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JoVE Journal Bioengineering
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Bioengineering

Fabbricazione di una matrice di multiplex artificiale microambiente cellulare

Published: September 7, 2018 doi: 10.3791/57377
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 1, 1, 1, 1, 3, 2, 4, 1,5, 1,6, 1
1Institute for Integrated Cell-Material Sciences (WPI-iCeMS), Kyoto University, 2Department of Life Science and Technology, School of Life Science and Technology, Tokyo Institute of Technology, 3Biomaterials Center for Regenerative Medical Engineering, Foundation for Advancement of International Science, 4Faculty of Science and Natural Resources, Universiti Malaysia Sabah, 5Institute for Chemical Research, Kyoto University, 6Ecole Normale Supérieure

Summary

Questo articolo descrive la metodologia dettagliata per preparare una matrice Multiplexed artificiale microambiente cellulare (MACME) per manipolazione di alto-rendimento di fisica e chimica di stecche che imita in vivo cellulare microambienti e a identificare l'ambiente cellulare ottima per le cellule staminali pluripotenti umane (hPSCs) con l'analisi di singole cellule.

Abstract

Microambienti cellulari consistono di una varietà di segnali, quali fattori di crescita, matrici extracellulari e interazioni intercellulari. Questi spunti sono ben orchestrati e sono fondamentali nella regolazione di funzioni cellulari in un sistema vivente. Anche se un numero di ricercatori hanno tentato di studiare la correlazione tra fattori ambientali e funzioni cellulari desiderate, molto rimane sconosciuto. Questo è in gran parte a causa della mancanza di una corretta metodologia di imitare tali stimoli ambientali in vitroe testare simultaneamente diversi stimoli ambientali sulle cellule. Qui, segnaliamo una piattaforma integrata di canali microfluidici e una matrice di nanofibra, seguita da analisi unicellulare ad alto contenuto, per esaminare i fenotipi di cellule staminali alterati da fattori ambientali distinti. Per illustrare l'applicazione di questa piattaforma, questo studio si concentra sui fenotipi di autorinnovanti cellule staminali pluripotenti umane (hPSCs). Qui, presentiamo le procedure di preparazione per una matrice di nanofibra e la struttura di microfluidica nella fabbricazione di una matrice di Multiplexed artificiale microambiente cellulare (MACME). Inoltre, procedura generale della singolo-cella profilatura, con marcatori fluorescenti multiple, multiple imaging di fluorescenza e analisi statistiche, di colorazione cellulare è descritti.

Introduction

Pluripotenti umane cellule staminali (hPSCs)1,2 auto-rinnovarsi illimitatamente e differenziare in varie linee cellulari del tessuto, che potrebbero rivoluzionare lo sviluppo di farmaci, terapie basate su cellule, ingegneria tissutale e medicina rigenerativa 3 , 4 , 5 , 6. cultura generale piatti e piastre di microtitolazione, tuttavia, non sono progettati per consentire la manipolazione precisa delle cellule fisiche e chimiche a livello cellulare con la gamma di nano - per micrometri, che è un fattore critico per l'espansione cellulare, auto-rinnovamento e differenziazione. Per risolvere questo inconveniente, studi hanno studiato i ruoli di microambienti cellulari nella regolazione decisioni di destino delle cellule e cellula funzioni4. Negli ultimi anni, un numero crescente di studi è stati condotti per ricostruire microambienti cellulari in vitro7,8. Processi di nano - e micro-fabbricazione hanno stabilito questi microambienti attraverso la manipolazione chimica9,10,11,12,13, 14,15,16,17 e stimoli ambientali fisici18,19,20 . Fino ad ora, c'erano rapporti di indagare sistematicamente i meccanismi di fondo di stimoli ambientali chimici e fisici sulle decisioni di destino delle cellule e funzioni all'interno di una singola piattaforma.

Qui, presentiamo una strategia basata sui principi di progettazione semplice per stabilire una piattaforma di screening robusto (Figura 1). In primo luogo, descriviamo la procedura di sviluppo di una piattaforma integrata per la creazione di microambienti cellulare versatile, artificiale utilizzando una matrice di nanofibra e una struttura di microfluidica: matrice di The Multiplexed artificiale cellulare microambiente (MACME) (Figura 1A e 2A). La matrice di nanofibra ha 12 differenti microambienti in diverse combinazioni di materiali nanofibra e densità. Elettrofilatura è stato usato per fabbricare le nanofibre. I materiali di nanofibra, quali polistirolo (PS)21, polymethylglutarimide (PMGI)22e gelatina (GT)23, sono stati progettati per testare le loro proprietà chimiche, che possono pregiudicare adesione cellulare e mantenimento della pluripotenza ( Figura 2B). Nanofibra densità sono state variate cambiando tempo elettrofilatura e le nanofibre generate sono state definite secondo la loro densità (DNF, con D = XLow/bassi/medi/alti). La struttura di microfluidica è composta di polidimetilsilossano (PDMS) che harboring 48 alloggiamenti di coltura cellulare, che possono essere posizionate lungo le dimensioni standard della micropiastra 96 pozzetti. PDMS è un polimero biocompatibile e gas-exchangeable generalmente usato per fabbricare di dispositivi microfluidici24. Ogni canale di microfluidica è stato progettato per essere 700 µm di larghezza e 8,4 mm lungo e aveva due ingressi ai relativi bordi (tabella 1). La chambers ebbe diverse altezze (250, 500 e 1000 µm) per manipolare le densità iniziale delle cellule-semina (0.3, 0.6 e 1.2 × 105 cellule/cm2), che potrebbero correlare con la sopravvivenza, proliferazione e differenziazione di hPSCs25 (Figura 2C). Il numero delle cellule seminate in una camera è proporzionale alla densità di colonna sopra il pavimento di camera, e così semina la densità iniziale delle cellule era controllata introducendo la stessa sospensione di cellule in alloggiamenti di cultura con diverse altezze. Tutti i canali sono stati progettati per essere ≥ 250 µm-altezza26 per minimizzare gli effetti di tensione basso ossigeno27 e shear stress28 sulle cellule. Altezze di canale di 250, 500 e 1000 µm sono abbreviate qui come XCD con X = Low, Mid e High, rispettivamente. Gli ambienti con nanofibra distinte densità e densità di semina delle cellule iniziali sono stati accorciati come "Material_NF density_Cell densità" (ad es., GT_HighNF_HighCD: un ambiente caratterizzato da nanofibre GT ad alta densità e alta cella-seeding iniziale densità).

Successivamente, descriviamo come eseguire analisi unicellulare per studiare sistematicamente il comportamento delle cellule in risposta a fattori ambientali (Figura 1B). Come un proof-of-concept, abbiamo identificato l'ambiente cellulare ottima per hPSC auto-rinnovamento, che è una funzione chiave per hPSC manutenzione (Figura 1B)29. Basata su immagine cytometry, seguita da analisi statistiche, consente di interpretazione quantitativa delle singole risposte cellulari fenotipiche agli ambienti cellulari. Tra una varietà di funzioni cellulari, questo libro fornisce una procedura dettagliata per individuare le condizioni ottimale per il mantenimento di hPSC auto-rinnovamento.

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Protocol

1. fabbricazione di matrice MACME

Nota: Tutti i materiali e le attrezzature sono elencati nella tabella materiali.

  1. Preparazione di maschere per una matrice di nanofibra e uno stampo per una struttura di microfluidica
    1. Creare immagini tridimensionali (3D) di maschere utilizzate per il nanofibra matrici e stampi per strutture di microfluidica utilizzando pacchetti software 3D-computer grafica (tabella 1).
      Nota: Le immagini 3D vengono letti e stampate da una stampante 3D. Le maschere stampate e muffa hanno le stesse dimensioni con immagini 3D definite utilizzando il software di grafica al punto 1.1.1.
    2. Stampare maschere e uno stampo sulla base di questi disegni utilizzando una stampante 3D.
      Nota: In questo protocollo, una stampante 3D di ink-jet-come con resina UV-curable era usato30. La risoluzione della stampante è stato 635 × 400 dpi e 15 µm in X, Y e Z, rispettivamente, tuttavia, la reale X, risoluzione Y era circa quattro volte inferiore.
  2. Preparazione di nanofibre-matrice (Figura 3A)
    1. Preparare soluzioni di polimeri per elettrofilatura.
      1. Diluire il liquido PMGI 13% con tetraidrofurano 9% (p/v)22.
      2. Sciogliere 0,08 g di PS (peso molecolare medio numerico (Mn): 130.000) in THF:dimethylformamide (rapporto 1:1 in volume)21e aggiungere THF:dimethylformamide per portare il volume fino al livello finale mL 1 (soluzione all'8% (p/v) PS).
      3. Sciogliere 0,1 g di GT in acqua: acido acetico: Etilacetato (rapporto volume 1:1.6:2.1) e aggiungere acqua: acido acetico: Etilacetato per portare il volume fino al livello finale mL 1 (soluzione al 10% (p/v) GT) come descritto23,31.
    2. Utilizzare un macchina di polverizzazione del magnetron, depositare un sottile strato di platino con uno spessore di 5 nm su un polistirene (PS) piastra di base (127.7 × 85,5 mm), che funge da catodo nel setup elettrofilatura.
    3. Caricare ogni soluzione di polimero in una siringa da 5 mL con ago smussato in acciaio inox 23-G.
    4. Posizionare e ancorare la siringa con l'ago su una pompa a siringa con 12 cm a parte il collettore del dispositivo elettrofilatura.
    5. Collegare l'ago della siringa ad un alimentatore ad alta tensione e set da applicare a 11 kV.
    6. Impostare la velocità di pompaggio di 0,2 mL/h.
    7. Mantenere la temperatura e l'umidità a 30 ° C e < 30% (v/v).
    8. Mettere la maschera sulla piastra di base preparato al punto 1.2.2.
    9. Fabbricare le nanofibre sulla piastra di base attraverso i fori della maschera con densità distinti modificando l'ora di elettrofilatura (ad es., 20, 60, 90 e 180 s).
    10. Rimuovere la maschera dalla piastra di base.
      Nota. Etanolo può essere spruzzato sulle nanofibre GT elettrofilate prima di rimuovere la maschera per evitare staccando le nanofibre GT insieme con la maschera.
    11. Ripetere il passaggio 1.2.4-1.2.10 fino al completamento della fabbricazione di nanofibra-matrice.
    12. Inserire la matrice di nanofibra in un essiccatore a 25 ° C per 16 h per far evaporare il solvente residuo.
    13. Crosslink GT nanofibre con 0,2 M 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide cloridrato (EDC) e 0,2 M N-Idrossisuccinimide (NHS) in etanolo a 25 ° C per 4 h23.
    14. Sciacquare le nanofibre GT due volte con etanolo 99,5% (v/v) e vuoto-a secco a 25 ° C per 16 h.
  3. Fabbricazione di strutture di microfluidica (Figura 3B)
    1. Mescolare 2 g di PDMS indurimento agente e 20 g di base PDMS (01:10 peso rapporto; Pre-PDMS). 24
    2. Versare il composto di pre-PDMS su stampo fabbricato al punto 1.2.
    3. De-gas la miscela di pre-PDMS in un essiccatore per 30 min.
    4. Curare la miscela di pre-PDMS in un forno a 65 ° C per 16 h.
  4. Matrici assembly di MACME (Figura 3B)
    1. Staccare la struttura PDMS curata al punto 1.3.4 dallo stampo e pulito con etanolo al 70% (v/v).
    2. Trattare la scarica atmosferica corona sul lato inferiore del PDMS struttura32.
      Nota: In questo protocollo, la corona viene scaricata su tutta la superficie di uno strato di 3 o 4 volte con un apparato di effetto corona "Handy". Trattamento al plasma di ossigeno è stato sostituito con Scarica corona atmosferica per alterare l'adesività superficiale.
    3. Assemblare la struttura PDMS con la matrice di nanofibra rapidamente.
    4. Cuocere in forno a 65° C per 2 giorni.

2. caricamento hESCs in MACME matrice

  1. Per la coltura sistematica di H9 cellule staminali embrionali umane (hESC), mantenere le cellule in xeno-libero chimicamente definito terreno di coltura per hPSC manutenzione33 completati con 10 µM Y-27632 ROCK inibitore34 (denominato hPSC medio) in una coltura cellulare di 35 mm piatto rivestito con matrice di gel della membrana dello scantinato (MG).
  2. Cellule di passaggio ogni 4-7 giorni utilizzando una proteasi tripsina-simile ricombinante.
  3. Sterilizzare una matrice MACME con etanolo 99,5%, di caricamento negli alloggiamenti per 10 min e quindi rimuovere l'etanolo. Ripetere l'operazione 3 volte.
  4. Introdurre 12 µ l di MG, 10 µ g/mL vitronectina (VN), e 0,1% (p/v) GT nel controllo cultura chambers e incubare gli alloggiamenti a 37 ° C per 1 h a loro cappotto sulle superfici di alloggiamento.
    Nota: In questo protocollo, MG, VN e GT sono stati selezionati come proteine di riferimento per adesione delle cellule e la cultura. Perché MG e VN sono matrici standard di coltura cellulare per mantenere hPSC auto-rinnovamento, sono usati come controlli positivi; rivestimento di GT bidimensionale (2DGT) o non-rivestimento (NC) sono stati utilizzati come controlli negativi.
  5. Introdurre pre-riscaldato hPSC medio in tutti gli alloggiamenti della matrice MACME. Incubare gli alloggiamenti per 30 min a 37 ° C.
  6. Lavare H9 hESC coltivate su un piatto da 35 mm con DPBS, aggiungere 0,5 mL di una proteasi tripsina-simile ricombinante al piatto e incubare a 37 ° C per 1 min e aspirare accuratamente solo i surnatanti mescolati con proteasi.
    Nota: Nella fase di aspirazione, le cellule non sono staccate.
  7. Aggiungere immediatamente hPSC medio, versare delicatamente il mezzo contro la superficie del piatto ripetutamente per dissociare le cellule e trasferire le cellule indipendente a un tubo conico di 15 mL.
  8. Centrifugare a 200 x g per 3 min. aspirare il supernatante e sospendere le cellule in un mezzo di hPSC pre-riscaldato.
  9. Introdurre 12 µ l della sospensione delle cellule (1,2 × 106 cellule/mL) in ogni camera microfluidica.
    Nota: Introdurre le cellule per una camera da un altro utilizzando una micropipetta. Poiché il numero delle cellule seminate nelle stanze è proporzionale alla densità di colonna sopra il pavimento di camera, la densità di semina cellulare iniziale potrebbe essere controllata anche se sono stati utilizzati campioni da sospensione cellulare stesso. Garantire il pipettaggio è fatto delicatamente. Rimuovere eccesso di terreno dalle camere con un bastoncino di cotone con punta dopo il caricamento. La matrice MACME è compatibile con sistemi automatizzati pipetta e pipette da laboratorio comunemente usati, e non richiede particolari attrezzature.
  10. Cambiare la sostanza hPSC ogni 12 h e cultura per 4 giorni.
    Nota: Volumi di costante del mezzo (1.6, 3.2 e 6,4 µ l) vengono gestite tramite camere di diverse dimensioni. Cellule di cultura sotto una condizione statica per ridurre al minimo la sollecitazione di taglio fatta eccezione per lo scambio del terreno di coltura cellulare35,36.

3. quantitativo unicellulare profilatura

  1. Macchiatura delle cellule fluorescenti su piastra
    Nota:     per analizzare i cambiamenti fenotipici di autorinnovanti hPSCs, questo protocollo selezionato tre marcatori fenotipici chiavi per questo protocollo: OCT4, 5-Etinil-2'-deoxyuridine (EdU) e Annessina V, per misurare lo stato di pluripotenza, proliferazione e apoptosi , rispettivamente (Figura 2b). 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) viene utilizzato per identificare i nuclei delle cellule. OCT4 è uno dei fattori di trascrizione critica di pluripotenza.
    1. Incubare H9 hESCs in matrici MACME in hPSC supplementato con alchini di EdU 10 µM a 37 ° C per 30 min.
    2. Dopo il lavaggio con annessina-associazione buffer (10 mM HEPES (pH 7.4), 140 mM NaCl, 2.5 mM CaCl2), macchia le celle con un coniugato di V Annexin colorante arancione fluorescente a 20 ° C per 15 min.
    3. Difficoltà cellule in PBS con paraformaldeide al 4% (v/v) a 20 ° C per 15 min e risciacquare le cellule con PBS due volte.
    4. Permeabilize celle utilizzando PBS con 0,3% (v/v) X-100 Triton a 20 ° C per 16 h.
      Nota: Paraformaldeide indebolisce il legame tra una piastra di base in plastica e una struttura di microfluidica PDMS. Così, il distacco dello strato PDMS dalla matrice al punto 3.2.1 può essere eseguito anche dopo questo passaggio.
    5. Incubare le cellule in tampone di reazione basata su Tris con un azoturo di colorante rosso fluorescente a 20 ° C per 30 min.
    6. Incubare le cellule in tampone bloccante (PBS con siero di capra normale 5% (v/v), siero di donkey normale 5% (v/v), albumina di siero bovino di 3% (p/v), 0.1% (v/v) di Tween-20 e 0,1% (p/v) N-dodecil-β-D-maltoside) a 4 ° C per 16 h.
    7. Incubare in PBS con 0.5% (v/v) soluzione di Triton X-100 e umano OCT3/4 anticorpo (IgG di topo) a 4 ° C per 16 h.
    8. Incubare in tampone bloccante con del anti-mouse verde fluorescente tingere-contrassegnati asino IgG (H + L) a 37 ° C per 60 min.
    9. Incubare in PBS con DAPI a 20 ° C per 30 min.
    10. Sostituire PBS-DAPI con PBS.
    11. Preservare la matrice MACME a 4 ° C fino alla acquisizione immagine.
  2. Acquisizione immagini (Figura 4)
    1. Rimuovere la struttura di microfluidica PDMS dalla matrice MACME.
    2. Rimuovere il PBS residuo dalla matrice MACME, applicare 90%(v/v) glicerolo in PBS le cellule e posizionare i vetrini coprioggetti sopra le cellule marcate.
    3. Mettere la piastra capovolta sul palco di un microscopio a fluorescenza invertito.
    4. Acquisire immagini a colori di 12 bit utilizzando automaticamente tutti i componenti motorizzati (fase, filtri, otturatore e sistemi di messa a fuoco) che sono stati controllati da un microscopio software di imaging.
      Nota. In questo protocollo, tempi di esposizione vengono regolati per raggiungere vicino a valori di intensità massima (massima intensità di pixel: 4096), ma non la saturazione, per ogni immagine, DAPI, OCT4, Annessina V ed EdU.
  3. Quantificazione del segnale di fluorescenza e di elaborazione delle immagini di computer-guidata (Figura 5)
    Nota:     la seguente analisi di immagine di cella viene eseguita basata su un metodo descritto in precedenza37.
    1. Convertire immagini a colori in scala di grigi.
    2. Calcolare un valore di soglia singola per ogni immagine DAPI con il metodo Otsu e classificare pixel sopra la soglia come primo piano e di seguito come sfondo. Assicurarsi che il valore foreground corrisponde all'intensità fluorescente di DAPI.
      Nota: Il processo di analisi di immagine contiene 5 passi; identificazione di oggetti principali in DAPI immagini, identificazione di oggetti secondari in OCT4, Annessina V ed EdU immagini, rispettivamente e la misurazione dell'intensità di oggetto. Figura 3 fornisce le immagini dell'interfaccia di utente grafica (GUI) all'impostazione di elaborazione delle immagini.
    3. Misurare le intensità fluorescente di OCT4 ed EdU su ogni immagine.
    4. Identificare l'area macchiata con Annessina V con il metodo di propagazione e quantificare l'intensità di fluorescenza.
  4. 3.4. statistica analisi di visualizzare singoli fenotipi cellulari su formazione immagine singola cellula
    1. Normalizzare le intensità fluorescente inpue di ogni marcatore fenotipico di centratura e ridimensionamento queste variabili per dare loro uguale peso.
    2. Eseguire auto-organizzanti mappa (SOM) analisi utilizzando un ambiente software per elaborazione statistica e grafica come descritto da precedenti studi38,39.
      1. Creare 25 SOM nodi con distintivo quattro "codebook vettori" corrispondente alle intensità fluorescente di quattro indicatori, DAPI, EdU, Annessina V e OCT4.
      2. Assegnare le singole celle in ogni microambiente a un nodo (più simile) "vincente" e tracciare come frequenza di cella, in base al quale i vettori del codebook del nodo vincente vengono aggiornati utilizzando una media ponderata, in cui il peso è il tasso di apprendimento (qui, 0.05 come (impostazione predefinita).
        Nota: Omettere dati da camere contenenti meno di 1.000 cellule perché DataSet contenente alcune cellule non ha fornito risultati statisticamente rilevanti SOM.
    3. Eseguire il clustering gerarchico non supervisionato con i valori di SOM-nodo utilizzando il metodo di media-sollevatore basato sulla correlazione di Pearson di un clustering software40.
    4. Il rendering dei dati clustering in dendrogramma e heatmap viste41.

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Representative Results

Matrici MACME: progettazione e fabbricazione: In combinazione con la tecnologia di nanofibra, abbiamo usato coltura cellulare microfluidica e screening tecniche impiegate in precedenza per identificare le condizioni ottimali per hPSC auto-rinnovamento o differenziazione35,36 (Figura 1). Questo è adatto per stabilire solide analisi cell-based di alto-rendimento perché gli alloggiamenti di cultura delle cellule e le condizioni sono precisamente controllabile ed espandibile42,43,44. Qui, la matrice di nanofibra è stata preparata da un metodo di deposizione del semplice nanofibra, elettrofilatura con maschere 3D-stampato. La parte di microfluidica è stata fabbricata con uno stampo 3D-stampato facilmente progettare la struttura di alloggiamento attraverso molte prove ed errori. La matrice MACME è stata costruita combinando le due parti e contenuti 48 ambienti, offrendo diversi spunti di biofisiche e biochimiche di diverse combinazioni di entrambi nanofibra ECMs (3 tipi di materiali di nanofibra e 4 diverse densità o controllo 4 proteine della matrice) e interazioni cellula-cellula (3 gamme di densità cellulare-seeding iniziale) come illustrato nella Figura 2.

Valutazione degli effetti complessivi della nanofibra proprietà e cellulare densità sui fenotipi hESC: A seguito di coltura cellulare su una matrice MACME e su piastra (Figura 6A) di colorazione fluorescente, unicellulari sono state effettuate con le immagini acquisite. Per il confronto di omogeneità ed eterogeneità dei livelli di espressione per i quattro marcatori fenotipici in ogni set di dati, questo protocollo utilizzato SOM analisi38,39, che converte il DataSet multiparametrico, alto-dimensionali in mappe 2D bassa dimensionalità. In particolare, i risultati delle matrici di nanofibre e 2DGT PS sono stati omessi da questa analisi, dato che la maggior parte delle cellule non ha aderito. Inoltre, da questa analisi sono stati esclusi quegli esperimenti con basso CD dove le cellule non aveva abbastanza diretta (ad es., juxtacrine) o indiretta (paracrino) interazioni per sopravvivere. A seguito di analisi SOM, unsupervised clustering gerarchico è stato effettuato per i nodi SOM di tutti i campioni analizzati (Figura 6B). Considerando l'altezza del dendrogramma cluster, le differenze fenotipiche ci ha permesso di classificare i campioni in tre gruppi: gruppo i, la maggior parte delle nicchie di campione che comprende di nanofibre GT, MG_HighCD e VN_HighCD; Gruppo ii, campioni contenenti GT nanofibre (GT_XLow e MidNF_MidCD), MG_MidCD o VN_MidCD; e gruppo iii, tutti i campioni di PMGI_NF.

Per studiare le differenze fra i gruppi, abbiamo esaminato un campione rappresentativo di ciascun gruppo (Figura 6C; Gruppo i-GT_MidNF_HighCD, gruppo ii-GT_MidNF_MidCD e gruppo iii-PMGI_MidNF_HighCD). In termini di segnali OCT4, tutti i gruppi hanno mostrato una più alta espressione di quella di MG (MG_MidCD). Gruppo che stavo caratterizza alta EdU segnali, che indica che la maggior parte delle cellule attivamente stavano proliferando. Così, microambienti in gruppo fossi definì condizioni idonee per la manutenzione di hPSC perché hPSCs indifferenziato in genere proliferano rapidamente quando fasi di gap del ciclo cellulare sono stati ridotti45,46.

GT_MidNF_HighCD e GT_MidNF_MidCD si distinguono per la loro densità di cella-carico iniziale distinti. Densità elevata delle cellule iniziali maggiori opportunità di cellule di interagire con le cellule vicine, che ha aumentato la loro sopravvivenza e proliferazione47. Le cellule seminate ad una densità iniziale insufficiente (3,0 × 104 cellule/cm2) sopravvissero né crebbe durante il periodo sperimentale (4 giorni). Pertanto, non ha fatto inserire questi campioni nell'analisi SOM; numeri di cellulare erano sotto il cut-off di vivere 1000 cellule/camera. Le cellule su scaffold 2DGT inoltre sono state categorizzate come cellule di ii del gruppo; queste condizioni non supportano hPSC auto-rinnovamento48. EdU segnale delle cellule GT_MidNF_MidCD era perso e leggermente sono stati aumentati livelli di Annexin V, che indica che le cellule avevano perso il loro staminalità e avevano gradualmente diventano apoptotic. PMGI_MidNF_HighCD, che rappresenta i microambienti composto da matrici di nanofibra PMGI, ha mostrato le più grandi variazioni nei segnali OCT4 ed EdU confrontati con le altre condizioni.

Figure 1
Figura 1 . Strategia per identificare microambienti cellulare ottimale per la regolazione di funzioni cellulari di screening. (A) Panoramica dei componenti della matrice multiplex artificiale microambiente cellulare (MACME). La matrice è composta da due parti principali: nanofibra letti modellato su un substrato basale (nanofibra matrice) e un polidimetilsilossano (PDMS)-base di microfluidica struttura. La matrice MACME è in grado di preparare nanofibra ECMs con una varietà di caratteristiche (cioè, nanofibra materiali e densità) e cellulare di varie densità di semina. La struttura di microfluidica PDMS della matrice MACME dispone di tre altezze di canali microfluidici (250, 500 e 1000 µm) per regolare la densità di semina cella iniziale. (B) l'impatto dei microambienti cellulari su fenotipi cellulari viene valutata quantitativamente usando un'analisi di singola cellula basata su immagine e l'analisi di dati statistici di self-organizing mappa (SOM) seguita da clustering gerarchico. Questa figura è stata adattata da riferimento49 con permesso da Wiley. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2 . Disegno della matrice MACME. (A) Overhead e colpi di alto angolo dell'intera matrice MACME e il diagramma concettuale di un canale di microfluidica (luce blu) su una matrice di nanofibra (rosa). Ogni canale è composto di un 700 µm ampia e camera di coltura prolungata di 8,4 mm e due ingressi per l'introduzione dei media e delle cellule. (B) confronto delle dimensioni delle cellule e matrici di nanofibra. Le altezze delle cellule e nanofibra letti vanno da 1-3 µm e 0.05-5,0 µm, rispettivamente. (C) una sezione trasversale di ogni canale microfluidico con un'altezza di 250/500/1000 µm. Cellule e letti di nanofibra sono rappresentati come cerchi blu e righe arancioni, rispettivamente. Ogni camera ha la stessa larghezza e lunghezza ma diverse altezze (250, 500 e 1000 µm), e ogni volume della camera era 1.6, 3.2 e 6,4 µ l, rispettivamente. Il rettangolo punteggiato nero Figura 2C denota Figura 2B. Figura 2 è stato adattato da riferimento49 con permesso da Wiley. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3 . Fabbricazione di matrice MACME. (A) realizzazione di una matrice di nanofibra. Patterning multiple nanofibra matrici su una piastra di base è stato effettuato di elettrofilatura modificata utilizzando un set di maschere cuscinetto fori fantasia. Platino-rivestimento è stato effettuato per facilitare la deposizione di nanofibra su una piastra di base in plastica. Le maschere con foro-modelli distinti sono state preparate da una stampante 3D. Seguito di mascheramento della zona platino-rivestito della piastra, il set piastra-maschera era messo sullo schermo insieme, e normale elettrofilatura è stato effettuato. Le nanofibre iniziale sono state formate presso le posizioni rivestite con Pt sulla piastra attraverso i fori nella maschera. Nanofibra ulteriori letti erano stati fabbricati sul piatto sostituendo la maschera esistente e ripetere la procedura. (B) realizzazione di una struttura di microfluidica. Lo stampo stampato da una stampante 3D con resina UV-curable a forma lo strato PDMS del dispositivo microfluidico. Dopo la fusione, la matrice MACME è stata assemblata collegando uno strato microfluidici basati su PDMS con una matrice di nanofibra superficie-attivato. Nella figura 3 è stato adattato da riferimento49 con permesso da Wiley. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4 . Immagini delle interfacce utente grafiche (GUI) per l'acquisizione immagine microscopica. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5 . Immagini delle interfacce utente grafiche (GUI) guidato dal computer di elaborazione delle immagini per cella singola phenotyping. Il processo di analisi di immagine contiene 5 passi; (A) identificazione di oggetti principali in DAPI immagini, (B-D) identificazione di oggetti secondari in OCT4, Annessina V ed EdU immagini, rispettivamente e la misurazione dell'intensità di oggetto. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6 . Phenotyping e classificazione dei fenotipi di H9 hESCs alterate da fattori microambientali. (A) immunofluorescente immagini di H9 hESC coltivate ad alta densità di semina iniziale su nanofibre di gelatina (GT) (GT_HighNF_HighCD), macchiato con tre marcatori fenotipici cellulari (OCT4, pluripotenza; EdU, proliferazione delle cellule; Annessina V, apoptosi) e DAPI per nuclei delle cellule. (B) un heatmap e dendrogrammi di clustering gerarchico senza supervisione. I microambienti testati sono stati categorizzati in tre gruppi con caratteristiche distintive, sulla base di somiglianze dei fenotipi. Gruppo ho incluso le nanofibre GT, MG_HighCD e VN_HighCD. Gruppo ii ha consistito dei campioni di nanofibre GT (GT_XLow e MidNF_MidCD), MG_MidCD, o VN_MidCD. Tutti gli esempi di PMGI_NF sono stati raggruppati nel gruppo iii. Nell'heatmap, colori rosa e blu indicano frequenze alte e basse cellulare SOM conteggio piazzole, rispettivamente. (C) distribuzione dei livelli di espressione del marcatore quantificati di 1000 cellule un campione rappresentativo di ogni gruppo (gruppo i-GT_MidNF_HighCD, gruppo ii-GT_MidNF_MidCD e gruppo iii-PMGI_MidNF_HighCD). I percentili 25 e 75 ° sono stati indicati come i limiti di casella. I baffi si estendono a 1,5 volte l'intervallo interquartile dai percentili 25 e 75 °. Gli esperimenti sono stati ripetuti tre volte per ogni gruppo. Figura 6 A-C sono stati adattati da riferimento49 con permesso da Wiley. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Nome Canale lunghezza (mm) Larghezza del canale (μm) Altezza del canale (μm) Diametro entrata/uscita (μm) Altezza ingresso/uscita (μm) Stampo lunghezza (mm) Stampo larghezza (mm) Altezza della muffa (mm)
Muffa 8.4 700 250/500/1000 800 3000 127.76 85,48 14.35
Nome Spessore (μm) Lunghezza del foro (mm) Larghezza foro (mm) Maschera lunghezza (mm) Maschera larghezza (mm) Altezza della muffa (mm) Offset di riga (mm) Offset di colonna (mm)
Maschera 1000 6 5 123,5 80,2 14.35 11,24 14,38

Tabella 1. Dimensioni di stampo per una struttura di microfluidica e maschera per una campitura di nanofibra.

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Discussion

Questo protocollo viene illustrato il primo metodo di screening per stabilire un sistema di cultura robusta per la manutenzione di hPSCs qualificato. In primo luogo, abbiamo descritto come preparare una piattaforma con diversi ECMs artificiale e densità di semina utilizzando un dispositivo microfluidico integrato con una matrice di nanofibra, la matrice MACME cellulare. Secondo, quantitativa basata su immagine unicellulare phenotyping era eseguita50 per valutare risultati cellulari individuali e comportamenti alterati da distinte caratteristiche biochimiche e biofisiche. In questo protocollo, l'ambiente composto da GT nanofibra e proteine ECM controllo positivo nella condizione di alta densità di semina iniziale delle cellule è stato caratterizzato dalle caratteristiche di uno stato indifferenziato; rapida proliferazione45 e stabile OCT4 espressione51. Questa osservazione ha indicato che i meccanismi molecolari relativi alla "cellula matrice extracellulare" e "cella" interazioni potrebbero influenzare pluripotenza di hPSCs.

Questa strategia può essere personalizzata per soddisfare scopo dell'utente. Ad esempio, velocità effettiva e manipolazione delle cellule può essere regolate per una varietà di impostazioni sperimentali di ri-progettare le forme e modelli della struttura microfluidica. Come un altro modo per miglioramento velocità effettiva, le posizioni di ingresso e di uscita di ogni camera sono state progettate secondo lo standard di micropiastre di piastre a 96 pozzetti, standardizzata dalla società delle Scienze Biomolecolari; così, un dispenser liquido robot automatizzato può essere utilizzato per high throughput screening. Per più ulteriormente esaminare il meccanismo molecolare riguardo "Interazioni cellula-ECM", l'artificiale microambienti cellulare possono essere fatto per imitare più precisamente le condizioni in vivo modificando chimicamente le nanofibre con segnalazione molecole52 .

Ad oggi, la maggior parte delle piattaforme sviluppate per lo screening di microambienti cellulari sono stata indirizzate a fattori solubili (ad es., fattori di crescita e composti chimici)42,43,44, ma non nanofibra ECMs a causa di screening Difficoltà a coniugare le tecniche di fabbricazione distinti. Ad esempio, un foglio di nanofibra produce un piccolo divario tra una struttura di microfluidica e una piastra di base e causa loro legame instabile, che si traduce in cross-contaminazione tra diversi campioni perché un terreno di coltura si mescolano con uno un'altra camera attraverso il piccolo spazio. Il nostro nuovo metodo facilita il montaggio semplice e preciso di nanofibra matrici in siti specifici e consente loro legame diretto con la piastra di base, che impedisce sia legame instabile e la contaminazione incrociata. Inoltre, alcune piattaforme53 integrato con microfluidica e matrici di nanofibra sono stati accessibili per la sistematica manipolazione dei segnali di fisiche e chimiche per studiare i loro effetti sulle funzioni delle cellule, perché le tecnologie necessarie per l'integrazione erano altamente sofisticati. Nostra singola cellula profilatura con la matrice MACME può essere eseguita con un apparecchio facilmente raggiungibile e tecniche semplici e ha un grande potenziale per l'uso in ambienti cellulari per di modellazione inerente allo sviluppo e cellulare studi biologici e scoperta di nuovi farmaci / screening.

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Disclosures

Nessuno.

Acknowledgments

Ringraziamo la Prof. ssa N. Nakatsuji alla iCeMS, Università di Kyoto, per la fornitura di cellule umane ES. Ringraziamo anche la Prof. ssa A. Maruyama Tokyo Institute of Technology per il suo sostegno nell'uso del microscopio a forza atomica. Finanziamento è stato generosamente fornito dalla società Giappone per la promozione della scienza (JSPS; 22350104, 23681028, 25886006 e 24656502); finanziamento è stato fornito anche dalla nuova energia e organizzazione di sviluppo industriale tecnologia (NEDO) e la Fondazione di Life Science di Terumo. Il WPI-iCeMS è supportato da mondo Premier International Research Centre iniziativa (WPI), il Ministero della pubblica istruzione, cultura, sport, scienza e tecnologia (MEXT), Giappone. Una parte di questo lavoro è stata supportata da Kyoto University Nanotechnology Hub e l'impianto di Nano-elaborazione AIST in "Progetto di piattaforma nanotecnologie" sponsorizzato da MEXT, Giappone.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Polystyrene (PS) Sigma #182435 Average Mw: 290,000, average Mn: 130,000
Polymethylglutarimide (PMGI) MicroChem G113113
Gelatin (GT) Sigma G2625 From porcine skin, type A
Sylgard 184 silicone elastomer kit Doe Corning Toray #1064291 PDMS curing agent and silicone elastomer base are components of this kit.
OpenSCAD This is a free 3D computer graphics software (http://www.openscad.org/) used for designing the mold of the microfluidic device.
AutoCAD 2014 Autodesk This is a 3D computer graphics software (https://www.autodesk.com/products/autocad/overview) used for design of the mask used on nanofiber-array preparation.
3D printer, AGILISTA-3000 Keyence
UV-curable resin, AR-M2 Keyence This is used for 3D printing by Agilista.
Acetic acid Sigma #338826 ≥99.99%
Ethyl acetate Sigma #270989 Anhydrous, 99.8%
Tetrahydrofuran (THF) Sigma #401757
MSP-30T Vacuum Device Magnetron sputtering machine
Nunc OmniTray Thermo Fisher Scientific #242811 This is a polystyrene baseplate on which the nanofiber array is created. This plate size is typically 127.7 x 85.5 mm. 
Gun-type corona discharge machine Shinko Electric & Instrumentation CFG-500 This handy device is used to generate corona for activation of the bottom surface of the PDMS layer at step 1.5 "Assembly of the MACME arrays" in the protocol.
5 mL syringe Terumo SS-05SZ
Stainless-steel blunt needle (23-gauge) Nipro #2166 Outside diameter and length are 0.6 and 32 mm, respectively.
High-voltage power supply TechDempaz
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide, hydrochloride Dojindo W001
N-Hydroxysuccinimide Sigma #56480
Matrigel hESC-Qualified Matrix Corning #354277 This protein is refered as basement membrane gel matrix in the protocol.
CellAdhere Vitronectin, Human, Solution STEMCELL Technologies #07004
TeSR-E8 STEMCELL Technologies #05940 Feeder-free, xeno-free culture medium for maintenance of human ES and iPS cells
Y-27632 Wako Pure Chemical Industries #253-00513
TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red Thermo Fisher Scientific #12605028 This ia a recombinant trypsin-like protease for dissociation of adherant mammalian cells.
Click-iT EdU Imaging Kit with Alexa Fluor 647 Azides Thermo Fisher Scientific C10086 The fluorescent labeling of proliferating cells in on-plate fluorescent staining was performed along the product manual of this kit.
Annexin V, Alexa Fluor 594 conjugate Thermo Fisher Scientific A13203
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Thermo Fisher Scientific D1306
Oct-3/4 Antibody (C-10) Santa Cruz Biotechnology sc-5279
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (DyLight 488) abcam ab96875 This is a secondary antibody used in on-plate fluorescent cell staining.
ECLIPSE Ti-E Nikon This is an inverted fluorescence microscope equipped with a CFI Plan Fluor 4×/0.13 N.A. objective lens (Nikon), CCD camera (ORCA-R2, Hamamatsu), mercury lamp (Intensilight, Nikon), XYZ automated stage (Ti-S-ER motorized stage with encoders, Nikon), and filter cubes for four fluorescence channels (DAPI, GFP HYQ, TRITC, Cy5; Nikon)
NIS-Elements Advanced Research Nikon This is a microscope imaging software used for automatic image acquisition.
CellProfiler, Version 2.1.0 This is a free open software for cell image analysis (http://cellprofiler.org/).
R SOM analysis is performed by kohonen package of this software. This is freely available (https://www.r-project.org/).
Cluster 3.0 This is the open source clustering software (http://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster/software.htm). Unsupervised hierarchical clustering is performed with this software.
Java TreeView This open source software (http://jtreeview.sourceforge.net/) is used to visualize clustering data as a heatmap and a dendrogram.
H9 human embryonic stem cell WiCell Stem Cell Bank WA09

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Bioingegneria problema 139 microfluidica nanofibre sulle cellule staminali embrionali microambiente cellulare unicellulare profilatura auto-rinnovamento
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Mashimo, Y., Yoshioka, M., Tokunaga, … More

Mashimo, Y., Yoshioka, M., Tokunaga, Y., Fockenberg, C., Terada, S., Koyama, Y., Shibata-Seki, T., Yoshimoto, K., Sakai, R., Hakariya, H., Liu, L., Akaike, T., Kobatake, E., How, S. E., Uesugi, M., Chen, Y., Kamei, K. i. Fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment Array. J. Vis. Exp. (139), e57377, doi:10.3791/57377 (2018).

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