Summary
Este artículo describe la metodología detallada para preparar una matriz de multiplexado Artificial celular microambiente (MACME) para manipulación de alto rendimiento de física y química señales mímico en vivo microambientes celulares y a identificar el entorno celular óptimo para las células de vástago pluripotent humanas (hPSCs) con perfiles de unicelulares.
Abstract
Microambientes celulares consisten en una variedad de señales, tales como factores de crecimiento, matrices extracelulares y las interacciones intercelulares. Estas señales están bien orquestados y son cruciales en la regulación de las funciones celulares en un sistema de vida. Aunque un número de investigadores ha intentado investigar la correlación entre factores ambientales y las funciones celulares deseadas, mucho sigue siendo desconocido. Esto es en gran parte debido a la falta de una metodología apropiada para imitar tales señales ambientales en vitroy probar simultáneamente señales ambientales diferentes en las células. Aquí, Divulgamos una plataforma integrada de canales de microfluidos y una variedad de nanofibras, seguida por análisis unicelular de alto contenido, para examinar células de fenotipos alterados por distintos factores ambientales. Para demostrar la aplicación de esta plataforma, este estudio se centra en los fenotipos de uno mismo-renovar las células de vástago pluripotent humanas (hPSCs). Presentamos los procedimientos de preparación de una matriz de nanofibras y la estructura de microfluidos en la fabricación de una gama de multiplexado Artificial celular microambiente (MACME). Por otra parte, se describen pasos generales de la célula solo perfiles, tinción con marcadores fluorescentes múltiples, múltiples imágenes de fluorescencia y análisis estadísticos, de la célula.
Introduction
Humanas pluripotentes células madre (hPSCs)1,2 uno mismo-renovar ilimitadamente y diferenciarse en varios linajes de tejido, que podrían revolucionar el desarrollo de fármacos, terapias basadas en células, ingeniería tisular y medicina regenerativa 3 , 4 , 5 , 6. platos de cultura general y las placas de microtitulación, sin embargo, no están diseñadas para permitir la manipulación precisa de la célula física y química a nivel celular con la gama de nano a micro-metros, que es un factor crítico para la extensión celular, auto renovación y diferenciación. Para solucionar este inconveniente, los estudios han investigado los roles de microambientes celulares en la regulación de las decisiones de destino celular y funciones de la célula4. En los últimos años, un creciente número de estudios se han realizado para reconstruir microambientes celulares in vitro7,8. Procesos de fabricación de nano y micro han establecido estos microambientes mediante la manipulación de productos químicos9,10,11,12,13, 14,15,16,17 y física18,19,20 señales ambientales. Hasta ahora no había informes de investigar sistemáticamente los mecanismos subyacentes de señales ambientales físicos y químicos en las decisiones de destino celular y funciones dentro de una única plataforma.
Aquí, presentamos una estrategia basada en los principios de diseño simple para establecer una plataforma de proyección sólida (figura 1). En primer lugar, describimos el procedimiento de desarrollo de una plataforma integrada para la creación de microambientes celulares versátiles, artificiales mediante una matriz de nanofibras y una estructura de microfluidos: matriz el multiplexado Artificial celular microambiente (MACME) (Figura 1A y 2A). La matriz de nanofibras tiene 12 diferentes microambientes en diferentes combinaciones de materiales de nanofibras y densidades. Electrospinning fue utilizada para fabricar nanofibras. Los materiales de nanofibras, como poliestireno (PS)21, polymethylglutarimide (PMGI)22y23de la gelatina (GT), fueron diseñados para poner a prueba sus propiedades químicas, que puedan afectar la adhesión celular y el mantenimiento de pluripotencia ( Figura 2B). Densidades de nanofibras fueron variadas por electrospinning tiempo cambiante y las nanofibras generadas fueron definidas según sus densidades (DNF, con D = XLow/Low/Mid/High). La estructura de microfluidos se compone de polidimetilsiloxano (PDMS) albergar 48 cámaras de cultivo celular, que pueden colocarse a lo largo de las dimensiones estándar de la microplaca de 96 pozos. PDMS es un polímero biocompatible y gas intercambiables que generalmente se utiliza para fabricar dispositivos de microfluidos24. Cada canal microfluídico fue diseñado para ser 700 μm ancho 8.4 mm de largo y tenía dos entradas en sus bordes (cuadro 1). Las cámaras tenían diferentes alturas (250, 500 y 1000 μm) para manipular las iniciales siembra celular densidades (0.3, 0.6 y 1.2 × 105 células/cm2), que pueden correlacionar con la supervivencia, proliferación y diferenciación de hPSCs25 (Figura 2C). El número de células sembradas en una cámara es proporcional a la densidad de la columna sobre el piso de la cámara, y así siembra la densidad de la célula inicial fue controlada introduciendo la misma suspensión de células en cámaras de cultivo con diferentes alturas. Todos los canales fueron diseñados para ser ≥ 250 μm de altura26 para minimizar los efectos de la tensión de oxígeno27 y tensión de esquileo28 en las células. Canal alturas de 250, 500 y 1000 μm son abreviados aquí como XCD con X = Low, Mid y High, respectivamente. Los ambientes con nanofibras distintas densidades y densidades de siembra de células iniciales fueron acortados como "Material_NF density_Cell densidad" (por ejemplo, GT_HighNF_HighCD: un entorno caracterizado por alta densidad GT nanofibras y alta inicial de la célula-siembra densidad).
Posteriormente, describimos cómo realizar el análisis unicelular para investigar sistemáticamente el comportamiento de la célula en respuesta a factores ambientales (figura 1B). Como una prueba de concepto, se identificaron el entorno celular óptimo para hPSC auto renovación, que es una función clave para hPSC mantenimiento (figura 1B)29. Citometría de imagen, seguida por análisis estadísticos, permite la interpretación cuantitativa de respuestas fenotípicas celulares individuales a entornos celulares. Entre una variedad de funciones celulares, este artículo proporciona un procedimiento detallado para identificar las condiciones óptimas para mantener hPSC auto renovación.
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Protocol
1. fabricación de matriz MACME
Nota: Todos los materiales y equipos se enumeran en la tabla de materiales.
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Preparación de máscaras para una variedad de nanofibras y un molde para una estructura de microfluidos
- Crear imágenes tridimensionales (3D) de máscaras para las matrices de nanofibras y moldes para microfluidos estructuras utilizando paquetes de software de gráficos de computadora 3D (tabla 1).
Nota: Las imágenes 3D son leer e imprimir por una impresora 3D. Las máscaras impresos y molde tienen las mismas dimensiones con imágenes en 3D mediante el software de gráficos en el paso 1.1.1. - Imprimir máscaras y un molde de estos diseños utilizando una impresora 3D.
Nota: En el presente Protocolo, una impresora 3D de ink-jet-como con la resina UV-curable fue usado30. La resolución de la impresora fue 635 × 400 ppp y 15 μm en X, Y y Z, respectivamente, sin embargo, la X real, Y resolución era aproximadamente cuatro veces menor.
- Crear imágenes tridimensionales (3D) de máscaras para las matrices de nanofibras y moldes para microfluidos estructuras utilizando paquetes de software de gráficos de computadora 3D (tabla 1).
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Preparación de la matriz de nanofibras (figura 3A)
- Preparar soluciones de polímeros para el electrospinning.
- Líquido PMGI 13% diluido con Tetrahidrofurano por 9% (w/v)22.
- Disolver 0,08 g de PS (peso molecular medio en número (Mn): 130.000) en THF:dimethylformamide (cociente del volumen 1:1)21y THF:dimethylformamide para llevar el volumen hasta el final 1 mL (solución al 8% (w/v) PS).
- Disolver 0,1 g de GT en el agua: ácido acético: etilo acetato (cociente del volumen 1:1.6:2.1) y añadir agua: ácido acético: etilo acetato para llevar el volumen hasta el final 1 mL (solución al 10% (p/v) GT) como descrito23,31.
- Utilizar un máquina de la farfulla del magnetrón, depositar una fina capa de platino con un espesor de 5 nm en un poliestireno (PS) base (127,7 × 85,5 mm), que sirve como cátodo en la configuración de electrospinning.
- Carga de cada solución de polímero en una jeringa de 5 mL, equipada con una aguja embotada del acero inoxidable de 23 G.
- Colocar y fijar la jeringa con la aguja en una bomba de jeringa con 12 cm aparte del colector del dispositivo electrospinning.
- Conecte la aguja de la jeringa a una fuente de alimentación de alto voltaje y situado a 11 kV.
- Ajustar la velocidad de bombea de 0,2 mL por hora.
- Mantener temperatura y humedad a 30 ° C y < 30% (v/v).
- Poner la máscara en la placa base preparada en el paso 1.2.2.
- Fabricar nanofibras en la placa base a través de los agujeros de la máscara con densidades distintas, cambiando el tiempo de centrifugado eléctrico (por ejemplo, 20, 60, 90 y 180 s).
- Quitar la máscara de la placa base.
Nota. Etanol puede ser rociado sobre las nanofibras GT electrospun antes de quitar la máscara para evitar pelar nanofibras GT junto con la máscara. - Repita el paso 1.2.4-1.2.10 hasta la finalización de la fabricación de nanofibras de arreglo de discos.
- Coloque la matriz de nanofibras en un desecador a 25 ° C por 16 h para evaporar el disolvente restante.
- CrossLink GT nanofibras con clorhidrato de 0.2 M 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimida (EDC) y 0,2 M N-hydroxysuccinimide (NHS) en etanol a 25 ° C por 4 h23.
- Enjuague nanofibras GT dos veces con etanol al 99.5% (v/v) y de vacío en seco a 25 ° C durante 16 horas.
- Preparar soluciones de polímeros para el electrospinning.
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Fabricación de estructuras de microfluidos (figura 3B)
- Mezcle 2 g de PDMS curado agente y 20 g de base PDMS (1:10 peso relación; Pre-PDMS). 24
- Vierta la mezcla pre-PDMS en el molde fabricado en el paso 1.2.
- Gas de la mezcla pre-PDMS en un desecador durante 30 minutos.
- Curar la mezcla pre-PDMS en un horno a 65 ° C por 16 h.
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Matrices de ensamble de MACME (figura 3B)
- Retire la estructura PDMS curada a paso 1.3.4 del molde y limpia con etanol al 70% (v/v).
- Tratar la atmósfera descarga de corona en la parte inferior de la estructura PDMS32.
Nota: En el presente Protocolo, la corona se descarga sobre toda la superficie de una capa de 3 o 4 veces con un aparato de descarga de corona "Handy". Tratamiento plasma de oxígeno fue sustituido por descarga atmosférica de corona para alterar la adherencia superficial. - Montar rápidamente la estructura PDMS con la matriz de nanofibras.
- Horno-cueza al horno a 65° C durante 2 días.
2. carga de hESCs en matriz MACME
- Para el cultivo rutinario de H9 tallo las células embrionarias humanas (hESCs), mantener las células en xeno-libre químicamente definición medio de cultivo para hPSC mantenimiento33 suplementado con 10 μm Y-27632 roca inhibidor34 (llamado hPSC medio) en un cultivo celular de 35 mm plato recubierto con matriz de gel de la membrana del sótano (MG).
- Células de paso cada 4 a 7 días con una proteasa de tipo tripsina recombinante.
- Esterilizar una matriz MACME con etanol al 99.5%, por carga en los compartimientos durante 10 min y luego eliminar el etanol. Repetir este paso 3 veces.
- Introducir 12 μl de magnesio, 10 vitronectina μg/mL (VN), y 0.1% (p/v) GT en el control de cámaras de la cultura e incubar las cámaras a 37 ° C por 1 h a capa en las superficies de la cámara.
Nota: En este protocolo, MG, VN y GT fueron seleccionados como proteínas de referencia para la adherencia de la célula y la cultura. Porque MG y VN son estándar de cultivo de células matrices utilizado para mantener la auto renovación hPSC, se utilizan como controles positivos; dos dimensiones GT (2 díg) o no-capa de recubrimiento (NC) se utilizaron como controles negativos. - Introducir hPSC precalentado medio en todos los compartimientos de la matriz MACME. Incubar las cámaras durante 30 min a 37 ° C.
- Células H9 lavar cultivado en una placa de 35 mm con DPBS, Añadir 0,5 mL de una proteasa de tipo tripsina recombinante al plato e incubar a 37 ° C por 1 min y aspirar con cuidado sólo los sobrenadantes mezclados con proteasa.
Nota: En la etapa de aspiración, las células no están separadas. - Inmediatamente añada medio hPSC, suavemente, dispensar el medio contra la superficie del plato repetidamente para disociar las células y las células separadas se transfieren a un tubo cónico de 15 mL.
- Centrifugue a 200 x g durante 3 min aspirar el sobrenadante y suspender las células en un medio precalentado hPSC.
- Introducir 12 μl de la suspensión celular (1,2 × 106 células/mL) en cada cámara de microfluidos.
Nota: Introducir células en una cámara de otra utilizando una micropipeta. Porque el número de células sembradas de cámaras es proporcional a la densidad de la columna sobre el piso de la cámara, la densidad inicial de siembra de células podría ser controlada a pesar de muestras de la suspensión de la célula misma. Asegúrese de pipeteo se realiza suavemente. Retire el exceso medio de las cámaras con un palito con punta de algodón después de la carga. La matriz MACME es compatible con sistemas de pipeta automatizada y pipetas de laboratorio comúnmente usado, y no requiere ningún equipo especial. - Cambiar el medio hPSC cada 12 h y la cultura durante 4 días.
Nota: Volúmenes constantes del medio (1.6, 3.2 y 6.4 μL) se mantienen mediante el uso de cámaras de diferentes tamaños. Células en cultivo bajo una condición estática para minimizar la tensión de esquileo excepto el cambio del medio de cultivo celular35,36.
3. cuantitativa unicelular perfiles
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Tinción fluorescente de la célula en placa
Nota: para analizar cambios fenotípicos de la uno mismo-renovación de hPSCs, este protocolo seleccionado tres marcadores fenotípicos claves de este protocolo: OCT4, 5-ethynyl-2'-desoxiuridina (EdU) y la anexina V, para medir el estado de pluripotencia, proliferación y apoptosis , respectivamente (figura 2b). 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) se utiliza para identificar los núcleos de célula. OCT4 es uno de los factores de transcripción crítica de pluripotencia.- Incubar H9 hESCs en arreglos de discos de MACME en hPSC suplementado con alquino EdU de 10 μm a 37 ° C por 30 min.
- Después del lavado con tampón de annexin-obligatoria (10 mM HEPES (pH 7.4), 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCl2), se tiñen las células con un conjugado fluorescente naranja de tinte-anexina V a 20 ° C durante 15 minutos.
- Fijar las células en PBS con paraformaldehído al 4% (v/v) a 20 ° C durante 15 minutos y luego enjuague las células con PBS dos veces.
- Permeabilizar las células con PBS con 0.3% (v/v) Triton X-100 a 20 ° C por 16 h.
Nota: Paraformaldehido debilita el vínculo entre una placa base de plástico y una estructura de microfluídica PDMS. Así, el desprendimiento de la capa PDMS del array al paso 3.2.1 también puede realizarse justo después de este paso. - Incubar las células en buffer Tris base de la reacción con una azida de tinte fluorescente rojo a 20 ° C durante 30 minutos.
- Incubar las células en solución amortiguadora de bloqueo (PBS con 5% (v/v) de suero normal de cabra, burro normal 5% (v/v) suero, albúmina de suero bovino 3% (p/v), 0,1% (v/v) de Tween-20 y 0.1% (w/v) N-dodecil-β-D-maltoside) a 4 ° C por 16 h.
- Incubar en PBS con 0,5% (v/v) solución Triton X-100 y anticuerpo OCT3/4 humano (IgG de ratón) a 4 ° C por 16 h.
- Incubar en solución amortiguadora de bloqueo con anti-ratón burro de marcado tinte verde fluorescente IgG (H+L) a 37 ° C durante 60 minutos.
- Incubar en PBS con DAPI a 20 ° C durante 30 minutos.
- Reemplace DAPI PBS con PBS.
- Conservar la matriz MACME a 4 ° C hasta la adquisición de la imagen.
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Adquisición de la imagen (figura 4)
- Retire la estructura de la microfluídica PDMS de la matriz MACME.
- Retirar el PBS residual de la matriz MACME, aplicar 90%(v/v) glicerol en PBS a las células y coloque el cubreobjetos sobre las células.
- Coloque la placa boca abajo en el escenario de un microscopio de fluorescencia invertido.
- Adquisición de imágenes de color de 12 bits automáticamente con todos componentes motorizados (etapa, filtros, obturador y sistemas de enfoque) que eran controlados por un software de imágenes de microscopio.
Nota. En este protocolo, tiempos de exposición se ajustan para llegar a cerca de los valores de intensidad máxima (máxima intensidad de pixel: 4096), pero no la saturación, para cada imagen, DAPI, OCT4, anexina V y EdU.
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Tratamiento de la imagen guiado por ordenador y fluorescencia la señal de cuantificación (figura 5)
Nota: el siguiente análisis de la imagen de la célula se realiza en base a un método previamente descrito37.- Convertir imágenes en color a escala de grises.
- Calcular el valor umbral individual para cada imagen DAPI con el método de Otsu y clasificar píxeles por encima del umbral como primer plano y a continuación como fondo. Asegúrese de que el valor del primer plano corresponde a la intensidad fluorescente de DAPI.
Nota: El proceso de análisis de imagen contiene 5 pasos; identificación de los objetos primarios en DAPI imágenes, identificación de objetos secundarios de OCT4, anexina V e imágenes de EdU, respectivamente y la medición de la intensidad del objeto. La figura 3 muestra las imágenes de la interfaz gráfica de usuario (GUI) en la configuración de procesamiento de imágenes. - Medir la intensidad fluorescente de OCT4 y EdU en cada imagen.
- Identificar la región manchada con anexina V con el método de propagación y cuantificar la intensidad fluorescente.
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3.4. estadístico análisis para visualizar los fenotipos celulares individuales en proyección de imagen de unicelular
- Normalizar la intensidad fluorescente entrada de cada marcador fenotípico centrado y escalando estas variables para darles peso igual.
- Realizar análisis de mapa (SOM) uno mismo-organización mediante el uso de un entorno de software para computación estadística y gráficos según lo descrito por anteriores estudios38,39.
- Crear 25 nodos SOM con distintivo cuatro "codebook vectores" correspondiente a la intensidad fluorescente de cuatro marcadores, DAPI, EdU, anexina V y OCT4.
- Asignar celdas individuales en cada microambiente a un "ganador" nodo de (más similar) y trazar como frecuencia de la célula, según la cual los vectores de códigos del nodo ganador se actualizan utilizando un promedio ponderado, donde el peso es la tasa de aprendizaje (aquí, 0,05 como por defecto).
Nota: Omitir datos de cámaras que contiene menos de 1.000 células porque conjuntos de datos que contiene algunas células no proporciona resultados estadísticamente relevantes de SOM.
- Realizar clustering jerárquico sin supervisión con los valores de SOM-nodo mediante el método de ligamiento promedio basado en la correlación de Pearson de una agrupación de software40.
- Que los datos de clustering en el dendrograma y heatmap views41.
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Representative Results
Matrices MACME: diseño y fabricación: En combinación con la tecnología de nanofibras, utilizamos cultivo celular de microfluidos y detección técnicas empleadas anteriormente para identificar las condiciones óptimas para hPSC auto-renovación o diferenciación35,36 (figura 1). Esto es idóneo para el establecimiento de robustos alto rendimiento celular ensayos porque las cámaras de cultivo de células y las condiciones son precisamente controlable y ampliable42,43,44. Aquí, la matriz de nanofibras fue preparada por un método de deposición de nanofibras simple, electrospinning con máscaras impreso en 3D. La parte de microfluidos se fabricó con un molde impreso en 3D diseñar fácilmente la estructura de la cámara a través de muchos ensayos y errores. La matriz MACME fue construida mediante la combinación de las dos partes y contiene 48 ambientes, proporcionando señales biofísicas y bioquímicas diferentes por diferentes combinaciones de dos ECMs de nanofibras (3 tipos de materiales de nanofibras y 4 diferentes densidades o 4 control proteínas de la matriz) y las interacciones célula-célula (rangos de densidad de siembra de la célula inicial 3) como se muestra en la figura 2.
Evaluación de los efectos globales de la densidad celular y propiedades de nanofibras en fenotipos de células: Después de cultivo de células en una matriz MACME y tinción fluorescente en la placa (figura 6A), unicelular mediciones se realizaron con las imágenes adquiridas. Para comparar la homogeneidad y la heterogeneidad de niveles de expresión para los cuatro marcadores fenotípicos en cada conjunto de datos, este protocolo utiliza SOM análisis38,39, que convierte bases de datos multidimensional, multiparamétrico en mapas de baja dimensión 2D. En particular, los resultados de matrices de nanofibras y 2 díg PS fueron omitidos de este análisis dado que la mayoría de las células no adhirió. Por otra parte, excluidas de este análisis fueron aquellos experimentos con CD bajo donde las células no tenían suficiente directa (por ejemplo, yuxtacrina) o indirecta (paracrina) interacciones para sobrevivir. Después del análisis SOM clustering jerárquico sin supervisión fue realizada para los nodos que SOM de todas las muestras analizadas (figura 6B). Teniendo en cuenta la altura del dendrograma de cluster, las diferencias fenotípicas nos permitieron clasificar las muestras en tres grupos: Grupo i, la mayor parte de la muestra nichos compuesto por nanofibras GT, MG_HighCD y VN_HighCD; Grupo ii, las muestras que contienen GT nanofibras (GT_XLow y MidNF_MidCD), MG_MidCD o VN_MidCD; y grupo iii, todas las muestras PMGI_NF.
Para estudiar las diferencias entre los grupos, se analizó una muestra representativa de cada grupo (figura 6C; Grupo i-GT_MidNF_HighCD, grupo ii-GT_MidNF_MidCD y grupo iii-PMGI_MidNF_HighCD). En cuanto a señales de OCT4, todos los grupos mostraron una mayor expresión que la de MG (MG_MidCD). Grupo que estaba caracterizado por altas señales de EdU, que indica que mayoría de las células se multiplican activamente. Por lo tanto, microambientes en grupo estuviera caracterizado como condiciones adecuadas para el mantenimiento de hPSC porque hPSCs indiferenciadas normalmente proliferan rápidamente al ciclo celular fases de gap fueron acortan45,46.
GT_MidNF_HighCD y GT_MidNF_MidCD se distinguen por sus diferentes densidades de célula de carga iniciales. Densidad celular inicial alta aumento de oportunidades de las células para interactuar con las células vecinas, que mejora su supervivencia y proliferación de47. Las células sembradas a una densidad inicial insuficiente (3,0 × 104 células/cm2) no sobrevivieran ni crecieron durante el periodo experimental (4 días). Por lo tanto, no incorporamos estas muestras en el análisis SOM; número de células estaban por debajo del Cut-off de la vida de 1000 células/cámara. Las células en 2 díg andamios se clasificaron también como células de grupo ii; estas condiciones no admiten hPSC auto-renovación48. Señal de las células de GT_MidNF_MidCD EdU fue perdido y los niveles de anexina V se incrementaron ligeramente, indicando que las células habían perdido su troncalidad y poco a poco se habían convertido en apoptosis. PMGI_MidNF_HighCD, que representa a los microambientes que incluye matrices de nanofibras PMGI, mostraron las mayores variaciones en señales OCT4 y EdU en comparación con las demás condiciones.
Figura 1 . Proyección estrategia para identificar microambientes celulares óptimo para la regulación de funciones celulares. (A) Resumen de los componentes de la Matriz microambiente celular artificial multiplexados (MACME). La matriz se compone de dos partes principales: nanofibras camas con dibujos sobre un sustrato basal (matriz de nanofibras) y un polidimetilsiloxano (PDMS)-basado en estructura de microfluidos. La matriz MACME es capaz de preparar nanofibras ECMs con una variedad de características (es decir, materiales de nanofibras y las densidades) y células diferentes densidades de siembra. El PDMS microfluídicos estructura de la matriz MACME cuenta con tres alturas de canal microfluídico (250, 500 y 1000 μm) para regular la densidad de siembra de la célula inicial. (B) el impacto de los microambientes celulares en fenotipos celulares se evalúa cuantitativamente usando un análisis basado en imágenes de unicelular y el análisis de datos estadísticos por mapa autoorganizado (SOM) seguido del clustering jerárquico. Esta figura fue adaptada de la referencia49 con permiso de Wiley. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 . Diseño de la matriz MACME. (A) cabeza y tiros de alto ángulo de la matriz completa de MACME y el diagrama conceptual de un canal de microfluidos (azul claro) en matriz de nanofibras (rosa). Cada canal se compone de un 700 μm ancho y compartimiento de la larga cultura de 8,4 mm y dos entradas para la introducción del medio y las células. (B) comparación de tamaños de células y matrices de nanofibras. Las alturas de las células y nanofibras camas van desde 1 a 3 μm y 0.05-5.0 μm, respectivamente. (C) una sección transversal de cada canal microfluídico con una altura de 250/500/1000 μm. Camas de nanofibras y las células se representan como círculos azules y naranja líneas, respectivamente. Cada cámara tiene la misma anchura y longitud pero de diferentes alturas (250, 500 y 1000 μm), y cada volumen de la cámara fue de 1.6, 3.2 y 6.4 μL, respectivamente. El rectángulo negro punteado en la figura 2C denota figura 2B. Figura 2 fue adaptado de la referencia49 con permiso de Wiley. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 . Fabricación de matriz MACME. (A) fabricación de una matriz de nanofibras. Patrones múltiples matrices de nanofibras en una placa de base se realizan mediante electrospinning modificado utilizando un conjunto de máscaras teniendo agujeros estampados. Capa de platino se realizó para facilitar la deposición de nanofibras en una placa de base plástica. Las mascaras con distintos patrones de orificios se prepararon mediante una impresora 3D. Después de enmascaramiento de la zona de platino recubierto de la placa, el conjunto de placa de la máscara fue puesto en la pantalla de colección y electrospinning normal fue realizada. Las nanofibras iniciales se formaron en las posiciones Pt-revestida en la placa a través de los agujeros en la máscara. Camas adicionales nanofibras fueron fabricados en la placa de reemplazo la máscara existente y repitiendo el procedimiento. (B) fabricación de una estructura de microfluidos. El molde imprimido por una impresora 3D con resina de curado UV en forma de la capa PDMS del dispositivo microfluídico. Después del vaciado, la matriz MACME fue montada por colocar una capa de microfluídica basada en PDMS con un arreglo de superficie activa de nanofibras. Figura 3 es una adaptación de referencia49 con permiso de Wiley. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 . Imágenes de interfaces gráficas de usuario (GUI) para la adquisición de la imagen microscópica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5 . Imágenes de interfaces gráficas de usuario (GUI) guiada por computadora de procesamiento de imágenes para unicelular phenotyping. El proceso de análisis de imagen contiene 5 pasos; (A) identificación de los objetos primarios en DAPI imágenes, (B-D) identificación de los objetos secundarios de OCT4, anexina V y EdU imágenes, respectivamente y la medición de la intensidad del objeto. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6 . Phenotyping y clasificación de los fenotipos de hESCs H9 alterado por factores microambiental. (A) imágenes inmunofluorescente de hESCs H9 cultivadas en alta densidad de siembra inicial en nanofibras de gelatina (GT) (GT_HighNF_HighCD), teñidos con tres marcadores fenotípicos celulares (OCT4, pluripotencia; EdU, proliferación celular; Anexina V, apoptosis) y DAPI para el núcleo celular. (B) un heatmap y dendrogramas de clustering jerárquico sin supervisión. Los microambientes probados se categorizaron en tres grupos con características distintivas basadas en semejanzas de los fenotipos. Grupo incluí GT nanofibras, MG_HighCD y VN_HighCD. Grupo ii consistió en muestras de nanofibras GT (GT_XLow y MidNF_MidCD), MG_MidCD o VN_MidCD. Todas las muestras PMGI_NF fueron agrupadas en el grupo iii. En el mapa de calor, colores rosados y azules indican las frecuencias alta y baja celulares en SOM cuenta parcelas, respectivamente. (C) distribución de los niveles de expresión de marcador cuantificada de 1000 células en una muestra representativa de cada grupo (Grupo i-GT_MidNF_HighCD, grupo ii-GT_MidNF_MidCD y grupo iii-PMGI_MidNF_HighCD). Los percentiles 25 y 75 fueron indicados como los límites de la caja. Los bigotes se extienden a 1.5 veces el rango intercuartil de los percentiles 25 y 75. Experimentos se repitieron tres veces para cada grupo. Figura 6 A-C se han adaptado con permiso de Wiley de referencia49 . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Nombre | Canal largo (mm) | Ancho de canal (μm) | Altura de canal (μm) | Diámetro de entrada y salida (μm) | Altura de entrada y salida (μm) | Molde largo (mm) | Ancho del molde (mm) | Altura del molde (mm) |
| Molde | 8.4 | 700 | 250/500/1000 | 800 | 3000 | 127.76 | 85.48 | 14.35 |
| Nombre | Grueso (μm) | Longitud de agujero (mm) | Anchura del orificio (mm) | Máscara longitud (mm) | Máscara de ancho (mm) | Altura del molde (mm) | Desplazamiento de fila (mm) | Desplazamiento de la columna (mm) |
| Máscara | 1000 | 6 | 5 | 123.5 | 80.2 | 14.35 | 11.24 | 14.38 |
Tabla 1. Dimensiones de molde para una estructura de microfluidos y máscara para un patrón de nanofibras.
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Discussion
Este protocolo muestra el primer método de screening para establecer un sistema de cultivo sólido para el mantenimiento de hPSCs calificado. En primer lugar, hemos descrito cómo preparar una plataforma con diversas ECMs artificial y célula siembra densidades usando un dispositivo microfluídico integrado con una variedad de nanofibras, la matriz MACME. Phenotyping sola célula basada en imágenes en segundo lugar, cuantitativo fue realizado50 para evaluar los resultados celulares individuales y comportamientos alterados por diferentes características bioquímicas y biofísicas. En el presente Protocolo, el entorno compuesto por nanofibras GT y proteínas de la ECM de control positivo en la condición de la celda inicial alta densidad de siembra fue caracterizado por las características de un estado indiferenciado; rápida proliferación45 y estable OCT4 expresión51. Esta observación indica que los mecanismos moleculares relacionados con la "matriz extracelular de la célula" y "célula" interacciones podrían afectar pluripotencia de hPSCs.
Esta estrategia puede personalizarse para adaptarse a propósito del usuario. Por ejemplo, rendimiento de procesamiento y manipulación de células pueden ajustarse para una variedad de configuraciones experimentales por rediseñar las formas y los patrones de la estructura de microfluidos. Como otra forma de mejora de rendimiento, las posiciones de entrada y salida de cada compartimiento están diseñadas según el estándar de microplacas de 96 pocillos de placas, estandarizados por la sociedad de Ciencias biomoleculares; por lo tanto, puede utilizarse un dispensador líquido robótico automatizado para el cribado de alto rendimiento. Para examinar más lejos el mecanismo molecular sobre "Interacciones célula-ECM", las artificiales microambientes celulares se pueden hacer para imitar más precisamente en vivo condiciones modificando químicamente las nanofibras con señalización de moléculas52 .
Hasta la fecha, la mayoría plataformas desarrolladas para la detección de microambientes celulares han estado orientadas en el screening de factores solubles (p. ej., factores de crecimiento y compuestos químicos)42,43,44, pero no nanofibras ECMs debido a dificultades en la combinación de las técnicas de fabricación distintos. Por ejemplo, una hoja de nanofibras produce un pequeño espacio entre una estructura de microfluidos y una placa de base y hace que su unión inestable, que resulta en la contaminación entre diferentes muestras porque un medio de cultivo se mezcla con otra cámara a través de el pequeño espacio. Nuestro nuevo método facilita la fabricación simple y precisa de matrices de nanofibras en sitios específicos y permite su vinculación directa con la placa base, que evita la Unión inestable y la contaminación cruzada. Por otra parte, algunas plataformas53 integrado con la microfluídica y matrices de nanofibras han sido accesibles para la sistemática manipulación de señales químicas y físicas para investigar sus efectos sobre las funciones de la célula, porque las tecnologías necesitan para la integración eran altamente sofisticado. Nuestros perfiles sola célula con la matriz MACME puede realizarse con un aparato fácilmente alcanzable y técnicas sencillas y tiene gran potencial para el uso en la modelación celulares entornos para desarrollo y celular estudios biológicos y el descubrimiento de medicamentos / proyección.
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Disclosures
Ninguno.
Acknowledgments
Agradecemos a Prof. N. Nakatsuji en iCeMS, Universidad de Kyoto, para proporcionar células madre embrionarias humanas. También agradecemos a Prof. A. Maruyama en Instituto de tecnología de Tokio por su apoyo en el uso del microscopio de fuerza atómica. Financiamiento fue proporcionado generosamente por la sociedad japonesa para la promoción de la ciencia (JSPS; 22350104, 23681028, 25886006 y 24656502); la financiación también fue proporcionada por la nueva energía y organización de desarrollo de tecnologías industriales (NEDO) y la Fundación de Ciencias de la vida de Terumo. El WPI iCeMS es apoyado por el mundo Premier Internacional Investigación Centro iniciativa (IPM), el Ministerio de educación, cultura, deportes, ciencia y tecnología (MEXT), Japón. Una parte de este trabajo fue apoyada por el centro de nanotecnología de Universidad de Kyoto y la planta de Nano-procesamiento de AIST en "Proyecto de plataforma de nanotecnología" patrocinado por MEXT, Japón.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polystyrene (PS) | Sigma | #182435 | Average Mw: 290,000, average Mn: 130,000 |
| Polymethylglutarimide (PMGI) | MicroChem | G113113 | |
| Gelatin (GT) | Sigma | G2625 | From porcine skin, type A |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Doe Corning Toray | #1064291 | PDMS curing agent and silicone elastomer base are components of this kit. |
| OpenSCAD | This is a free 3D computer graphics software (http://www.openscad.org/) used for designing the mold of the microfluidic device. | ||
| AutoCAD 2014 | Autodesk | This is a 3D computer graphics software (https://www.autodesk.com/products/autocad/overview) used for design of the mask used on nanofiber-array preparation. | |
| 3D printer, AGILISTA-3000 | Keyence | ||
| UV-curable resin, AR-M2 | Keyence | This is used for 3D printing by Agilista. | |
| Acetic acid | Sigma | #338826 | ≥99.99% |
| Ethyl acetate | Sigma | #270989 | Anhydrous, 99.8% |
| Tetrahydrofuran (THF) | Sigma | #401757 | |
| MSP-30T | Vacuum Device | Magnetron sputtering machine | |
| Nunc OmniTray | Thermo Fisher Scientific | #242811 | This is a polystyrene baseplate on which the nanofiber array is created. This plate size is typically 127.7 x 85.5 mm. |
| Gun-type corona discharge machine | Shinko Electric & Instrumentation | CFG-500 | This handy device is used to generate corona for activation of the bottom surface of the PDMS layer at step 1.5 "Assembly of the MACME arrays" in the protocol. |
| 5 mL syringe | Terumo | SS-05SZ | |
| Stainless-steel blunt needle (23-gauge) | Nipro | #2166 | Outside diameter and length are 0.6 and 32 mm, respectively. |
| High-voltage power supply | TechDempaz | ||
| 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide, hydrochloride | Dojindo | W001 | |
| N-Hydroxysuccinimide | Sigma | #56480 | |
| Matrigel hESC-Qualified Matrix | Corning | #354277 | This protein is refered as basement membrane gel matrix in the protocol. |
| CellAdhere Vitronectin, Human, Solution | STEMCELL Technologies | #07004 | |
| TeSR-E8 | STEMCELL Technologies | #05940 | Feeder-free, xeno-free culture medium for maintenance of human ES and iPS cells |
| Y-27632 | Wako Pure Chemical Industries | #253-00513 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red | Thermo Fisher Scientific | #12605028 | This ia a recombinant trypsin-like protease for dissociation of adherant mammalian cells. |
| Click-iT EdU Imaging Kit with Alexa Fluor 647 Azides | Thermo Fisher Scientific | C10086 | The fluorescent labeling of proliferating cells in on-plate fluorescent staining was performed along the product manual of this kit. |
| Annexin V, Alexa Fluor 594 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A13203 | |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Oct-3/4 Antibody (C-10) | Santa Cruz Biotechnology | sc-5279 | |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (DyLight 488) | abcam | ab96875 | This is a secondary antibody used in on-plate fluorescent cell staining. |
| ECLIPSE Ti-E | Nikon | This is an inverted fluorescence microscope equipped with a CFI Plan Fluor 4×/0.13 N.A. objective lens (Nikon), CCD camera (ORCA-R2, Hamamatsu), mercury lamp (Intensilight, Nikon), XYZ automated stage (Ti-S-ER motorized stage with encoders, Nikon), and filter cubes for four fluorescence channels (DAPI, GFP HYQ, TRITC, Cy5; Nikon) | |
| NIS-Elements Advanced Research | Nikon | This is a microscope imaging software used for automatic image acquisition. | |
| CellProfiler, Version 2.1.0 | This is a free open software for cell image analysis (http://cellprofiler.org/). | ||
| R | SOM analysis is performed by kohonen package of this software. This is freely available (https://www.r-project.org/). | ||
| Cluster 3.0 | This is the open source clustering software (http://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster/software.htm). Unsupervised hierarchical clustering is performed with this software. | ||
| Java TreeView | This open source software (http://jtreeview.sourceforge.net/) is used to visualize clustering data as a heatmap and a dendrogram. | ||
| H9 human embryonic stem cell | WiCell Stem Cell Bank | WA09 |
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