Summary
מאמר זה מתאר את המתודולוגיה מפורט כדי להכין מערך מרובב מלאכותי תאית MicroEnvironment (MACME) עבור תפוקה גבוהה מניפולציה גופנית, כימית רמזים היה שווה ויוו הסלולר microenvironments וכדי זיהוי הסביבה התאית אופטימלית עבור תאי גזע pluripotent אנושי (hPSCs) עם פרופיל תא בודד.
Abstract
Microenvironments הסלולר להכיל מגוון של רמזים, כגון גורמי גדילה, מטריצה חוץ-תאית, אינטראקציות המערכת. רמזים אלה הם מתוזמר היטב, חיוניות בוויסות תא פונקציות במערכת חיה. למרות מספר חוקרים ניסו לחקור את הקשר בין גורמים סביבתיים לבין הרצוי תאיים, הרבה נותר עלום. זאת במידה רבה בשל חוסר במתודולוגיה נכונה לחקות כזה רמזים סביבתיים במבחנה, ולבדוק במקביל רמזים סביבתיים שונים על תאי. כאן, אנו מדווחים על פלטפורמה משולבת של ערוצי microfluidic, מערך nanofiber, ואחריו ניתוח מתא בודד גבוה-תוכן, לבחון את תאי הגזע פנוטיפים ששונו על ידי גורמים סביבתיים ברורים. כדי להדגים את היישום של הפלטפורמה, מחקר זה מתמקד הפנוטיפים של עצמי חידוש תאי גזע pluripotent אנושי (hPSCs). כאן, אנו מציגים את הליכי הכנת מערך nanofiber ומבנה microfluidic הזיוף של מערך מרובב מלאכותי תאית MicroEnvironment (MACME). יתר על כן, מתוארים השלבים הכוללת של פרופילים, תא מכתים עם מספר סמני פלורסנט, הדמיה פלורסצנטיות מרובות ניתוחים סטטיסטיים, תא בודד.
Introduction
Pluripotent האנושי תאי גזע (hPSCs)1,2 עצמית לחדש unlimitedly ו להתמיין שושלות רקמות שונות, אשר יכול לחולל מהפכה פיתוח תרופות, טיפולים מבוססי תאים, הנדסת רקמות, רפואה רגנרטיבית 3 , 4 , 5 , 6. מאכלים תרבות כללית, לוחות microtiter, עם זאת, לא נועדו לאפשר מניפולציה תא הפיסיקליות והכימיות מדויק ברמה התאית עם מגוון של ננו - כדי מיקרו-מטר, הוא גורם קריטי עבור הרחבת הסלולר, התחדשות עצמית, בידול. כדי לטפל חיסרון זה, מחקרים חקרו את התפקידים של microenvironments הסלולר בוויסות-גורל החלטות ותא פונקציות4. בשנים האחרונות, מספר גדל והולך של מחקרים נערכו לשחזר microenvironments הסלולר במבחנה7,8. תהליכי ייצור ננו מיקרו הקמנו אלה microenvironments באמצעות המניפולציה של כימי9,10,11,12,13, 14,15,16,17 ו הפיזי18,19,20 רמזים סביבתיים. עד עכשיו, היו דיווחים לחקור באופן שיטתי את המנגנון הבסיסי של רמזים סביבתיים הכימי והפיזי על החלטות גורל והפונקציות פלטפורמה אחת.
כאן, אנחנו מציגים אסטרטגיה המבוססת על עקרונות עיצוב פשוט להקים פלטפורמה הקרנה חזקה (איור 1). ראשית, אנו מתארים את ההליך בפיתוח של פלטפורמה משולבת ליצירת microenvironments הסלולר רב-תכליתי, מלאכותי באמצעות מערך nanofiber ומבנה microfluidic: מערך מרובב מלאכותי תאית MicroEnvironment (MACME) (איור 1א' ו- 2A). המערך nanofiber יש 12 microenvironments שונות שילובים שונים של חומרים nanofiber וצפיפות. Electrospinning שימשה לפברק nanofibers. החומרים nanofiber, כגון פוליסטירן (PS)21, polymethylglutarimide (PMGI)22לטין (GT)23, נועדו לבחון את התכונות הכימיות שלהם, דבר שעשוי להשפיע על התא אדהזיה ותחזוקה של pluripotency ( איור 2B). צפיפות Nanofiber היו מגוונות על-ידי שינוי זמן electrospinning, nanofibers שנוצר הוגדרו לפי צפיפות שלהם (החמורה, עם D = XLow/נמוך/בינוני/גבוה). המבנה microfluidic מורכב polydimethylsiloxane (PDMS) מחסה-48 לשכות תרבית תאים, אשר יכולים להיות ממוקם לאורך הממדים סטנדרטי של microplate 96-ובכן. PDMS הוא פולימר מסתיימים, גז-להחלפה משמש בדרך כלל כדי לפברק התקנים microfluidic24. כל ערוץ microfluidic תוכננה להיות 700-מיקרומטר רחב ו- 8.4 מ מ ארוך והיו שני פתחי הכניסה-הקצוות שלה (טבלה 1). התאים היו בגבהים שונים (250, 500, 1000 מיקרומטר) לטיפול הראשוני זורעות תא הצפיפויות 0.3, 0.6 ו 1.2 × 105 תאים/cm, (2) אשר עשוי לתאם עם הישרדות, התפשטות, הבידול של hPSCs25 (איור 2C). מספר התאים נזרע לתא ביחס לצפיפות העמודה מעל הרצפה קאמרית, ובכך התא הראשוני זריעה צפיפות נשלטה על ידי החדרת התליה תא אותו לתוך התרבות תאי בגבהים שונים. כל הערוצים נועדו להיות ≥ 250-מיקרומטר-גבוהה26 כדי למזער את ההשפעות של חמצן נמוך מתח27 ו גזירה28 על התאים. ערוץ לגבהים של 250, 500 ו- 1000 מיקרומטר הם מקוצר כאן כמו XCD עם X = נמוך, בינוני, ו גבוה, בהתאמה. הסביבות עם צפיפויות שונות nanofiber וצפיפות זורעות תא הראשונית קוצרו כמו "צפיפות density_Cell Material_NF" (למשל, GT_HighNF_HighCD: סביבה מאופיין בצפיפות גבוהה nanofibers GT ו גבוהה הראשונית תא זורעות צפיפות).
כתוצאה מכך, אנו נתאר כיצד לבצע ניתוח מתא בודד לחקור באופן שיטתי בהתנהגות התא בתגובה גורמים סביבתיים (איור 1B). כמושג הוכחה-של-, זיהינו את הסביבה התאית אופטימלית עבור hPSC העצמי-חידוש, אשר היא פונקציה מפתח עבור hPSC תחזוקה (איור 1B)29. Cytometry מבוססת תמונה, ואחריו ניתוחים סטטיסטיים, מאפשר פרשנות כמותית של תגובות פנוטיפי הסלולר הפרט סביבות הסלולר. בין מגוון רחב של פונקציות הסלולר, מאמר זה מספק הליך מפורט כדי לזהות את התנאים אופטימאליים לשמירה על התחדשות עצמית hPSC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ייצור מערך MACME
הערה: כל חומרים וציוד מפורטים בטבלה חומרים.
-
הכנת מסכות עבור מערך nanofiber ותבנית עבור מבנה microfluidic
- ליצור תמונות תלת מימד (3D) של מסכות המשמשות את nanofiber ומעריכי ליציקות מבנים microfluidic באמצעות חבילות תוכנה גרפיקת תלת-ממד-מחשב (טבלה 1).
הערה: תמונות 3D לקריאה ולהדפסה במדפסת תלת-ממד. מסכות המודפס של עובש יש מידות זהות עם תמונות 3D המוגדרים באמצעות התוכנה גרפיקה צעד 1.1.1. - הדפס תבנית המבוססת על עיצובים אלה משתמשים במדפסת תלת-ממד ומסיכות.
הערה: פרוטוקול זה, דמויי סילון דיו מדפסת תלת-ממד עם UV-לריפוי שרף היה בשימוש30. רזולוציית המדפסת היה 635 × 400 dpi ו 15 מיקרומטר ב- X, Y ו- Z, בהתאמה, עם זאת, בפועל X, Y ברזולוציה שנמוך כ ארבע פעמים.
- ליצור תמונות תלת מימד (3D) של מסכות המשמשות את nanofiber ומעריכי ליציקות מבנים microfluidic באמצעות חבילות תוכנה גרפיקת תלת-ממד-מחשב (טבלה 1).
-
Nanofiber-מערך הכנה (איור 3A)
- להכין תמיסות פולימר electrospinning.
- לדלל 13% נוזלים PMGI עם tetrahydrofuran על ידי 9% (w/v)22.
- להמיס 0.08 גר' PS (המספר הממוצע משקל מולקולרי (Mn): 130,000) THF:dimethylformamide (יחס 1:1 נפח)21, ולהוסיף THF:dimethylformamide להביא את אמצעי האחסון עד גמר 1 מ"ל (8% (w/v) PS פתרון).
- להמיס 0.1 גר' GT במים: חומצה אצטית: אתיל אצטט (יחס נפח של 1:1.6:2.1), ומוסיפים מים: חומצה אצטית: אתיל אצטט להביא את אמצעי האחסון עד גמר 1 מ"ל (10% (w/v) GT פתרון) כפי שמתואר23,31.
- השתמש מגנטרון sputtering המכונה, להפקיד פלטינה שכבה דקה עם עובי 5-nm ב פוליסטירן (PS) baseplate (127.7 × 85.5 מ מ), אשר משמש קטודית בכיוונון electrospinning.
- לטעון את כל הפתרונות פולימרי לתוך מזרק 5-mL מצויד עם מחט בוטה של פלדת 23-G.
- המקום, עוגן המזרק עם מחט משאבת מזרק עם 12-ס מ האספן של המכשיר electrospinning.
- להתחבר מחט מזרק ספק כח בעל מתח גבוה, להגדיר כדי להחיל על 11 kV.
- הגדר את קצב השאיבה של 0.2 מ"ל/h.
- לשמור על טמפרטורה ולחות ב- 30 ° C ו- < 30% (v/v).
- שימי את המסיכה על baseplate המוכנים בשלב 1.2.2.
- לפברק nanofibers על baseplate דרך החורים של מסיכה עם צפיפויות שונות על-ידי שינוי הזמן electrospinning (למשל, 20, 60, 90, 180 s).
- להסיר את המסכה baseplate.
הערה. אתנול יכול להיות ריססו על nanofibers GT electrospun לפני הסרת המסכה להימנע מתקלפת GT nanofibers יחד עם המסכה. - חזור על שלב 1.2.4-1.2.10 עד להשלמת מערך nanofiber פבריקציה נוספת.
- מקם את המערך nanofiber desiccator ב- 25 ° C עבור 16 h מתמוססות הממס הנותרים.
- Nanofibers Crosslink GT עם 0.2 מ' 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide הידרוכלוריד (EDC) ו- 0.2 M N-hydroxysuccinimide (NHS) אתנול ב 25 מעלות צלזיוס במשך 4 שעות23.
- לשטוף GT nanofibers פעמיים עם 99.5% (v/v) אתנול וביו -ואקום-יבש 25 ° c עבור 16 h.
- להכין תמיסות פולימר electrospinning.
-
ייצור מבנים microfluidic (איור 3B)
- לערבב 2 גר' PDMS אשפרה הסוכן ו- 20 גרם של בסיס PDMS (1:10 משקל יחס; Pre-PDMS). 24
- יוצקים את התערובת pre-PDMS על העובש מפוברק בשלב 1.2.
- דה-גז התערובת pre-PDMS ב desiccator במשך 30 דקות.
- לרפא את התערובת pre-PDMS בתנור ב 65 ° C עבור 16 h.
-
מערכי הרכבה של MACME (איור 3B)
- לקלף את מבנה PDMS נרפא בשלב 1.3.4 מ העובש ונקי עם אתנול 70% (v/v).
- לטיפול הפרשות corona אטמוספרי בצד התחתון של המבנה PDMS32.
הערה: ב פרוטוקול זה, בקורונה משוחרר על-פני כל שכבה 3 או 4 פעמים עם מנגנון השחרור קורונה "שימושיים". טיפול בחמצן פלזמה הוחלף עם הפרשות corona האטמוספירה כדי לשנות את פני השטח adhesiveness. - להרכיב את מבנה PDMS עם המערך nanofiber במהירות.
- תנור-אופים ב 65 מעלות צלזיוס במשך יומיים.
2. טעינת hESCs למערך MACME
- לתרבות שגרתית H9 תאי גזע עובריים (hESCs), לשמור על תאים ללא קסנו המוגדרים כימי תרבות בינונית עבור תחזוקה hPSC33 בתוספת 10 מיקרומטר רוק Y-27632 מעכב34 (בשם hPSC בינוני) בתרבות 35 מ מ תא מאכל מצופה קרום המרתף ג'ל מטריקס (מ ג).
- מעבר תאים כל ימים 4-7 באמצעות פרוטאז כמו טריפסין רקומביננטי.
- לעקר את מערך MACME בעל 99.5% אתנול, על-ידי טעינה אל התאים למשך 10 דקות ולאחר מכן הסר האתנול. חזור על שלב זה 3 פעמים.
- להציג את µL 12 של מ ג, µg/mL 10 vitronectin (VN), ו- 0.1% (w/v) GT לתוך הפקד תרבות צ'יימברס, דגירה התאים ב 37 ° C עבור h 1 כדי להרגיע אותם על משטחים קאמרית.
הערה: ב פרוטוקול זה, MG, VN ו GT נבחרו כמו חלבונים הפניית תא אדהזיה ותרבות. בגלל מ"ג ו VN מטריצות תא סטנדרטי-תרבות המשמש לשמירה על התחדשות עצמית hPSC, הם משמשים כפקדי חיובי; GT מימדי ציפוי (2DGT) או ללא-ציפוי (NC) שימשו כפקדי שלילי. - להציג hPSC מראש ומחוממת בינוני לתוך תאי כל מערך MACME. דגירה הצ'יימברס למשך 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס.
- HESC לרחוץ H9 תרבותי על מאכל 35 מ מ עם DPBS, להוסיף 0.5 מיליליטר פרוטאז כמו טריפסין רקומביננטי למנה דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 1 דקה ו בקפידה מחוק לגמרי רק את supernatants מעורבב עם פרוטאז.
הערה: בשלב השאיפה, התאים לא מנותקים. - מיד להוסיף hPSC בינוני, בעדינות לוותר על המדיום מפני השטח המנה שוב ושוב כדי מביצועם תאים ולהעביר את התאים מנותקת צינור חרוטי 15-mL.
- צנטריפוגה-200 g x עבור 3 דקות לשאוב תגובת שיקוע, להשעות את התאים במדיום hPSC מראש ומחוממת.
- להציג µL 12 של התליה תא (1.2 × 106 תאים/mL) לתוך כל תא microfluidic.
הערה: להציג את התאים לתא אחד מהשני באמצעות micropipette. כי מספר התאים נזרע ללשכה הוא יחסי לצפיפות העמודה מעל הרצפה קאמרית, יכול להיות נשלט צפיפות זורעות תא הראשונית אף-על-פי דגימות באותו תא ההשעיה שימשו. ודא pipetting מתבצעת בעדינות. הסר בינוני עודף התאים באמצעות מקל שקצהו כותנה לאחר הטעינה. המערך MACME תואם פיפטות מעבדתיות נפוץ והן מערכות אוטומטיות פיפטה, זה לא דורש שום ציוד מיוחד. - שנה hPSC בינוני כל 12 שעות והתרבות במשך 4 ימים.
הערה: אמצעי אחסון קבוע של המדיום (1.6, 3.2 ו- 6.4 µL) מתוחזקים באמצעות לשכות בגדלים שונים. התרבות התאים תחת מצב סטטי כדי למזער את מאמץ גזירה למעט החלפת של התא תרבות בינוני35,36.
3. כמותיים פרופיל תא בודד
-
תא פלורסנט מכתים על צלחת
הערה: כדי לנתח את השינויים פנוטיפי לחידוש עצמי hPSCs, פרוטוקול זה נבחר שלושה סמנים פנוטיפי מפתח עבור פרוטוקול זה: OCT4, 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (אדו), ו- V Annexin, כדי למדוד את המצב של pluripotency, התפשטות אפופטוזיס , בהתאמה (איור 2b). 4', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) משמש לזיהוי גרעין התא. OCT4 הוא אחד הגורמים הקריטיים שעתוק של pluripotency.- דגירה H9 hESCs מערכים MACME בינוני hPSC בתוספת 10 מיקרומטר אדו אלקין ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
- אחרי כביסה עם כריכת annexin מאגר (10 מ מ HEPES (pH 7.4), 140 מ מ NaCl, 2.5 מ מ CaCl2), מכתים את התאים עם תפוז-פלורסנט לצבוע Annexin V המספר המשלים ב 20 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
- לתקן תאים ב- PBS עם 4% (v/v) paraformaldehyde ב 20 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות ולאחר מכן לשטוף פעמיים תאים עם PBS.
- Permeabilize תאים באמצעות PBS 0.3% (v/v) טריטון X-100 ב- 20 ° C עבור 16 h.
הערה: Paraformaldehyde מחלישה את הקשר בין צלחת הבסיס פלסטיק מבנה microfluidic PDMS. לפיכך, הניתוק של השכבה PDMS מן המערך בשלב 3.2.1 יכול להתבצע גם מיד לאחר שלב זה. - דגירה תאים במאגר המבוסס על טריס התגובה עם אזיד צבע אדום-פלורסנט ב 20 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
- דגירה תאים במאגר חסימה (PBS עם סרום עז רגילה 5% (v/v), סרום חמור רגילה 5% (v/v), 3% (w/v) אלבומין שור, 0.1% (v/v) Tween-20, ו- 0.1% (w/v) N-dodecyl-β-D-maltoside) ב 4 ° C עבור 16 h.
- דגירה PBS עם 0.5% (v/v) פתרון טריטון X-100, נוגדן OCT3/4 אנושי (עכבר IgG) ב 4 ° C עבור 16 h.
- דגירה במאגר חסימה עם התווית על-ידי צבע ירוק-פלורסנט חמור נגד העכבר IgG (H + L) ב 37 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות.
- דגירה ב- PBS עם דאפי ב 20 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
- החלף PBS-דאפי PBS.
- לשמר את המערך MACME ב 4 ° C עד ייבוא תמונות.
-
תמונה רכישה (איור 4)
- לקלף את המבנה microfluidic PDMS מן המערך MACME.
- להסיר את PBS שיורית מן המערך MACME, החל 90%(v/v) גליצרול ב- PBS לתאים, למקם coverslips מעל התאים מוכתם.
- הגדר את הצלחת במהופך על הבמה של מיקרוסקופ פלורסצנטיות הפוכה.
- לרכוש 12-bit צבע תמונות באופן אוטומטי באמצעות כל הרכיבים ממונע (שלב, מסננים, תריס של מערכות מיקוד) בידי מיקרוסקופ imaging התוכנה.
הערה. ב פרוטוקול זה, חשיפה יותאם להגיע ליד ערכי העוצמה המרבית (עוצמת פיקסל הגבוהה ביותר: 4096), אבל לא רוויה, כל תמונה, דאפי, OCT4, Annexin V של אדו.
-
עיבוד תמונה מונחה מחשב, קרינה פלואורסצנטית אות כמת (איור 5)
הערה: הניתוח הבא של התמונה תא מבוצעת בהתבסס על שיטת שתואר לעיל37.- להמיר תמונות צבע בגווני אפור.
- לחשב את ערך הסף יחיד עבור כל תמונה דאפי עם השיטה אוטסו ולסווג פיקסלים מעל הסף הקידמה וגם בהמשך כרקע. ודא כי הערך החזית תואם עוצמת דאפי פלורסנט.
הערה: תהליך ניתוח תמונה מכילה 5 צעדים; זיהוי של אובייקטים ראשוניים של דאפי תמונות, זיהוי של אובייקטים משני OCT4, Annexin V ותמונות אדו, בהתאמה, ומדידה של עוצמה אובייקט. איור 3 מספק התמונות של ממשק משתמש גרפי (GUI) על ההגדרה של עיבוד תמונה. - למדוד עוצמות פלורסנט OCT4, עידו על כל תמונה.
- לזהות את האזור מוכתם Annexin V עם שיטת ההפצה, לכמת את עוצמת פלורסנט.
-
3.4 ניתוח סטטיסטי להמחיש פנוטיפים הסלולר בודדים על תא בודד הדמיה
- לנרמל את עוצמות פלורסנט קלט כל סמן פנוטיפי על ידי מרכוז ושינוי קנה מידה משתנים אלה לתת להם משקל שווה.
- לבצע ניתוח מפה (סום) הארגון-העצמי באמצעות סביבת תוכנה עבור חישוב סטטיסטי של גרפיקה כפי שתואר על ידי מחקרים קודמים38,39.
- צור 25 צמתים סום ייחודי ארבע "טבלת פענוח וקטורים" המתאים עוצמות פלורסנט ארבעה סמנים, דאפי, אדו, Annexin V ו- OCT4.
- להקצות לתאים בודדים ב- microenvironment בכל צומת (הדומה ביותר) "הזוכה", ותכין כמו תדר תא, לפיה הווקטורים טבלת הפענוח של הצומת הזוכה יעודכנו באמצעות ממוצע משוקלל, איפה המשקל שקצב הלמידה (כאן, 0.05 כמו ברירת המחדל).
הערה: להשמיט נתונים צ'יימברס המכיל פחות מ- 1,000 תאים כי datasets המכיל מספר תאים לא סיפקו תוצאות רלוונטיות מבחינה סטטיסטית סום.
- לבצע ללא השגחה הירארכי קיבוץ באשכולות עם הערכים סום-צומת באמצעות שיטת הצמדה לממוצע המבוססת על המתאם פירסון תוכנה קיבוץ באשכולות40.
- להרכיב את נתוני האשכולות dendrogram ותצוגות heatmap41.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
MACME מערכים: העיצוב ועל פבריקציה נוספת: בשילוב עם טכנולוגיית nanofiber, השתמשנו תרבית תאים microfluidic, ההקרנה טכניקות עבדה בעבר כדי לזהות תנאים אופטימליים hPSC התחדשות עצמית או בידול35,36 (איור 1). זה גם מתאים להקמת מבחני מבוססת תא תפוקה גבוהה חזקים בגלל התא תרבות צ'יימברס והתנאים הם בדיוק לשליטה וניתן להרחבה42,43,44. כאן, המערך nanofiber הוכן על ידי שיטה פשוטה nanofiber התצהיר, electrospinning עם מסכות מודפס 3D. החלק microfluidic היה מפוברק עם תבנית מודפס 3D בקלות לעצב את מבנה התא דרך ניסויים רבים, שגיאות. המערך MACME נבנה על ידי שילוב של שני החלקים והכילה סביבות 48, מתן רמזים biophysical, ביוכימיים שונים על ידי שילובים שונים של שני ECMs nanofiber (3 סוגים של חומרים nanofiber, צפיפויות שונות 4 או 4 הדברה מטריקס חלבונים) אינטראקציות תא-תא (3 טווחים של צפיפות זורעות תא הראשונית) כפי שהוצגה באיור 2.
הערכת ההשפעות הכוללת של צפיפות המאפיינים וסלולר nanofiber על hESC פנוטיפים: בעקבות תרבית תאים על מערך MACME, צביעת פלורסנט ב- plate (איור 6א), בוצעו מדידות תא בודד עם תמונות נרכשות. לצורך השוואת הומוגניות והטרוגניות של רמות הביטוי עבור הסמנים פנוטיפי ארבעה בכל הנתונים (dataset), פרוטוקול זה משמש סום ניתוח38,39, אשר ממירה datasets גבוהה-ממדי, multiparametric לתוך מפות דו-ממדיות נמוך-ממדי. ראוי לציין, התוצאות של מטריצות nanofibers ו- 2DGT PS הושמטו בניתוח נתון כי רוב התאים תואם. יתר על כן, נכללו בניתוח זה היו את הניסויים האלה עם הדיסק נמוכים שבו תאים לא היו די ישיר (למשל, juxtacrine) או עקיף (paracrine) אינטראקציות כדי לשרוד. בעקבות ניתוח סום, קיבוץ באשכולות הירארכי ללא השגחה בוצעה עבור הצמתים סום של כל הדגימות שנותחה (איור 6B). בהתחשב הגובה של dendrogram האשכול, ההבדלים פנוטיפי אפשרה לנו לקטלג את הדגימות לשלוש קבוצות: הקבוצה אני, רוב מדגם נישות הכוללת של GT nanofibers, MG_HighCD, VN_HighCD; הקבוצה השנייה, דגימות המכיל GT nanofibers (GT_XLow ו- MidNF_MidCD), MG_MidCD, או VN_MidCD; וקבץ השלישי, כל דוגמאות PMGI_NF.
ללמוד את ההבדלים בין הקבוצות, שבדקנו במדגם מייצג אחד מכל קבוצה (איור 6C; קבוצה i-GT_MidNF_HighCD קבוצה ii-GT_MidNF_MidCD, קבוצה iii-PMGI_MidNF_HighCD). במונחים של אותות OCT4, כל הקבוצות הראה ביטוי גבוה יותר מזה של MG (MG_MidCD). קבוצת שאני התאפיינה אותות אדו גבוהה, המציין כי רוב התאים היו מתרבים באופן פעיל. לפיכך, microenvironments בקבוצה מאופיינים כתנאים מתאים תחזוקה hPSC כי hPSCs מובחן בדרך כלל להתרבות במהירות כאשר מחזור התא הפער שלבים היו יתקצר45,46.
GT_MidNF_HighCD, GT_MidNF_MidCD נבדלים על ידי צפיפות תא העמסה הראשונית שלהם ברורים. צפיפות גבוהה תא הראשונית מוגברת הזדמנויות של תאים לאינטראקציה עם תאים שכנים, אשר משופרת שלהם הישרדות והתפשטות47. תאים נזרע-לא מספיקות הראשונית צפיפות (3.0 × 104 תאים/cm2) לא שרד, ולא גדל במהלך תקופת הניסוי (4 ימים). לכן, אנחנו לא משלבים אלה דוגמאות בניתוח סום; מספרי הטלפון הנייד היו מתחת שרשם של תאים חיים 1000/חדר. התאים על פיגומים 2DGT היו גם כידידותיים קבוצה ii תאים; תנאים אלה אינם תומכים התחדשות עצמית hPSC48. אדו אות התאים GT_MidNF_MidCD אבד, Annexin V רמות מעט היו מוגברת, המציין כי התאים איבד stemness שלהם, הפך בהדרגה אפופטוטיים להיפגע. . PMGI_MidNF_HighCD, המייצגת את microenvironments הכוללת PMGI nanofiber מטריצות, הראו את הווריאציות גדול יותר OCT4 אדו אותות לעומת התנאים אחרים.
איור 1 . הקרנת אסטרטגיה כדי לזהות אופטימלית microenvironments הסלולר לוויסות תאיים. מבט כולל על מרכיבי המערך מרובבת מלאכותי תאית microenvironment (MACME) (A). המערך מורכב משני חלקים עיקריים: מיטות nanofiber בדוגמת על מצע הבזליים (מערך nanofiber), של polydimethylsiloxane (PDMS)-המבוסס על מבנה microfluidic. המערך MACME הוא מסוגל להכין nanofiber ECMs עם מגוון של תכונות (קרי, חומרים nanofiber, צפיפות) ותא שונות זריעה צפיפות. המבנה microfluidic PDMS של המערך MACME כולל גבהים microfluidic-ערוץ 3 (250, 500, 1000 מיקרומטר) כדי לווסת את הצפיפות זורעות תא הראשונית. (B) ההשפעה של microenvironments הסלולר על התא פנוטיפים מוערכת באופן כמותי שימוש assay תא בודד מבוססת תמונה, ניתוח נתונים סטטיסטיים על ידי הארגון-העצמי מפה (סום) ואחריו קיבוץ באשכולות הירארכי. איור זה הותאמה מן ההפניה49 באישור ויילי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 . עיצוב של המערך MACME. תקורה (A) ויריות זווית גבוהה של המערך MACME כל דיאגרמה מושגית של ערוץ microfluidic (תכלת) על מטריצה nanofiber (ורוד). בכל אחד מהערוצים מורכב של מיקרומטר 700 רחב ו 8.4 מ מ תרבות רב קאמרית אינלטס שני על ההקדמה של בינוני ותאים. (B) השוואה של גדלים של תאים, nanofiber מטריצות. לגבהים של תאים ומיטות nanofiber נעות בין 1-3 מיקרומטר ו- 0.05-5.0 מיקרומטר, בהתאמה. (ג) חתך רוחב של כל ערוץ microfluidic בגובה 250/500/1000 מיקרומטר. תאים ומיטות nanofiber מיוצגים כמו כחול עיגולים וקווים כתום, בהתאמה. בכל חדר יש האורך והרוחב אותו אבל בגבהים שונים (250, 500 ו- 1000 מיקרומטר), כל אמצעי אחסון קאמרית היה 1.6, 3.2 ו- 6.4 µL, בהתאמה. המלבן המנוקד שחור איור 2C מציין איור 2B. איור 2 הותאמה מן ההפניה49 באישור ויילי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 . ייצור מערך MACME. פבריקציה נוספת של מערך nanofiber (א). תכנים מרובים מטריצות nanofiber על baseplate בוצע על ידי electrospinning ששונתה באמצעות קבוצת מסכות הנושאת בדוגמת חורים. ציפוי פלטינה בוצעה כדי להקל על התצהיר nanofiber ב baseplate פלסטיק. המסכות עם חור-דפוסים ברורים הוכנו על ידי מדפסת תלת-ממד. בעקבות מיסוך של האזור מצופה פלטינה של הצלחת, ערכת צלחת-מסכת היה לשים על המסך אוסף, ובוצע electrospinning רגילה. Nanofibers הראשוני נוצרו על העמדות מצופים Pt בצלחת דרך החורים של המסיכה. מיטות nanofiber נוספים היו מפוברק על הצלחת על ידי החלפת המסכה הקיים וחוזר ההליך. פבריקציה נוספת של מבנה microfluidic (B). העובש מודפס במדפסת תלת-ממד עם שרף UV-לריפוי בצורת השכבה PDMS של המכשיר microfluidic. לאחר היציקה, המערך MACME נערכו על ידי הצמדת שכבה מבוססת PDMS microfluidic עם מערך nanofiber לפעיל על-פני השטח. איור 3 מקורי הפניה49 באישור ויילי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 . תמונות של ממשקי משתמש גרפיים (GUI) עבור רכישת התמונה המיקרוסקופית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5 . תמונות של ממשקי משתמש גרפיים (GUI) של תמונה מונחה מחשב לעיבוד תא בודד phenotyping. תהליך ניתוח תמונה מכילה 5 צעדים; (א) זיהוי של אובייקטים ראשוניים של דאפי תמונות, זיהוי (B-D) של האובייקטים משני OCT4, Annexin V ותמונות אדו, בהתאמה, ומדידה של עוצמה אובייקט. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6 . Phenotyping, סיווג של הפנוטיפים של hESCs H9 ששונו על ידי גורמים microenvironmental. דימויי hESCs H9 תרבותי-צפיפות גבוהה של זריעה הראשונית על לטין (GT) nanofibers (GT_HighNF_HighCD), Immunofluorescent (א) צבעונית עם שלושה סמנים פנוטיפי הסלולר (OCT4, pluripotency; אדו, התפשטות תאים; Annexin V, אפופטוזיס), דאפי עבור גרעין התא. (B) A heatmap, dendrograms של קיבוץ באשכולות הירארכי ללא השגחה. Microenvironments שנבדקו היו מסווגות לשלוש קבוצות עם תכונות ייחודיות בהתבסס על הדמיון בין הפנוטיפים. קבוצה שכללתי GT nanofibers, MG_HighCD ו- VN_HighCD. הקבוצה השנייה כללה דוגמאות GT nanofibers (GT_XLow ו- MidNF_MidCD), MG_MidCD, או VN_MidCD. כל דוגמאות PMGI_NF היו מקובצים באשכולות לתוך קבוצה iii. ב heatmap, ורוד וכחול הצבעים מצביעים על תדרי הסלולר גבוה ונמוך בסום ספירת חלקות, בהתאמה. (ג) הפצה של סמן כימות רמות הביטוי של 1000 בתאים במדגם מייצג אחד מכל קבוצה (קבוצה i-GT_MidNF_HighCD קבוצה ii-GT_MidNF_MidCD, קבוצה iii-PMGI_MidNF_HighCD). Percentiles ה-25, 75: היו מצוינת כמו לגבולות התיבה. נכון להרחיב פי 1.5 טווח בין רבעוני מ percentiles ה-25, ה-75. הניסויים היו חוזר על עצמו שלוש פעמים עבור כל קבוצה. איור 6 A-C הוסבו מן ההפניה49 באישור ויילי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| שם | אורך הערוץ (מ מ) | רוחב הערוץ (μm) | ערוץ גובה (μm) | קוטר כניסה/יציאה (μm) | שקע/גובה (μm) | עובש אורך (מ מ) | עובש רוחב (מ מ) | עובש גובה (מ מ) |
| עובש | 8.4 | 700 | 250/500/1000 | 800 | 3000 | 127.76 | 85.48 | 14.35 |
| שם | עובי (μm) | החור באורך (מ מ) | חור רוחב (מ מ) | מסכת אורך (מ מ) | מסכת רוחב (מ מ) | עובש גובה (מ מ) | היסט שורה (מ מ) | טור היסט (מ מ) |
| המסכה | 1000 | 6 | 5 | 123.5 | 80.2 | 14.35 | 11.24 | 14.38 |
טבלה 1. מידות של עובש עבור מבנה microfluidic ומסכת המתבנת nanofiber.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה מדגים את השיטה ההקרנה הראשונה להקים מערכת תרבות חזקים לשמירה של hPSCs מוסמך. ראשית, אנחנו תיאר כיצד להכין פלטפורמה שמציעות מגוונות ECMs מלאכותיים ותא זריעה צפיפויות באמצעות מכשיר microfluidic משולב עם מערך nanofiber, המערך MACME. שנית, כמותי המבוסס על תמונות תא בודד phenotyping היה שבוצעו50 להעריך תוצאות הסלולר הפרט והתנהגויות ששונו כתוצאה ביוכימיים שונים ותכונות ביופיזיקלי. ב פרוטוקול זה, הסביבה המורכב GT nanofiber וחלבונים ECM בקרה חיובית מצב של תא הראשונית גבוהה זריעה צפיפות מתאפיינת בתכונות של מצב וייעודים; התפשטות מהירה45 ו יציבה OCT4 ביטוי51. התבוננות זו יצוין כי המנגנונים המולקולריים הקשורים "מטריצה חוץ-תאית תא" ו- "תא-תא" אינטראקציות יכול להשפיע על pluripotency של hPSCs.
אסטרטגיה זו ניתן להתאים אישית בהתאם למטרה של המשתמש. לדוגמה, תא מניפולציה ותפוקת ניתן להתאים למגוון רחב של הגדרות ניסיוני על ידי עיצוב מחדש של צורות ותבניות של המבנה microfluidic. דרך נוספת לשיפור התפוקה, המיקומים כניסת ו עודפים של כל תא מתוכננים לפי תקן microplate של לוחות 96-ובכן, טופל על ידי החברה למערכות ביולוגיות למדעים; לפיכך, מתקן אוטומטית רובוטית נוזלי יכול לשמש להקרנה תפוקה גבוהה. לבחון יותר את המנגנון המולקולרי בדבר "תא-ECM אינטראקציות", microenvironments הסלולר מלאכותיים יכולים להתבצע לחקות תנאים ויוו בצורה מדויקת יותר באמצעות שינוי כימי של nanofibers עם מולקולות52 איתות .
עד כה, רוב פלטפורמות שפותחו עבור הקרנות microenvironments הסלולר כבר שכיוונתם הקרנה גורמים מסיסים (למשל, גורמי גדילה, תרכובות כימיות)42,43,44, אבל לא nanofiber ECMs owing ל קשיים בשילוב טכניקות ייצור שונות. לדוגמה, גיליון nanofiber מייצר רווח קטן בין מבנה microfluidic baseplate וגורם שלהם מליטה לא יציב, אשר התוצאות זיהום צולב בין מדגמים שונים כי תרבות בינוני מערבבים עם עוד חדר אחד עד הפער קטן. השיטה החדשה שלנו מקלה על ייצור פשוט ומדויק של מטריצות nanofiber באתרים ספציפיים ומאפשר שלהם התקשרות ישירה עם baseplate, אשר מונע מליטה לא יציב וגם זיהום צולב. יתר על כן, פלטפורמות מספר53 משולב עם מיקרופלואידיקה, מטריצות nanofiber היה נגיש עבור מניפולציה שיטתית של סימנים כימיים ופיזיים לחקור והשפעותיהם על פונקציות תא, כי טכנולוגיות לצורך השילוב היו מתוחכמת ביותר. שלנו פרופיל תא בודד עם המערך MACME יכול להתבצע עם מנגנון קל להשגה וטכניקות פשוטות, בעל פוטנציאל גדול לשימוש מידול סביבות הסלולר עבור התפתחותית, תא מחקרים ביולוגיים, גילוי תרופות / ההקרנה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. לא-
Acknowledgments
אנו מודים פרופסור ש Nakatsuji-iCeMS, אוניברסיטת קיוטו, על מתן ES תאים אנושיים. אנו מודים גם פרופסור א מרוימה טוקיו במכון הטכנולוגי התמיכה שלו בשימוש של מיקרוסקופ כוח אטומי. מימון בנדיבות סופק על ידי החברה יפן הקידום של המדע (JSPS; 22350104, 23681028, 25886006, 24656502); מימון נמסר גם האנרגיה החדשה, ארגון פיתוח טכנולוגיה תעשייתית (NEDO) ושל קרן מדעי החיים Terumo. WPI-iCeMS נתמך על ידי את העולם Premier הבינלאומי מחקר במרכז היוזמה (WPI), משרד החינוך, תרבות, ספורט, מדע, טכנולוגיה (MEXT), יפן. חלק של עבודה זו נתמכה על ידי רכזת ננוטכנולוגיה באוניברסיטת קיוטו, במתקן ננו-עיבוד AIST "ננוטכנולוגיה פלטפורמה פרויקט" בחסות MEXT, יפן.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polystyrene (PS) | Sigma | #182435 | Average Mw: 290,000, average Mn: 130,000 |
| Polymethylglutarimide (PMGI) | MicroChem | G113113 | |
| Gelatin (GT) | Sigma | G2625 | From porcine skin, type A |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Doe Corning Toray | #1064291 | PDMS curing agent and silicone elastomer base are components of this kit. |
| OpenSCAD | This is a free 3D computer graphics software (http://www.openscad.org/) used for designing the mold of the microfluidic device. | ||
| AutoCAD 2014 | Autodesk | This is a 3D computer graphics software (https://www.autodesk.com/products/autocad/overview) used for design of the mask used on nanofiber-array preparation. | |
| 3D printer, AGILISTA-3000 | Keyence | ||
| UV-curable resin, AR-M2 | Keyence | This is used for 3D printing by Agilista. | |
| Acetic acid | Sigma | #338826 | ≥99.99% |
| Ethyl acetate | Sigma | #270989 | Anhydrous, 99.8% |
| Tetrahydrofuran (THF) | Sigma | #401757 | |
| MSP-30T | Vacuum Device | Magnetron sputtering machine | |
| Nunc OmniTray | Thermo Fisher Scientific | #242811 | This is a polystyrene baseplate on which the nanofiber array is created. This plate size is typically 127.7 x 85.5 mm. |
| Gun-type corona discharge machine | Shinko Electric & Instrumentation | CFG-500 | This handy device is used to generate corona for activation of the bottom surface of the PDMS layer at step 1.5 "Assembly of the MACME arrays" in the protocol. |
| 5 mL syringe | Terumo | SS-05SZ | |
| Stainless-steel blunt needle (23-gauge) | Nipro | #2166 | Outside diameter and length are 0.6 and 32 mm, respectively. |
| High-voltage power supply | TechDempaz | ||
| 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide, hydrochloride | Dojindo | W001 | |
| N-Hydroxysuccinimide | Sigma | #56480 | |
| Matrigel hESC-Qualified Matrix | Corning | #354277 | This protein is refered as basement membrane gel matrix in the protocol. |
| CellAdhere Vitronectin, Human, Solution | STEMCELL Technologies | #07004 | |
| TeSR-E8 | STEMCELL Technologies | #05940 | Feeder-free, xeno-free culture medium for maintenance of human ES and iPS cells |
| Y-27632 | Wako Pure Chemical Industries | #253-00513 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red | Thermo Fisher Scientific | #12605028 | This ia a recombinant trypsin-like protease for dissociation of adherant mammalian cells. |
| Click-iT EdU Imaging Kit with Alexa Fluor 647 Azides | Thermo Fisher Scientific | C10086 | The fluorescent labeling of proliferating cells in on-plate fluorescent staining was performed along the product manual of this kit. |
| Annexin V, Alexa Fluor 594 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A13203 | |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Oct-3/4 Antibody (C-10) | Santa Cruz Biotechnology | sc-5279 | |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (DyLight 488) | abcam | ab96875 | This is a secondary antibody used in on-plate fluorescent cell staining. |
| ECLIPSE Ti-E | Nikon | This is an inverted fluorescence microscope equipped with a CFI Plan Fluor 4×/0.13 N.A. objective lens (Nikon), CCD camera (ORCA-R2, Hamamatsu), mercury lamp (Intensilight, Nikon), XYZ automated stage (Ti-S-ER motorized stage with encoders, Nikon), and filter cubes for four fluorescence channels (DAPI, GFP HYQ, TRITC, Cy5; Nikon) | |
| NIS-Elements Advanced Research | Nikon | This is a microscope imaging software used for automatic image acquisition. | |
| CellProfiler, Version 2.1.0 | This is a free open software for cell image analysis (http://cellprofiler.org/). | ||
| R | SOM analysis is performed by kohonen package of this software. This is freely available (https://www.r-project.org/). | ||
| Cluster 3.0 | This is the open source clustering software (http://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster/software.htm). Unsupervised hierarchical clustering is performed with this software. | ||
| Java TreeView | This open source software (http://jtreeview.sourceforge.net/) is used to visualize clustering data as a heatmap and a dendrogram. | ||
| H9 human embryonic stem cell | WiCell Stem Cell Bank | WA09 |
References
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Ameen, C., et al. Human embryonic stem cells: Current technologies and emerging industrial applications. Crit Rev Oncol Hematol. 65 (1), 54-80 (2008).
- Nishikawa, S., Goldstein, R. A., Nierras, C. R. The promise of human induced pluripotent stem cells for research and therapy. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (9), 725-729 (2008).
- Robinton, D. A., Daley, G. Q. The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy. Nature. 481 (7381), 295-305 (2012).
- Sartipy, P., Bjorquist, P., Strehl, R., Hyllner, J. The application of human embryonic stem cell technologies to drug discovery. Drug Discovery Today. 12 (17-18), 688-699 (2007).
- Discher, D. E., Mooney, D. J., Zandstra, P. W. Growth factors, matrices, and forces combine and control stem cells. Science. 324 (5935), 1673-1677 (2009).
- Joyce, J. A., Pollard, J. W. Microenvironmental regulation of metastasis. Nat Rev Cancer. 9 (4), 239-252 (2009).
- Danhier, F., Feron, O., Preat, V. To exploit the tumor microenvironment: Passive and active tumor targeting of nanocarriers for anti-cancer drug delivery. J Control Release. 148 (2), 135-146 (2010).
- Murphy, W. L., McDevitt, T. C., Engler, A. J. Materials as stem cell regulators. Nat Mater. 13 (6), 547-557 (2014).
- Patel, A. K., et al. A defined synthetic substrate for serum-free culture of human stem cell derived cardiomyocytes with improved functional maturity identified using combinatorial materials microarrays. Biomaterials. 61, 257-265 (2015).
- Zhang, R., et al. A thermoresponsive and chemically defined hydrogel for long-term culture of human embryonic stem cells. Nat Commun. 4, (2013).
- Anderson, D. G., Putnam, D., Lavik, E. B., Mahmood, T. A., Langer, R. Biomaterial microarrays: rapid, microscale screening of polymer-cell interaction. Biomaterials. 26 (23), 4892-4897 (2005).
- Celiz, A. D., et al. Discovery of a Novel Polymer for Human Pluripotent Stem Cell Expansion and Multilineage Differentiation. Adv Mater. 27 (27), 4006-4012 (2015).
- Hansen, A., et al. High-Density Polymer Microarrays: Identifying Synthetic Polymers that Control Human Embryonic Stem Cell Growth. Adv Healthcare Mater. 3 (6), 848-853 (2014).
- Mei, Y., et al. A high throughput micro-array system of polymer surfaces for the manipulation of primary pancreatic islet cells. Biomaterials. 31 (34), 8989-8995 (2010).
- Saha, K., et al. Surface-engineered substrates for improved human pluripotent stem cell culture under fully defined conditions. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (46), 18714-18719 (2011).
- Bettinger, C. J., Langer, R., Borenstein, J. T. Engineering substrate topography at the micro- and nanoscale to control cell function. Angew Chem Int Ed Engl. 48 (30), 5406-5415 (2009).
- McMurray, R. J., et al. Nanoscale surfaces for the long-term maintenance of mesenchymal stem cell phenotype and multipotency. Nat Mater. 10 (8), 637-644 (2011).
- Sun, Y., Jallerat, Q., Szymanski, J. M., Feinberg, A. W. Conformal nanopatterning of extracellular matrix proteins onto topographically complex surfaces. Nat Methods. 12 (2), 134-136 (2015).
- Nitanan, T., et al. Effects of processing parameters on morphology of electrospun polystyrene nanofibers. Korean J Chem Eng. 29 (2), 173-181 (2012).
- Liu, L., et al. Chemically-defined scaffolds created with electrospun synthetic nanofibers to maintain mouse embryonic stem cell culture under feeder-free conditions. Biotechnol Lett. 34 (10), 1951-1957 (2012).
- Liu, L., et al. Nanofibrous gelatin substrates for long-term expansion of human pluripotent stem cells. Biomaterials. 35 (24), 6259-6267 (2014).
- Kamei, K., et al. Phenotypic and transcriptional modulation of human pluripotent stem cells induced by nano/microfabrication materials. Adv Healthcare Mater. 2 (2), 287-291 (2013).
- Peerani, R., et al. Niche-mediated control of human embryonic stem cell self-renewal and differentiation. EMBO J. 26 (22), 4744-4755 (2007).
- Yamamoto, K., et al. Fluid shear stress induces differentiation of Flk-1-positive embryonic stem cells into vascular endothelial cells in vitro. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 288 (4), 1915-1924 (2005).
- Charati, S. G., Stern, S. A. Diffusion of gases in silicone polymers: Molecular dynamics simulations. Macromolecules. 31 (16), 5529-5535 (1998).
- Prado-Lopez, S., et al. Hypoxia promotes efficient differentiation of human embryonic stem cells to functional endothelium. Stem Cells. 28 (3), 407-418 (2010).
- Yanagihara, K., et al. Prediction of Differentiation Tendency Toward Hepatocytes from Gene Expression in Undifferentiated Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cells and Development. 25 (24), 1884-1897 (2016).
- Kamei, K., et al. 3D printing of soft lithography mold for rapid production of polydimethylsiloxane-based microfluidic devices for cell stimulation with concentration gradients. Biomed Microdevices. 17 (2), (2015).
- Song, J. H., Kim, H. E., Kim, H. W. Production of electrospun gelatin nanofiber by water-based co-solvent approach. J Mater Sci Mater Med. 19 (1), 95-102 (2008).
- Owen, M. J., Smith, P. J. Plasma Treatment of Polydimethylsiloxane. J Adhes Sci Technol. 8 (10), 1063-1075 (1994).
- Chen, G. K., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nat Methods. 8 (5), 424-476 (2011).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25 (6), 681-686 (2007).
- Kamei, K., et al. An integrated microfluidic culture device for quantitative analysis of human embryonic stem cells. Lab Chip. 9 (4), 555-563 (2009).
- Kamei, K., et al. Microfluidic image cytometry for quantitative single-cell profiling of human pluripotent stem cells in chemically defined conditions. Lab Chip. 10 (9), 1113-1119 (2010).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7 (10), 100 (2006).
- Kohonen, T. Self-Organized Formation of Topologically Correct Feature Maps. Biol Cybern. 43 (1), 59-69 (1982).
- Wehrens, R., Buydens, L. M. C. Self- and super-organizing maps in R: The kohonen package. J Stat Softw. 21 (5), 1-19 (2007).
- Eisen, M. B., Spellman, P. T., Brown, P. O., Botstein, D. Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (25), 14863-14868 (1998).
- Saldanha, A. J. Java Treeview--extensible visualization of microarray data. Bioinformatics. 20 (17), 3246-3248 (2004).
- Du, G. S., Fang, Q., den Toonder, J. M. J. Microfluidics for cell-based high throughput screening platformsd-A review. Anal Chim Acta. 903, 36-50 (2016).
- Huang, S. B., et al. An integrated microfluidic cell culture system for high-throughput perfusion three-dimensional cell culture-based assays: effect of cell culture model on the results of chemosensitivity assays dagger. Lab Chip. 13 (6), 1133-1143 (2013).
- Wang, B. L., et al. Microfluidic high-throughput culturing of single cells for selection based on extracellular metabolite production or consumption. Nat Biotechnol. 32 (5), 473 (2014).
- Becker, K. A., et al. Self-renewal of human embryonic stem cells is supported by a shortened G1 cell cycle phase. J Cell Physiol. 209 (3), 883-893 (2006).
- Neganova, I., Lako, M. G1 to S phase cell cycle transition in somatic and embryonic stem cells. J Anat. 213 (1), 30-44 (2008).
- Fox, V., et al. Cell-cell signaling through NOTCH regulates human embryonic stem cell proliferation. Stem Cells. 26 (3), 715-723 (2008).
- Xu, C., et al. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 19 (10), 971-974 (2001).
- Kamei, K., et al. Microfluidic-Nanofiber Hybrid Array for Screening of Cellular Microenvironments. Small. 13 (18), (2017).
- Sun, J., et al. A Microfluidic Platform for Systems Pathology: Multiparameter Single-Cell Signaling Measurements of Clinical Brain Tumor Specimens. Cancer Res. 70 (15), 6128-6138 (2010).
- Theunissen, T. W., Jaenisch, R. Molecular Control of Induced Pluripotency. Cell Stem Cell. 14 (6), 720-734 (2014).
- Yoo, H. S., Kim, T. G., Park, T. G. Surface-functionalized electrospun nanofibers for tissue engineering and drug delivery. Adv Drug Del Rev. 61 (12), 1033-1042 (2009).
- Dixon, J. E., et al. Combined hydrogels that switch human pluripotent stem cells from self-renewal to differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (15), 5580-5585 (2014).
