrays. Biomaterials. 61, 257-265 (2015).
- Zhang, R., et al. A thermoresponsive and chemically defined hydrogel for long-term culture of human embryonic stem cells. Nat Commun. 4, (2013).
- Anderson, D. G., Putnam, D., Lavik, E. B., Mahmood, T. A., Langer, R. Biomaterial microarrays: rapid, microscale screening of polymer-cell interaction. Biomaterials. 26 (23), 4892-4897 (2005).
- Celiz, A. D., et al. Discovery of a Novel Polymer for Human Pluripotent Stem Cell Expansion and Multilineage Differentiation. Adv Mater. 27 (27), 4006-4012 (2015).
- Hansen, A., et al. High-Density Polymer Microarrays: Identifying Synthetic Polymers that Control Human Embryonic Stem Cell Growth. Adv Healthcare Mater. 3 (6), 848-853 (2014).
- Mei, Y., et al. A high throughput micro-array system of polymer surfaces for the manipulation of primary pancreatic islet cells. Biomaterials. 31 (34), 8989-8995 (2010).
- Saha, K., et al. Surface-engineered substrates for improved human pluripotent stem cell culture under fully defined conditions. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (46), 18714-18719 (2011).
- Bettinger, C. J., Langer, R., Borenstein, J. T. Engineering substrate topography at the micro- and nanoscale to control cell function. Angew Chem Int Ed Engl. 48 (30), 5406-5415 (2009).
- McMurray, R. J., et al. Nanoscale surfaces for the long-term maintenance of mesenchymal stem cell phenotype and multipotency. Nat Mater. 10 (8), 637-644 (2011).
- Sun, Y., Jallerat, Q., Szymanski, J. M., Feinberg, A. W. Conformal nanopatterning of extracellular matrix proteins onto topographically complex surfaces. Nat Methods. 12 (2), 134-136 (2015).
- Nitanan, T., et al. Effects of processing parameters on morphology of electrospun polystyrene nanofibers. Korean J Chem Eng. 29 (2), 173-181 (2012).
- Liu, L., et al. Chemically-defined scaffolds created with electrospun synthetic nanofibers to maintain mouse embryonic stem cell culture under feeder-free conditions. Biotechnol Lett. 34 (10), 1951-1957 (2012).
- Liu, L., et al. Nanofibrous gelatin substrates for long-term expansion of human pluripotent stem cells. Biomaterials. 35 (24), 6259-6267 (2014).
- Kamei, K., et al. Phenotypic and transcriptional modulation of human pluripotent stem cells induced by nano/microfabrication materials. Adv Healthcare Mater. 2 (2), 287-291 (2013).
- Peerani, R., et al. Niche-mediated control of human embryonic stem cell self-renewal and differentiation. EMBO J. 26 (22), 4744-4755 (2007).
- Yamamoto, K., et al. Fluid shear stress induces differentiation of Flk-1-positive embryonic stem cells into vascular endothelial cells in vitro. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 288 (4), 1915-1924 (2005).
- Charati, S. G., Stern, S. A. Diffusion of gases in silicone polymers: Molecular dynamics simulations. Macromolecules. 31 (16), 5529-5535 (1998).
- Prado-Lopez, S., et al. Hypoxia promotes efficient differentiation of human embryonic stem cells to functional endothelium. Stem Cells. 28 (3), 407-418 (2010).
- Yanagihara, K., et al. Prediction of Differentiation Tendency Toward Hepatocytes from Gene Expression in Undifferentiated Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cells and Development. 25 (24), 1884-1897 (2016).
- Kamei, K., et al. 3D printing of soft lithography mold for rapid production of polydimethylsiloxane-based microfluidic devices for cell stimulation with concentration gradients. Biomed Microdevices. 17 (2), (2015).
- Song, J. H., Kim, H. E., Kim, H. W. Production of electrospun gelatin nanofiber by water-based co-solvent approach. J Mater Sci Mater Med. 19 (1), 95-102 (2008).
- Owen, M. J., Smith, P. J. Plasma Treatment of Polydimethylsiloxane. J Adhes Sci Technol. 8 (10), 1063-1075 (1994).
- Chen, G. K., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nat Methods. 8 (5), 424-476 (2011).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25 (6), 681-686 (2007).
- Kamei, K., et al. An integrated microfluidic culture device for quantitative analysis of human embryonic stem cells. Lab Chip. 9 (4), 555-563 (2009).
- Kamei, K., et al. Microfluidic image cytometry for quantitative single-cell profiling of human pluripotent stem cells in chemically defined conditions. Lab Chip. 10 (9), 1113-1119 (2010).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7 (10), 100 (2006).
- Kohonen, T. Self-Organized Formation of Topologically Correct Feature Maps. Biol Cybern. 43 (1), 59-69 (1982).
- Wehrens, R., Buydens, L. M. C. Self- and super-organizing maps in R: The kohonen package. J Stat Softw. 21 (5), 1-19 (2007).
- Eisen, M. B., Spellman, P. T., Brown, P. O., Botstein, D. Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (25), 14863-14868 (1998).
- Saldanha, A. J. Java Treeview--extensible visualization of microarray data. Bioinformatics. 20 (17), 3246-3248 (2004).
- Du, G. S., Fang, Q., den Toonder, J. M. J. Microfluidics for cell-based high throughput screening platformsd-A review. Anal Chim Acta. 903, 36-50 (2016).
- Huang, S. B., et al. An integrated microfluidic cell culture system for high-throughput perfusion three-dimensional cell culture-based assays: effect of cell culture model on the results of chemosensitivity assays dagger. Lab Chip. 13 (6), 1133-1143 (2013).
- Wang, B. L., et al. Microfluidic high-throughput culturing of single cells for selection based on extracellular metabolite production or consumption. Nat Biotechnol. 32 (5), 473 (2014).
- Becker, K. A., et al. Self-renewal of human embryonic stem cells is supported by a shortened G1 cell cycle phase. J Cell Physiol. 209 (3), 883-893 (2006).
- Neganova, I., Lako, M. G1 to S phase cell cycle transition in somatic and embryonic stem cells. J Anat. 213 (1), 30-44 (2008).
- Fox, V., et al. Cell-cell signaling through NOTCH regulates human embryonic stem cell proliferation. Stem Cells. 26 (3), 715-723 (2008).
- Xu, C., et al. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 19 (10), 971-974 (2001).
- Kamei, K., et al. Microfluidic-Nanofiber Hybrid Array for Screening of Cellular Microenvironments. Small. 13 (18), (2017).
- Sun, J., et al. A Microfluidic Platform for Systems Pathology: Multiparameter Single-Cell Signaling Measurements of Clinical Brain Tumor Specimens. Cancer Res. 70 (15), 6128-6138 (2010).
- Theunissen, T. W., Jaenisch, R. Molecular Control of Induced Pluripotency. Cell Stem Cell. 14 (6), 720-734 (2014).
- Yoo, H. S., Kim, T. G., Park, T. G. Surface-functionalized electrospun nanofibers for tissue engineering and drug delivery. Adv Drug Del Rev. 61 (12), 1033-1042 (2009).
- Dixon, J. E., et al. Combined hydrogels that switch human pluripotent stem cells from self-renewal to differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (15), 5580-5585 (2014).
