Summary
Эта статья описывает подробная методология подготовить массив мультиплексированных искусственных сотовой микроокружения (MACME) для манипуляции высок объём физико-химические сигналы подражая в vivo сотовой микросреды и Определите оптимальные клеточной среды для человеческих плюрипотентных стволовых клеток (hPSCs) с одной ячейкой профилирования.
Abstract
Сотовый микросреды состоят из различных сигналов, таких как факторы роста, внеклеточной матрицы и межклеточных взаимодействий. Эти сигналы являются хорошо организованы и имеют решающее значение в регуляции функций клеток в живых систем. Хотя ряд исследователей пытались исследовать взаимосвязь между экологическими факторами и желаемого клеточных функций, многое остается неизвестным. Это во многом обусловлено отсутствием надлежащей методологии имитировать такие экологические сигналы в пробирке, и одновременно проверить различные экологические сигналы на клетки. Здесь мы приводим интегрированной платформы microfluidic каналов и массив нановолокно, следуют высоким содержанием одноклеточных анализа, для изучения стволовых клеток фенотипов, изменено, различных экологических факторов. Чтобы продемонстрировать применение этой платформы, это исследование посвящено фенотипов самостоятельного обновления человеческих плюрипотентных стволовых клеток (hPSCs). Здесь мы представляем процедуры подготовки нановолокно массив и структуру microfluidic в изготовление массив мультиплексированных искусственных сотовой микроокружения (MACME). Кроме того описаны общие шаги одной ячейки, профилирование, клетки, окрашивание с несколькими флуоресцентные маркеры, несколько изображений флуоресценции и статистического анализа.
Introduction
Человеческих плюрипотентных стволовых клеток (hPSCs)1,2 самостоятельно продлевать неограниченно и дифференцироваться в различные ткани линий, которые могут революционизировать разработки лекарственных средств, на основе ячеек терапии, тканевой инженерии и регенеративной медицины 3 , 4 , 5 , 6. Общая культура блюда и микротитровальных пластин, однако, не предназначены для включения точные физические и химические Сотовый манипуляции на клеточном уровне с диапазоном от nano - для микро метров, который является критическим фактором для сотовых расширения, самообновления и дифференциации. Чтобы устранить этот недостаток, исследования изучили роль клеточных микросреды в регулировании клеток судьба решения и функции клеток4. В последние годы все большее число исследований были проведены реконструировать сотовой микросреды в vitro7,8. Нано - и микро изготовление процессы создали эти микросреды через манипуляции химических9,10,11,12,13, 14,,1516,17 и физической18,19,20 экологические сигналы. До сих пор не поступало систематически расследовать основных механизмов химических и физических экологических сигналы на решений клеток судьба и функций в рамках единой платформы.
Здесь мы представляем стратегию, основанную на принципах простой дизайн для создания надежного скрининга платформы (рис. 1). Во-первых, мы описываем порядок разработки интегрированной платформы для создания универсальный, искусственные сотовой микросреды, используя массив нановолокно и структуру microfluidic: массив мультиплексированных искусственных сотовой микроокружения (MACME) (Рис. 1A и 2A). Нановолокно массив имеет 12 различных микросреды в разных сочетаниях нановолокно материалов и плотности. Electrospinning была использована для изготовления нановолокон. Нановолокно материалов, таких, как полистирол (PS)21, polymethylglutarimide (PMGI)22и23желатин (GT), были разработаны для проверки их химические свойства, которые могут повлиять на клеточной адгезии и поддержания плюрипотентности ( Рисунок 2B). Нановолокно плотности были разнообразны, изменяя время electrospinning и сгенерированный nanofibers были определены согласно их плотности (DNF, с D = XLow/низкий/средний/высокий). Microfluidic структура состоит из укрывательство 48 камеры в культуре клеток, которые могут быть расположены вдоль стандартные размеры 96-луночных микропланшетов полидиметилсилоксан (PDMS). PDMS — обычно используется для изготовления microfluidic приборы24биосовместимых и газ сменный полимер. Каждый канал microfluidic был разработан чтобы быть 700 мкм широкий и 8.4-мм длиной и имел два отверстия на его краях (Таблица 1). Камеры были разной высоты (250, 500 и 1000 мкм) для манипулирования первоначального заполнения ячейки плотности (0,3 0,6 и 1.2 × 105 клеток/см2), которые можно соотнести с выживания, пролиферации и дифференцирования hPSCs25 (Рис. 2C). Количество ячеек в камеру семенами пропорциональна плотности столбца над полом камеры, и таким образом первоначальная клеточная посева плотность контролировался путем введения же суспензию клеток в культуре камер с разных высот. Все каналы были призваны быть ≥ 250 мкм высотой26 для сведения к минимуму воздействия напряжения низкой кислорода27 и касательное напряжение28 на клетки. Канал высот 250, 500 и 1000 мкм сокращенно здесь как XCD с X = низкий, Mid и высокий, соответственно. Средах с собственный нановолокно и первоначальный плотностью заполнения ячейки были укорочены как «Material_NF density_Cell» (например, GT_HighNF_HighCD: окружающей среды, характеризуется высокой плотностью GT нановолокон и высокой начального заполнения ячейки плотность).
Впоследствии мы описывают, как выполнять анализ одноклеточных систематически расследовать поведение клеток в ответ на экологические факторы (рис. 1Б). Как доказательство концепции мы определили оптимальные клеточной среды для hPSC самообновлению, который является одной из ключевых функций для hPSC обслуживание (рис. 1Б)29. На основе образа цитометрии, следуют статистического анализа, позволяет для количественной интерпретации отдельных клеточных реакций фенотипические клеточной среде. Среди различных клеточных функций этот документ содержит подробные процедуры для выявления оптимальных условий для поддержания hPSC самообновлению.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Изготовление MACME массива
Примечание: Все материалы и оборудование, перечислены в таблице материалы.
-
Подготовка масок для нановолокно массив и плесень microfluidic структуры
- Создание трехмерного (3D) изображения маски, используемые для нановолокно массивов и формы для microfluidic структур с использованием пакетов программного обеспечения 3D компьютерной графики (Таблица 1).
Примечание: 3D изображения читать и напечатаны на 3D принтере. Печатных маски и формы имеют те же размеры с трехмерными изображениями, определяются с использованием графического программного обеспечения на этапе 1.1.1. - Распечатать маски и плесень, основанный на эти проекты с использованием 3D-принтер.
Примечание: В этом протоколе ink-jet как 3D-принтер с УФ отверждаемыми смолы был используется30. Разрешение принтера был 635 × 400 dpi и 15 мкм в X, Y и Z, соответственно, однако, фактические X, Y резолюции был примерно в четыре раза ниже.
- Создание трехмерного (3D) изображения маски, используемые для нановолокно массивов и формы для microfluidic структур с использованием пакетов программного обеспечения 3D компьютерной графики (Таблица 1).
-
Подготовка нановолокно массив (Рисунок 3A)
- Растворы полимерные подготовиться electrospinning.
- Разбавьте 13% PMGI жидкость с тетрагидрофуран 9% (w/v)22.
- Распустить 0,08 г PS (номер Средний молекулярный вес (Mn): 130 000) в THF:dimethylformamide (соотношение 1:1 объем)21и добавить THF:dimethylformamide довести объем до окончательного 1 мл (8% (w/v) PS раствор).
- Распустить 0,1 г GT в воде: уксусной кислоты: этиловый ацетат (отношение объема 1:1.6:2.1) и добавить воду: уксусной кислоты: Этилацетат довести объем до окончательного 1 мл (раствор 10% (w/v) GT) как описано23,31.
- Используйте магнетронного распыления машина, депозит тонкий слой платины с толщиной 5-Нм на полистирол (PS) baseplate (127,7 × 85.5 мм), который служит катодом в electrospinning установки.
- Загрузите каждый раствор полимера в 5-мл шприц с тупой иглой 23 G из нержавеющей стали.
- Место и якорь шприц с иглой на шприцевый насос с 12-см помимо коллекционер electrospinning устройства.
- Подключите иглу шприца высокого напряжения питания и установить для применения к 11 кв.
- Установите на насосных скорость 0,2 мл/ч.
- Держите температуры и влажности при 30 ° C и < 30% (v/v).
- Положите маску на плите, подготовленный на этапе 1.2.2.
- Изготовить nanofibers на плите через отверстия маски с различных плотностей, изменяя время electrospinning (например, 20, 60, 90 и 180 s).
- Снимите маску из плите.
Примечание. Этанол могут быть распылены на electrospun GT nanofibers перед удалением маски во избежание отшелушивающим GT nanofibers вместе с маской. - Повторите шаг 1.2.4-1.2.10 до завершения изготовление нановолокно массив.
- Место нановолокно массив в эксикатор при 25 ° C для 16 h для испарения растворителя оставшихся.
- Нановолокна crosslink GT с 0,2 М 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) Карбодиимиды гидрохлорид (EDC) и 0,2 M-N-оксисукцинимидного (NHS) в этаноле при 25 ° C для 4 h23.
- Промойте nanofibers GT дважды с 99,5% (v/v) этанола и вакуум сухой при 25 ° C для 16 h.
- Растворы полимерные подготовиться electrospinning.
-
Изготовление microfluidic структур (Рисунок 3B)
- Смешать 2 g PDMS отверждения агента и 20 g PDMS базы (1:10 вес коэффициент; Pre-PDMS). 24
- Вылейте смесь pre-PDMS на плесень, изготовленный в шаге 1.2.
- Де газ pre-PDMS смесь в эксикатор для 30 мин.
- Вылечить pre-PDMS смесь в духовке при температуре 65 ° C для 16 h.
-
Ассамблеи MACME массивы (Рисунок 3B)
- Отделите PDMS структуры, вылечить на шаге 1.3.4 от плесени и чистый с 70% (v/v) этанола.
- Лечить атмосферных коронного разряда на нижней стороне PDMS структуры32.
Примечание: В этом протоколе corona сбрасываются на всей поверхности слоя 3 или 4 раза с коронным разрядом аппарата «Удобный». Плазменной очистки кислорода был заменен с атмосферными коронным разрядом для изменения поверхности адгезии. - Быстро Соберите PDMS структуры с массивом нановолокно.
- Печь выпекать при температуре 65° C на 2 дня.
2. Загрузка ЭСК в MACME массив
- Для повседневной культуры H9 человеческих эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) сохранить клетки в xeno свободно химически определены питательной среды для hPSC обслуживания33 с 10 мкм Y-27632 рок ингибитор34 (названный hPSC средних) в культуре клеток 35-мм блюдо с базальной мембраны матрицы геля (мг) покрытием.
- Клетки проход каждые 4-7 дней, с использованием рекомбинантного трипсина как протеазы.
- Стерилизовать MACME массив с 99,5% этанола, путем загрузки в камеры на 10 минут, а затем удалить этанола. Повторите этот шаг 3 раза.
- Ввести 12 мкл мг, 10 мкг/мл vitronectin (VN), и 0,1% (w/v) GT в управления культуры камер и инкубировать камер при 37 ° C за 1 ч до пальто их на поверхности камеры.
Примечание: В этом протоколе мг, VN и GT были отобраны как ссылка белков клеточной адгезии и культуры. Потому что мг и VN стандартные культуры клеток матрицы используется для поддержания hPSC самообновлению, они используются в качестве позитивных элементов управления; двумерные GT покрытие (2DGT) или не покрытие (NC) использовались как негативный контроль. - Ввести предварительно разогретые hPSC среднего во всех палатах MACME массива. Инкубировать камер для 30 минут при 37 ° C.
- Госкомсанэпиднадзором мыть H9, культивируемых на 35-мм блюдо с DPBS, добавить 0,5 мл рекомбинантных протеазы трипсина как на блюдо и инкубировать при 37 ° C за 1 мин и тщательно удалить только supernatants, смешанного с протеазы.
Примечание: На шаге аспирации клетки не отсоединяется. - Сразу же добавить hPSC средний, аккуратно распределить средство против блюдо поверхности неоднократно отмежеваться клетки и передавать отдельные ячейки 15 мл Конические трубки.
- Центрифуга на 200 g x 3 мин аспирата супернатант и приостановить клеток в среде подогретым hPSC.
- Ввести в каждой камере microfluidic 12 мкл суспензии клеток (1,2 × 106 клеток/мл).
Примечание: Представить в одной палате от другого с помощью микропипеткой клетки. Потому что количество клеток, семенами для камер пропорциональна плотности столбца над полом камеры, начальная плотность посева клеток может контролироваться хотя образцы из же суспензию клеток были использованы. Убедитесь, что дозирование делается аккуратно. Удалите избыток среднего из камер, используя палку хлопка накренилась после загрузки. Массив MACME совместим с пипетки часто используемые лабораторные и автоматических дозаторов системы, и она не требует никакого специального оборудования. - Измените hPSC среднего каждые 12 ч и культуры за 4 дня.
Примечание: Постоянные тома носителя (1.6, 3.2 и 6.4 мкл) обслуживаются с помощью камер различных размеров. Культура клетки под статического состояния для сведения к минимуму напряжение сдвига за исключением обмена клеток культуры среднего35,36.
3. количественное профилирование одной ячейки
-
На пластине люминесцентные клеток пятнать
Примечание: для анализа фенотипические изменения самостоятельного обновления hPSCs, этот протокол выбран три ключевых фенотипические маркеры для этого протокола: OCT4, 5-ethynyl-2'-дезоксиуридина (EdU) и Annexin V, для измерения статуса плюрипотентности, пролиферации и апоптоза , соответственно (Рисунок 2b). 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) используется для идентификации клеточных ядер. OCT4 является одним из важнейших транскрипционных факторов плюрипотентности.- Инкубируйте H9 ЭСК в массивах MACME в hPSC среде с 10 мкм EdU алкины при 37 ° C за 30 мин.
- После мытья с annexin привязки буфера (10 мм HEPES (рН 7,4), 140 мм NaCl, 2,5 мм CaCl2), выведение клетки с флуоресцентный оранжевый краситель Annexin конъюгата V при 20 ° C на 15 мин.
- Исправить клетки в PBS с параформальдегида 4% (v/v) при 20 ° C в течение 15 минут, а затем промыть клетки с PBS дважды.
- Разрушения клеток с использованием PBS с 0,3% (v/v) Тритон X-100 при 20 ° C для 16 h.
Примечание: Параформальдегида ослабляет связь между пластиковые фундаментной плите и структуру microfluidic PDMS. Таким образом отряд PDMS слоя из массива на шаге 3.2.1 также может выполняться сразу после этого шага. - Инкубируйте ячейки в буфер Tris основе реакции с красно Люминесцентная краска азид при 20 ° C за 30 мин.
- Инкубируйте клетки в блокирующем буфере (PBS с 5% (v/v) нормальной козьего сыворотки крови, сыворотке нормальный осла 5% (v/v), 3% (w/v) бычьего сывороточного альбумина, 0,1% (v/v) Tween-20 и 0,1% (w/v) Н-додецил β-D-maltoside) на 4 ° C на 16 h.
- Инкубируйте в PBS с 0,5% (v/v) Тритон X-100 решения и человеческих антител OCT3/4 (мыши IgG) при 4 ° C для 16 h.
- Инкубируйте в блокирующем буфере с Грин Люминесцентная краска меченых осла анти мыши IgG (H + L) при 37 ° C 60 мин.
- Инкубируйте в PBS с DAPI при 20 ° C за 30 мин.
- Замените PBS-DAPI PBS.
- Сохранить в массиве MACME, с 4 ° C до захвата изображений.
-
Видеосъемка (Рисунок 4)
- Отделите PDMS microfluidic структуры из массива MACME.
- Удаление остаточных PBS из массива MACME, применить 90%(v/v) глицерина в PBS в клетки и место coverslips над окрашенных клеток.
- Установите пластину вниз на сцене Перевернутый флуоресцентным микроскопом.
- Приобрести 12-битные цветные изображения автоматически с использованием всех моторизованных компонентов (этап, затвора, фильтров и систем фокус), которые были под контролем микроскопа изображений.
Примечание. В этом протоколе, времени экспозиции корректируются, чтобы достичь возле значения максимальной интенсивности (высокая интенсивность пикселя: 4096), но нулевая насыщенность, для каждого изображения, DAPI, OCT4, Annexin V и EdU.
-
Обработка изображений, компьютер экскурсии и флуоресценции сигнал количественной оценки (Рисунок 5)
Примечание: следующие ячейки анализ изображений осуществляется на ранее описанных метод37.- Преобразование цветного изображения в оттенки серого.
- Вычислить одно пороговое значение для каждого DAPI изображения с помощью метода Оцу и классифицировать пикселей выше порога переднего плана и ниже как фон. Убедитесь, что значение foreground соответствует интенсивности флуоресценции DAPI.
Примечание: Процесс анализа изображения содержит 5 шагов; идентификация первичных объектов в DAPI изображения, идентификация вторичных объектов в OCT4 и Annexin V, EdU изображения, соответственно и измерение интенсивности объекта. Рисунок 3 обеспечивает изображения графического интерфейса пользователя (GUI) на настройки обработки изображений. - Измерьте флуоресцентного света OCT4 и EdU на каждом изображении.
- Определить регион, окрашенных с Annexin V метод распространения и количественного определения интенсивности флуоресценции.
-
3.4. Статистический анализ для визуализации отдельных клеточных фенотипов на одну ячейку изображений
- Нормализовать входные флуоресцентные интенсивности каждого фенотипических маркеров, центрирование и масштабирование эти переменные, чтобы дать им равный вес.
- Самоорганизующаяся карта (SOM) анализ с использованием программного обеспечения среды для статистических вычислений и графики, как описано в предыдущих исследованиях38,39.
- Создание 25 сом узлы с отличительной четыре «Справочник кодов векторов» соответствует флуоресцентного света четырех маркеров, DAPI, Эду, Annexin V и OCT4.
- Отдельные ячейки в каждом микроокружения назначить узел «победы» (наиболее близок) и сюжет как ячейки частоты, согласно которому таблица кодов векторов победы узла обновляются с использованием средневзвешенной, где вес — коэффициент обучения (здесь, как 0.05 значение по умолчанию).
Примечание: Исключить данные из камер, содержащих менее чем 1000 ячеек, поскольку наборы данных, содержащие несколько ячеек не предоставляют статистически значимые результаты сом.
- Выполняйте без присмотра иерархическая кластеризация с СОМ узел значения с помощью метода среднего связь, основанный на корреляции Пирсона кластеризации программного обеспечения40.
- Отображают кластеризации данных дендрограмма и heatmap просмотров41.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
MACME массивы: проектирование и изготовление: В сочетании с технологией нановолокно мы использовали microfluidic клеточной культуры и проверки методов, используемых ранее определить оптимальные условия для hPSC самообновлению или дифференциация35,36 (рис. 1). Это хорошо подходит для создания надежных высокой пропускной способностью на основе ячеек анализов потому что клетки культуры камер и условия точно контролируемый и расширяемая42,,4344. Здесь в массив нановолокно был подготовлен простой нановолокно методом осаждения, electrospinning с 3D-печати маски. Microfluidic часть было изготовлено с 3D-печатные формы легко разрабатывать структуру камеры через много проб и ошибок. Массив MACME был построен путем объединения двух частей и содержит 48 сред, предоставляя различные биофизических и биохимических сигналов различной комбинации обоих нановолокно ECMs (3 типа нановолокно материалов и 4 различные плотности или 4 управления Матрица белков) и ячеек взаимодействий (3 диапазона начальной плотности заполнения ячейки) как показано на рисунке 2.
Оценки общего воздействия нановолокно свойства и сотовых плотности на Госкомсанэпиднадзором фенотипов: После культуры клеток на MACME массив и на табличке флуоресцентные окрашивание (рисA) одноклеточных измерения проводились с полученных изображений. Для сравнения, однородности и неоднородность уровней выражения для четырех фенотипических маркеров в каждом наборе данных, этот протокол используется сом анализ38,39, который преобразует высокой мерных, многопараметрических наборов данных в низкоразмерных 2D карты. Примечательно результаты PS нановолокон и 2DGT матрицы были исключены из этого анализа, учитывая, что большинство клеток не придерживались. Кроме того исключаются из этого анализа были эти эксперименты с низкой CD, где клетки не имеют достаточно прямой (например, juxtacrine) или косвенные (паракринными) взаимодействия, чтобы выжить. После анализа сом неконтролируемой иерархической кластеризации была выполнена для СОМ узлов всех анализируемых образцов (Рисунок 6B). Рассматривая высоту дендрограмма кластера, фенотипические различия позволило нам классифицировать образцы на три группы: Группа i, большая часть образца ниши, состоящий из нановолокон GT, MG_HighCD и VN_HighCD; Группа ii, образцы, содержащие GT nanofibers (GT_XLow и MidNF_MidCD), MG_MidCD или VN_MidCD; и iii групп, все образцы PMGI_NF.
Изучение различий между группами, мы рассмотрели один репрезентативной выборки из каждой группы (рис. 6C; Группа i-GT_MidNF_HighCD, Группа ii-GT_MidNF_MidCD и группы iii-PMGI_MidNF_HighCD). С точки зрения OCT4 сигналов все группы показали выражение выше чем у мг (MG_MidCD). Группа, которую я характеризовалась высокой EdU сигналов, указав, что большинство клеток активно пролиферирующих. Таким образом микросреды в группе я были охарактеризованы как условий, пригодных для обслуживания hPSC, потому что недифференцированные hPSCs обычно размножаются быстро когда разрыв фазы клеточного цикла были сокращен45,46.
GT_MidNF_HighCD и GT_MidNF_MidCD отличаются их собственный начальной плотности клеток загрузки. Высокая первоначальная клеточная плотности увеличение клеток возможности взаимодействовать с соседних клеток, которые расширение их выживания и распространения47. Клетки осеменены на недостаточно Начальная плотность (3.0 × 104 клетки/см2) выжили ни росла в течение экспериментального периода (4 дня). Поэтому мы не включают эти образцы в SOM анализа; число клеток были ниже отсечения 1000 живых клеток/камеры. Клетки на 2DGT леса также были отнесены к группе ii клетки; Эти условия не поддерживают hPSC самообновлению48. GT_MidNF_MidCD клетки EdU сигнал был потерян и Annexin V уровни были слегка увеличились, что клетки потеряли их stemness и постепенно стала apoptotic. PMGI_MidNF_HighCD, который представляет микросреды, включающий PMGI нановолокно матрицы, показал большие вариации в OCT4 и EdU сигналов, по сравнению с другими условиями.
Рисунок 1 . Скрининг стратегии для выявления оптимального клеточного микросреды для регулирования клеточных функций. (A) Обзор компонентов массива мультиплексированных искусственных сотовой микроокружения (MACME). Массив состоит из двух основных частей: нановолокно кровати узором на подложке базальную (нановолокно массив) и полидиметилсилоксана (PDMS)-на основе microfluidic структуры. Массив MACME возможность подготовить нановолокно ECMs с целым рядом функций (т.е., материалы нановолокно и плотности) и различных клеток, заполнение плотности. PDMS microfluidic структура массива MACME есть три microfluidic канальный высот (250, 500 и 1000 мкм) для регулирования Начальная плотность заполнения ячейки. (B) влияние сотовых микросреды на ячейку фенотипов количественно оценивается с помощью assay одной ячейки на основе изображений и анализа статистических данных, Самоорганизующаяся карта (SOM) следуют иерархической кластеризации. Эта цифра была адаптирована из49 ссылка с разрешения от Wiley. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 . Дизайн в массив MACME. (A) Накладные расходы и крутонаклонные снимки всего массива MACME и концептуальная схема microfluidic канал (голубой) на матрицу нановолокно (розовый). Каждый канал состоит из 700 мкм и 8,4 мм длиной культуры палаты и два отверстия для введения среднего и клеток. (B) Сравнение размеров клеток и нановолокно матрицы. Высоты ячеек и нановолокно кровати в диапазоне от 1-3 мкм и 0,05-5,0 мкм, соответственно. (C) площадью поперечного сечения для каждого канала microfluidic с высотой 250/500/1000 мкм. Клетки и нановолокно кровати представлены как синие круги и оранжевой линии, соответственно. Каждая палата имеет одинаковую ширину и длину но различных высот (250, 500 и 1000 мкм), и объем каждой камеры 1.6, 3.2 и 6.4 мкл, соответственно. Черный прямоугольник пунктирным в Рисунок 2C обозначает Рисунок 2B. Рисунок 2 был адаптирован от49 ссылка с разрешения от Wiley. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 . Изготовление MACME массива. (A) изготовление нановолокно массива. Кучность несколько нановолокно матрицы на плите была исполнена модифицированных electrospinning, используя набор масок, принимая рисунком отверстий. Платина покрытием была выполнена для облегчения нановолокно осаждения на пластиковые опорной плиты. Маски с различных отверстий были подготовлены 3D-принтер. После маскировки платины покрытием площади пластины, пластины маска набор был поставлен на экране коллекции, и нормальной electrospinning была выполнена. Первоначальный nanofibers были сформированы в Pt покрытием позициях на плите через отверстия в маске. Дополнительные нановолокно кровати были сфабрикованы на плите, заменив существующие маски и повторить процедуру. (B) изготовление microfluidic структуры. Плесень, напечатаны на 3D принтере с УФ отверждаемыми смола форме PDMS слой microfluidic устройства. После отливки, MACME массив был собран, прикрепив на основе PDMS microfluidic слой с поверхности активированный нановолокно массива. Рисунок 3 был адаптирован от49 ссылка с разрешения от Wiley. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 . Изображения графических пользовательских интерфейсов (GUI) для приобретения микроскопических изображений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5 . Изображения графических пользовательских интерфейсов (GUI) компьютера руководствуясь изображения обработки для одноклеточных фенотипирование. Процесс анализа изображения содержит 5 шагов; (A) Определение первичных объектов в DAPI изображения, (B-D) идентификация вторичных объектов в OCT4, Annexin V и EdU изображений, соответственно и измерение интенсивности объекта. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6 . Фенотип и классификация фенотипов H9 ЭСК изменены microenvironmental факторами. (A) Immunofluorescent изображения H9 ЭСК, культивируемых в высокой плотности первоначального посева на основе нановолокон желатин (GT) (GT_HighNF_HighCD), окрашенных с три сотовых фенотипические маркеры (OCT4, плюрипотентности; Эду, пролиферации; Annexin V, апоптоза) и DAPI для клеточных ядер. (B) A heatmap и dendrograms без присмотра иерархической кластеризации. Протестированных микросреды были разбиты на три группы с характерными особенностями, основанный на схожести фенотипов. Группа, я включил nanofibers GT, MG_HighCD и VN_HighCD. Ii Группа состояла из образцов nanofibers GT (GT_XLow и MidNF_MidCD), MG_MidCD, или VN_MidCD. Все образцы PMGI_NF были объединены в группы iii. В heatmap розовые и голубые цвета свидетельствуют о высоких и низких сотовых частот в SOM количество участков, соответственно. (C) распределение количественных маркер выражения уровня 1000 ячеек в одной репрезентативной выборки из каждой группы (группы i-GT_MidNF_HighCD, Группа ii-GT_MidNF_MidCD и группы iii-PMGI_MidNF_HighCD). 25 и 75-й процентили были указаны как поле пределов. Усы распространяется на 1,5 раза межквартильный диапазон от 25 и 75-й процентили. Эксперименты были повторяется три раза для каждой группы. Рисунок 6 A-C были адаптированы из49 ссылка с разрешения от Wiley. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Имя | Длина канала (мм) | Ширина канала (мкм) | Высота канала (мкм) | Диаметр входа/выхода (мкм) | Высота входа/выхода (мкм) | Плесень Длина (мм) | Ширина заготовки (мм) | Плесень высота (мм) |
| Плесень | 8.4 | 700 | 250/500/1000 | 800 | 3000 | 127.76 | 85.48 | 14.35 |
| Имя | Толщина (мкм) | Длина отверстия (мм) | Ширина отверстия (мм) | Длина маски (мм) | Маска-ширина (мм) | Плесень высота (мм) | Строка смещение (мм) | Смещение столбца (мм) |
| Маска | 1000 | 6 | 5 | 123.5 | 80.2 | 14.35 | 11.24 | 14.38 |
Таблица 1. Размеры формы для microfluidic структуры и маска для патронирования нановолокно.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол демонстрирует первый метод скрининга для создания системы надежных культуры для поддержания квалифицированных hPSCs. Во-первых мы описали как подготовить платформу, показывая различные искусственные ECMs и клеток, заполнение плотности, используя microfluidic устройства, интегрированные с нановолокно массив, массив MACME. Во-вторых, количественных на основе образа одноклеточных фенотип был выполненных50 для оценки отдельных клеточных Итоги и изменены различные биохимические и биофизические характеристики поведения. В этом протоколе окружающей среды, состоящей из позитивного управления ECM белков в условиях высокой начальной ячейки, плотность посева и GT нановолокно характеризовалась черты недифференцированные государства; быстрое распространение45 и стабильной OCT4 выражение51. Это наблюдение указал, что молекулярные механизмы, связанные с «клеток внеклеточная матрица» и «ячеек» взаимодействия могут повлиять на плюрипотентности hPSCs.
Эта стратегия может настраиваться с учетом цели пользователя. Например ячейка манипуляции и пропускная способность может быть отрегулирован для целого ряда экспериментальных параметры повторное проектирование формы и узоры microfluidic структуры. Как еще один способ для улучшения пропускной способности входным и выходным отверстием позиции каждой камеры разработаны в соответствии с Гонав стандартных 96-луночных плит, стандартизированные общества биомолекулярных наук; Таким образом автоматизированный робот жидкого мыла может использоваться для высокопроизводительного скрининга. Продолжить изучение молекулярного механизма, касающегося «Взаимодействия ячейки ECM», искусственные сотовой микросреды можно сделать более точно имитировать условия в естественных условиях , химически изменяя nanofibers с сигнальных молекул52 .
На сегодняшний день, большинство платформ, разработанных для скрининга сотовой микросреды были направлены на скрининг растворимых факторов (например, факторы роста и химических соединений)42,,4344, но не нановолокно ECMs вследствие трудности в сочетании методов собственный изготовления. Например лист нановолокно производит небольшой зазор между структурой microfluidic и опорной плиты и вызывает их нестабильным склеивание, что приводит к перекрестного загрязнения между различными образцами, потому что культура среднего смешивают с другой камере через небольшой зазор. Наш новый метод позволяет простое и точное изготовление матриц нановолокно на конкретных участках и позволяет их прямого связывания с плите, которая предотвращает нестабильной склеивание и перекрестное загрязнение. Кроме того несколько платформ53 интегрирована с микрофлюидика и нановолокно матрицы были доступны для систематического манипуляции химические и физические сигналы для изучения их влияния на функции клеток, потому что технологии необходимые для интеграции были весьма сложными. Наши одноклеточных профилирования с массивом MACME могут быть выполнены с легко достижимым аппарат и простых методов и имеет большой потенциал для использования в моделировании клеточной среды для развития и клеточной биологических исследований и лекарств / скрининг.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет.
Acknowledgments
Мы благодарим проф. н. Nakatsuji iCeMS, Университет Киото, для обеспечения человеческих клеток ES. Мы также благодарим профессора A. Маруяма в Токийском технологическом институте за его поддержку в использовании атомно-силового микроскопа. Щедро финансировались японского общества для содействия развитию науки (страниц JSP; 22350104, 23681028, 25886006 и 24656502); финансирование было также предоставлено новой энергии и организация развития промышленных технологий (NEDO) и Фондом Terumo науки о жизни. WPI-iCeMS поддерживается мир премьер международного исследовательский центр инициативы (ИЗВ), Министерство образования, культуры, спорта, науки и техники (МПКСНТ), Япония. Часть этой работы была поддержана центром нанотехнологий университета Киото и аист нано-перерабатывающего завода в «Нанотехнологии платформы проекта «авторами МПКСНТ, Япония.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polystyrene (PS) | Sigma | #182435 | Average Mw: 290,000, average Mn: 130,000 |
| Polymethylglutarimide (PMGI) | MicroChem | G113113 | |
| Gelatin (GT) | Sigma | G2625 | From porcine skin, type A |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Doe Corning Toray | #1064291 | PDMS curing agent and silicone elastomer base are components of this kit. |
| OpenSCAD | This is a free 3D computer graphics software (http://www.openscad.org/) used for designing the mold of the microfluidic device. | ||
| AutoCAD 2014 | Autodesk | This is a 3D computer graphics software (https://www.autodesk.com/products/autocad/overview) used for design of the mask used on nanofiber-array preparation. | |
| 3D printer, AGILISTA-3000 | Keyence | ||
| UV-curable resin, AR-M2 | Keyence | This is used for 3D printing by Agilista. | |
| Acetic acid | Sigma | #338826 | ≥99.99% |
| Ethyl acetate | Sigma | #270989 | Anhydrous, 99.8% |
| Tetrahydrofuran (THF) | Sigma | #401757 | |
| MSP-30T | Vacuum Device | Magnetron sputtering machine | |
| Nunc OmniTray | Thermo Fisher Scientific | #242811 | This is a polystyrene baseplate on which the nanofiber array is created. This plate size is typically 127.7 x 85.5 mm. |
| Gun-type corona discharge machine | Shinko Electric & Instrumentation | CFG-500 | This handy device is used to generate corona for activation of the bottom surface of the PDMS layer at step 1.5 "Assembly of the MACME arrays" in the protocol. |
| 5 mL syringe | Terumo | SS-05SZ | |
| Stainless-steel blunt needle (23-gauge) | Nipro | #2166 | Outside diameter and length are 0.6 and 32 mm, respectively. |
| High-voltage power supply | TechDempaz | ||
| 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide, hydrochloride | Dojindo | W001 | |
| N-Hydroxysuccinimide | Sigma | #56480 | |
| Matrigel hESC-Qualified Matrix | Corning | #354277 | This protein is refered as basement membrane gel matrix in the protocol. |
| CellAdhere Vitronectin, Human, Solution | STEMCELL Technologies | #07004 | |
| TeSR-E8 | STEMCELL Technologies | #05940 | Feeder-free, xeno-free culture medium for maintenance of human ES and iPS cells |
| Y-27632 | Wako Pure Chemical Industries | #253-00513 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red | Thermo Fisher Scientific | #12605028 | This ia a recombinant trypsin-like protease for dissociation of adherant mammalian cells. |
| Click-iT EdU Imaging Kit with Alexa Fluor 647 Azides | Thermo Fisher Scientific | C10086 | The fluorescent labeling of proliferating cells in on-plate fluorescent staining was performed along the product manual of this kit. |
| Annexin V, Alexa Fluor 594 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A13203 | |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Oct-3/4 Antibody (C-10) | Santa Cruz Biotechnology | sc-5279 | |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (DyLight 488) | abcam | ab96875 | This is a secondary antibody used in on-plate fluorescent cell staining. |
| ECLIPSE Ti-E | Nikon | This is an inverted fluorescence microscope equipped with a CFI Plan Fluor 4×/0.13 N.A. objective lens (Nikon), CCD camera (ORCA-R2, Hamamatsu), mercury lamp (Intensilight, Nikon), XYZ automated stage (Ti-S-ER motorized stage with encoders, Nikon), and filter cubes for four fluorescence channels (DAPI, GFP HYQ, TRITC, Cy5; Nikon) | |
| NIS-Elements Advanced Research | Nikon | This is a microscope imaging software used for automatic image acquisition. | |
| CellProfiler, Version 2.1.0 | This is a free open software for cell image analysis (http://cellprofiler.org/). | ||
| R | SOM analysis is performed by kohonen package of this software. This is freely available (https://www.r-project.org/). | ||
| Cluster 3.0 | This is the open source clustering software (http://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster/software.htm). Unsupervised hierarchical clustering is performed with this software. | ||
| Java TreeView | This open source software (http://jtreeview.sourceforge.net/) is used to visualize clustering data as a heatmap and a dendrogram. | ||
| H9 human embryonic stem cell | WiCell Stem Cell Bank | WA09 |
References
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Ameen, C., et al. Human embryonic stem cells: Current technologies and emerging industrial applications. Crit Rev Oncol Hematol. 65 (1), 54-80 (2008).
- Nishikawa, S., Goldstein, R. A., Nierras, C. R. The promise of human induced pluripotent stem cells for research and therapy. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (9), 725-729 (2008).
- Robinton, D. A., Daley, G. Q. The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy. Nature. 481 (7381), 295-305 (2012).
- Sartipy, P., Bjorquist, P., Strehl, R., Hyllner, J. The application of human embryonic stem cell technologies to drug discovery. Drug Discovery Today. 12 (17-18), 688-699 (2007).
- Discher, D. E., Mooney, D. J., Zandstra, P. W. Growth factors, matrices, and forces combine and control stem cells. Science. 324 (5935), 1673-1677 (2009).
- Joyce, J. A., Pollard, J. W. Microenvironmental regulation of metastasis. Nat Rev Cancer. 9 (4), 239-252 (2009).
- Danhier, F., Feron, O., Preat, V. To exploit the tumor microenvironment: Passive and active tumor targeting of nanocarriers for anti-cancer drug delivery. J Control Release. 148 (2), 135-146 (2010).
- Murphy, W. L., McDevitt, T. C., Engler, A. J. Materials as stem cell regulators. Nat Mater. 13 (6), 547-557 (2014).
- Patel, A. K., et al. A defined synthetic substrate for serum-free culture of human stem cell derived cardiomyocytes with improved functional maturity identified using combinatorial materials microarrays. Biomaterials. 61, 257-265 (2015).
- Zhang, R., et al. A thermoresponsive and chemically defined hydrogel for long-term culture of human embryonic stem cells. Nat Commun. 4, (2013).
- Anderson, D. G., Putnam, D., Lavik, E. B., Mahmood, T. A., Langer, R. Biomaterial microarrays: rapid, microscale screening of polymer-cell interaction. Biomaterials. 26 (23), 4892-4897 (2005).
- Celiz, A. D., et al. Discovery of a Novel Polymer for Human Pluripotent Stem Cell Expansion and Multilineage Differentiation. Adv Mater. 27 (27), 4006-4012 (2015).
- Hansen, A., et al. High-Density Polymer Microarrays: Identifying Synthetic Polymers that Control Human Embryonic Stem Cell Growth. Adv Healthcare Mater. 3 (6), 848-853 (2014).
- Mei, Y., et al. A high throughput micro-array system of polymer surfaces for the manipulation of primary pancreatic islet cells. Biomaterials. 31 (34), 8989-8995 (2010).
- Saha, K., et al. Surface-engineered substrates for improved human pluripotent stem cell culture under fully defined conditions. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (46), 18714-18719 (2011).
- Bettinger, C. J., Langer, R., Borenstein, J. T. Engineering substrate topography at the micro- and nanoscale to control cell function. Angew Chem Int Ed Engl. 48 (30), 5406-5415 (2009).
- McMurray, R. J., et al. Nanoscale surfaces for the long-term maintenance of mesenchymal stem cell phenotype and multipotency. Nat Mater. 10 (8), 637-644 (2011).
- Sun, Y., Jallerat, Q., Szymanski, J. M., Feinberg, A. W. Conformal nanopatterning of extracellular matrix proteins onto topographically complex surfaces. Nat Methods. 12 (2), 134-136 (2015).
- Nitanan, T., et al. Effects of processing parameters on morphology of electrospun polystyrene nanofibers. Korean J Chem Eng. 29 (2), 173-181 (2012).
- Liu, L., et al. Chemically-defined scaffolds created with electrospun synthetic nanofibers to maintain mouse embryonic stem cell culture under feeder-free conditions. Biotechnol Lett. 34 (10), 1951-1957 (2012).
- Liu, L., et al. Nanofibrous gelatin substrates for long-term expansion of human pluripotent stem cells. Biomaterials. 35 (24), 6259-6267 (2014).
- Kamei, K., et al. Phenotypic and transcriptional modulation of human pluripotent stem cells induced by nano/microfabrication materials. Adv Healthcare Mater. 2 (2), 287-291 (2013).
- Peerani, R., et al. Niche-mediated control of human embryonic stem cell self-renewal and differentiation. EMBO J. 26 (22), 4744-4755 (2007).
- Yamamoto, K., et al. Fluid shear stress induces differentiation of Flk-1-positive embryonic stem cells into vascular endothelial cells in vitro. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 288 (4), 1915-1924 (2005).
- Charati, S. G., Stern, S. A. Diffusion of gases in silicone polymers: Molecular dynamics simulations. Macromolecules. 31 (16), 5529-5535 (1998).
- Prado-Lopez, S., et al. Hypoxia promotes efficient differentiation of human embryonic stem cells to functional endothelium. Stem Cells. 28 (3), 407-418 (2010).
- Yanagihara, K., et al. Prediction of Differentiation Tendency Toward Hepatocytes from Gene Expression in Undifferentiated Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cells and Development. 25 (24), 1884-1897 (2016).
- Kamei, K., et al. 3D printing of soft lithography mold for rapid production of polydimethylsiloxane-based microfluidic devices for cell stimulation with concentration gradients. Biomed Microdevices. 17 (2), (2015).
- Song, J. H., Kim, H. E., Kim, H. W. Production of electrospun gelatin nanofiber by water-based co-solvent approach. J Mater Sci Mater Med. 19 (1), 95-102 (2008).
- Owen, M. J., Smith, P. J. Plasma Treatment of Polydimethylsiloxane. J Adhes Sci Technol. 8 (10), 1063-1075 (1994).
- Chen, G. K., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nat Methods. 8 (5), 424-476 (2011).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25 (6), 681-686 (2007).
- Kamei, K., et al. An integrated microfluidic culture device for quantitative analysis of human embryonic stem cells. Lab Chip. 9 (4), 555-563 (2009).
- Kamei, K., et al. Microfluidic image cytometry for quantitative single-cell profiling of human pluripotent stem cells in chemically defined conditions. Lab Chip. 10 (9), 1113-1119 (2010).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7 (10), 100 (2006).
- Kohonen, T. Self-Organized Formation of Topologically Correct Feature Maps. Biol Cybern. 43 (1), 59-69 (1982).
- Wehrens, R., Buydens, L. M. C. Self- and super-organizing maps in R: The kohonen package. J Stat Softw. 21 (5), 1-19 (2007).
- Eisen, M. B., Spellman, P. T., Brown, P. O., Botstein, D. Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (25), 14863-14868 (1998).
- Saldanha, A. J. Java Treeview--extensible visualization of microarray data. Bioinformatics. 20 (17), 3246-3248 (2004).
- Du, G. S., Fang, Q., den Toonder, J. M. J. Microfluidics for cell-based high throughput screening platformsd-A review. Anal Chim Acta. 903, 36-50 (2016).
- Huang, S. B., et al. An integrated microfluidic cell culture system for high-throughput perfusion three-dimensional cell culture-based assays: effect of cell culture model on the results of chemosensitivity assays dagger. Lab Chip. 13 (6), 1133-1143 (2013).
- Wang, B. L., et al. Microfluidic high-throughput culturing of single cells for selection based on extracellular metabolite production or consumption. Nat Biotechnol. 32 (5), 473 (2014).
- Becker, K. A., et al. Self-renewal of human embryonic stem cells is supported by a shortened G1 cell cycle phase. J Cell Physiol. 209 (3), 883-893 (2006).
- Neganova, I., Lako, M. G1 to S phase cell cycle transition in somatic and embryonic stem cells. J Anat. 213 (1), 30-44 (2008).
- Fox, V., et al. Cell-cell signaling through NOTCH regulates human embryonic stem cell proliferation. Stem Cells. 26 (3), 715-723 (2008).
- Xu, C., et al. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 19 (10), 971-974 (2001).
- Kamei, K., et al. Microfluidic-Nanofiber Hybrid Array for Screening of Cellular Microenvironments. Small. 13 (18), (2017).
- Sun, J., et al. A Microfluidic Platform for Systems Pathology: Multiparameter Single-Cell Signaling Measurements of Clinical Brain Tumor Specimens. Cancer Res. 70 (15), 6128-6138 (2010).
- Theunissen, T. W., Jaenisch, R. Molecular Control of Induced Pluripotency. Cell Stem Cell. 14 (6), 720-734 (2014).
- Yoo, H. S., Kim, T. G., Park, T. G. Surface-functionalized electrospun nanofibers for tissue engineering and drug delivery. Adv Drug Del Rev. 61 (12), 1033-1042 (2009).
- Dixon, J. E., et al. Combined hydrogels that switch human pluripotent stem cells from self-renewal to differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (15), 5580-5585 (2014).
