Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Fabrikasjon av en multiplex kunstig mobilnettet MicroEnvironment matrise

Published: September 7, 2018 doi: 10.3791/57377
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 1, 1, 1, 1, 3, 2, 4, 1,5, 1,6, 1
1Institute for Integrated Cell-Material Sciences (WPI-iCeMS), Kyoto University, 2Department of Life Science and Technology, School of Life Science and Technology, Tokyo Institute of Technology, 3Biomaterials Center for Regenerative Medical Engineering, Foundation for Advancement of International Science, 4Faculty of Science and Natural Resources, Universiti Malaysia Sabah, 5Institute for Chemical Research, Kyoto University, 6Ecole Normale Supérieure

Summary

Denne artikkelen beskriver detaljert metodikk for å forberede en multiplekset kunstig Cellular MicroEnvironment (MACME)-matrise for høy gjennomstrømming manipulering av fysiske og kjemiske pekepinner mimicking i vivo mobilnettet microenvironments og til identifisere optimal mobilnettet miljø for menneskelig pluripotent stamceller (hPSCs) med encellede profilering.

Abstract

Mobilnettet microenvironments består av en rekke signaler, som vekstfaktorer, ekstracellulære matriser og intercellulære interaksjoner. Disse pekepinner er godt organisert og er avgjørende i å regulere celle funksjoner i en levende system. Selv om mange forskere har forsøkt å undersøke sammenhengen mellom miljøfaktorer og ønsket cellulære funksjoner, fortsatt mye ukjent. Dette er hovedsakelig på grunn av mangel på en riktig metode for å etterligne slike miljømessige signaler i vitro, og samtidig teste ulike miljømessige signaler på celler. Her rapporterer vi et integrert plattform microfluidic kanaler og en nanofiber matrise, etterfulgt av høyt innhold én celle analyse, undersøke stamcelleforskningen fenotyper endres av forskjellige miljøfaktorer. For å demonstrere anvendelsen av denne plattformen, fokuserer denne studien på av fenotyper av selvtillit fornyelse menneskelige pluripotent stamceller (hPSCs). Her presenterer vi forberedelse prosedyrene for et nanofiber utvalg og microfluidic strukturen i produksjon av en multiplekset kunstig Cellular MicroEnvironment (MACME)-matrise. Videre, samlet av encellede profilering, celle farging med flere fluorescerende markører, flere fluorescens imaging og statistiske analyser, fremgangsmåtene.

Introduction

Menneskelige pluripotent stamceller (hPSCs)1,2 selvstendig fornye unlimitedly og skille ut forskjellige vev linjene, som kan revolusjonere narkotika utvikling, celle-basert behandling, vevet engineering og regenerativ medisin 3 , 4 , 5 , 6. generell kultur retter og være ferdig innen plater, men er ikke utformet slik at presis fysiske og kjemiske celle manipulasjon på cellenivå med et utvalg av nano - til mikro-meter, som er en kritisk faktor for mobilnettet ekspansjon, selvtillit fornyelse, og differensiering. For å løse denne ulempen, har studier undersøkt rollene til mobilnettet microenvironments i å regulere celle skjebne beslutninger og celle funksjoner4. De siste årene, har et økende antall studier vært gjennomført for å rekonstruere mobilnettet microenvironments i vitro7,8. Nano - og mikro-metallbearbeiding prosesser har etablert disse microenvironments gjennom manipulering av kjemiske9,10,11,12,13, 14,15,16,17 og fysiske18,19,20 miljømessige signaler. Inntil nå er det ikke systematisk undersøke de underliggende mekanismene av kjemiske og fysiske miljømessige signaler på cellen skjebne beslutninger og funksjoner i en enkelt plattform.

Her introduserer vi en strategi basert på enkel designprinsipper å etablere en robust screening plattform (figur 1). Først vi beskrive utviklingen prosedyren av en integrert plattform for å lage allsidig, kunstige mobilnettet microenvironments ved hjelp av en nanofiber-matrise og en microfluidic struktur: The multiplekset kunstig Cellular MicroEnvironment (MACME) matrise (Figur 1A og 2A). Nanofiber matrisen har 12 ulike microenvironments med ulike kombinasjoner av nanofiber materialer og tettheter. Electrospinning ble brukt til å dikte opp nanofibers. Nanofiber materialer, som polystyren (PS)21, polymethylglutarimide (PMGI)22og gelatin (GT)23, ble utviklet for å teste deres kjemiske egenskaper som kan påvirke celleadhesjon og vedlikehold av pluripotency ( Figur 2B). Nanofiber tettheter var varieres med electrospinning gang og de genererte nanofibers ble definert etter deres tettheter (BRUTT, med D = XLow/lav/Mid/høy). Microfluidic strukturen består av polydimethylsiloxane (PDMS) skjuler 48 celle-kultur chambers, som kan plasseres i standard dimensjoner i 96-brønnen microplate. PDMS er en biokompatible og gass-utskiftbare polymer som vanligvis brukes til å dikte microfluidic enheter24. Hver mikrovæskekanalen laget som 700-µm bred og 8.4 mm lang og hadde to innganger i kantene (tabell 1). Chambers hadde ulike høyder (250 500 og 1000 µm) å manipulere de første cellen-såing tettheter (0,3 og 0,6 1.2 × 105 celler/cm2), som kan relatere til overlevelse, spredning og differensiering av hPSCs25 (Figur 2C). Antall celler seeded i et kammer er proporsjonal med kolonnen tetthet over kammeret gulvet, og dermed første celle seeding tetthet ble kontrollert ved å innføre samme celle suspensjon i kultur kamre med ulike høyder. Alle kanaler var ment å være ≥ 250 µm høy26 å redusere effekten av lav oksygen spenning27 og skjæring stress28 på cellene. Kanal høyder av 250 500 og 1000 µm er forkortet her som XCD x = lav, Mid, og høy, henholdsvis. Miljøer med forskjellige nanofiber tettheter og første celle-såing tettheter var forkortet som "Material_NF density_Cell tetthet" (f.eks GT_HighNF_HighCD: et miljø preget av høy tetthet GT nanofibers og høy første celle-såing tetthet).

Deretter beskriver vi hvordan å utføre encellede analyser systematisk undersøke celle atferd svar for miljøfaktorer (figur 1B). Som en proof-of-concept identifisert vi det optimale mobilnettet miljøet for hPSC selv-fornyelse, som er en viktig funksjon hPSC vedlikehold (figur 1B)29. Image-basert cytometri, etterfulgt av statistiske analyser, gir kvantitative tolkning av individuelle mobilnettet fenotypiske svar på cellular miljøer. Blant en rekke cellulære funksjoner gir dette dokumentet en detaljert prosedyre for å identifisere de optimale forholdene for å opprettholde hPSC selvtillit fornyelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. fabrikasjon av MACME matrise

Merk: Alle materialer og utstyr er oppført i tabellen materialer.

  1. Forberedelse av masker til et nanofiber utvalg og en form for en microfluidic struktur
    1. Opprette tredimensjonale (3D) bilder av masker brukt for nanofiber matriser og former for microfluidic strukturer ved hjelp av 3D-datagrafikk programvarepakker (tabell 1).
      Merk: 3D-bilder leses og skrives ut i en 3D-skriver. Den trykte masker og mold har samme dimensjoner med 3D-bilder som er definert med grafikkfilterprogramvare på trinn 1.1.1.
    2. Skrive ut masker og en mold basert på disse design bruker en 3D-skriver.
      Merk: I denne protokollen var en ink-jet-like 3D skriver med UV-helbredelig harpiks brukte30. Skriveroppløsning var 635 × 400 dpi og 15 µm i X, Y og Z, henholdsvis, men den faktiske X, Y oppløsning var omtrent fire ganger lavere.
  2. Nanofiber-matrise forberedelse (Figur 3A)
    1. Klargjør polymer løsninger for electrospinning.
      1. Fortynne 13% PMGI væske med tetrahydrofuran av 9% (w/v)22.
      2. Oppløse 0,08 g PS (nummer-gjennomsnittlig molekylvekt (Mn): 130.000) i THF:dimethylformamide (1:1 volumkontrollen)21, og legge til THF:dimethylformamide for å bringe volumet til det siste 1 mL (8% (w/v) PS løsning).
      3. Oppløse 0,1 g GT i vann: eddiksyre acid: ethyl acetate (1:1.6:2.1 volumkontrollen), og tilsett vann: eddiksyre acid: ethyl acetate å bringe volumet til det siste 1 mL (10% (w/v) GT løsning) som beskrevet23,31.
    2. Bruk en magnetron sputtering maskin, innskudd platina løsmasse med 5-nm tykkelse på en polystyren (PS)-sokkelen (127.7 × 85.5 mm), som fungerer som en katode i oppsettet av electrospinning.
    3. Legg hver polymer løsning i en 5-mL sprøyte utstyrt med en 23-G rustfritt stål sløv nål.
    4. Plasser og forankre sprøyten med nålen på en sprøytepumpe med 12 cm fra kollektoren electrospinning enheten.
    5. Koble sprøytenålen til en høyspent strømforsyning og satt til gjelder 11 kV.
    6. Angi pumping hastigheten på 0,2 mL/t.
    7. Holde temperatur og luftfuktighet på 30 ° C og < 30% (v/v).
    8. Sette masken på sokkelen forberedt på trinn 1.2.2.
    9. Dikte nanofibers platen gjennom hullene av maske med forskjellige tettheter ved å endre electrospinning tiden (f.eks 20, 60, 90 og 180 s).
    10. Fjern masken fra sokkelen.
      Merk. Etanol kan sprayes på electrospun GT nanofibers før du fjerner masken for å unngå peeling av GT nanofibers sammen med masken.
    11. Gjenta trinn 1.2.4-1.2.10 til fullføring av nanofiber-matrise fabrikasjon.
    12. Plass nanofiber matrisen i en desiccator ved 25 ° C 16 h å fordampe gjenværende løsemiddelet.
    13. Crosslink GT nanofibers med 0,2 M 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydroklorid (EDC) og 0,2 M N-hydroxysuccinimide (NHS) i etanol ved 25 ° C til 4 h23.
    14. Skyll GT nanofibers to ganger med 99,5% (v/v) etanol og vakuum-tørr ved 25 ° C 16 h.
  3. Fabrikasjon av microfluidic strukturer (Figur 3B)
    1. Bland 2 g PDMS herding agent og 20 g PDMS base (1:10 vekt ratio; Pre-PDMS). 24
    2. Hell blandingen pre-PDMS på mold fabrikkert i trinn 1.2.
    3. De gass pre-PDMS blandingen i en desiccator i 30 min.
    4. Kurere pre-PDMS blandingen i en ovn ved 65 ° C i 16 h.
  4. Samling av MACME matriser (Figur 3B)
    1. Løsner PDMS strukturen kurert på trinn 1.3.4 fra formen og ren med 70% (v/v) etanol.
    2. Behandle atmosfæriske corona utslipp på undersiden av PDMS struktur32.
      Merk: I denne protokollen slippes corona på hele overflaten av et lag 3 eller 4 ganger med en "Handy" corona utslipp apparater. Oksygen plasma behandling ble erstattet med atmosfæriske corona utslipp å endre overflaten feste.
    3. Montere PDMS strukturen med nanofiber array raskt.
    4. Ovn-stek ved 65° C i 2 dager.

2. legge hESCs i MACME matrise

  1. For rutinemessig kultur H9 menneskelige embryonale stamceller (hESCs), vedlikeholde celler i xeno-fri kjemisk definert kultur medium for hPSC vedlikehold33 supplert med 10 µM Y-27632 ROCK hemmer34 (kalt hPSC medium) i en 35 mm cellekultur rett belagt med kjelleren membran gel matrix (MG).
  2. Passasjen cellene hver 4-7 dager med en rekombinant trypsin som protease.
  3. Sterilisere en MACME matrise med 99,5% etanol ved lasting i kamrene i 10 min, og fjern deretter etanol. Gjenta dette trinnet 3 ganger.
  4. Introdusere 12 µL mg, 10 µg/mL vitronectin (VN) og 0,1% (w/v) GT i kontroll kultur kamre og ruge chambers på 37 ° C 1t til coat dem. på kammeret overflater.
    Merk: I denne protokollen, ble MG, VN og GT valgt som referanse proteiner for celleadhesjon og kultur. Fordi MG og VN er standard cellekultur matriser brukes for å vedlikeholde hPSC selvtillit fornyelse, brukes de som positive kontroller; todimensjonal GT belegg (2DGT) eller ikke-belegg (NC) ble brukt som negative kontroller.
  5. Innføre forvarmes hPSC medium i alle chambers i MACME matrise. Inkuber kamrene i 30 min på 37 ° C.
  6. Vask H9 hESC kultivert på en 35 mm parabolen med DPBS, legge til 0,5 mL av en rekombinant trypsin som protease fatet og ruge ved 37 ° C i 1 min Sug opp nøye bare supernatants blandet med protease.
    Merk: Ved aspirasjon trinn, cellene, ikke kobles.
  7. Straks legge hPSC medium, forsiktig dispensere mediet mot tallerken overflaten å distansere celler og overføre frittstående cellene til en 15-mL konisk rør.
  8. Sentrifuge 200 x g for 3 min. leveringstanken nedbryting og låse celler i et forvarmes hPSC medium.
  9. Innføre 12 µL av cellen suspensjon (1,2 × 106 celler/mL) i hver microfluidic kammeret.
    Merk: Presentere celler for et kammer fra en annen bruker brønnene. Antall celler seeded til kamre er proporsjonal med kolonnen tetthet over kammeret gulvet, kan den første celle-såing tettheten kontrolleres selv prøver fra samme celle suspensjon ble brukt. Sikre pipettering gjøres forsiktig. Fjern overflødig medium fra kammer med en bomull-tipped pinne etter lasting. MACME matrisen er kompatibel med både brukte laboratorium Pipetter og automatiske pipetter systemer, og det krever ikke noe spesialutstyr.
  10. Endre hPSC medium hver 12t og kultur for 4 dager.
    Merk: Konstant mengder mediet (1.6, 3.2 og 6,4 µL) vedlikeholdes ved hjelp av kamrene av forskjellige størrelser. Kultur celler under en statisk tilstand å minimere skjæring stress unntatt utveksling av celle kultur medium35,36.

3. kvantitativ encellede profilering

  1. På plate fluorescerende celle flekker
    Merk:     for å analysere fenotypiske endringer av selvtillit fornyelse hPSCs, denne protokollen valgt tre viktige fenotypiske markører for denne protokollen: OCT4, 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU), og Annexin V, måle statusen for pluripotency og spredning apoptose , henholdsvis (figur 2b). 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) brukes til å identifisere celle kjerner. OCT4 er en av de kritiske transkripsjonsfaktorer for pluripotency.
    1. Inkuber H9 hESCs i MACME matriser i hPSC medium med 10 µM EdU alkyne på 37 ° C i 30 min.
    2. Etter vask med annexin-binding buffer (10 mM HEPES (pH 7.4), 140 mM NaCl, 2,5 CaCl2), beis cellene med en oransje-fluorescerende fargestoff-Annexin V konjugert ved 20 ° C i 15 min.
    3. Reparer celler i PBS med 4% (v/v) paraformaldehyde ved 20 ° C i 15 minutter, og skyll celler med PBS to ganger.
    4. Permeabilize celler med PBS med 0,3% (v/v) Triton X-100 ved 20 ° C i 16 h.
      Merk: Paraformaldehyde svekker bånd mellom en plast bunnplate og en PDMS microfluidic struktur. Dermed kan brøkdel av PDMS laget fra matrisen på trinn 3.2.1 også utføres rett etter dette trinnet.
    5. Inkuber celler i Tris-baserte reaksjon buffer med en rød-fluorescerende farge azide ved 20 ° C i 30 min.
    6. Inkuber celler i blokkering buffer (PBS med 5% (v/v) normal geit serum, 5% (v/v) normal esel serum, 3% (w/v) bovin serum albumin, 0,1% (v/v) Tween-20, og 0,1% (w/v) N-dodecyl-β-D-maltoside) ved 4 ° C 16 h.
    7. Inkuber i PBS med 0,5% (v/v) Triton X-100 løsning og menneskelig OCT3/4 antistoff (mus IgG) på 4 ° C 16 h.
    8. Inkuber blokkerer buffer med grønn-fluorescerende farge-merket esel anti-mus IgG (H + L) på 37 ° C for 60 min.
    9. Inkuber i PBS med DAPI ved 20 ° C i 30 min.
    10. Erstatt PBS-DAPI med PBS.
    11. Bevare MACME matrisen ved 4 ° C til bilde oppkjøpet.
  2. Image vinningen (Figur 4)
    1. Løsner PDMS microfluidic strukturen fra MACME array.
    2. Fjern gjenværende PBS fra MACME array, 90%(v/v) glyserol i PBS gjelder cellene og plasser coverslips over farget cellene.
    3. Stille inn platen opp ned på scenen av en invertert fluorescens mikroskop.
    4. Få 12-biters fargebilder automatisk med alle motorisert komponenter (scenen, filtre, lukker og fokus systemer) som var kontrollert av et mikroskop bildebehandlingsprogrammer.
      Merk. I denne protokollen, eksponeringstider er justert for å komme nær maksimal intensitetsverdiene (høyeste pixel intensitet: 4096), men ingen metning, for hvert bilde, DAPI, OCT4, Annexin V og EdU.
  3. Datamaskin-guidede bildebehandling og fluorescens signal kvantifisering (figur 5)
    Merk:     følgende celle bildeanalyse utføres basert på en tidligere beskrevet metoden37.
    1. Konverter fargebilder til gråtoner.
    2. Beregne en enkelt terskelverdi for hvert DAPI bilde med metoden Otsu og klassifisere piksler over sperregrensen forgrunnen og nedenfor som bakgrunn. Kontroller at forgrunnen verdien tilsvarer fluorescerende intensiteten av DAPI.
      Merk: Bildet analyseprosessen inneholder 5 trinn; Identifikasjon av primære objekter i DAPI bilder, identifikasjon av sekundær objekter i OCT4, Annexin V og EdU bilder, henholdsvis og måling av objektet. Figur 3 gir bilder av grafisk brukergrensesnitt (GUI) på innstillingen for bildebehandling.
    3. Måle fluorescerende intensiteten av OCT4 og EdU på hvert bilde.
    4. Identifisere regionen farget med Annexin V med metoden forplantning og kvantifisere fluorescerende intensiteten.
  4. 3.4. statistisk analyse å visualisere personlige mobilnettet fenotyper om encellede bildebehandling
    1. Normalisere input fluorescerende intensiteten av hver fenotypiske indikator av sentrering og skalering disse variablene gi dem lik vekt.
    2. Utføre selv-organisering kart (SOM) analyse ved hjelp av en programvaremiljø for statistiske og grafikk som beskrevet av tidligere studier38,39.
      1. Opprette 25 SOM noder med karakteristiske fire "føre vektorer," tilsvarer fluorescerende intensiteten av fire markører, DAPI, EdU, Annexin V og OCT4.
      2. Tilordne individuelle celler i hver microenvironment til en "vinne" (mest ligner) node og plot som cellen frekvens, som føre vektorer i noden vinnende oppdateres bruker en avveid gjennomsnitt, hvor vekten er læring rate (her, 0,05 som standard).
        Merk: Utelat data fra chambers som inneholder mindre enn 1000 celler fordi datasett som inneholder noen celler ikke gi statistisk relevante SOM resultater.
    3. Utføre unsupervised hierarkisk klynger med verdiene SOM-node med metoden gjennomsnitt-kobling basert på Pearson korrelasjon av en klynging programvare40.
    4. Gjengi klynging dataene i dendrogram og heatmap viser41.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

MACME matriser: Design og fabrikasjon: I kombinasjon med nanofiber teknologi brukte vi microfluidic cellekultur og screening teknikker ansatt tidligere å identifisere optimale forhold for hPSC selvtillit fornyelse eller differensiering35,36 (figur 1). Dette er velegnet for å etablere robust høy gjennomstrømming cellebasert analyser fordi cellen kultur kamre og betingelser er nettopp kontrollerbar og utvides42,43,44. Her ble nanofiber matrisen utarbeidet av en enkel nanofiber avsettelse metode, electrospinning med 3D-trykt masker. Den microfluidic delen ble fabrikert med en 3D-trykt form lett utforme kammer strukturen gjennom mange prøvelser og feil. MACME matrisen ble bygget ved å kombinere de to delene og inneholdt 48 miljøer, gir forskjellige Biofysiske og biokjemiske pekepinner varierende kombinasjoner av begge nanofiber ECMs (3 typer nanofiber materialer og 4 forskjellige tettheter eller 4 kontroll Matrix proteiner) og celle-celle interaksjoner (3 områder av første celle-såing) som vist i figur 2.

Vurdering av samlede effekten av nanofiber egenskaper og cellular på hESC fenotyper: Etter cellekultur MACME matrise og på-plate fluorescerende flekker (figur 6A), encellede målinger ble utført med ervervet bilder. For å sammenligne homogenitet og heterogenitet av uttrykk for fire fenotypiske indikatorene i hvert datasett, brukes denne protokollen SOM analyse38,39, som konverterer høy-dimensjonale, multiparametric datasett i lav-dimensjonale 2D-kart. Spesielt er resultatene av PS nanofibers og 2DGT matriser utelatt fra denne analysen gitt at de fleste cellene ikke kunne plasseres. Videre var ekskludert fra denne analysen de eksperimentene med lav CD der cellene ikke har nok direkte (f.eks juxtacrine) eller indirekte (paracrine) interaksjoner å overleve. Etter SOM analyse, unsupervised hierarkisk klynger ble utført for SOM nodene i alle analyserte prøvene (figur 6B). Ved å vurdere høyden på klyngen dendrogram, fenotypiske forskjellene tillatt oss å kategorisere prøvene i tre grupper: gruppe i, de fleste av prøven nisjer bestående av GT nanofibers, MG_HighCD og VN_HighCD; Gruppere ii, prøver som inneholder GT nanofibers (GT_XLow og MidNF_MidCD), MG_MidCD eller VN_MidCD; og gruppere iii, alle PMGI_NF prøver.

For å studere forskjellene mellom gruppene, undersøkte vi et representativt utvalg fra hver gruppe (figur 6C; Gruppe jeg-GT_MidNF_HighCD, gruppe ii-GT_MidNF_MidCD og gruppe iii-PMGI_MidNF_HighCD). I OCT4 signaler, alle grupper viste en høyere uttrykk enn MG (MG_MidCD). Gruppen jeg var preget av høy EdU signaler, indikerer at de fleste cellene var aktivt voksende. Dermed forkortet microenvironments i gruppen jeg var preget som betingelser egnet for hPSC vedlikehold fordi udifferensierte hPSCs vanligvis sprer raskt når cellen syklus gapet fasene var45,46.

GT_MidNF_HighCD og GT_MidNF_MidCD er preget av sin distinkte første celle-lasting tettheter. Høy første celle tettheter økt cellenes muligheter til å samhandle med nabokommunene cellene som forbedret deres overlevelse og spredning47. Celler seeded på en utilstrekkelig første tetthet (3.0 × 104 celler/cm2) overlevde verken vokste i eksperimentell perioden (4 dager). Derfor innlemme vi ikke disse prøvene i SOM analyse; cellen tallene var under cut-off av 1000 levende celler/kammer. Cellene i 2DGT stillaser var også kategorisert som gruppe ii celler. disse betingelsene støtter ikke hPSC selvtillit fornyelse48. GT_MidNF_MidCD cellene EdU signalet var tapt og Annexin V nivåer ble litt økt, indikerer at cellene hadde mistet sin stemness og hadde etter hvert blitt apoptotisk. PMGI_MidNF_HighCD, som representerer microenvironments bestående av PMGI nanofiber matriser, viste større variasjoner i OCT4 og EdU signaler sammenlignet med de andre betingelsene.

Figure 1
Figur 1 . Screening strategi for å identifisere optimal mobilnettet microenvironments for å regulere cellular funksjonene. (A) oversikt over komponentene i matrisen multiplex kunstig mobilnettet microenvironment (MACME). Matrisen består av to hoveddeler: nanofiber senger mønstret på en basal substrat (nanofiber matrise) og en polydimethylsiloxane (PDMS)-basert microfluidic struktur. MACME matrisen er kjøpedyktig forberede nanofiber ECMs med en rekke funksjoner (dvs. nanofiber materialer og tettheter) og ulike celle seeding tettheter. PDMS microfluidic oppbygning MACME matrisen har tre mikrovæskekanalen høyder (250 500 og 1000 µm) å regulere første celle-såing tetthet. (B) virkningen av mobilnettet microenvironments på cellen fenotyper evalueres kvantitativt ved å bruke en avbildningsbasert encellede analysen og statistiske dataanalyse av selv-organisering kart (SOM) etterfulgt av hierarkiske klynger. Dette tallet ble tilpasset fra referanse49 tillatelse fra Wiley. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 . Design av MACME array. (A) Overhead og høy vinkel bilder av hele MACME matrisen og det konseptuelle diagrammet av en mikrovæskekanalen (lys blå) på en nanofiber matrise (rosa). Hver kanal består av en 700 µm bredt og 8.4 mm lang kultur kammer og to innganger for innføring av middels og celler. (B) sammenligning av størrelser av celler og nanofiber matriser. Høydene av celler og nanofiber senger spenner fra 1-3 µm og 0,05-5.0 µm, henholdsvis. (C) et tverrsnitt av hver mikrovæskekanalen med en 250-/ 500-/ 1000 µm høyde. Celler og nanofiber senger vises som blå sirkler og oransje linjer, henholdsvis. Hvert kammer har samme bredde og lengde men ulike høyder (250 500 og 1000 µm), og hvert kammer volum var 1.6 og 3.2 6,4 µL, henholdsvis. Svart stiplede rektanglet i figur 2C angir figur 2B. Figur 2 ble tilpasset fra referanse49 tillatelse fra Wiley. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 . Fabrikasjon av MACME matrise. (A) fabrikasjon av en nanofiber-matrise. Mønstre flere nanofiber matriser på en plate ble utført av modifisert electrospinning med en masker bærer mønstret hull. Platina-belegg ble utført for å lette nanofiber program på en plast plate. Maskene med forskjellige hull-mønster ble utarbeidet av en 3D-skriver. Etter maskering av platina-belagt platen, hvilke plate-maske ble satt på skjermbildet samling, og normalt electrospinning ble utført. De første nanofibers ble dannet i Pt-belagt plasseringene på tallerkenen gjennom hullene i masken. Ytterligere nanofiber senger var laget på platen ved å erstatte eksisterende masken og gjenta prosedyren. (B) fabrikasjon av en microfluidic struktur. Mold trykt av en 3D-skriver med UV-helbredelig harpiks formet PDMS laget av den microfluidic enheten. Etter støping, var MACME matrisen samlet ved å feste en PDMS-baserte microfluidic lag med en overflate-aktivert nanofiber matrise. Figur 3 ble tilpasset fra referanse49 tillatelse fra Wiley. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 . Bilder av grafisk brukergrensesnitt (GUI) for mikroskopiske bildeopptak. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5 . Bilder av grafiske brukergrensesnitt (GUI) av datamaskin-guidede bildebehandlingen for én celle phenotyping. Bildet analyseprosessen inneholder 5 trinn; (A) identifikasjon av primære objekter i DAPI bilder, (B-D) identifikasjon av sekundær objekter i OCT4, Annexin V og EdU bilder, henholdsvis og måling av objektet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6 . Phenotyping og klassifisering av fenotyper av H9 hESCs forandret av microenvironmental faktorer. (A) Immunofluorescent bilder av H9 hESCs kultivert på innledende seeding kompakt på gelatin (GT) nanofibers (GT_HighNF_HighCD), beiset med tre mobilnettet fenotypiske indikatorer (OCT4, pluripotency; EdU, celle spredning; Annexin V, apoptose) og DAPI for celle kjerner. (B) en heatmap og dendrograms unsupervised hierarkisk klynging. De testet microenvironments ble kategorisert i tre grupper med særpreg basert på likheter i av fenotyper. Gruppe jeg tatt GT nanofibers, MG_HighCD og VN_HighCD. Gruppe ii besto av prøver av GT nanofibers (GT_XLow og MidNF_MidCD), MG_MidCD eller VN_MidCD. Alle PMGI_NF prøver ble gruppert i gruppen iii. I heatmap angir rosa og blå fargene høyt og lavt mobilnettet frekvenser SOM antall tomter, henholdsvis. (C) fordeling av kvantifisert markør uttrykk 1000 celler i et representativt utvalg fra hver gruppe (gruppe jeg-GT_MidNF_HighCD, gruppe ii-GT_MidNF_MidCD og gruppe iii-PMGI_MidNF_HighCD). 25 og 75 persentil ble angitt som boksen grensene. Kinnskjegg utvide 1,5 ganger interquartile utvalg fra de 25 og 75 persentil. Eksperimenter ble gjentatt tre ganger for hver gruppe. Figur 6 Vekselstrøm var tilpasset fra referanse49 med tillatelse fra Wiley. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

navn Kanal lengde (mm) Kanal bredde (μm) Kanal høyde (μm) Inn-/ utløp diameter (μm) Inn-/ utløp høyde (μm) Mould lengde (mm) Mould bredde (mm) Mould høyde (mm)
Mold 8.4 700 250-/ 500-/ 1000 800 3000 127.76 85.48 14.35
navn Tykkelse (μm) Hull lengde (mm) Hull bredde (mm) Maske lengde (mm) Maske bredde (mm) Mould høyde (mm) Rad forskyvning (mm) Kolonner forskjøvet (mm)
Maske 1000 6 5 123.5 80.2 14.35 11.24 14.38

Tabell 1. Dimensjonene av mold for en microfluidic struktur og masken for et nanofiber mønster.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokollen viser den første screening metoden å etablere et robust kultur system for vedlikehold av kvalifiserte hPSCs. Først beskrev vi hvordan forberede en plattform med mangfoldig kunstig ECMs og celle seeding tettheter ved hjelp av en microfluidic enhet integrert med et nanofiber utvalg, MACME array. Andre, kvantitativ bildebasert encellede phenotyping var utført50 å vurdere personlige mobilnettet resultater og atferd endres av forskjellige biokjemiske og Biofysiske funksjoner. I denne protokollen, var miljøet GT nanofiber og positiv kontroll ECM proteiner i tilstanden til høy første celle seeding tetthet preget av funksjoner av en udifferensierte tilstand; raske spredningen45 og stabil OCT4 uttrykk51. Denne observasjonen indikerte at molekylære mekanismer "celle-ekstracellulær matrix" og "celle-celle" interaksjoner kan påvirke pluripotency av hPSCs.

Denne strategien kan tilpasses til brukerens formål. For eksempel kan celle manipulasjon og gjennomstrømning justeres for en rekke eksperimentelle innstillinger av re-design figurer og mønstre av microfluidic. Som en annen måte for gjennomstrømming forbedring, er innløp og utløp plasseringen av hvert kammer utformet som microplate standarden på 96-brønns plater, standardisert av Society of Biomolecular Sciences; Dermed kan en automatisert robot flytende dispenser brukes for høy gjennomstrømming screening. For å ytterligere undersøke molekylær mekanismen om "Celle-ECM samspill", gjøres de kunstige mobilnettet microenvironments å etterligne mer presist i vivo forhold av kjemisk endring i nanofibers med signalnettverk molekyler52 .

Hittil har har de fleste plattformer utviklet for screening mobilnettet microenvironments vært rettet mot screening løselig faktorer (f.eks vekstfaktorer og kjemiske forbindelser)42,43,44, men ikke nanofiber ECMs grunn vanskeligheter i å kombinere forskjellige fabrikasjon teknikker. For eksempel et nanofiber ark produserer en liten avstand mellom et microfluidic og en plate og fører deres ustabil binding, noe som resulterer i kryssforurensning mellom ulike eksempler fordi en kultur medium bland med en annen kammer en gjennom den lille gapet. Vår nye metoden muliggjør enkel og presis fabrikasjon av nanofiber matriser ved bestemte områder og lar sine direkte bånd med platen, som hindrer både ustabil bånd og kryss-smitte. Videre noen plattformer53 integrert med microfluidics og nanofiber matriser har vært tilgjengelig for systematisk manipulasjon av både kjemiske og fysiske signaler å undersøke virkningene på cellen funksjoner, fordi teknologier trengs for integreringen var svært sofistikerte. Våre encellede profilering med MACME array kan utføres med et lett oppnåelig apparat og enkle teknikker og har stort potensial for bruk i modellering mobilnettet miljøer for utviklingsmessige og biologiske studier og medisiner / screening.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen.

Acknowledgments

Vi takke Prof N. Nakatsuji iCeMS, Kyoto University, for å gi human ES celler. Vi takker også Prof A. Maruyama ved Tokyo Institute of Technology for sin støtte i bruk av atomic force mikroskopet. Midler ble sjenerøst gitt av Japan Society for fremme av vitenskap (JSP, 22350104, 23681028, 25886006 og 24656502); midler ble også gitt av ny energi og industriell teknologi utvikling organisasjon (NEDO) og Terumo Life Science Foundation. WPI-iCeMS støttes av World Premier International Research Centre initiativ (WPI), utdannings, kultur, sport, vitenskap og teknologi (MEXT), Japan. En del av dette arbeidet ble støttet av Kyoto University nanoteknologi Hub og AIST Nano behandling anlegget i "Nanoteknologi plattform Project" sponset av MEXT, Japan.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Polystyrene (PS) Sigma #182435 Average Mw: 290,000, average Mn: 130,000
Polymethylglutarimide (PMGI) MicroChem G113113
Gelatin (GT) Sigma G2625 From porcine skin, type A
Sylgard 184 silicone elastomer kit Doe Corning Toray #1064291 PDMS curing agent and silicone elastomer base are components of this kit.
OpenSCAD This is a free 3D computer graphics software (http://www.openscad.org/) used for designing the mold of the microfluidic device.
AutoCAD 2014 Autodesk This is a 3D computer graphics software (https://www.autodesk.com/products/autocad/overview) used for design of the mask used on nanofiber-array preparation.
3D printer, AGILISTA-3000 Keyence
UV-curable resin, AR-M2 Keyence This is used for 3D printing by Agilista.
Acetic acid Sigma #338826 ≥99.99%
Ethyl acetate Sigma #270989 Anhydrous, 99.8%
Tetrahydrofuran (THF) Sigma #401757
MSP-30T Vacuum Device Magnetron sputtering machine
Nunc OmniTray Thermo Fisher Scientific #242811 This is a polystyrene baseplate on which the nanofiber array is created. This plate size is typically 127.7 x 85.5 mm. 
Gun-type corona discharge machine Shinko Electric & Instrumentation CFG-500 This handy device is used to generate corona for activation of the bottom surface of the PDMS layer at step 1.5 "Assembly of the MACME arrays" in the protocol.
5 mL syringe Terumo SS-05SZ
Stainless-steel blunt needle (23-gauge) Nipro #2166 Outside diameter and length are 0.6 and 32 mm, respectively.
High-voltage power supply TechDempaz
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide, hydrochloride Dojindo W001
N-Hydroxysuccinimide Sigma #56480
Matrigel hESC-Qualified Matrix Corning #354277 This protein is refered as basement membrane gel matrix in the protocol.
CellAdhere Vitronectin, Human, Solution STEMCELL Technologies #07004
TeSR-E8 STEMCELL Technologies #05940 Feeder-free, xeno-free culture medium for maintenance of human ES and iPS cells
Y-27632 Wako Pure Chemical Industries #253-00513
TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red Thermo Fisher Scientific #12605028 This ia a recombinant trypsin-like protease for dissociation of adherant mammalian cells.
Click-iT EdU Imaging Kit with Alexa Fluor 647 Azides Thermo Fisher Scientific C10086 The fluorescent labeling of proliferating cells in on-plate fluorescent staining was performed along the product manual of this kit.
Annexin V, Alexa Fluor 594 conjugate Thermo Fisher Scientific A13203
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Thermo Fisher Scientific D1306
Oct-3/4 Antibody (C-10) Santa Cruz Biotechnology sc-5279
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (DyLight 488) abcam ab96875 This is a secondary antibody used in on-plate fluorescent cell staining.
ECLIPSE Ti-E Nikon This is an inverted fluorescence microscope equipped with a CFI Plan Fluor 4×/0.13 N.A. objective lens (Nikon), CCD camera (ORCA-R2, Hamamatsu), mercury lamp (Intensilight, Nikon), XYZ automated stage (Ti-S-ER motorized stage with encoders, Nikon), and filter cubes for four fluorescence channels (DAPI, GFP HYQ, TRITC, Cy5; Nikon)
NIS-Elements Advanced Research Nikon This is a microscope imaging software used for automatic image acquisition.
CellProfiler, Version 2.1.0 This is a free open software for cell image analysis (http://cellprofiler.org/).
R SOM analysis is performed by kohonen package of this software. This is freely available (https://www.r-project.org/).
Cluster 3.0 This is the open source clustering software (http://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster/software.htm). Unsupervised hierarchical clustering is performed with this software.
Java TreeView This open source software (http://jtreeview.sourceforge.net/) is used to visualize clustering data as a heatmap and a dendrogram.
H9 human embryonic stem cell WiCell Stem Cell Bank WA09

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  2. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  3. Ameen, C., et al. Human embryonic stem cells: Current technologies and emerging industrial applications. Crit Rev Oncol Hematol. 65 (1), 54-80 (2008).
  4. Nishikawa, S., Goldstein, R. A., Nierras, C. R. The promise of human induced pluripotent stem cells for research and therapy. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (9), 725-729 (2008).
  5. Robinton, D. A., Daley, G. Q. The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy. Nature. 481 (7381), 295-305 (2012).
  6. Sartipy, P., Bjorquist, P., Strehl, R., Hyllner, J. The application of human embryonic stem cell technologies to drug discovery. Drug Discovery Today. 12 (17-18), 688-699 (2007).
  7. Discher, D. E., Mooney, D. J., Zandstra, P. W. Growth factors, matrices, and forces combine and control stem cells. Science. 324 (5935), 1673-1677 (2009).
  8. Joyce, J. A., Pollard, J. W. Microenvironmental regulation of metastasis. Nat Rev Cancer. 9 (4), 239-252 (2009).
  9. Danhier, F., Feron, O., Preat, V. To exploit the tumor microenvironment: Passive and active tumor targeting of nanocarriers for anti-cancer drug delivery. J Control Release. 148 (2), 135-146 (2010).
  10. Murphy, W. L., McDevitt, T. C., Engler, A. J. Materials as stem cell regulators. Nat Mater. 13 (6), 547-557 (2014).
  11. Patel, A. K., et al. A defined synthetic substrate for serum-free culture of human stem cell derived cardiomyocytes with improved functional maturity identified using combinatorial materials microarrays. Biomaterials. 61, 257-265 (2015).
  12. Zhang, R., et al. A thermoresponsive and chemically defined hydrogel for long-term culture of human embryonic stem cells. Nat Commun. 4, (2013).
  13. Anderson, D. G., Putnam, D., Lavik, E. B., Mahmood, T. A., Langer, R. Biomaterial microarrays: rapid, microscale screening of polymer-cell interaction. Biomaterials. 26 (23), 4892-4897 (2005).
  14. Celiz, A. D., et al. Discovery of a Novel Polymer for Human Pluripotent Stem Cell Expansion and Multilineage Differentiation. Adv Mater. 27 (27), 4006-4012 (2015).
  15. Hansen, A., et al. High-Density Polymer Microarrays: Identifying Synthetic Polymers that Control Human Embryonic Stem Cell Growth. Adv Healthcare Mater. 3 (6), 848-853 (2014).
  16. Mei, Y., et al. A high throughput micro-array system of polymer surfaces for the manipulation of primary pancreatic islet cells. Biomaterials. 31 (34), 8989-8995 (2010).
  17. Saha, K., et al. Surface-engineered substrates for improved human pluripotent stem cell culture under fully defined conditions. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (46), 18714-18719 (2011).
  18. Bettinger, C. J., Langer, R., Borenstein, J. T. Engineering substrate topography at the micro- and nanoscale to control cell function. Angew Chem Int Ed Engl. 48 (30), 5406-5415 (2009).
  19. McMurray, R. J., et al. Nanoscale surfaces for the long-term maintenance of mesenchymal stem cell phenotype and multipotency. Nat Mater. 10 (8), 637-644 (2011).
  20. Sun, Y., Jallerat, Q., Szymanski, J. M., Feinberg, A. W. Conformal nanopatterning of extracellular matrix proteins onto topographically complex surfaces. Nat Methods. 12 (2), 134-136 (2015).
  21. Nitanan, T., et al. Effects of processing parameters on morphology of electrospun polystyrene nanofibers. Korean J Chem Eng. 29 (2), 173-181 (2012).
  22. Liu, L., et al. Chemically-defined scaffolds created with electrospun synthetic nanofibers to maintain mouse embryonic stem cell culture under feeder-free conditions. Biotechnol Lett. 34 (10), 1951-1957 (2012).
  23. Liu, L., et al. Nanofibrous gelatin substrates for long-term expansion of human pluripotent stem cells. Biomaterials. 35 (24), 6259-6267 (2014).
  24. Kamei, K., et al. Phenotypic and transcriptional modulation of human pluripotent stem cells induced by nano/microfabrication materials. Adv Healthcare Mater. 2 (2), 287-291 (2013).
  25. Peerani, R., et al. Niche-mediated control of human embryonic stem cell self-renewal and differentiation. EMBO J. 26 (22), 4744-4755 (2007).
  26. Yamamoto, K., et al. Fluid shear stress induces differentiation of Flk-1-positive embryonic stem cells into vascular endothelial cells in vitro. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 288 (4), 1915-1924 (2005).
  27. Charati, S. G., Stern, S. A. Diffusion of gases in silicone polymers: Molecular dynamics simulations. Macromolecules. 31 (16), 5529-5535 (1998).
  28. Prado-Lopez, S., et al. Hypoxia promotes efficient differentiation of human embryonic stem cells to functional endothelium. Stem Cells. 28 (3), 407-418 (2010).
  29. Yanagihara, K., et al. Prediction of Differentiation Tendency Toward Hepatocytes from Gene Expression in Undifferentiated Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cells and Development. 25 (24), 1884-1897 (2016).
  30. Kamei, K., et al. 3D printing of soft lithography mold for rapid production of polydimethylsiloxane-based microfluidic devices for cell stimulation with concentration gradients. Biomed Microdevices. 17 (2), (2015).
  31. Song, J. H., Kim, H. E., Kim, H. W. Production of electrospun gelatin nanofiber by water-based co-solvent approach. J Mater Sci Mater Med. 19 (1), 95-102 (2008).
  32. Owen, M. J., Smith, P. J. Plasma Treatment of Polydimethylsiloxane. J Adhes Sci Technol. 8 (10), 1063-1075 (1994).
  33. Chen, G. K., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nat Methods. 8 (5), 424-476 (2011).
  34. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25 (6), 681-686 (2007).
  35. Kamei, K., et al. An integrated microfluidic culture device for quantitative analysis of human embryonic stem cells. Lab Chip. 9 (4), 555-563 (2009).
  36. Kamei, K., et al. Microfluidic image cytometry for quantitative single-cell profiling of human pluripotent stem cells in chemically defined conditions. Lab Chip. 10 (9), 1113-1119 (2010).
  37. Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7 (10), 100 (2006).
  38. Kohonen, T. Self-Organized Formation of Topologically Correct Feature Maps. Biol Cybern. 43 (1), 59-69 (1982).
  39. Wehrens, R., Buydens, L. M. C. Self- and super-organizing maps in R: The kohonen package. J Stat Softw. 21 (5), 1-19 (2007).
  40. Eisen, M. B., Spellman, P. T., Brown, P. O., Botstein, D. Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (25), 14863-14868 (1998).
  41. Saldanha, A. J. Java Treeview--extensible visualization of microarray data. Bioinformatics. 20 (17), 3246-3248 (2004).
  42. Du, G. S., Fang, Q., den Toonder, J. M. J. Microfluidics for cell-based high throughput screening platformsd-A review. Anal Chim Acta. 903, 36-50 (2016).
  43. Huang, S. B., et al. An integrated microfluidic cell culture system for high-throughput perfusion three-dimensional cell culture-based assays: effect of cell culture model on the results of chemosensitivity assays dagger. Lab Chip. 13 (6), 1133-1143 (2013).
  44. Wang, B. L., et al. Microfluidic high-throughput culturing of single cells for selection based on extracellular metabolite production or consumption. Nat Biotechnol. 32 (5), 473 (2014).
  45. Becker, K. A., et al. Self-renewal of human embryonic stem cells is supported by a shortened G1 cell cycle phase. J Cell Physiol. 209 (3), 883-893 (2006).
  46. Neganova, I., Lako, M. G1 to S phase cell cycle transition in somatic and embryonic stem cells. J Anat. 213 (1), 30-44 (2008).
  47. Fox, V., et al. Cell-cell signaling through NOTCH regulates human embryonic stem cell proliferation. Stem Cells. 26 (3), 715-723 (2008).
  48. Xu, C., et al. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 19 (10), 971-974 (2001).
  49. Kamei, K., et al. Microfluidic-Nanofiber Hybrid Array for Screening of Cellular Microenvironments. Small. 13 (18), (2017).
  50. Sun, J., et al. A Microfluidic Platform for Systems Pathology: Multiparameter Single-Cell Signaling Measurements of Clinical Brain Tumor Specimens. Cancer Res. 70 (15), 6128-6138 (2010).
  51. Theunissen, T. W., Jaenisch, R. Molecular Control of Induced Pluripotency. Cell Stem Cell. 14 (6), 720-734 (2014).
  52. Yoo, H. S., Kim, T. G., Park, T. G. Surface-functionalized electrospun nanofibers for tissue engineering and drug delivery. Adv Drug Del Rev. 61 (12), 1033-1042 (2009).
  53. Dixon, J. E., et al. Combined hydrogels that switch human pluripotent stem cells from self-renewal to differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (15), 5580-5585 (2014).

Tags

Bioteknologi problemet 139 microfluidic nanofiber embryonale stamcelleforskningen mobil microenvironment encellede profilering selvtillit fornyelse
Fabrikasjon av en multiplex kunstig mobilnettet MicroEnvironment matrise
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mashimo, Y., Yoshioka, M., Tokunaga, … More

Mashimo, Y., Yoshioka, M., Tokunaga, Y., Fockenberg, C., Terada, S., Koyama, Y., Shibata-Seki, T., Yoshimoto, K., Sakai, R., Hakariya, H., Liu, L., Akaike, T., Kobatake, E., How, S. E., Uesugi, M., Chen, Y., Kamei, K. i. Fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment Array. J. Vis. Exp. (139), e57377, doi:10.3791/57377 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter