Summary
Dieser Artikel beschreibt die detaillierte Methode ein Array gemultiplext künstliche zellulären Mikroumgebung (MACME) Vorbereitung für Hochdurchsatz-Manipulation von physikalischen und chemischen imitiert in Vivo zellulären Mikroumgebungen Queues und Identifizieren Sie die optimale zelluläre Umgebung für menschliche pluripotenten Stammzellen (hPSCs) mit einzelligen profiling.
Abstract
Zelluläre Mikroumgebungen bestehen aus einer Vielzahl von Signalen, wie Wachstumsfaktoren, extrazellulären Matrizen und interzelluläre Wechselwirkungen. Diese Hinweise sind gut inszeniert und von entscheidender Bedeutung bei der Regulierung der Zellfunktionen in ein lebendiges System. Obwohl eine Reihe von Forschern versucht haben, die Korrelation zwischen Umweltfaktoren und gewünschte Zellfunktionen zu untersuchen, bleibt noch viel Unbekanntes. Dies ist vor allem auf das Fehlen einer richtigen Methodik derartige ökologische Hinweise in Vitrozu imitieren und gleichzeitig testen verschiedene ökologische Hinweise auf Zellen. Hier berichten wir über eine integrierte Plattform von mikrofluidischen Kanälen und einer Nanofaser-Palette, gefolgt von hoch-einzellige Inhaltsanalyse, Stammzell-Phänotypen verändert durch verschiedene Umweltfaktoren zu untersuchen. Um die Anwendung dieser Plattform zu demonstrieren, konzentriert sich diese Studie auf die Phänotypen menschlicher pluripotenter Stammzellen (hPSCs) selbst zu erneuern. Hier präsentieren wir Ihnen die Vorbereitung-Verfahren für eine Nanofaser-Array und mikrofluidischen Struktur bei der Herstellung eines Arrays gemultiplext künstliche zellulären Mikroumgebung (MACME). Darüber hinaus werden allgemeine Schritte der Profilierung, Zelle färben mit mehreren fluoreszierenden Marker, mehrere Fluoreszenz-Bildgebung und statistische Analysen, einzellige beschrieben.
Introduction
Menschlicher pluripotenter Stammzellen (hPSCs)1,2 selbst unbegrenzt zu erneuern und zu differenzieren in verschiedene Gewebe Abstammungen, die Entwicklung von Medikamenten, zellbasierte Therapien, Gewebetechnik und regenerative Medizin revolutionieren könnte 3 , 4 , 5 , 6. allgemeine Kultur Gerichte und Mikrotiter-Platten, jedoch sollen nicht präzise physikalische und chemische Zelle Manipulation auf zellulärer Ebene mit dem Bereich der Nano -, Mikro-Meter, aktivieren, wodurch ein entscheidender Faktor für die zelluläre Expansion ist, Selbsterneuerung und Differenzierung. Um diesen Nachteil zu beheben, haben Studien die Rolle der zellulären Mikroumgebungen bei der Regulierung der Zelle-Schicksal Entscheidungen und Zelle Funktionen4untersucht. In den letzten Jahren haben eine wachsende Zahl von Studien durchgeführt, um zelluläre Mikroumgebungen in-vitro-7,8zu rekonstruieren. Nano und Mikro-Herstellungsprozesse haben diese Mikroumgebungen durch die Manipulation der chemischen9,10,11,12,13etabliert, 14,15,16,17 und physischen18,19,20 ökologische Hinweise. Bis jetzt gab es keine Berichte, die zugrunde liegenden Mechanismen der chemischen und physikalischen Umwelt Hinweise auf Zelle-Schicksal Entscheidungen und Funktionen innerhalb einer einzigen Plattform systematisch zu untersuchen.
Hier stellen wir eine Strategie basiert auf einfachen Design-Prinzipien, eine robuste Screening-Plattform (Abbildung 1) zu etablieren. Zunächst beschreiben wir die Entwicklung Vorgehensweise einer integrierten Plattform für die Erstellung vielseitiger, künstliche zellulärer Mikroumgebungen mithilfe einer Nanofaser-Array und mikrofluidischen Struktur: die gemultiplext künstliche zellulären Mikroumgebung (MACME) Array (Abbildung 1A , 2A). Das Nanofaser-Array enthält 12 verschiedene Mikroumgebungen in unterschiedlichen Kombinationen von Nanofaser Materialien und dichten. Elektrospinnen wurde zur Nanofasern zu fabrizieren. Die Nanofaser-Materialien, wie Polystyrol (PS)21, Polymethylglutarimide (PMGI)22und Gelatine (GT)23, wurden entwickelt, um ihrer chemischen Eigenschaften testen die Zelladhäsion und Aufrechterhaltung der Pluripotenz ( beeinträchtigen könnten Abbildung 2B). Nanofaser dichten waren vielfältig durch Elektrospinnen Zeit ändern und die generierten Nanofasern wurden nach ihrer Dichte definiert (DNF, mit D = XLow/Low/Mid/High). Die mikrofluidischen Struktur besteht aus Polydimethylsiloxan (PDMS) beherbergen 48 Zellkultur Kammern, die entlang die Standardabmessungen der 96-Well Mikrotestplatte positioniert werden können. PDMS ist eine biokompatible und Gas-austauschbare Polymer in der Regel zur Herstellung von mikrofluidischen Geräten24verwendet. Jeden mikrofluidischen Kanal wurde entwickelt, um 700 µm breit und 8,4 mm lang und hatte zwei Buchten an den Rändern (Tabelle 1). Die Kammern hatten unterschiedliche Höhen (250, 500 und 1000 µm), die erste Zelle Aussaat dichten (0,3 und 0,6 1,2 × 105 Zellen/cm2), die mit überleben, Proliferation und Differenzierung von hPSCs25 korrelieren könnte zu manipulieren (Abbildung 2C). Die Anzahl der Zellen ausgesät in eine Kammer ist proportional zu der Spalte Dichte über dem Kammerboden, und somit erste Zelle Dichte Aussaat wurde durch die Einführung der gleichen Zellsuspension in Kultur Kammern mit unterschiedlichen Höhen gesteuert. Alle Kanäle wurden entwickelt, um ≥ 250 µm hohen26 werden zur Minimierung der Auswirkungen von sauerstoffarmen Spannung27 und Schubspannung28 auf die Zellen. Kanal-Höhen von 250, 500 und 1000 µm werden hier abgekürzt als XCD mit X = Low, Mid, und hoch, beziehungsweise. Umgebungen mit unterschiedlichen Nanofaser dichten und erste Zelle Aussaat dichten wurden als "Material_NF-Density_Cell-Dichte" verkürzt (z. B. GT_HighNF_HighCD: ein Umfeld mit hoher Dichte GT Nanofasern und hohe anfängliche Zelle-seeding geprägt Dichte).
Anschließend beschreiben wir, wie einzellige Analysen um Zellen Verhalten als Reaktion auf Umweltfaktoren (Abbildung 1B) systematisch zu untersuchen. Als ein Proof-of-Concept identifizierten wir die optimale zelluläre Umgebung hPSC Selbsterneuerung, das ist eine zentrale Funktion für hPSC Wartung (Abbildung 1B)29. Image-basierte zytometrie, gefolgt von statistischen Analysen ermöglicht quantitative Interpretation der einzelnen zellulären phänotypischen Antworten auf zelluläre Umgebungen. Unter einer Vielzahl von zellulären Funktionen bietet dieses Papier ein detailliertes Verfahren um die optimalen Bedingungen für die Aufrechterhaltung der hPSC Selbsterneuerung zu identifizieren.
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Protocol
(1) Herstellung von MACME Array
Hinweis: Alle Materialien und Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.
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Vorbereitung von Masken für eine Nanofaser-Array und eine Form für eine mikrofluidische Struktur
- Erstellen Sie dreidimensionale (3D) Bilder von Masken für die Nanofaser-Arrays und Formen für mikrofluidischen Strukturen mittels 3D Computergraphik-Software-Pakete (Tabelle 1) verwendet.
Hinweis: Die 3D-Bilder sind gelesen und durch einen 3D-Drucker ausgedruckt. Die gedruckten Masken und Schimmel haben die gleichen Abmessungen mit 3D Bildern über die Grafiksoftware bei Schritt 1.1.1 definiert. - Drucken Sie Masken und eine Form basierend auf diese Entwürfe mit einem 3D-Drucker.
Hinweis: In diesem Protokoll war ein Ink-Jet-Like-3D-Drucker mit UV-härtender Harz verwendet30. Die Auflösung des Druckers war 635 × 400 dpi und 15 µm in X, Y und Z, bzw. der tatsächlichen X Y-Auflösung war jedoch etwa viermal geringer.
- Erstellen Sie dreidimensionale (3D) Bilder von Masken für die Nanofaser-Arrays und Formen für mikrofluidischen Strukturen mittels 3D Computergraphik-Software-Pakete (Tabelle 1) verwendet.
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Nanofaser-Array Vorbereitung (Abbildung 3A( )
- Elektrospinnen Polymerlösungen vorbereiten.
- Verdünnen Sie 13 % PMGI Flüssigkeit mit Tetrahydrofuran von 9 % (w/V)22.
- Lösen Sie 0,08 g PS (Anzahl durchschnittliche Molekulargewicht (Mn): 130.000) in THF:dimethylformamide (Volumenverhältnis 1:1)21, und fügen Sie THF:dimethylformamide das Volumen bis zu der endgültigen 1 mL (8 % (w/V) PS Lösung) zu bringen.
- 0,1 g GT in Wasser auflösen: acetic Acid: Ethylacetat (1:1.6:2.1-Volumen-Verhältnis), und fügen Sie Wasser: acetic Acid: Ethylacetat bringen das Volumen bis zu der endgültigen 1 mL (10 % (w/V) GT-Lösung) als beschrieben23,31.
- Verwenden Sie ein Magnetron Sputtern Maschine, Zahlen Sie eine dünne Schicht Platin mit einer 5-nm Dicke auf einer Polystyrol (PS)-Grundplatte (127,7 × 85,5 mm), dient als eine Kathode im Elektrospinnen Setup ein.
- Laden Sie jede Polymerlösung in einer 5-mL-Spritze mit einer stumpfen Nadel von 23 G aus rostfreiem Stahl ausgestattet.
- Legen und die Spritze mit der Nadel auf eine Spritzenpumpe mit 12-cm neben der Sammler das Elektrospinnen Gerät zu verankern.
- Verbindung die Spritzennadel mit einer Hochspannungs-Stromversorgung, und zuweisen 11 kV.
- Festlegen der FÖRDERRATE von 0,2 mL/h.
- Halten Sie die Temperatur und Luftfeuchtigkeit bei 30 ° C und < 30 % (V/V).
- Ziehen Sie die Maske auf der Grundplatte am Schritt 1.2.2 zubereitet.
- Nanofasern auf der Grundplatte durch die Löcher der Maske mit unterschiedlichen dichten zu fabrizieren, indem Sie ändern die Elektrospinnen Zeit (z. B. 20, 60, 90 und 180 s).
- Entfernen Sie die Maske aus der Grundplatte.
Hinweis. Ethanol kann auf Electrospun GT Nanofasern gesprüht werden, bevor Sie die Maske zur Vermeidung von GT Nanofasern zusammen mit der Maske abziehen entfernen. - Wiederholen Sie Schritt 1.2.4-1.2.10 bis zur Fertigstellung des Nanofaser-Array Fertigung.
- Nanofaser-Array in einem Exsikkator bei 25 ° C 16 h das restliche Lösungsmittel verdunsten zu platzieren.
- Crosslink GT Nanofasern mit 0,2 M 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) Carbodiimide Hydrochlorid (EDC) und 0,2 M N-Hydroxysuccinimide (NHS) in Ethanol bei 25 ° C für 4 h23.
- Spülen Sie GT Nanofasern zweimal mit 99,5 % (V/V) Ethanol und Vakuum-trocken, bei 25 ° C 16 h.
- Elektrospinnen Polymerlösungen vorbereiten.
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Herstellung von mikrofluidischen Strukturen (Abbildung 3B( )
- Mischen Sie 2 g PDMS Heilung Agent und 20 g der PDMS-Basis (01:10 Gewicht-Verhältnis; Pre-PDMS). 24
- Gießen Sie die Pre-PDMS-Mischung auf die Form, die in Schritt 1.2 hergestellt.
- De-Gas die Pre-PDMS-Mischung in den Exsikkator gestellt für 30 Minuten.
- Die Pre-PDMS-Mischung in einem Ofen bei 65 ° C 16 h zu heilen.
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Montage von MACME Arrays (Abbildung 3B( )
- Abziehen der PDMS-Struktur bei Schritt 1.3.4 aus der Form und sauber mit 70 % (V/V) Ethanol geheilt.
- Atmosphärischen Korona-Entladung auf der Unterseite des PDMS Struktur32zu behandeln.
Hinweis: In diesem Protokoll wird die Korona auf der gesamten Oberfläche eine Schicht 3 oder 4 mal mit einem "Handy" Korona-Entladung Apparat entladen. Sauerstoff-Plasmabehandlung ersetzte mit atmosphärischen Korona-Entladung, die Oberfläche Haftfähigkeit zu ändern. - Montieren Sie die PDMS-Struktur mit dem Nanofaser-Array schnell.
- Backen Sie Backofen-bei 65° C für 2 Tage.
2. Laden hESC in MACME Array
- Pflegen Sie für die routinemäßige Kultur der H9 menschliche embryonale Stammzellen (hESC), dass Zellen in Xeno-freien Kulturmedium für hPSC Wartung33 ergänzt mit 10 µM Y-27632 ROCK-Inhibitor34 (hPSC Medium genannt) in einer 35-mm-Zellkultur chemisch definiert Gericht mit Basalmembran Gelmatrix (MG) beschichtet.
- Durchgang Zellen alle 4-7 Tage mit einem rekombinanten Trypsin-ähnliche Protease.
- Sterilisieren Sie eine MACME Array mit 99,5 % Ethanol, durch Einlegen in den Kammern für 10 min, und entfernen Sie dann das Ethanol. Wiederholen Sie diesen Schritt 3 Mal.
- Stellen 12 µL 10 µg/mL Vitronectin (VN), mg und 0,1 % (w/V) GT in Steuerelement Kultur Kammern und inkubieren Sie die Kammern bei 37 ° C für 1 h auf den Oberflächen der Kammer zu beschichten.
Hinweis: In diesem Protokoll wurden MG, VL und GT als Referenz Proteine für die Zelladhäsion und Kultur gewählt. Da MG und VN standard Zellkultur Matrizen verwendet für die Aufrechterhaltung der hPSC Selbsterneuerung sind, dienen sie als Positivkontrollen; zweidimensionale GT Beschichtung (2DGT) oder nicht-Beschichtung (NC) dienten als Negativkontrollen. - Vorgewärmte hPSC Medium in alle Kammern MACME Arrays einführen. Inkubieren Sie die Kammern für 30 min bei 37 ° c
- Waschen H9 hESC kultiviert auf einer 35-mm-Schale mit DPBS, 0,5 mL eines rekombinanten Trypsin-ähnliche Protease in die Schale hinzufügen und Inkubation bei 37 ° C für 1 min und Aspirieren Sie sorgfältig nur die Überstände mit Protease gemischt.
Hinweis: Bei der Aspiration Schritt sind die Zellen nicht gelöst. - Fügen Sie sofort hPSC Medium, verzichten Sie sanft das Medium gegen die Oberfläche der Schale mehrmals, um Zellen zu trennen und die freistehenden Zellen auf eine 15 mL konische Rohr übertragen.
- Zentrifugieren bei 200 X g für 3 min. Aspirat überstand und Zellen in einem vorgewärmten hPSC Medium aussetzen.
- 12 µL Zellsuspension (1,2 × 106 Zellen/mL) in jeder Kammer mikrofluidischen einführen.
Hinweis: Eine Kammer stellen Sie Zellen voneinander mit einer Mikropipette vor. Da die Anzahl der Zellen ausgesät Kammern proportional zur Spalte Dichte über dem Kammerboden ist, konnte die erste Zelle Aussaat Dichte kontrolliert werden, obwohl Proben aus gleichen Zellsuspension verwendet wurden. Sicherstellen Sie, dass pipettieren sanft erfolgt. Entfernen Sie überschüssiges Mittel aus den Kammern mit einem Baumwoll-Kreissägeblätter-Stick nach dem Laden. Das MACME-Array ist kompatibel mit gängigen Labor Pipetten und automatische Pipette Systeme, und es erfordert keine spezielle Ausrüstung. - HPSC Medium jeder 12 h und Kultur für 4 Tage zu ändern.
Hinweis: Konstanten Volumen des Mediums (1,6 mm, 3,2 und 6.4 µL) werden mithilfe von Kammern mit unterschiedlichen Größen beibehalten. Kultur-Zellen unter einen statischen Zustand Scherbeanspruchung bis auf den Austausch der Zelle Kulturmedium35,36zu minimieren.
3. quantitative einzellige Profilierung
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Fluoreszierende Zelle Färbung auf Platte
Hinweis: um phänotypischen Veränderungen selbst erneuern hPSCs zu analysieren, dieses Protokoll drei wichtige phänotypischer Marker für dieses Protokoll ausgewählt: OCT4, 5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine (EdU), und Annexin V, um den Status der Pluripotenz, Proliferation und Apoptose zu messen , bzw. (Abbildung 2b). 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) wird verwendet, um die Zellkerne zu identifizieren. OCT4 gehört zu den kritischen Transkriptionsfaktoren der Pluripotenz.- Inkubieren Sie H9 hESC in MACME Arrays in hPSC Medium ergänzt mit 10 µM EdU Alkinen bei 37 ° C für 30 min.
- Nach dem Waschen mit annexin-Bindung-Puffer (10 mM HEPES (pH-Wert 7,4), 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCl2), Färben Sie sich die Zellen mit einer Orange-fluoreszierenden Farbstoff Annexin V Konjugat bei 20 ° C für 15 min.
- Beheben Sie Zellen mit PBS-Puffer mit 4 % (V/V) Paraformaldehyd bei 20 ° C für 15 min zu, und dann spülen Sie Zellen mit PBS zweimal.
- Permeabilize Zellen mit PBS mit 0,3 % (V/V) Triton x-100 bei 20 ° C 16 h.
Hinweis: Paraformaldehyd schwächt die Bindung zwischen einer Kunststoff Grundplatte und einem PDMS mikrofluidischen Struktur. Somit kann die Ablösung des PDMS-Schicht aus dem Array bei Schritt 3.2.1 auch direkt nach diesem Schritt durchgeführt werden. - Inkubieren Sie Zellen in Tris-basierte Reaktion Puffer mit einer rot-fluoreszierenden Farbstoff-azid bei 20 ° C für 30 min.
- Inkubieren Sie Zellen in blockierende Puffer (PBS mit normalem ziegenserum 5 % (V/V), 5 % (V/V) normale Esel-Serum, 3 % (w/V) Rinderserumalbumin, 0,1 % (V/V) Tween-20 und 0,1 % (w/V) N-Dodecyl-β-D-maltosid) bei 4 ° C für 16 h.
- In PBS mit 0,5 % (V/V) Triton x-100 Lösung und menschlichen OCT3/4 Antikörper (Maus IgG) bei 4 ° C für 16 h inkubieren.
- In blockierende Puffer mit grün fluoreszierenden Farbstoff-markierten Esel Anti-Maus IgG (H + L) bei 37 ° C für 60 min inkubieren.
- In PBS mit DAPI bei 20 ° C für 30 min inkubieren.
- PBS-DAPI mit PBS zu ersetzen.
- Bewahren Sie das MACME-Array bei 4 ° C bis Bildaufnahme.
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Image-Erwerb (Abbildung 4( )
- Die PDMS mikrofluidischen Struktur aus dem Array MACME abziehen.
- Entfernen der restlichen PBS aus dem Array MACME, gelten 90%(v/v) Glycerin mit PBS-Puffer für die Zellen und Deckgläsern über die gefärbten Zellen.
- Die Platte auf dem Kopf stehend auf der Bühne von einem umgekehrten Fluoreszenzmikroskop einstellen
- 12-Bit-Farbe Bilder automatisch mit allen motorisierten Komponenten (Bühne, Filter, Verschlusszeit und Fokus Systeme), die durch ein Mikroskop imaging-Software gesteuert waren zu erwerben.
Hinweis. In diesem Protokoll Belichtungszeiten werden angepasst, um in der Nähe von höchster Intensitätswerte zu erreichen (höchste Pixel-Intensität: 4096), aber keine Sättigung, für jedes Bild, DAPI OCT4, Annexin V und EdU.
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Computer-gesteuerten Bildverarbeitung und Fluoreszenz-signal Quantifizierung (Abbildung 5)
Hinweis: die folgenden Zelle Bildanalyse erfolgt anhand einer zuvor beschriebenen Methode37.- Konvertieren Sie Farbbilder in Graustufen.
- Einen einzigen Schwellenwert für jedes DAPI-Bild mit der Otsu-Methode zu berechnen und zu klassifizieren Pixel oberhalb der Schwelle als Vordergrund und unten als Hintergrund. Sicherstellen Sie, dass die Fluoreszenz Intensität des DAPI Foreground-Wert entspricht.
Hinweis: Die Bild-Analyse-Prozess enthält 5 Schritte; Kennung der primären Objekte in DAPI Bilder, Identifikation von sekundären Objekten in OCT4, Annexin V und EdU Bilder, bzw., und die Messung der Intensität des Objekts. Abbildung 3 stellt die Bilder der grafischen Benutzeroberfläche (GUI) auf die Einstellung der Bildverarbeitung. - Messen Sie die fluoreszierenden Intensitäten der OCT4 und EdU auf das jeweilige Bild.
- Identifizieren Sie die Region mit Annexin V mit der Vermehrung Methode befleckt zu und quantifizieren Sie die fluoreszente Intensität.
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3.4 statistische Analyse einzelne zelluläre Phänotypen auf einzellige Bildgebung zu visualisieren
- Normalisieren Sie die Eingabe fluoreszierenden Intensitäten der einzelnen phänotypischer Marker zentrieren und Skalieren diese Variablen, um ihnen Gleiches Gewicht zu verleihen.
- Führen Sie selbstorganisierende Karte (SOM) Analyse mithilfe einer Softwareumgebung für statistische Berechnungen und Grafiken wie von früheren Studien38,39beschrieben aus.
- Erstellen Sie 25 SOM Knoten mit markanten vier "Codebuch Vektoren" entspricht die fluoreszierenden Intensitäten der vier Markierungen, DAPI, EdU, Annexin V und OCT4.
- Ein "Gewinner" (am ähnlichsten) Knoten Einzelzellen in jeder Mikroumgebung zuweisen und Grundstück als Zelle Frequenz, wonach die Codebuch Vektoren des preisgekrönten Knotens aktualisiert werden, mit einem gewichteten Durchschnitt, wo ist das Gewicht der Lern-Kurs (hier 0,05 als (Standardeinstellung).
Hinweis: Lassen Sie Daten aus Kammern, die mit weniger als 1.000 Zellen, weil Datasets enthält ein paar Zellen nicht statistisch relevante SOM Ergebnisse geliefert hat.
- Führen Sie unbeaufsichtigt hierarchischen clustering mit den SOM-Knoten-Werten mit der Durchschnitts-Kinematik-Methode basierend auf Pearson Korrelation von einem Cluster Software40.
- Rendern Sie die clustering Daten in Dendrogramm und Heatmap Ansichten41.
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Representative Results
MACME Arrays: Design und Herstellung: In Kombination mit Nanofaser-Technologie verwendeten wir mikrofluidischen Zellkultur und screening-Verfahren zuvor eingesetzt, um optimale Bedingungen für hPSC Selbsterneuerung und Differenzierung35,36 (Abbildung 1) zu identifizieren. Dies eignet sich gut für den Aufbau robuster Hochdurchsatz-zellbasierte Assays, weil die Zelle Kultur Kammern und Bedingungen genau kontrollierbar und erweiterbar42,43,44. Hier bereitete die Nanofaser-Array eine einfache Nanofaser Abscheidungsverfahren Elektrospinnen mit 3D-Druck Masken. Mikrofluidische Teil wurde mit einem 3D-gedruckten Werkzeug leicht Kammerstruktur durch viele Versuche und Irrtümer Design hergestellt. Das MACME Array wurde durch die Kombination der beiden Teile gebaut und enthalten 48 Umgebungen, bietet verschiedene biophysikalische und biochemische Signale von verschiedenen Kombinationen von beiden Nanofaser ECMs (3 Arten von Nanofaser Materialien und 4 unterschiedliche dichten oder 4 Kontrolle matrixproteine) und Zell-Zell-Interaktionen (3 Bereiche der Zelle-säen anfangsdichte) wie dargestellt in Abbildung 2.
Bewertung der Gesamtwirkung von Nanofaser Eigenschaften und zelluläre Dichte auf hESC Phänotypen: Im Anschluss an Zellkulturen auf einem MACME Array und / Platte fluoreszierende Färbung (Abb. 6A) wurden mit den erworbenen Bildern einzellige Messungen durchgeführt. Für den Vergleich von Homogenität und Heterogenität der Ausdruck Niveaus für die vier phänotypische Markierungen in jedes Dataset, verwendet dieses Protokoll SOM Analyse38,39, der hochdimensionalen, multiparametric Datasets in umwandelt niedrigdimensionale 2D-Karten. Insbesondere wurden die Ergebnisse der PS-Nanofasern und 2DGT-Matrizen aus dieser Analyse ausgespart, angesichts der Tatsache, dass die meisten Zellen nicht befolgten. Darüber hinaus wurden von dieser Analyse ausgeschlossen diese Experimente mit niedrigen CD wo Zellen nicht genügend direkt (z. B. Juxtacrine) oder indirekte (Parakrine) Interaktionen bis hin zum Überleben haben. Nach SOM Analyse erfolgte unbeaufsichtigt hierarchischen clustering für die SOM-Knoten aller analysierten Proben (Abb. 6B). Durch die Berücksichtigung der Höhe des Clusters Dendrogramm, die phänotypische Unterschiede konnten wir die Proben in drei Gruppen zu kategorisieren: Gruppe i, die meisten der Probe Nischen bestehend aus GT-Nanofasern, MG_HighCD und VN_HighCD; Gruppe Ii, Proben mit GT-Nanofasern (GT_XLow und MidNF_MidCD), MG_MidCD oder VN_MidCD; und Gruppe Iii, alle PMGI_NF Proben.
Um die Unterschiede zwischen den Gruppen zu untersuchen, haben wir eine repräsentative Stichprobe aus jeder Gruppe (Abbildung 6C; Gruppe i-GT_MidNF_HighCD, Gruppe Ii-GT_MidNF_MidCD und Gruppe Iii-PMGI_MidNF_HighCD). In Bezug auf OCT4 Signale zeigten alle Gruppen einen höheren Ausdruck als der MG (MG_MidCD). Gruppe, die ich geprägt war durch hohe EdU Signale darauf hinweist, dass die meisten Zellen aktiv vermehren waren. Damit verkürzt Mikroumgebungen in Gruppe ich zeichneten sich als Bedingungen für hPSC Wartung weil undifferenzierte hPSCs in der Regel rasch vermehren, wenn Zellzyklus Lücke Phasen waren45,46.
GT_MidNF_HighCD und GT_MidNF_MidCD zeichnen sich durch ihre ausgeprägten erste Zelle-Ladedichten. Hohe anfängliche Zelldichten mehr Zellen Möglichkeiten zur Interaktion mit benachbarten Zellen, die ihr Überleben und Verbreitung47noch verstärkt. Zellen, die auf eine unzureichende anfangsdichte (3,0 × 104 Zellen/cm2) ausgesät überlebt weder wuchs während der Probezeit (4 Tage). Daher wir nicht diese Proben in der SOM-Analyse zu übernehmen; Zellzahlen wurden unterhalb des Cut-off von 1000 lebende Zellen/Kammer. Die Zellen in 2DGT Gerüste wurden auch als Gruppe Ii Zellen kategorisiert; Diese Bedingungen unterstützen keine hPSC Selbsterneuerung48. Die GT_MidNF_MidCD Zellen EdU Signal war verloren und Annexin V waren leicht erhöht, darauf hinweist, dass die Zellen ihre Stemness verloren hatte und sich Apoptotic allmählich hatte. PMGI_MidNF_HighCD, entspricht der Mikroumgebungen bestehend aus PMGI Nanofaser Matrizen, zeigte die größere Variationen OCT4 und EdU Signale im Vergleich zu den anderen Bedingungen.
Abbildung 1 . Screening-Strategie, um optimale zellulären Mikroumgebungen für die Regulierung der zellulärer Funktionen identifizieren. (A) Übersicht über die Komponenten des Arrays gemultiplexten künstliche zellulären Mikroumgebung (MACME). Das Array besteht aus zwei Hauptteilen: Nanofaser Betten auf eine basale Substrat (Nanofaser Array) und ein Polydimethylsiloxan (PDMS) gemustert-basierte mikrofluidischen Struktur. MACME Array ist in der Lage, Nanofaser ECMs mit einer Vielzahl von Funktionen (d. h. Nanofaser Materialien und dichten) und verschiedenen Zelle Dichte Aussaat vorbereiten. Die PDMS mikrofluidischen Struktur des Arrays MACME verfügt über drei mikrofluidischen-Kanal Höhen (250, 500 und 1000 µm), die erste Zelle Aussaat Dichte zu regulieren. (B) die Auswirkungen der zellulären Mikroumgebungen auf Zelle Phänotypen ist mit einem bildbasierten einzellige Assay quantitativ ausgewertet und die statistische Analyse von Self-organizing Map (SOM) gefolgt von hierarchischen clustering. Diese Zahl wurde mit freundlicher Genehmigung von Wiley aus Referenz49 angepasst. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 . Gestaltung des Arrays MACME. (A) Overhead und High-Angle-Aufnahmen des gesamten MACME Arrays und Konzeptdiagramm eines mikrofluidischen Kanals (hellblau) auf einer Nanofaser-Matrix (rosa). Jeder Kanal besteht aus einer 700 µm breit und 8,4 mm langen Kultur Kammer und zwei Einlässe für Einführung des Mediums und Zellen. (B) Vergleich der Größen der Zellen und Nanofaser-Matrizen. Die Höhen der Zellen und Nanofaser Betten reichen von 1 bis 3 µm und 0,05-5,0 µm, beziehungsweise. (C) einen Querschnitt der einzelnen mikrofluidische Kanäle mit einer Höhe von 250/500/1000 µm. Zellen und Nanofaser Betten werden als blaue Kreise und orange Linien dargestellt. Jede Kammer hat die gleiche Breite und Länge aber unterschiedlichen Höhen (250, 500 und 1000 µm), und jede Kammervolumen betrug 1,6 mm, 3,2 und 6.4 µL bzw.. Das schwarze gepunktete Rechteck in Abbildung 2C zeigt Abbildung 2B. Abbildung 2 wurde mit freundlicher Genehmigung von Wiley aus Referenz49 angepasst. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 . Herstellung von MACME Array. (A) Herstellung eines Nanofaser-Arrays. Anordnen mehrerer Nanofaser-Matrizen auf einer Grundplatte erfolgte durch modifizierte Elektrospinnen mit einem Satz von Masken mit gemusterten Löcher. Platin-Beschichtung wurde durchgeführt, um Nanofaser Ablagerung auf einer Kunststoff-Grundplatte zu erleichtern. Die Masken mit unterschiedlichen Lochbildern wurden von einem 3D-Drucker erstellt. Nach Maskierung von Platin beschichtete Fläche der Platte, Platte-Maske-Satz wurde im Fenster Sammlung und normalen Elektrospinnen wurde durchgeführt. Die anfängliche Nanofasern bildeten sich an den Pt-beschichtete Positionen auf der Platte durch die Löcher in der Maske. Zusätzliche Nanofaser Betten wurden auf der Platte hergestellt, durch die vorhandene Maske ersetzt und den Vorgang wiederholen. (B) Herstellung einer mikrofluidischen Struktur. Die Form gedruckt von einem 3D Drucker mit UV-härtender Harz geformt PDMS-Schicht von mikrofluidischen Gerät. Nach dem Gießen, wurde das MACME Array durch das Anbringen einer PDMS-basierte Mikrofluidik-Schicht mit einer Oberfläche aktiviert Nanofaser-Palette zusammengestellt. Abbildung 3 wurde mit freundlicher Genehmigung von Wiley aus Referenz49 angepasst. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 . Bilder von grafischen Benutzeroberflächen (GUI) für die mikroskopischen Bildaufnahme. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5 . Bilder von grafischen Benutzeroberflächen (GUI) von Computer-gesteuerten Bildverarbeitung für einzellige Phänotypisierung. Die Bild-Analyse-Prozess enthält 5 Schritte; (A) Identifizierung der primären Objekte in DAPI Bilder, (B-D) Identifizierung der sekundären Objekte in OCT4, Annexin V und EdU Bilder, bzw., und die Messung der Intensität des Objekts. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6 . Phänotypisierung und Klassifizierung der Phänotypen der H9 hESC durch microenvironmental Faktoren verändert. (A) Immunofluorescent Bilder von H9 hESC kultiviert bei hohen anfänglichen Aussaatdichte auf Gelatine (GT) Nanofasern (GT_HighNF_HighCD), befleckt mit drei zellulären phänotypische Markierungen (OCT4, Pluripotenz; EdU, Zellproliferation; Annexin V, Apoptose) und DAPI für Zellkerne. (B) ein Heatmap und Dendrogramme der unbeaufsichtigten hierarchischen clustering. Die erprobten Mikroumgebungen wurden in drei Gruppen mit Besonderheiten basierend auf Ähnlichkeiten der Phänotypen kategorisiert. Gruppe ich GT Nanofasern, MG_HighCD und VN_HighCD enthalten. Gruppe Ii bestand aus Proben von GT-Nanofasern (GT_XLow und MidNF_MidCD), MG_MidCD oder VN_MidCD. Alle PMGI_NF Proben wurden in Gruppe Iii zusammengefasst. In der Heatmap zeigen Rosa und blaue Farben Ebbe und zelluläre Frequenzen in SOM zählen Grundstücke, bzw.. (C) Verteilung der quantifizierten Marker Ausdruck Niveaus von 1000 Zellen in einer repräsentativen Stichprobe aus jeder Gruppe (Gruppe i-GT_MidNF_HighCD, Gruppe Ii-GT_MidNF_MidCD und Gruppe Iii-PMGI_MidNF_HighCD). Die 25. und 75. Perzentile wurden als die Grenzen der Box angegeben. Die Schnurrhaare erstrecken sich auf das 1,5-fache der interquartilbereich aus der 25. und 75. Perzentile. Experimente wurden für jede Gruppe drei Mal wiederholt. Abbildung 6 A-C wurden von Referenz49 adaptiert mit Erlaubnis von Wiley. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Name | Kanal-Länge (mm) | Kanalbreite (μm) | Kanalhöhe (μm) | Einlass/Auslass Durchmesser (μm) | Einlass/Auslass Höhe (μm) | Schimmel-Länge (mm) | Schimmel-Breite (mm) | Schimmel-Höhe (mm) |
| Schimmel | 8.4 | 700 | 250/500/1000 | 800 | 3000 | 127.76 | 85.48 | 14.35 |
| Name | Dicke (µm) | Lochlänge (mm) | Loch-Breite (mm) | Maskenlänge (mm) | Maske-Breite (mm) | Schimmel-Höhe (mm) | Zeile Offset (mm) | Spaltenabstand (mm) |
| Maske | 1000 | 6 | 5 | 123,5 | 80,2 | 14.35 | 11.24 | 14,38 |
Tabelle 1. Dimensionen des Form für eine mikrofluidische Struktur und Maske für eine Nanofaser-Musterung.
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Discussion
Dieses Protokoll zeigt die erste Screening-Methode um eine robuste Kultursystems für die Pflege des qualifizierten hPSCs zu etablieren. Erstens beschrieben wir, wie man eine Plattform mit verschiedenen künstlichen ECMs und Zelle dichten mithilfe eines mikrofluidischen Geräts integriert mit einem Nanofaser-Array, das Array MACME Aussaat vorzubereiten. Zweite, quantitative bildbasierte einzellige Phänotypisierung war durchgeführten50 Bewertung einzelner zellulärer Ergebnisse und Verhaltensweisen, die durch unterschiedliche Biochemische und biophysikalische Eigenschaften verändert. In diesem Protokoll war die Umgebung bestehend aus GT Nanofaser und Positivkontrolle ECM Proteine in den Zustand der hohen anfänglichen Zelle Dichte Aussaat geprägt von Eigenschaften von einem undifferenzierten Zustand; rasante Verbreitung45 und stabile OCT4 Ausdruck51. Diese Beobachtung darauf hingewiesen, dass die molekulare Mechanismen, die im Zusammenhang mit "Zelle extrazelluläre Matrix" und "Zell-Zell"-Interaktionen Pluripotenz von hPSCs beeinträchtigen könnten.
Diese Strategie kann der Benutzer Zweck angepasst werden. Zum Beispiel Zelle Manipulation und Durchsatz für eine Vielzahl von experimentellen Einstellungen einstellbar durch die Formen und Muster der mikrofluidischen Struktur neu zu gestalten. Als weitere Möglichkeit zur Verbesserung der Durchsatz sollen die Einlass und Auslass Positionen jeder Kammer nach dem Mikrotestplatte Standard von 96-Well-Platten, von der Gesellschaft der molekularbiologischen Wissenschaften standardisiert; So kann eine automatisierte Roboter liquid Dispenser für Hochdurchsatz-Screening verwendet werden. Um die molekularen Mechanismen, die zu "Zelle-ECM Wechselwirkungen" weiter zu untersuchen, können die künstliche zellulären Mikroumgebungen erfolgen, genauer gesagt in Vivo Bedingungen nachzuahmen durch chemisch ändern die Nanofasern mit Signalmoleküle52 .
Bisher haben die meisten Plattformen entwickelt für das screening von zellulärer Mikroumgebungen abzielen, wurden screening lösliche Faktoren (z. B. Wachstumsfaktoren und chemische Verbindungen)42,43,44, aber nicht Nanofaser ECMs aufgrund Schwierigkeiten in der Kombination der unterschiedlichen Fertigungstechniken. Zum Beispiel ein Nanofaser-Blatt erzeugt eine kleine Lücke zwischen einem mikrofluidischen Struktur und einer Grundplatte und bewirkt, dass ihre instabile Bindung, führt zu Kreuzkontaminationen zwischen verschiedenen Proben, weil ein Nährmedium zu mischen, mit einer anderen Kammer 1 bis die kleine Lücke. Unsere neue Methode einfach und präzise Herstellung von Nanofaser Matrizen an bestimmten Standorten erleichtert und ermöglicht ihre direkte Verklebung mit der Grundplatte, die instabile Bindung und Cross-Kontamination verhindert. Darüber hinaus einige Plattformen53 integriert mit Mikrofluidik und Nanofaser Matrizen wurden für die systematische Manipulation der chemischen und physikalischen Signale zu untersuchen, deren Auswirkungen auf die Zellfunktionen, zugänglich, weil Technologien für erforderlich die Integration wurden hochentwickelte. Unsere einzellige Profilierung mit dem MACME Array kann mit einfachen Techniken und eine leicht erreichbare Vorrichtung durchgeführt werden und birgt ein großes Potenzial für den Einsatz bei der Modellierung von zellulärer Umgebungen für Entwicklungs- und Zell-biologische Studien und Wirkstoffforschung / Screening.
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Disclosures
Keine.
Acknowledgments
Wir danken Prof. N. Nakatsuji bei iCeMS, Kyoto University, für die Bereitstellung von humanen ES-Zellen. Wir danken auch Prof. A. Maruyama am Tokyo Institute of Technology für seine Unterstützung im Umgang mit dem Rasterkraftmikroskop. Finanzierung wurde großzügig zur Verfügung gestellt von der Japan Society for Promotion of Science (JSPS; 22350104, 23681028, 25886006 und 24656502); auch wurde von der neuen Energie and Industrial Technology Development Organization (NEDO) und der Terumo Life Science Foundation finanziert. WPI-iCeMS stützt sich auf die World Premier International Research Center Initiative (WPI), Ministerium für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie (MEXT), Japan. Ein Teil dieser Arbeit wurde von Kyoto Universität Nanotechnologie Hub und der AIST Nano-Verarbeitungsanlage in "Nanotechnologie Plattform Förderprojekt" MEXT, Japan unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polystyrene (PS) | Sigma | #182435 | Average Mw: 290,000, average Mn: 130,000 |
| Polymethylglutarimide (PMGI) | MicroChem | G113113 | |
| Gelatin (GT) | Sigma | G2625 | From porcine skin, type A |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Doe Corning Toray | #1064291 | PDMS curing agent and silicone elastomer base are components of this kit. |
| OpenSCAD | This is a free 3D computer graphics software (http://www.openscad.org/) used for designing the mold of the microfluidic device. | ||
| AutoCAD 2014 | Autodesk | This is a 3D computer graphics software (https://www.autodesk.com/products/autocad/overview) used for design of the mask used on nanofiber-array preparation. | |
| 3D printer, AGILISTA-3000 | Keyence | ||
| UV-curable resin, AR-M2 | Keyence | This is used for 3D printing by Agilista. | |
| Acetic acid | Sigma | #338826 | ≥99.99% |
| Ethyl acetate | Sigma | #270989 | Anhydrous, 99.8% |
| Tetrahydrofuran (THF) | Sigma | #401757 | |
| MSP-30T | Vacuum Device | Magnetron sputtering machine | |
| Nunc OmniTray | Thermo Fisher Scientific | #242811 | This is a polystyrene baseplate on which the nanofiber array is created. This plate size is typically 127.7 x 85.5 mm. |
| Gun-type corona discharge machine | Shinko Electric & Instrumentation | CFG-500 | This handy device is used to generate corona for activation of the bottom surface of the PDMS layer at step 1.5 "Assembly of the MACME arrays" in the protocol. |
| 5 mL syringe | Terumo | SS-05SZ | |
| Stainless-steel blunt needle (23-gauge) | Nipro | #2166 | Outside diameter and length are 0.6 and 32 mm, respectively. |
| High-voltage power supply | TechDempaz | ||
| 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide, hydrochloride | Dojindo | W001 | |
| N-Hydroxysuccinimide | Sigma | #56480 | |
| Matrigel hESC-Qualified Matrix | Corning | #354277 | This protein is refered as basement membrane gel matrix in the protocol. |
| CellAdhere Vitronectin, Human, Solution | STEMCELL Technologies | #07004 | |
| TeSR-E8 | STEMCELL Technologies | #05940 | Feeder-free, xeno-free culture medium for maintenance of human ES and iPS cells |
| Y-27632 | Wako Pure Chemical Industries | #253-00513 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red | Thermo Fisher Scientific | #12605028 | This ia a recombinant trypsin-like protease for dissociation of adherant mammalian cells. |
| Click-iT EdU Imaging Kit with Alexa Fluor 647 Azides | Thermo Fisher Scientific | C10086 | The fluorescent labeling of proliferating cells in on-plate fluorescent staining was performed along the product manual of this kit. |
| Annexin V, Alexa Fluor 594 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A13203 | |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Oct-3/4 Antibody (C-10) | Santa Cruz Biotechnology | sc-5279 | |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (DyLight 488) | abcam | ab96875 | This is a secondary antibody used in on-plate fluorescent cell staining. |
| ECLIPSE Ti-E | Nikon | This is an inverted fluorescence microscope equipped with a CFI Plan Fluor 4×/0.13 N.A. objective lens (Nikon), CCD camera (ORCA-R2, Hamamatsu), mercury lamp (Intensilight, Nikon), XYZ automated stage (Ti-S-ER motorized stage with encoders, Nikon), and filter cubes for four fluorescence channels (DAPI, GFP HYQ, TRITC, Cy5; Nikon) | |
| NIS-Elements Advanced Research | Nikon | This is a microscope imaging software used for automatic image acquisition. | |
| CellProfiler, Version 2.1.0 | This is a free open software for cell image analysis (http://cellprofiler.org/). | ||
| R | SOM analysis is performed by kohonen package of this software. This is freely available (https://www.r-project.org/). | ||
| Cluster 3.0 | This is the open source clustering software (http://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster/software.htm). Unsupervised hierarchical clustering is performed with this software. | ||
| Java TreeView | This open source software (http://jtreeview.sourceforge.net/) is used to visualize clustering data as a heatmap and a dendrogram. | ||
| H9 human embryonic stem cell | WiCell Stem Cell Bank | WA09 |
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