Summary
이 문서에서는 물리와 화학의 높은 처리량 조작 신호 세포 microenvironments vivo에서 흉내 낸 고을 다중화 인공 세포 MicroEnvironment (MACME) 배열 준비 하 상세한 방법론 단일 셀 프로 파일링 인간 만능 줄기 세포 (hPSCs)를 위한 최적의 휴대폰 환경을 식별 합니다.
Abstract
단서, 성장 인자, 세포 외 매트릭스, 세포 상호 작용 등의 다양 한 세포 microenvironments에 의하여 이루어져 있다. 이러한 신호 잘 조율 된 그리고 생활 시스템에서 세포 기능 조절에 중요 한. 연구자의 숫자는 환경 요인과 원하는 세포 기능 간의 상관 관계를 조사 하려고 했습니다, 많은 알 수 없는 남아 있다. 이것은 같은 환경 신호에 vitro에, 모방 하 고 셀에 다른 환경 신호를 테스트 하는 동시에 적절 한 방법론의 부족 때문에 크게 이다. 여기, 우리는 미세 채널 및 높은 콘텐츠 단일 셀 분석, 줄기 세포 고기 다른 환경 요인에 의해 변경 될 검사를 다음 nanofiber 배열의 통합된 플랫폼을 보고 합니다. 설명 하기 위해이 플랫폼의 응용 프로그램,이 연구는 인간 만능 줄기 세포 (hPSCs) 자기 갱신의 고기에 집중 한다. 여기, 우리 다중화 인공 세포 MicroEnvironment (MACME) 배열의 제작에 nanofiber 배열 및 미세 구조에 대 한 준비 절차를 제시. 또한, 프로 파일링, 여러 형광 마커, 여러 형광 이미징, 그리고 통계 분석, 얼룩 셀 단일 셀의 전체 단계 설명 합니다.
Introduction
인간 만능 줄기 세포 (hPSCs)1,2 자체 unlimitedly 확장 한다 갱신 하 고 신약 개발, 세포 기반 치료, 조직 공학 및 재생 의학 혁명을 수 있는 다양 한 조직 혈통으로 차별화 3 , 4 , 5 , 그러나 6. 일반 문화 요리와 결정 판,, 세포 확장을 위한 중요 한 요소는 정확한 물리적, 화학적 셀 조작 범위의 나노를 마이크로-미터, 세포 수준에서 사용 하도록 설계 되지 않았습니다 셀프-갱신, 그리고 감 별 법입니다. 이 단점을 해결 하기 위해 연구 세포 운명 결정 및 셀 기능4규제에 세포 microenvironments의 역할 조사 했습니다. 최근 몇 년 동안, 연구의 증가7,8 체 외에서세포 microenvironments를 재구성 하기 위해 실시 되었습니다. 나노 및 마이크로 제작 공정 화학9,10,,1112,13의 조작을 통해 이러한 microenvironments 설립 14,15,,1617 및 실제18,,1920 환경 신호. 지금까지 세포 운명 결정 및 단일 플랫폼 내에서 기능에 화학적 및 물리적 환경 단서의 기본 메커니즘을 체계적으로 조사를 보고 했다.
여기에 심플한 디자인 원칙 강력한 심사 플랫폼 (그림 1)을 설정 하는 전략을 소개 합니다. 우리가 nanofiber 배열 및 미세 구조를 사용 하 여 다재 다능 한, 인공 세포 microenvironments를 만들기 위한 통합된 플랫폼의 개발 절차를 설명 하는 첫째,: 더 다중화 인공 세포 MicroEnvironment (MACME) 배열 (그림 1A 그리고 2A). Nanofiber 배열 nanofiber 재료와 밀도의 다양 한 조합에서 12 다른 microenvironments를 있다. 전기 조작 nanofibers 하 사용 되었다. 폴리스 티 렌 (PS)21,22, polymethylglutarimide (PMGI) 젤라틴 (GT)23, 같은 nanofiber 재료 세포 접착 및 pluripotency ( 의 유지 보수에 영향을 미칠 수 있습니다 그들의 화학 재산을 테스트 하도록 설계 되었습니다. 그림 2B). Nanofiber 밀도 했다 전기 시간을 변경 하 여 다양 하 고 생성 된 nanofibers 그들의 밀도 따라 정의 된 (DNF, d = XLow/낮은/중간/높은). 미세 구조입니다 (PDMS) 48 세포 배양 챔버, 96-잘 microplate의 표준 치수에 따라 배치 될 수 있습니다 있는 은닉의 구성 됩니다. PDMS는 일반적으로 미세 장치24를 조작 하는 데 사용 하는 생체 및 가스 교환 중합체 이다. 각 미세 채널 설계 되었습니다 700 µ m 폭 및 8.4 m m 길고 가장자리 (표 1)에서 2 개의 후미를 했다. 약 실 다른 고소 했다 (250, 500 및 1000 µ m)에서 초기 셀 시드 밀도 (0.3, 0.6, 1.2 × 105 셀/cm2), 생존, 확산, 그리고 hPSCs25의 연관 시킬 수 있는 조작 (그림 2C). 챔버로 시드 셀 수 챔버 바닥 위에 열 밀도에 비례 이며 따라서 밀도 시드 초기 셀 문화 실로 서로 다른 높이와 동일한 세포 현 탁 액을 도입 하 여 통제 되었다. 모든 채널 ≥ 250 µ m 높이26 셀에 낮은 산소 긴장27 및 전단 응력28 의 효과 최소화 하기 위해 되도록 설계 되었습니다. 250, 500 및 1000 µ m의 채널 높이 여기 약식 x XCD = 낮음, 중간, 그리고 높은, 각각. 고유한 nanofiber 밀도와 초기 셀 시드 밀도 환경 "Material_NF density_Cell 밀도"로 단축 되었다 (예를 들어, GT_HighNF_HighCD: 고밀도 GT nanofibers 및 높은 초기 셀 시드 특징 환경 밀도)입니다.
그 후, 우리는 단일 셀 셀 동작 환경 요인 (그림 1B)에 대 한 응답을 체계적으로 조사 분석을 수행 하는 방법을 설명 합니다. 의 증거-개념, 우리 식별 hPSC 자체 재생을 위한 최적의 세포 환경 hPSC 유지 보수 (그림 1B)29에 대 한 주요 기능입니다. 이미지 기반 cytometry, 통계 분석, 이어서 세포 환경 개별 세포 phenotypic 응답의 정량적 해석 할 수 있습니다. 다양 한 세포 기능 가운데이 종이 hPSC 자기 갱신을 유지 하기 위한 최적의 조건을 식별 하는 자세한 절차를 제공 합니다.
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Protocol
1입니다. MACME 배열의 제작
참고: 모든 재료와 장비 자료 테이블에 나열 됩니다.
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마스크의 nanofiber 배열 및 미세 구조에 대 한 금형에 대 한 준비
- Nanofiber 배열 및 3D 컴퓨터 그래픽 소프트웨어 패키지 (표 1)를 사용 하 여 미세 구조에 대 한 금형에 사용 되는 마스크의 3 차원 (3D) 이미지를 만듭니다.
참고: 3D 이미지는 읽었고 3D 프린터에서 인쇄. 인쇄 마스크와 금형 단계 1.1.1에서 그래픽 소프트웨어를 사용 하 여 정의 하는 3 차원 이미지와 같은 크기 있다. - 인쇄 마스크와 3 차원 프린터를 사용 하 여 이러한 설계에 따라 금형.
참고: 이 프로토콜에서 UV 경화 수 지와 잉크 제트 같은 3D 프린터 사용된30이었다. 그러나 프린터 해상도 635 × 400 dpi 및 15 µ m x, Y 및 Z, 각각,, 실제 X Y 해상도 약 4 배 낮 았다.
- Nanofiber 배열 및 3D 컴퓨터 그래픽 소프트웨어 패키지 (표 1)를 사용 하 여 미세 구조에 대 한 금형에 사용 되는 마스크의 3 차원 (3D) 이미지를 만듭니다.
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Nanofiber 배열 준비 (그림 3A)
- 전기에 대 한 폴리머 솔루션을 준비 합니다.
- 9% (w/v)22tetrahydrofuran 13 %PMGI 액체를 희석.
- PS의 0.08 g을 분해 (수 평균 분자량 (Mn): 130000) THF:dimethylformamide (볼륨 1:1 비율)21, 마지막 1 mL (8% (w/v) PS 솔루션)까지 볼륨을가지고 THF:dimethylformamide를 추가 하 고.
- 분해 물에 GT의 0.1 g: 아세트산 산: 에틸 아세테이트 (1:1.6:2.1 볼륨 비율), 그리고 물을 추가: 아세트산 산: 에틸 아세테이트로 최종 1 mL (10% (w/v) GT 솔루션)까지 볼륨을가지고 설명23,31.
- 마 그 네트 론 스퍼터 링 기계를 사용 하 여, 폴리스 티 렌 (PS) baseplate (127.7 × 85.5 m m), 전기 설치에 음극 역할에 5 nm 두께 가진 백 금 박막을 예금.
- 5 mL 주사기 23 G 스테인리스 스틸 무딘 바늘으로 장착으로 각 폴리머 솔루션을 로드 합니다.
- 장소와 앵커 전기 소자의 컬렉터를 제외 하 고 12 cm 주사기 펌프에 바늘 주사기.
- 높은 전압 전원 공급 장치에 주사기 바늘을 연결 하 고 11에 적용할 설정 kV.
- 0.2 mL/h의 양수 속도 설정 합니다.
- 30 ° C와 < 30% (v/v)에서 온도 습도 유지.
- 준비 단계 1.2.2 baseplate에 마스크를 넣어.
- 전기 시간을 변경 하 여 고유한 밀도와 마스크의 구멍을 통해 baseplate에 nanofibers 조작 (예를 들어, 20, 60, 90, 및 180 s).
- baseplate에서 마스크를 제거 합니다.
참고. 에탄올을 벗 겨 내는 마스크와 함께 GT nanofibers 피하기 위해 마스크를 제거 하기 전에 electrospun GT nanofibers에 살포 될 수 있다. - 단계 1.2.4-1.2.10 nanofiber 배열 제작 완료 될 때까지 반복 합니다.
- 나머지 용 매 증발에 16 h 25 ° C에서 desiccator nanofiber 배열 장소.
- 0.2 M 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide 염 산 염 (EDC)와 0.2 M N-hydroxysuccinimide (NHS) 25 ° C 4 h23에서 에탄올에 Crosslink GT nanofibers.
- 16 h 25 ° C에서 99.5% (v/v) 에탄올 및 진공 건조로 두 번 GT nanofibers 린스.
- 전기에 대 한 폴리머 솔루션을 준비 합니다.
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미세 구조의 제작 (그림 3B)
- 에이전트 및 PDMS 자료의 20 g 치료 PDMS의 2 세대 혼합 (1시 10분 무게 비율; Pre-PDMS). 24
- 1.2 단계에서 조작 하는 금형에 사전 PDMS 혼합물을 붓는 다.
- 탈 가스에서 30 분 동안 desiccator 사전 PDMS 혼합물.
- 16 h 65 ° C에서 오븐에 사전 PDMS 혼합물을 치료.
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어셈블리의 MACME 배열 (그림 3B)
- 1.3.4 형에서와 70% (v/v) 에탄올과 깨끗 한 단계에서 치료 PDMS 구조를 벗기십시오.
- PDMS 구조32의 하단 측면에 대기 코로나 방전 처리 합니다.
참고: 이 프로토콜에서 코로나는 3 또는 4 번 "핸디" 코로나 방전 장치 층의 전체 표면에 출력 된다. 산소 플라즈마 처리 표면 접착 력 변경 대기 코로나 방전으로 대체 되었다. - Nanofiber 배열 된 PDMS 구조를 신속 하 게 조립.
- 오븐-구워 65 ° C에서 2 일 동안.
2. MACME 배열에 hESCs 로드
- H9 인간 배아 줄기 세포 (hESCs)의 일상 문화에 대 한 셀 이종 무료 화학적 hPSC 유지 보수33 10 µ M Y-27632 바위 억제제34 (hPSC 매체 라는) 35 m m 세포 배양에서 보충에 대 한 문화 매체를 정의 하는 것을 유지합니다 지하실 막 젤 매트릭스 (MG)으로 요리.
- 통로 세포 재조합 트립 신 같은 효소를 사용 하 여 4 ~ 7 일 마다.
- 10 분 동안 챔버로 로드 하 여 99.5% 에탄올, MACME 배열을 소독 한 다음 에탄올을 제거. 3 번이이 단계를 반복 합니다.
- MG, 10 µ g/mL vitronectin (VN)의 12 µ L를 소개 하 고 컨트롤에 0.1% (w/v) GT 문화 실, 고 실 챔버 표면에 코트를 1 시간 동안 37 ° C에서 품 어.
참고: 이 프로토콜에 MG, VN, 그리고 GT는 세포 접착 및 문화에 대 한 참조 단백질으로 선정 됐다. MG와 VN 표준 셀 문화 매트릭스 hPSC 자체-갱신 유지에 사용 되는, 때문에 그들은 긍정적인 컨트롤;로 사용 됩니다. 2 차원 GT 코팅 (2DGT) 또는 비 코팅 (NC)는 부정적인 컨트롤으로 사용 되었다. - MACME 배열의 모든 챔버에 미리 데워 진된 hPSC 매체를 소개 합니다. 37 ° c.에 30 분 동안 챔버를 품 어
- 씻어 H9 hESC DPBS, 35 mm 접시에 배양 접시에 재조합 트립 신 같은 효소의 0.5 mL을 추가 하 고 1 분 동안 37 ° C에서 품 어 신중 하 게 발음만 supernatants 효소와 혼합.
참고: 포부 단계에서 세포를 분리 하는 되지. - 부드럽게 반복적으로 세포 분열을 15 mL 원뿔 튜브를 분리 된 세포를 전송 접시 표면에 대 한 매체를 분배, 즉시 hPSC 매체를 추가 합니다.
- 200 x g 3 분 Aspirate는 상쾌한에 centrifuge 고 미리 데워 진된 hPSC 매체에 셀 중단.
- 각 미세 챔버에 세포 현 탁 액 (1.2 × 106 셀/mL)의 12 µ L를 소개 합니다.
참고: micropipette를 사용 하 여 다른 한 챔버에 세포를 소개 합니다. 셀 챔버에 시드 수 챔버 바닥 위에 열 밀도에 비례 이기 때문에 불구 하 고 동일한 세포 현 탁 액에서 샘플 사용 되었다 초기 셀 시드 밀도 제어할 수 수 있습니다. 부드럽게 이루어집니다 pipetting 확인 합니다. 목화로 만들어진 지팡이 사용 하 여 로드 후 약 실에서 초과 매체를 제거 합니다. MACME 배열이 일반적으로 사용 되는 실험실 펫와 자동된 피 펫 시스템, 그리고 그것은 어떤 특별 한 장비가 필요 하지 않습니다. - 변경 hPSC 매체 마다 12 h와 문화 4 일.
참고: 매체의 지속적인 볼륨 (1.6, 3.2, 그리고 6.4 µ L) 다른 크기의 챔버를 사용 하 여 유지 된다. 문화 세포 세포 배양 매체35,36의 교환 제외한 전단 응력을 최소화 하기 위해 정적 조건 하에서.
3. 양적 단일 셀 프로 파일링
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접시에 형광 세포 염색
참고: hPSCs 자기 갱신의 phenotypic 변화를 분석,이 프로토콜 선택이 프로토콜에 대 한 세 가지 주요 phenotypic 마커: OCT4, deoxyuridine (듀),-5-ethynyl-2'와 Annexin V pluripotency, 확산, 및 apoptosis의 상태를 측정 하 각각 (그림 2b). 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 세포 핵을 식별 하는 데 사용 됩니다. OCT4는 pluripotency의 중요 한 녹음 방송 요인 중 하나입니다.- 30 분 동안 37 ° C에서 10 µ M 듀 alkyne 보충 hPSC 매체에 MACME 배열에서 H9 hESCs를 품 어.
- 씻은 후 annexin 바인딩 버퍼 (10 mM HEPES (pH 7.4), 140 m NaCl, 2.5 m CaCl2m m), 셀 한 오렌지 형광 염료 Annexin V 공액 20 ° c에서 15 분을 얼룩.
- 15 분 동안 20 ° C에서 4% (v/v) paraformaldehyde와 PBS에서 셀을 수정 하 고 PBS 가진 셀을 두 번 씻어.
- 0.3% (v/v) 트라이 톤 X-100 16 h 20 ° C에서 PBS를 사용 하 여 셀 permeabilize
참고: Paraformaldehyde 플라스틱 베이스 플레이트 및 PDMS 미세 구조 사이의 유대를 약화. 따라서, 단계 3.2.1에서 배열에서 PDMS 층의 초연 직후에이 단계도 수행할 수 있습니다. - 30 분 동안 20 ° C에서 빨간색 형광 염료 아 지 드와 트리 기반 반응 버퍼에 세포를 품 어.
- 셀 16 h 4 ° C에서 블로킹 버퍼 (PBS 5% (v/v) 정상 염소 혈 청, 혈 청 5% (v/v) 정상 당나귀, 3% (w/v) 소 혈 청 알 부 민, 0.1% (v/v) 트윈-20, 그리고 0.1% (w/v) N-라우릴-β-D-maltoside)에 품 어.
- 0.5% (v/v) 트라이 톤 X-100 솔루션 PBS에 인간의 OCT3/4 항 체 (마우스 IgG) 16 h 4 ° C에서 품 어.
- 60 분 동안 37 ° C에서 녹색 형광 염료 라는 당나귀 안티 마우스 IgG (H + L) 블로킹 버퍼에서 품 어.
- 30 분 동안 20 ° C에 DAPI와 PBS에서 품 어.
- PBS에 PBS DAPI 바꿉니다.
- 이미지 수집까지 4 ° C에서 MACME 배열을 유지 합니다.
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수집 이미지 (그림 4)
- MACME 배열에서 PDMS 미세 구조를 벗기십시오.
- MACME 배열에서 잔여 PBS를 제거 하 고 세포를 PBS에서 90%(v/v) 글리세롤 적용 스테인드 셀 coverslips 장소.
- 거꾸로 거꾸로 형광 현미경의 스테이지에 접시를 설정 합니다.
- 모든 자동화 된 구성 요소 (무대, 필터, 셔터, 및 초점 시스템) 현미경 이미징 소프트웨어에 의해 통제 되었다를 사용 하 여 자동으로 12-비트 컬러 이미지를 취득 합니다.
참고. 이 프로토콜에서 노출 시간 최대 강도 값 근처에 도달 하도록 조정 됩니다 (높은 픽셀 강도: 4096), 각 이미지, DAPI, OCT4, Annexin V와 듀 채도 없음 하지만.
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컴퓨터 기반 영상 처리 및 형광 신호 정량화 (그림 5)
참고: 다음 셀 이미지 분석37앞에서 설명한 방법 따라 수행 됩니다.- 컬러 이미지를 회색조로 변환 합니다.
- 오쓰 방법으로 각 DAPI 이미지에 대 한 단일 임계값 값을 계산 하 고 임계값을 전경으로 하 고 아래 픽셀 분류 배경으로. 전경색 값 DAPI의 형광 강도에 해당 함을 확인 하십시오.
참고: 5 단계;를 포함 하는 이미지 분석 프로세스 DAPI에서 기본 개체의 식별 이미지, 각각, OCT4, Annexin V에 듀 이미지, 보조 개체의 식별 및 개체 강도의 측정. 그림 3 이미지 처리 설정에 그래픽 사용자 인터페이스 (GUI)의 이미지를 제공합니다. - 각 이미지에 OCT4 및 듀의 형광 강도 측정 합니다.
- 전파 방법 Annexin v 스테인드 영역을 식별 하 고 형광 강도 측정.
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3.4. 통계 분석을 시각화 하는 단일 셀 이미징에 개별 세포 고기
- 중심으로 하 고 그들에 게 동등한 무게를 주고 이러한 변수를 확장 하 여 각 phenotypic 마커의 입력된 형광 강도 정상화.
- 통계 컴퓨팅 및 그래픽 이전 연구38,39에 의해 설명 된 대로 소프트웨어 환경을 사용 하 여 자체 조직 지도 (SOM) 분석을 수행 합니다.
- 독특한 4 개의 "스트림과 벡터" 해당 4 마커, DAPI, 듀, Annexin V 및 OCT4 형광 강렬 하로 25 솜 노드를 만듭니다.
- 각 microenvironment 개별 셀 "승리" (가장 유사한) 노드에 할당 하 고는 승리 노드 스트림과 벡터 업데이트 무게는 학습 속도가 중된 평균을 사용 하 여 셀 주파수로 플롯 (여기, 0.05로 기본값)입니다.
참고: 몇 셀을 포함 하는 데이터 집합은 통계적으로 관련성이 높은 솜 결과 제공 하지 않았다 때문에 미만 1000 셀을 포함 하는 약 실에서 데이터를 생략 합니다.
- 클러스터링 소프트웨어40여 피어슨 상관 관계에 따라 평균 연결 방법을 사용 하 여 솜 노드 값 자동 계층적 클러스터링을 수행 합니다.
- Dendrogram와 heatmap 조회41에 클러스터링 데이터를 렌더링 합니다.
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Representative Results
MACME 배열: 설계 및 제조: Nanofiber 기술 함께, 우리는 미세 세포 배양 및 심사 기술을 이전 hPSC 자체 갱신 또는 차별화35,36 (그림 1)에 대 한 최적의 조건을 식별 하기 위해 사용. 이것은 세포 배양 챔버와 조건을 정확 하 게 제어 하 고 확장 가능한42,,4344때문에 강력한 높은 처리량 세포 기반 분석을 설정 하는 데 적합. 여기, nanofiber 배열 간단한 nanofiber 증 착 방법, 3D 인쇄 마스크와 전기에 의해 준비 되었다. 미세 부품 쉽게 많은 시련과 오류를 통해 챔버 구조를 디자인 하는 3D 인쇄 형 조작 했다. MACME 배열 두 부분을 결합 하 여 생성 된 및 포함 된 48 환경, 두 nanofiber ECMs (nanofiber 재료의 3 종류와 4 다른 밀도 또는 4 컨트롤의 다양 한 조합에 의해 다른 생물 및 생 화 확 적인 신호를 제공 하 매트릭스 단백질)에 표시 된 그림 2-셀 상호 작용 (초기 셀 시드 밀도의 3 범위).
HESC 고기에 nanofiber 속성 및 세포 밀도의 전반적인 효과의 평가: 세포 배양에 MACME 배열 판에 형광 성 얼룩그림 6(A), 다음 단일 셀 측정 획득된 이미지와 함께 수행 했다. 동종 및 이종 4 phenotypic 표식 각 데이터 집합에 대 한 식 레벨의 비교,이 프로토콜 사용 솜 분석38,39, 고 차원, multiparametric 데이터 집합으로 변환 저 차원 2D 지도입니다. 특히, PS nanofibers 및 2DGT 매트릭스의 결과 대부분 세포 고착 하지 않았다이 분석에서 생략 했다. 또한,이 분석에서 제외 했다 낮은 cd 그 실험 어디 셀 하지 않은 충분 한 직접적인 (예를 들어, juxtacrine) 또는 간접 (paracrine) 상호 작용 생존. 솜 분석, 다음 자동 계층적 클러스터링의 모든 분석된 샘플 (그림 6B) 솜 노드 수행 되었다. 클러스터 dendrogram의 높이 고려 하 여 phenotypic 차이 수 샘플 3 개 그룹으로 분류: 나, GT nanofibers, MG_HighCD, 및 VN_HighCD; 샘플 틈새 구성의 대부분을 그룹화 그룹 ii, GT nanofibers (GT_XLow 및 MidNF_MidCD), MG_MidCD, 또는 VN_MidCD;을 포함 하는 샘플 그리고 그룹 iii, 모든 PMGI_NF 샘플입니다.
연구 그룹 간의 차이, 우리는 (그림 6C각 그룹에서 하나의 대표 샘플 검사 그룹 i GT_MidNF_HighCD, 그룹 ii-GT_MidNF_MidCD, 및 그룹 iii-PMGI_MidNF_HighCD). OCT4 신호에서 모든 그룹 MG (MG_MidCD)의 저것 보다는 더 높은 식을 보였다. 그룹 난 높은 듀 신호, 대부분 셀 적극적으로 확산 했다 나타내는 특징 이었다. 따라서, 그룹 undifferentiated hPSCs 일반적으로 확산 빠르게 세포 주기 간격 단계 때 때문에 hPSC 유지 보수에 적합 한 조건으로 특징 이었다 microenvironments,4546단축.
GT_MidNF_HighCD와 GT_MidNF_MidCD 그들의 독특한 초기 셀 로드 밀도 의해 구분 됩니다. 높은 초기 세포 밀도 증가 그들의 생존 및 확산47강화 인접 세포와 상호 작용을 세포의 기회. 부족 한 초기 밀도 (3.0 × 104 셀/cm2) 시드 셀 살아도 실험 기간 (4 일) 동안 성장 했다. 따라서, 우리 솜 분석;에서이 샘플을 포함 하지 않았다 핸드폰 번호 1000 생활 셀/챔버의 컷오프 밑에 있었다. 2DGT 건설 기계에 셀 그룹 ii 세포;로 또한 분류 했다 이 조건은 hPSC 자체 갱신48를 지원 하지 않습니다. GT_MidNF_MidCD 셀 듀 신호 손실 그리고 Annexin V 레벨 약간 세포의 stemness 잃었다 고 apoptotic 점차 했다 나타내는 증가 했다. PMGI_MidNF_HighCD PMGI nanofiber 행렬으로 구성 된 microenvironments을 나타내는 다른 조건에 비해 OCT4 및 듀 신호에 큰 변화를 보였다.
그림 1 . 최적의 세포 microenvironments 세포 기능 조절에 대 한 식별 하는 전략 스크리닝. 멀티플렉스 인공 세포 microenvironment (MACME) 배열의 구성 요소 개요 (A). 배열 두 주요 부분으로 구성: nanofiber 침대 기저 기판 (nanofiber 배열)입니다 (PDMS)에 꽃무늬-미세 구조를 기반으로. MACME 배열 nanofiber ECMs 다양 한 기능 (nanofiber 재료 및 밀도)와 다양 한 세포 밀도 시드를 준비 할 수 있다. PDMS 미세 구조의 MACME 배열 기능 3 미세 채널 하이츠 (250, 500 및 1000 µ m) 초기 셀 시드 밀도 조절. 자기 조직 지도 (SOM)에 의해 통계 데이터 분석 계층적 클러스터링 선행 고 (B) 셀 고기에 세포 microenvironments의 영향 양적 이미지 기반 단일 세포 분석 실험을 사용 하 여 계산 됩니다. 이 수치는와 일리 허가 기준49 에서 적응 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 . MACME 배열의 디자인. (A) 오버 헤드와 높은 각도 촬영 전체 MACME 배열의 nanofiber 매트릭스 (분홍색)에 미세 채널 (밝은 파랑)의 개념도. 각 채널 700 µ m 폭 및 8.4 m m 긴 문화 실과 매체와 셀의 도입에 대 한 2 개의 후미의 구성 됩니다. (B) 세포 및 nanofiber 행렬의 크기 비교. 세포와 nanofiber 침대의 높이 범위에서 1-3 µ m 및 0.05-5.0 µ m, 각각. (C) 각 미세 채널 250/500/1000 µ m 높이 횡단면. 셀 및 nanofiber 침대 각각 푸른 원과 오렌지 라인으로 표시 됩니다. 각 챔버에 같은 너비와 길이 다른 고도 하지만 (250, 500 및 1000 µ m), 그리고 각 챔버 볼륨 1.6, 3.2, 6.4 µ L, 각각. 그림 2C 에 검은 점선된 사각형 그림 2B나타냅니다. 그림 2 는 일리 허가 기준49 에서 적응 시켰다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 . MACME 배열의 제조. (A) 제조 nanofiber 배열. 패턴화는 baseplate에 여러 nanofiber 행렬 마스크 패턴된 구멍 베어링의 집합을 사용 하 여 수정 된 전기에 의해 수행 되었다. 백 금 코팅 플라스틱 baseplate에 nanofiber 증 착을 촉진 하기 위하여 수행 되었다. 독특한 구멍 패턴 마스크 3D 프린터에 의해 준비 되었다. 다음 접시 마스크 세트 컬렉션 화면에 지시 했다 접시의 백 금 코팅 영역의 마스킹 및 일반 전기 수행 되었다. 초기 nanofibers 마스크에 구멍을 통해 접시에 Pt 코팅 위치에 형성 되었다. 추가 nanofiber 침대는 기존 마스크를 대체 하 고 절차를 반복 하 여 접시에 조작 했다. 미세 구조 (B) 제조. UV 경화 수 지와 3 차원 프린터 인쇄 형 미세 소자의 PDMS 층 형성. 주조 후, MACME 배열 표면 활성화 nanofiber 배열 PDMS 기반 미세 레이어를 연결 하 여 조립 되었다. 그림 3 와 일리 허가 기준49 에서 적응 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 . 미세한 이미지 수집을 위한 그래픽 사용자 인터페이스 (GUI)의 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 . 단일 셀 형질에 대 한 처리 하는 컴퓨터 기반 이미지의 그래픽 사용자 인터페이스 (GUI)의 이미지. 5 단계;를 포함 하는 이미지 분석 프로세스 (A) 식별 DAPI에서 기본 개체의 이미지, OCT4, Annexin V에 듀 이미지, 보조 개체 식별 (B-D) 각각, 및 개체 강도의 측정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6 . 형질 그리고 microenvironmental 요인에 의해 변경 H9 hESCs의 고기의 분류. H9 hESCs 젤라틴 (GT) nanofibers (GT_HighNF_HighCD)에 높은 초기 시드 밀도에서 경작의 (A) Immunofluorescent 이미지 물 3 셀룰러 phenotypic 마커 (OCT4, pluripotency; 듀, 세포 증식; Annexin V, apoptosis)와 DAPI 세포 핵에 대 한. (B) A heatmap 및 자동 계층적 클러스터링의 dendrograms. 테스트 microenvironments는 고기의 유사성에 따라 독특한 특징을 가진 3 개의 그룹으로 분류 했다. 난 GT nanofibers, MG_HighCD, 및 VN_HighCD 포함 하는 그룹. 그룹 ii MG_MidCD, 또는 VN_MidCD (GT_XLow 및 MidNF_MidCD), GT nanofibers의 샘플의 구성 되어 있습니다. 모든 PMGI_NF 샘플 그룹 iii에 클러스터 했다. Heatmap에 핑크와 블루 색상 각각 솜 수 음모에 높고 낮은 셀룰러 주파수를 나타냅니다. (C) 각 그룹 (그룹 i GT_MidNF_HighCD, 그룹 ii-GT_MidNF_MidCD, 및 그룹 iii-PMGI_MidNF_HighCD)에서 한 대표 샘플에 1000 셀의 정량된 마커 식 레벨의 분포. 25 그리고 75 백분위 상자 제한으로 표시 했다. 수염은 25 그리고 75 백분위에서 1.5 배 interquartile 범위를 확장합니다. 실험은 각 그룹에 대 한 세 번 반복 했다. 그림 6 A-C 와 일리 허가 기준49 에서 적응 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 이름 | 채널 길이 (mm) | 채널 폭 (μ m) | 채널 높이 (μ m) | 입구/출구 직경 (μ m) | 입구/출구 높이 (μ m) | 형 길이 (mm) | 금형 폭 (mm) | 금형 높이 (mm) |
| 금형 | 8.4 | 700 | 250/500/1000 | 800 | 3000 | 127.76 | 85.48 | 14.35 |
| 이름 | 두께 (μ m) | 구멍 길이 (mm) | 구멍 폭 (mm) | 마스크 길이 (mm) | 마스크 폭 (mm) | 금형 높이 (mm) | 행 오프셋 (mm) | 열 오프셋 (mm) |
| 마스크 | 1000 | 6 | 5 | 123.5 | 80.2 | 14.35 | 11.24 | 14.38 |
표 1입니다. 미세 구조 및 nanofiber 패터 닝에 대 한 마스크에 대 한 금형의 치수.
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Discussion
이 프로토콜 자격 갖춘된 hPSCs의 유지 보수에 대 한 강력한 문화 시스템 구축 첫 번째 심사 메서드를 보여 줍니다. 첫째, 우리는 다양 한 인공 소프트웨어와 통합 nanofiber 배열, MACME 배열 된 미세 장치를 사용 하 여 밀도 시드 셀 플랫폼을 준비 하는 방법을 설명 합니다. 두 번째, 양적 이미지 기반 단일 셀 형질 개별 세포 결과 및 다른 생 화 확 및 생물 기능에 의해 변경 하는 동작 수행된50 이었다. 이 프로토콜에서 GT nanofiber 시드 밀도 높은 초기 세포의 상태에 긍정적인 제어 ECM 단백질의 구성 된 환경 undifferentiated 상태;의 기능 특징 이었다 급속 한 확산45 와 안정적인 OCT4 식51. 이 관측은 "세포-기질" 및 "셀" 상호 작용 하는 분자 메커니즘 hPSCs의 pluripotency 영향을 미칠 수 표시.
이 전략은 사용자의 목적에 맞게 사용자 지정할 수 있습니다. 예를 들어 셀 조작 및 처리량 조정할 수 있습니다 실험 설정의 다양 한 형태와 패턴의 미세 구조를 다시 설계 하 여. 처리량 개선 위한 또 다른 방법은, 각 챔버의 입구와 출구 위치는 96 잘 접시, 바이오 과학의 사회;에 의해 표준화의 미 판 기준에 의하여 설계 되 따라서, 높은 처리량 검사는 자동화 된 로봇 액체 디스펜서를 사용할 수 있습니다. "세포-ECM 상호 작용"에 관한 분자 메커니즘을 더 검사를 인공 세포 microenvironments 만들 수 있습니다 더 정확 하 게 화학적 신호 분자52과 nanofibers 수정 하 여 비보에 조건을 모방 .
날짜 하려면, 세포 microenvironments를 검사 하기 위해 개발 하는 대부분 플랫폼 상영 용 해 요인 (예를들면, 성장 인자 및 화합물)42,43,44, 하지만 하지 nanofiber 소프트웨어 때문에 목적 되었습니다. 독특한 제작 기법을 결합 하는 어려움 예를 들어 nanofiber 시트 미세 구조와는 baseplate 사이의 작은 차이 생성 하 고 문화 매체 믹스를 통해 또 다른 챔버의 하나 때문에 다른 견본 사이의 교차 오염 귀착되는 그들의 불안정 한 결합 하면 작은 간격입니다. 우리의 새로운 방법은 특정 사이트에서 nanofiber 매트릭스의 간단 하 고 정확한 제작을 용이 하 게 하 불안정 한 결합 및 상호 오염을 방지 baseplate와 함께 그들의 직접 결합 하며 또한, 몇 가지 플랫폼53 마이크로와 통합 되었으며 nanofiber 행렬 셀 기능에 미치는 영향을 조사 하기 위해 화학 및 물리적 단서의 체계적인 조작에 대 한 접근 기술을 위해 필요 하기 때문에 통합은 매우 정교한. 우리의 단일 셀 프로 파일링 MACME 배열을 쉽게 달성 기구 및 간단한 기술을 수행할 수 발달에 대 한 셀룰러 환경 모델링에 사용 하기 위해 큰 잠재력을 보유 하 고 있고 세포 생물학 연구 및 신약 / 심사입니다.
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Disclosures
없음입니다.
Acknowledgments
우리는 인간의 ES 세포를 제공 하기 위한 iCeMS, 교토 대학에서 교수 N. 辻를 감사 합니다. 우리는 또한 감사 교수 A. 마루야마 도쿄 기술 연구소에서 원자 힘 현미경의 사용에 그의 지원에 대 한. 자금 아낌없이 제공 했다 일본 사회 과학의 프로 모션에 대 한 (JSP; 22350104, 23681028, 25886006, 및 24656502); 자금 또한 새로운 에너지와 산업 기술 종합 개발 기구 (NEDO)와 Terumo 생명 과학 재단에 의해 제공 했다. WPI iCeMS는 세계 최고의 국제 연구 센터 이니셔티브 (WPI), 교육, 문화, 스포츠, 과학 및 기술 (MEXT), 일본에 의해 지원 됩니다. 이 작품의 일부는 교토 대학 나노기술 허브와 AIST 나노 처리 시설 "나노기술 플랫폼 프로젝트" 일본 문 부 과학성의 후원에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polystyrene (PS) | Sigma | #182435 | Average Mw: 290,000, average Mn: 130,000 |
| Polymethylglutarimide (PMGI) | MicroChem | G113113 | |
| Gelatin (GT) | Sigma | G2625 | From porcine skin, type A |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Doe Corning Toray | #1064291 | PDMS curing agent and silicone elastomer base are components of this kit. |
| OpenSCAD | This is a free 3D computer graphics software (http://www.openscad.org/) used for designing the mold of the microfluidic device. | ||
| AutoCAD 2014 | Autodesk | This is a 3D computer graphics software (https://www.autodesk.com/products/autocad/overview) used for design of the mask used on nanofiber-array preparation. | |
| 3D printer, AGILISTA-3000 | Keyence | ||
| UV-curable resin, AR-M2 | Keyence | This is used for 3D printing by Agilista. | |
| Acetic acid | Sigma | #338826 | ≥99.99% |
| Ethyl acetate | Sigma | #270989 | Anhydrous, 99.8% |
| Tetrahydrofuran (THF) | Sigma | #401757 | |
| MSP-30T | Vacuum Device | Magnetron sputtering machine | |
| Nunc OmniTray | Thermo Fisher Scientific | #242811 | This is a polystyrene baseplate on which the nanofiber array is created. This plate size is typically 127.7 x 85.5 mm. |
| Gun-type corona discharge machine | Shinko Electric & Instrumentation | CFG-500 | This handy device is used to generate corona for activation of the bottom surface of the PDMS layer at step 1.5 "Assembly of the MACME arrays" in the protocol. |
| 5 mL syringe | Terumo | SS-05SZ | |
| Stainless-steel blunt needle (23-gauge) | Nipro | #2166 | Outside diameter and length are 0.6 and 32 mm, respectively. |
| High-voltage power supply | TechDempaz | ||
| 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide, hydrochloride | Dojindo | W001 | |
| N-Hydroxysuccinimide | Sigma | #56480 | |
| Matrigel hESC-Qualified Matrix | Corning | #354277 | This protein is refered as basement membrane gel matrix in the protocol. |
| CellAdhere Vitronectin, Human, Solution | STEMCELL Technologies | #07004 | |
| TeSR-E8 | STEMCELL Technologies | #05940 | Feeder-free, xeno-free culture medium for maintenance of human ES and iPS cells |
| Y-27632 | Wako Pure Chemical Industries | #253-00513 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red | Thermo Fisher Scientific | #12605028 | This ia a recombinant trypsin-like protease for dissociation of adherant mammalian cells. |
| Click-iT EdU Imaging Kit with Alexa Fluor 647 Azides | Thermo Fisher Scientific | C10086 | The fluorescent labeling of proliferating cells in on-plate fluorescent staining was performed along the product manual of this kit. |
| Annexin V, Alexa Fluor 594 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A13203 | |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Oct-3/4 Antibody (C-10) | Santa Cruz Biotechnology | sc-5279 | |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (DyLight 488) | abcam | ab96875 | This is a secondary antibody used in on-plate fluorescent cell staining. |
| ECLIPSE Ti-E | Nikon | This is an inverted fluorescence microscope equipped with a CFI Plan Fluor 4×/0.13 N.A. objective lens (Nikon), CCD camera (ORCA-R2, Hamamatsu), mercury lamp (Intensilight, Nikon), XYZ automated stage (Ti-S-ER motorized stage with encoders, Nikon), and filter cubes for four fluorescence channels (DAPI, GFP HYQ, TRITC, Cy5; Nikon) | |
| NIS-Elements Advanced Research | Nikon | This is a microscope imaging software used for automatic image acquisition. | |
| CellProfiler, Version 2.1.0 | This is a free open software for cell image analysis (http://cellprofiler.org/). | ||
| R | SOM analysis is performed by kohonen package of this software. This is freely available (https://www.r-project.org/). | ||
| Cluster 3.0 | This is the open source clustering software (http://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster/software.htm). Unsupervised hierarchical clustering is performed with this software. | ||
| Java TreeView | This open source software (http://jtreeview.sourceforge.net/) is used to visualize clustering data as a heatmap and a dendrogram. | ||
| H9 human embryonic stem cell | WiCell Stem Cell Bank | WA09 |
References
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Ameen, C., et al. Human embryonic stem cells: Current technologies and emerging industrial applications. Crit Rev Oncol Hematol. 65 (1), 54-80 (2008).
- Nishikawa, S., Goldstein, R. A., Nierras, C. R. The promise of human induced pluripotent stem cells for research and therapy. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (9), 725-729 (2008).
- Robinton, D. A., Daley, G. Q. The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy. Nature. 481 (7381), 295-305 (2012).
- Sartipy, P., Bjorquist, P., Strehl, R., Hyllner, J. The application of human embryonic stem cell technologies to drug discovery. Drug Discovery Today. 12 (17-18), 688-699 (2007).
- Discher, D. E., Mooney, D. J., Zandstra, P. W. Growth factors, matrices, and forces combine and control stem cells. Science. 324 (5935), 1673-1677 (2009).
- Joyce, J. A., Pollard, J. W. Microenvironmental regulation of metastasis. Nat Rev Cancer. 9 (4), 239-252 (2009).
- Danhier, F., Feron, O., Preat, V. To exploit the tumor microenvironment: Passive and active tumor targeting of nanocarriers for anti-cancer drug delivery. J Control Release. 148 (2), 135-146 (2010).
- Murphy, W. L., McDevitt, T. C., Engler, A. J. Materials as stem cell regulators. Nat Mater. 13 (6), 547-557 (2014).
- Patel, A. K., et al. A defined synthetic substrate for serum-free culture of human stem cell derived cardiomyocytes with improved functional maturity identified using combinatorial materials microarrays. Biomaterials. 61, 257-265 (2015).
- Zhang, R., et al. A thermoresponsive and chemically defined hydrogel for long-term culture of human embryonic stem cells. Nat Commun. 4, (2013).
- Anderson, D. G., Putnam, D., Lavik, E. B., Mahmood, T. A., Langer, R. Biomaterial microarrays: rapid, microscale screening of polymer-cell interaction. Biomaterials. 26 (23), 4892-4897 (2005).
- Celiz, A. D., et al. Discovery of a Novel Polymer for Human Pluripotent Stem Cell Expansion and Multilineage Differentiation. Adv Mater. 27 (27), 4006-4012 (2015).
- Hansen, A., et al. High-Density Polymer Microarrays: Identifying Synthetic Polymers that Control Human Embryonic Stem Cell Growth. Adv Healthcare Mater. 3 (6), 848-853 (2014).
- Mei, Y., et al. A high throughput micro-array system of polymer surfaces for the manipulation of primary pancreatic islet cells. Biomaterials. 31 (34), 8989-8995 (2010).
- Saha, K., et al. Surface-engineered substrates for improved human pluripotent stem cell culture under fully defined conditions. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (46), 18714-18719 (2011).
- Bettinger, C. J., Langer, R., Borenstein, J. T. Engineering substrate topography at the micro- and nanoscale to control cell function. Angew Chem Int Ed Engl. 48 (30), 5406-5415 (2009).
- McMurray, R. J., et al. Nanoscale surfaces for the long-term maintenance of mesenchymal stem cell phenotype and multipotency. Nat Mater. 10 (8), 637-644 (2011).
- Sun, Y., Jallerat, Q., Szymanski, J. M., Feinberg, A. W. Conformal nanopatterning of extracellular matrix proteins onto topographically complex surfaces. Nat Methods. 12 (2), 134-136 (2015).
- Nitanan, T., et al. Effects of processing parameters on morphology of electrospun polystyrene nanofibers. Korean J Chem Eng. 29 (2), 173-181 (2012).
- Liu, L., et al. Chemically-defined scaffolds created with electrospun synthetic nanofibers to maintain mouse embryonic stem cell culture under feeder-free conditions. Biotechnol Lett. 34 (10), 1951-1957 (2012).
- Liu, L., et al. Nanofibrous gelatin substrates for long-term expansion of human pluripotent stem cells. Biomaterials. 35 (24), 6259-6267 (2014).
- Kamei, K., et al. Phenotypic and transcriptional modulation of human pluripotent stem cells induced by nano/microfabrication materials. Adv Healthcare Mater. 2 (2), 287-291 (2013).
- Peerani, R., et al. Niche-mediated control of human embryonic stem cell self-renewal and differentiation. EMBO J. 26 (22), 4744-4755 (2007).
- Yamamoto, K., et al. Fluid shear stress induces differentiation of Flk-1-positive embryonic stem cells into vascular endothelial cells in vitro. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 288 (4), 1915-1924 (2005).
- Charati, S. G., Stern, S. A. Diffusion of gases in silicone polymers: Molecular dynamics simulations. Macromolecules. 31 (16), 5529-5535 (1998).
- Prado-Lopez, S., et al. Hypoxia promotes efficient differentiation of human embryonic stem cells to functional endothelium. Stem Cells. 28 (3), 407-418 (2010).
- Yanagihara, K., et al. Prediction of Differentiation Tendency Toward Hepatocytes from Gene Expression in Undifferentiated Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cells and Development. 25 (24), 1884-1897 (2016).
- Kamei, K., et al. 3D printing of soft lithography mold for rapid production of polydimethylsiloxane-based microfluidic devices for cell stimulation with concentration gradients. Biomed Microdevices. 17 (2), (2015).
- Song, J. H., Kim, H. E., Kim, H. W. Production of electrospun gelatin nanofiber by water-based co-solvent approach. J Mater Sci Mater Med. 19 (1), 95-102 (2008).
- Owen, M. J., Smith, P. J. Plasma Treatment of Polydimethylsiloxane. J Adhes Sci Technol. 8 (10), 1063-1075 (1994).
- Chen, G. K., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nat Methods. 8 (5), 424-476 (2011).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25 (6), 681-686 (2007).
- Kamei, K., et al. An integrated microfluidic culture device for quantitative analysis of human embryonic stem cells. Lab Chip. 9 (4), 555-563 (2009).
- Kamei, K., et al. Microfluidic image cytometry for quantitative single-cell profiling of human pluripotent stem cells in chemically defined conditions. Lab Chip. 10 (9), 1113-1119 (2010).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7 (10), 100 (2006).
- Kohonen, T. Self-Organized Formation of Topologically Correct Feature Maps. Biol Cybern. 43 (1), 59-69 (1982).
- Wehrens, R., Buydens, L. M. C. Self- and super-organizing maps in R: The kohonen package. J Stat Softw. 21 (5), 1-19 (2007).
- Eisen, M. B., Spellman, P. T., Brown, P. O., Botstein, D. Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (25), 14863-14868 (1998).
- Saldanha, A. J. Java Treeview--extensible visualization of microarray data. Bioinformatics. 20 (17), 3246-3248 (2004).
- Du, G. S., Fang, Q., den Toonder, J. M. J. Microfluidics for cell-based high throughput screening platformsd-A review. Anal Chim Acta. 903, 36-50 (2016).
- Huang, S. B., et al. An integrated microfluidic cell culture system for high-throughput perfusion three-dimensional cell culture-based assays: effect of cell culture model on the results of chemosensitivity assays dagger. Lab Chip. 13 (6), 1133-1143 (2013).
- Wang, B. L., et al. Microfluidic high-throughput culturing of single cells for selection based on extracellular metabolite production or consumption. Nat Biotechnol. 32 (5), 473 (2014).
- Becker, K. A., et al. Self-renewal of human embryonic stem cells is supported by a shortened G1 cell cycle phase. J Cell Physiol. 209 (3), 883-893 (2006).
- Neganova, I., Lako, M. G1 to S phase cell cycle transition in somatic and embryonic stem cells. J Anat. 213 (1), 30-44 (2008).
- Fox, V., et al. Cell-cell signaling through NOTCH regulates human embryonic stem cell proliferation. Stem Cells. 26 (3), 715-723 (2008).
- Xu, C., et al. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 19 (10), 971-974 (2001).
- Kamei, K., et al. Microfluidic-Nanofiber Hybrid Array for Screening of Cellular Microenvironments. Small. 13 (18), (2017).
- Sun, J., et al. A Microfluidic Platform for Systems Pathology: Multiparameter Single-Cell Signaling Measurements of Clinical Brain Tumor Specimens. Cancer Res. 70 (15), 6128-6138 (2010).
- Theunissen, T. W., Jaenisch, R. Molecular Control of Induced Pluripotency. Cell Stem Cell. 14 (6), 720-734 (2014).
- Yoo, H. S., Kim, T. G., Park, T. G. Surface-functionalized electrospun nanofibers for tissue engineering and drug delivery. Adv Drug Del Rev. 61 (12), 1033-1042 (2009).
- Dixon, J. E., et al. Combined hydrogels that switch human pluripotent stem cells from self-renewal to differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (15), 5580-5585 (2014).
