Summary
Bu makalede, bir Multiplexed yapay hücresel MicroEnvironment (MACME) dizi taklit eden vivo içinde hücresel microenvironments fiziksel ve kimyasal yüksek üretilen iş manipülasyonu ipuçları ve için hazırlamak için ayrıntılı metodolojisi insan pluripotent kök hücreler (hPSCs) için en iyi hücresel ortam tek hücreli profil oluşturma ile tanımlayın.
Abstract
Hücresel microenvironments büyüme faktörleri, hücre dışı matrisler ve hücreler arası etkileşimleri gibi yardımlar çeşitli oluşur. Bu cues de orkestra ve canlı bir sistem içinde hücre fonksiyonları düzenlenmesinde önemlidir. Her ne kadar bir dizi araştırmacılar çevresel faktörler ve istenen hücresel işlevler arasındaki ilişkiyi araştırmak için çalıştılar, pek bilinmeyen kalır. Bu büyük ölçüde bu tür çevre ipuçları vitrotaklit ve aynı anda farklı çevresel yardımlar hücreleri üzerinde test için uygun bir metodoloji eksikliği kaynaklanmaktadır. Burada, entegre bir platform mikrosıvısal kanalları ve yüksek-içerik tek hücre analizi, kök hücre fenotipleri farklı çevresel faktörler tarafından değiştirilmiş incelemek için ardından bir nanofiber dizi raporu. Bu platform uygulama göstermek için bu çalışma insan pluripotent kök hücreler (hPSCs) kendini sürekli yenileyen fenotipleri üzerinde duruluyor. Burada, bir Multiplexed yapay hücresel MicroEnvironment (MACME) dizi imalatı nanofiber dizi veya mikrosıvısal yapısı için hazırlık yordamlarını mevcut. Ayrıca, profil oluşturma, hücre birden çok floresan işaretleri, birden çok floresan görüntü ve istatistiksel analizler, boyama tek hücrenin genel adımlar açıklanmaktadır.
Introduction
İnsan pluripotent kök hücreler (hPSCs)1,2 unlimitedly kendi kendini yenilemek ve ilaç geliştirme, hücre tabanlı terapiler, doku mühendisliği ve rejeneratif tıp devrim olabilir çeşitli doku soy, ayırt etmek 3 , 4 , 5 , 6. genel kültür yemekleri ve microtiter levha, ancak, tasarlanmamıştır hücresel genişleme için kritik bir faktör olduğunu, kesin fiziksel ve kimyasal hücre manipülasyon ile sıra nano - için mikro-metre, hücresel düzeyde etkinleştirmek için kendini yenileme ve farklılaşma. Bu dezavantajı yönelik olarak çalışmalar hücre-kader karar ve hücre fonksiyonları4düzenlenmesinde hücresel microenvironments rolleri araştırdı. Son yıllarda, hücresel microenvironments vitro7,8yeniden oluşturmak için giderek artan sayıda çalışmalar yapılmıştır. Nano ve mikro imalat işlemleri bu microenvironments kimyasal9,10,11,12,13manipülasyonu yoluyla kurduk, 14,15,16,17 ve fiziksel18,19,20 çevre ipuçları. Şimdiye kadar sistematik olarak kimyasal ve fiziksel çevre yardımlar hücre-kader karar ve fonksiyonları içinde tek bir platform üzerinde temel mekanizmaları araştırmak için hiçbir raporlar vardı.
Burada, bir güçlü tarama platform (Şekil 1) kurmak için basit tasarım ilkelerine dayanan bir strateji tanıtmak. İlk olarak, çok yönlü, yapay hücresel microenvironments nanofiber dizi ve bir mikrosıvısal yapısı kullanarak oluşturmak için entegre bir platform geliştirme prosedürü açıklamak: Multiplexed yapay hücresel MicroEnvironment (MACME) dizi (Şekil 1A ve 2A). Nanofiber dizi nanofiber malzeme ve yoğunlukları farklı kombinasyonlarda 12 farklı microenvironments var. Electrospinning nanofibers imal etmek kullanıldı. Nanofiber malzemeleri, polistiren (PS)21, polymethylglutarimide (PMGI)22ve jelatin (GT)23, gibi hücre adezyon ve pluripotency ( bakımından etkileyebilecek kimyasal özelliklerini test etmek için tasarlanmıştır Şekil 2B). Nanofiber yoğunlukları çeşitli electrospinning zaman değiştirerek ve oluşturulan nanofibers onların yoğunlukları göre tanımlanmış (DNF, d = XLow/düşük/orta/yüksek). Mikrosıvısal yapısı 96-şey Mikroplaka standart boyut üzerinde konumlandırılmış olabilir 48 hücre kültürü chambers, yataklık polydimethylsiloxane (PDMS) oluşur. PDMS mikrosıvısal cihazlar24imal etmek genellikle kullanılan biyouyumlu ve gaz değiştirilebilen bir polimerdir. Her mikrosıvısal kanal 700-µm olarak tasarlanmıştır geniş ve 8.4 mm uzun ve kenarlarından (Tablo 1), iki giriş vardı. Odalar farklı yükseklikte vardı (250, 500 ve 1000 µm) hangi hayatta kalma, yayılması ve hPSCs25 farklılaşma ile ilişkilendirmek ilk hücre tohum yoğunlukları (0,3 0,6 ve 1,2 × 105 hücreleri/cm2), işlemek (Şekil 2C). Bir odaya seribaşı hücre sayısı sütun yoğunluğu odası kat yukarıda orantılıdır ve böylece ilk hücre yoğunluğu tohum kültür chambers ile farklı yükseklikte içine aynı hücre süspansiyon tanıtımı tarafından kontrol ediliyordu. Tüm kanallar ≥ 250-µm-yüksek26 hücreleri düşük oksijen gerginlik27 ve yamultma stres28 etkilerini en aza indirmek için tasarlanmıştır. 250, 500 ve 1000 µm kanal yüksekten burada kısaltılmış olarak XCD x = düşük, orta ve yüksek, anılan sıraya göre. Farklı nanofiber yoğunlukları ve ilk hücre tohum yoğunlukları ortamlarıyla "Material_NF density_Cell yoğunluğu" kısaltılmış (örneğin, GT_HighNF_HighCD: yüksek yoğunluklu GT nanofibers ve yüksek ilk hücre tohum ile karakterize bir ortam yoğunluk).
Daha sonra sistematik olarak hücre davranış çevresel faktörler (Şekil 1B) yanıt olarak araştırmak için tek hücreli çözümlemesi yapma nasıl açıklar. Bir kanıtı-of-concept olarak, biz en iyi hücresel ortam hPSC öz-yenileme, hangi hPSC bakım (Şekil 1B)29tuşu fonksiyonu tanımlanır. İstatistiksel analizler tarafından takip, yansıma tabanlı sitometresi bireysel hücresel fenotipik yanıt-e doğru hücresel ortamlar nicel yorumu sağlar. Çeşitli hücresel işlevler arasında bu kağıt hPSC öz-yenileme korumak için en uygun koşulları tanımlamak için detaylı bir yordam içermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. MACME dizi imalatı
Not: Tüm malzeme ve ekipmanları malzemeleri tabloda listelenir.
-
Nanofiber dizi ve bir kalıp bir mikrosıvısal yapısı için maskeler hazırlanması
- Üç boyutlu (3D) görüntüler nanofiber diziler ve 3D-Bilgisayar grafikleri yazılım paketleri (Tablo 1) kullanarak mikrosıvısal yapılar için kalıplar için kullanılan maskeler oluşturmak.
Not: 3D görüntü okumak ve bir 3D basımevinde. Yazdırılan maskeleri ve kalıp 1.1.1 bir adımda grafik yazılımı kullanılarak tanımlanmış 3D görüntülerle aynı boyutlara sahip. - Maskeleri ve bir 3D printerlere harcama maddeler kullanarak bu tasarımları dayalı bir kalıp yazdırın.
Not: Bu protokol için bir mürekkep jet gibi 3D printerlere harcama maddeler UV tedavi edilebilir reçine ile kullanılan30' du. Yazıcı çözünürlüğü 635 × 400 dpi ve x, 15 µm oldu Y ve Z, sırasıyla, ancak, gerçek X, Y çözünürlüğü yaklaşık dört kat daha düşük.
- Üç boyutlu (3D) görüntüler nanofiber diziler ve 3D-Bilgisayar grafikleri yazılım paketleri (Tablo 1) kullanarak mikrosıvısal yapılar için kalıplar için kullanılan maskeler oluşturmak.
-
Nanofiber-dizi hazırlık (Şekil 3A)
- Polimer çözümleri electrospinning için hazır olun.
- Tetrahydrofuran ile % 13 PMGI sıvı ile %9 (w/v)22oranında seyreltin.
- PS 0,08 gram dissolve (sayı ortalama molekül ağırlığı (Mn): 130.000) THF:dimethylformamide (1:1 hacim oranı)21ve birimin Son 1 mL (% 8 (w/v) PS çözüm) kadar getirmek için THF:dimethylformamide ekleyin.
- 0.1 g gt suda çözülür: asetik asit: etil asetat (1:1.6:2.1 hacim oranı) ve eklemek su: asetik asit: Etil Asetat olarak birimin Son 1 mL (% 10 (w/v) GT çözüm) kadar getirmek için açıklanan23,31.
- Makine SAÇTIRMA magnetron kullanın, electrospinning Kur içinde bir katot olarak hizmet veren bir Polistiren (PS) baseplate (127.7 × 85.5 mm), üzerinde 5-nm kalınlığında ince bir platin tabaka Kasası.
- 23-G paslanmaz çelik künt iğne ile donatılmış bir 5 mL şırınga içine her Polimer çözüm yükleyin.
- Yer ve çapa 12-cm toplayıcı electrospinning cihazın dışında bir şırınga pompa iğne şırınga.
- Şırınga iğne yüksek voltajlı güç kaynağına bağlayın ve 11'e uygulamak için ayarla kV.
- 0.2 mL/h pompalama hızını ayarlayın.
- Sıcaklık ve nem 30 ° C ve < %30 (v/v) tutmak.
- 1.2.2 adımda hazırlanan baseplate maskeyi tak.
- Electrospinning zaman değiştirerek farklı yoğunlukları ile maske deliklerden baseplate üzerinde nanofibers imal (örneğin, 20, 60, 90 ve 180 s).
- Maskeyi baseplate kaldırın.
Not. Etanol electrospun GT nanofibers GT nanofibers maskesi ile birlikte kapalı soyulması önlemek için maskeyi çıkarmadan önce püskürtülür. - Adım 1.2.4-1.2.10 nanofiber-dizi imalat tamamlanması kadar yineleyin.
- Nanofiber dizi 16 h için 25 ° C'de bir desiccator içinde kalan solvent buharlaşır için yerleştirin.
- 0.2 M 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hidroklorid (EDC) ve 0.2 M N-hydroxysuccinimide (NHS) 4 h2325 ° C'de etanol içinde Crosslink GT nanofibers.
- 16 h için 25 ° C'de GT nanofibers iki kez %99,5 (v/v) etanol ve vakum-kuru ile yıkayın.
- Polimer çözümleri electrospinning için hazır olun.
-
İmalat mikrosıvısal yapıları (Şekil 3B)
- Ajan ve PDMS Bankası 20 g kür PDMS 2 g mix (1:10 ağırlık oranı; Pre-PDMS). 24
- 1.2. adımda fabrikasyon kalıp üzerine pre-PDMS karışımı dökün.
- Bir desiccator 30 dk için pre-PDMS karışımı de-gaz.
- Pre-PDMS karışımı için 16 h 65 ° c fırında tedavi.
-
MACME derleme diziler (Şekil 3B)
- Adımda 1.3.4 kalıp ve temiz %70 (v/v) etanol ile tedavi PDMS yapısı akasındaki.
- Atmosferik corona deşarj PDMS yapısı32alt tarafında tedavi.
Not: Bu protokol için corona bir katman 3 veya 4 kez bir "Kullanışlı" corona deşarj aparatı ile tüm yüzeyi serbesttir. Oksijen Plazma tedavi atmosferik corona deşarj ile yüzey adhesiveness değiştirmek için değiştirildi. - Nanofiber dizi PDMS yapısıyla hızlı bir şekilde bir araya getirin.
- Fırın-65 ° C de 2 gün boyunca pişir.
2. yükleme hESCs MACME diziye
- Xeno-Alerjik hücrelerde kimyasal olarak kültür orta (hPSC orta olarak adlandırılır) 10 µM Y-27632 ROCK inhibitörü34 35-mm hücre kültürü ile takıma hPSC bakım33 için tanımlanan H9 insan embriyonik kök hücreleri (hESCs) rutin kültür için korumak çanak membran jel matris (MG) ile kaplı.
- Geçiş hücreleri her 4-7 gün rekombinant tripsin benzeri proteaz kullanarak.
- MACME dizi ile % 99.5 etanol, salonları 10 min için yükleme tarafından sterilize ve etanol kaldırın. Bu işlemi 3 kez tekrarlayın.
- Mg, 10 µg/mL vitronectin (VN), 12 µL tanıtmak ve %0,1 (w/v) GT denetimine chambers kültür ve odaları odası yüzeylerde kat 1 h için 37 ° C'de kuluçkaya.
Not: Bu protokol için MG, VN ve GT başvuru proteinler hücre adezyon ve kültür olarak seçildi. Çünkü MG ve VN hPSC öz-yenileme korumak için kullanılan standart hücre kültürü matrisler olumlu denetim kullanılır; iki boyutlu GT kaplama (2DGT) ya da non-kaplama (NC) negatif denetimler olarak kullanılmıştır. - Önceden ısıtılmış hPSC orta MACME dizi tüm odaları tanıtmak. Salonları 37 ° C'de 30 dk için kuluçkaya
- Yıkama H9 hESC ile DPBS, 35 mm çanak üzerinde kültürlü rekombinant tripsin benzeri proteaz 0.5 mL yemek için ekleyin ve 1 dk. için 37 ° C'de kuluçkaya ve dikkatli bir şekilde sadece proteaz ile karışık supernatants Aspire edin.
Not: Aspirasyon aşamada hücreleri müstakil değil. - Yavaşça tekrar tekrar hücreleri ayırmak ve müstakil hücreleri 15 mL konik tüp aktarmak için çanak yüzeye karşı orta dağıtmak, hemen hPSC orta ekleyin.
- 3 dk. aspiratı süpernatant 200 x g, santrifüj kapasitesi ve önceden ısıtılmış hPSC orta hücrelerde askıya alma.
- Hücre süspansiyon (1,2 × 106 hücre/mL) 12 µL her mikrosıvısal odasına tanıtmak.
Not: Hücreleri bir odasına başka bir micropipette kullanarak tanıtmak. Odama seribaşı hücre sayısı odası kat yukarıda sütun yoğunluğu ile orantılı olduğundan, düz-se bile aynı hücre süspansiyon örnekleri kullanılmıştır ilk hücre tohum yoğunluğu denetlenebilecek. Pipetting nazikçe yapılır emin olun. Aşırı orta odalarından bir pamuk uçlu sopa yükledikten sonra kullanarak kaldırın. MACME dizi sık kullanılan laboratuvar Pipetler ve otomatik pipet sistemleri ile uyumludur ve herhangi bir özel ekipman gerektirmez. - HPSC orta her 12 h ve kültür için 4 gün değiştirin.
Not: Orta sabit birimler (1.6, 3.2 ve 6.4 µL) odaları farklı boyutlarda kullanılarak sürdürülür. Kültür hücreleri kesme hücre kültürü orta35,36alışverişi dışında stres en aza indirmek için statik bir koşul altında.
3. nicel tek hücreli profil oluşturma
-
Plaka üzerinde floresan hücre boyama
Not: hPSCs kendini sürekli yenileyen, fenotipik değişiklikler çözümlemek için bu iletişim kuralı için üç anahtar fenotipik işaretleri bu iletişim kuralı seçili: OCT4, 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) ve Annexin V pluripotency, yayılmasını önleme ve Apoptozis durumunu ölçmek için , sırasıyla (Şekil 2b). 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) hücre çekirdeği tanımlamak için kullanılır. Pluripotent kritik transkripsiyon faktörlerin OCT4 biridir.- H9 hESCs 30 dk 37 ° C'de 10 µM EdU alkin ile takıma hPSC orta MACME dizilerde kuluçkaya.
- Annexin-bağlama arabellek (10 mM HEPES (pH 7,4), 140 mM NaCl, 2.5 mM CaCl2) ile yıkadıktan sonra bir turuncu-floresan boya Annexin V eşlenik 15dk için 20 ° C'de hücrelerle leke.
- PBS hücrelerde 15dk için 20 ° C'de % 4 (v/v) paraformaldehyde ile düzeltmek ve PBS hücrelerle iki kez yıkayın.
- PBS ile % 0.3 (v/v) Triton X-100 16 h için 20 ° C'de kullanarak hücreleri permeabilize.
Not: Paraformaldehyde plastik taban plakası ve PDMS mikrosıvısal yapısı arasındaki bağı zayıflar. Böylece, dekolmanı adımda 3.2.1 diziden PDMS tabakasının da bu adımdan sonra gerçekleştirilir. - Kırmızı-floresan boya azid 30 dk 20 ° C'de önbellekle Tris tabanlı reaksiyon hücrelerde kuluçkaya.
- Engelleme arabellek (PBS ile %5 (v/v) normal keçi serum, %5 (v/v) normal eşek serum, %3 (w/v) Sığır serum albümin, % 0,1 (v/v) ara-20 ve %0.1 (w/v) N-Lauryl-β-D-maltoside) 16 h için 4 ° C'de hücrelerde kuluçkaya.
- %0,5 (v/v) Triton X-100 çözüm ile PBS ve insan OCT3/4 antikor (fare IgG) 16 h için 4 ° C'de kuluçkaya.
- Fareyle yeşil-floresan boya etiketli eşek Anti-IgG (H + L) 60 dk 37° C'de engelleme arabellekte kuluçkaya.
- PBS DAPI ile içinde 30 dk 20 ° C'de kuluçkaya.
- PBS-DAPI PBS ile değiştirin.
- 4 ° C'de MACME dizi resim alma kadar korumak.
-
Görüntü edinme (Şekil 4)
- MACME dizi PDMS mikrosıvısal yapısından akasındaki.
- Kalan PBS MACME diziden çıkarın, PBS 90%(v/v) gliserol hücrelere uygulayın ve coverslips lekeli hücrenin üzerine yerleştirin.
- Plaka baş aşağı bir ters floresans mikroskobu sahnede ayarlayın.
- 12-bit renkli görüntüler düşsel bilgisayar yazılımı mikroskop tarafından kontrol (sahne, filtreler, çekim hızı ve odak sistemleri) tüm motorlu bileşenleri kullanılarak otomatik olarak elde.
Not. Bu protokol için maksimum yoğunluk değerleri ulaşmak için pozlama süreleri ayarlanır (en yüksek piksel yoğunluğu: 4096), ama yok doygunluk, her görüntü, DAPI, OCT4, Annexin V ve EdU.
-
Bilgisayar destekli görüntü işleme ve floresan sinyal miktar (Şekil 5)
Not: aşağıdaki hücre görüntü analizi dayalı bir yukarıda açıklanan Yöntem37olarak gerçekleştirilir.- Renkli görüntüler gri tonlamaya dönüştürme.
- Otsu yöntemi ile her DAPI görüntü için bir tek eşik değerini hesaplamak ve piksel olarak ön plan ve aşağıda eşiğin sınıflandırmak arka plan olarak. Ön plan değeri DAPI floresan yoğunluğu uygun olmasını sağlamak.
Not: Görüntü analiz süreci 5 adım içerir; birincil nesneleri DAPI tanımlaması görüntüler, OCT4, Annexin V ve EdU görüntüleri, ikincil nesneler tanımlaması sırasıyla ve nesne yoğunluğu ölçümü. Şekil 3 görüntü işleme ayarda görüntüleri grafik kullanıcı arabirim (GUI) sağlar. - Her resmin üzerine OCT4 ve EdU yoğunluklarda floresan ölçmek.
- Annexin V ile yayılma yöntemi ile lekeli bölgeyi tanımlamak ve floresan yoğunluğu ölçmek.
-
3.4. istatistiksel analiz bireysel hücresel fenotipleri tek hücreli görüntüleme üzerinde görselleştirmek için
- Her fenotipik işaretçisi giriş floresan yoğunluklarda merkezleme ve eşit ağırlık vermeyi bu değişkenler ölçekleme normalleştirmek.
- Kendiliğinden organize harita (SOM) analizi istatistiksel bilgi işlem ve önceki çalışmalar38,39tarafından açıklandığı gibi grafik için bir yazılım ortamı kullanarak gerçekleştirin.
- "Dört işaretleri, DAPI, EdU, Annexin V ve OCT4 floresan yoğunluklarda karşılık gelen kendine özgü dört kitabında vektörel çizimler" ile 25 SOM düğümleri oluşturur.
- Her microenvironment tek tek hücreleri "kazanan" (en çok benzeyen) düğüme atamak ve arsa göre kazanan düğümün kitabında vektörel çizimler ağırlıklı ortalama ağırlığı öğrenme oranı nerede kullanarak güncelleştirilmiş hücre frekans (burada, 0,05 olarak varsayılan).
Not: Verileri veri kümeleri birkaç hücreleri içeren istatistiksel SOM sonuç vermedi çünkü az 1.000 hücreleri içeren odalarından dışarıda.
- Denetimsiz hiyerarşik kümeleme tarafından kümeleme yazılımı40Pearson korelasyon dayalı ortalama-bağlantı yöntemini kullanarak SOM-düğüm değerleri ile gerçekleştirin.
- Küme veri dendrogram ve heatmap sayısı41işlemek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
MACME diziler: tasarım ve üretim: Nanofiber teknolojisi ile birlikte, biz mikrosıvısal hücre kültürü ve önce hPSC öz-yenileme veya farklılaşma35,36 (Şekil 1) için en iyi koşulları tanımlamak için istihdam teknikleri eleme kullanılır. Bu hücre kültür odalar ve koşulları tam olarak kontrol edilebilir ve Genişletilebilir42,43,44olduğundan sağlam yüksek üretilen iş hücre tabanlı deneyleri oluşturmak için uygundur. Burada, nanofiber dizi basit nanofiber biriktirme yöntemi, 3D baskılı maske ile electrospinning tarafından hazırlanmıştır. Mikrosıvısal bölümü kolayca birçok denemeler ve hatalar ile odası yapısını tasarlamak için bir 3D baskılı kalıp ile fabrikasyon. MACME dizi iki bölümden birleştirerek inşa edilmiş ve her iki nanofiber ECMs (nanofiber malzemeler 3 tip ve 4 farklı yoğunlukları veya 4 denetimi değişik kombinasyonları farklı biyofiziksel ve biyokimyasal cues sağlayan 48 ortamları bulunan Matris proteinler) ve hücre-hücre etkileşimler (ilk hücre tohum yoğunluğu 3 aralıkları) olarak gösterildiği Şekil 2.
Genel etkileri nanofiber özellikleri ve hücresel yoğunluk hESC fenotipleri değerlendirilmesi: Bir MACME dizi ve plaka üzerinde (Şekil 6A) Floresan boyama hücre kültürü elde edilen görüntülerle tek hücreli ölçümleri yapıldı. Homojenliği ve ifade düzeyleri her veri kümesi dört fenotipik işaretçileri için heterojen karşılaştırmak için bu iletişim kuralı, yüksek boyutlu, multiparametric veri kümeleri içine dönüştüren SOM analiz38,39, kullanılan düşük boyutlu 2D haritalar. Özellikle, en hücreleri değil uygun verilen bu PS nanofibers ve 2DGT matrisler sonuçlarını bu analiz göz ardı. Ayrıca, bu analiz hariç bu deneylerin düşük CD ile nerede hücreleri yeterli doğrudan (örneğin, juxtacrine) veya hayatta kalmak için dolaylı (parakrin) etkileşimleri yoktu edildi. SOM analizi, denetimsiz hiyerarşik kümeleme tüm analiz örnekleri (Şekil 6B) SOM düğümleri için gerçekleştirildi. Küme dendrogram yüksekliği göz önünde bulundurarak, fenotipik farklılıklar izin bize örnekleri üç gruplar halinde kategorilere ayırmak: ı, GT nanofibers, MG_HighCD ve VN_HighCD; oluşan örnek nişler en grubu II, GT nanofibers (GT_XLow ve MidNF_MidCD), MG_MidCD veya VN_MidCD içeren örnekleri Grup; ve Grup III, tüm PMGI_NF örnekleri.
Gruplar arasındaki farklılıklar çalışmaya, biz (Şekil 6C; her gruptan bir temsilcisi örnek muayene Grup i-GT_MidNF_HighCD, Grup II-GT_MidNF_MidCD ve Grup III-PMGI_MidNF_HighCD). OCT4 sinyalleri açısından tüm grupları MG (MG_MidCD) daha yüksek bir ifadesi gösterdi. Grup en hücreleri aktif Proliferasyona belirten yüksek EdU sinyalleri tarafından karakterize edildi. Böylece, microenvironments ben karakterize koşulları hPSC bakım için uygun olarak hücre döngüsü boşluğu aşamada idi zaman farklılaşmamış hPSCs genellikle hızlı bir şekilde çoğalırlar çünkü grubunda45,46kısaltılmış.
GT_MidNF_HighCD ve GT_MidNF_MidCD tarafından farklı onların ilk hücre-yük yoğunlukları ayırt edilirler. Yüksek ilk hücre yoğunluğu hücrelerin onların hayatta kalma ve nükleer silahların yayılmasına karşı47gelişmiş komşu hücreleri ile etkileşimli çalışma fırsatı arttı. Bir yetersiz ilk yoğunluğuna (3.0 × 104 hücreleri/cm2) seribaşı hücreleri hayatta ne deneysel döneminde (4 gün) büyüdü. Bu nedenle, bu örnekler SOM analizi dahil değil; hücre sayıları 1000 canlı hücreler/odası cut-off vardı. 2DGT iskele hücrelerdeyse Ayrıca Grup II hücreler olarak kategorize edildi; Bu koşullar hPSC kendini yenileme48desteklenmez. GT_MidNF_MidCD hücreleri EdU Sinyal kaybedildi ve Annexin V düzeyleri biraz, hücreleri kendi stemness kaybetmişti ve yavaş yavaş apoptotik olmuştu gösteren artan. PMGI nanofiber matrisler oluşan microenvironments temsil eder, PMGI_MidNF_HighCD OCT4 ve EdU sinyalleri diğer koşulları ile karşılaştırıldığında daha büyük farklılıklar gösterdi.
Resim 1 . Hücresel işlevleri düzenleyen için en uygun hücresel microenvironments tanımlamak için strateji eleme. Çoğaltılmış yapay hücresel microenvironment (MACME) dizi bileşenlerinin(a)genel bakış. Dizi iki ana bölümden oluşmaktadır: nanofiber yataklar desenli bazal substrat (nanofiber dizi) ve polydimethylsiloxane (PDMS)-mikrosıvısal yapısına dayalı. MACME dizi nanofiber ECMs çeşitli özellikleri (yani, nanofiber malzeme ve yoğunlukları) ve çeşitli hücre yoğunluğu tohum ile hazırlamak mümkün. MACME dizi PDMS mikrosıvısal yapısını üç mikrosıvısal kanallı yüksekliklere sahiptir (250, 500 ve 1000 µm) ilk hücre tohum yoğunluğu düzenleyen. (B) hücresel microenvironments hücre fenotipleri üzerinde etkisini kantitatif bir yansıma tabanlı tek hücreli tahlil kullanılarak hesaplandı ve hiyerarşik kümeleme tarafından kendiliğinden organize harita (SOM) göre istatistiksel veri analizi izledi. Bu rakam başvuru49 Wiley izniyle uyarlanmıştır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 . MACME dizi tasarımını. (A)genel giderleri ve tüm MACME diziyi yüksek açı çekim ve kavramsal diyagram nanofiber matris (pembe) bir mikrosıvısal kanalının (açık mavi). Her kanal 700 µm geniş ve 8.4 mm uzun kültür odası ve orta ve hücreleri giriş için iki giriş oluşur. (B) hücreleri ve nanofiber Matrislerin boyutları karşılaştırılması. Hücreleri ve nanofiber yataklar yükseklikleri aralığı 1-3 µm ve 0,05-5.0 µm, anılan sıraya göre. (C) 250/500/1000 µm yüksekliği her mikrosıvısal kanal kesiti. Hücreleri ve nanofiber yataklar mavi daireler ve turuncu çizgiler anılan sıraya göre temsil edilir. Aynı genişlik ve uzunluk her odası vardır ama farklı yükseklikte (250, 500 ve 1000 µm) ve her odası birim 1.6, 3.2 ve 6.4 µL, sırasıyla yapıldı. Şekil 2C ' deki Siyah noktalı dikdörtgen Şekil 2Bgösterir. Şekil 2 başvuru49 Wiley izniyle uyarlanmıştır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 . MACME dizi imalatı. (A)imalatı nanofiber dizi. Birden çok nanofiber matrisler üzerinde bir baseplate biçimlenme maskeleri desenli delik taşıyan bir dizi kullanarak değiştirilmiş electrospinning tarafından gerçekleştirildi. Platin kaplama nanofiber ifade üzerinde plastik bir baseplate kolaylaştırmak için yapılmıştır. Maskeleri farklı delik-desenleri ile 3D yazıcı tarafından hazırlanmıştır. Takip plaka platin kaplı alanının maskeleme, plaka-maske set koleksiyonu ekrana verin ve normal electrospinning gerçekleştirilen. İlk nanofibers maske Pt kaplı pozisyonlarda deliklerden plaka üzerinde kuruldu. Ek nanofiber yataklar plaka üzerinde mevcut maskeyi değiştirme ve yordamı yinelenen fabrikasyon. (B) bir mikrosıvısal yapı imalatı. Bir 3D printerlere harcama maddeler UV tedavi edilebilir reçine ile tarafından yazdırılan kalıp mikrosıvısal aygıt PDMS tabakası şeklinde. Döküm sonra MACME dizi bir mikrosıvısal PDMS tabanlı katman yüzey aktif nanofiber dizi ile takılarak toplandı. Şekil 3 başvuru49 Wiley izniyle uyarlanmıştır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 . Grafik Kullanıcı arayüzü (GUI) mikroskopik resim alma için görüntülerini. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5 . Grafik Kullanıcı arayüzü (GUI) bilgisayar destekli görüntü işleme için tek hücreli fenotipleme görüntülerini. Görüntü analiz süreci 5 adım içerir; (A)tanımlaması DAPI birincil nesneleri görüntüler, OCT4, Annexin V ve EdU görüntüleri, ikincil nesneler tanımlaması (B-D) sırasıyla ve nesne yoğunluğu ölçümü. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6 . Fenotipleme ve microenvironmental faktörler tarafından değiştirilmiş H9 hESCs fenotipleri sınıflandırılması. (A)immünfloresan jelatin (GT) nanofibers (GT_HighNF_HighCD), yüksek ilk tohumlama yoğunluğu, kültürlü H9 hESCs görüntülerini lekeli üç hücresel fenotipik işaretleri ile (OCT4, Nanog; EdU, hücre çoğalması; V, apoptosis annexin) ve DAPI hücre çekirdeği için. (B) A heatmap ve denetimsiz hiyerarşik kümeleme dendrograms. Test microenvironments üç gruba fenotipleri benzerlikler üzerinde temel ayırt edici özellikleri ile kategorize edildi. GT nanofibers, MG_HighCD ve VN_HighCD dahil grup. Grup II GT nanofibers (GT_XLow ve MidNF_MidCD), örnekleri MG_MidCD veya VN_MidCD oluşuyordu. Tüm PMGI_NF örnekleri Grup III kümelenmiş. Heatmap, pembe ve mavi rengi sırasıyla SOM sayısı parsellerde, yüksek ve düşük hücresel Frekanslar belirtir. (C) dağıtım quantified marker ifade düzeyleri (Grup ı-GT_MidNF_HighCD, Grup II-GT_MidNF_MidCD ve Grup III-PMGI_MidNF_HighCD) her gruptan bir temsilcisi örnek 1000 hücrelerinin. 25th ve 75 testlerinde kutusu sınırları belirtilen. Bıyık 1,5 katı için interquartile aralığı 25th ve 75 testlerinde genişletin. Deneyler her grup için üç kez tekrar. Şekil 6 A-C uyarlanmış başvuru49 Wiley izniyle. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Adı | Kanal genişliği (mm) | Kanal genişliği (mikron) | Kanal yüksekliği (mikron) | Giriş/çıkış çapı (mikron) | Giriş/çıkış yüksekliği (mikron) | Kalıp uzunluğu (mm) | Kalıp genişliği (mm) | Kalıp Yükseklik (mm) |
| Kalıp | 8.4 | 700 | 250/500/1000 | 800 | 3000 | 127.76 | 85.48 | 14.35 |
| Adı | Kalınlığı (mikron) | Delik çapı (mm) | Delik genişliği (mm) | Maske uzunluğu (mm) | Maske genişliği (mm) | Kalıp Yükseklik (mm) | Satır uzaklık (mm) | Sütun uzaklık (mm) |
| Maske | 1000 | 6 | 5 | 123,5 | 80.2 | 14.35 | 11.24 | 14.38 |
Tablo 1. Kalıp bir mikrosıvısal yapısı ve nanofiber desenlendirme için maske için boyutları.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu iletişim kuralı nitelikli hPSCs bakım için sağlam kültür sistem kurmak için ilk tarama yöntemi gösterir. İlk olarak, nasıl farklı yapay ECMs ve hücre yoğunluğu ile a nanofiber düzenlemek, MACME dizi entegre bir mikrosıvısal aygıtını kullanarak tohum bir platform hazırlamak için nitelendirdi. İkinci, nicel yansıma tabanlı tek hücreli fenotipleme bireysel hücresel sonuçları ve farklı biyokimyasal ve biyofiziksel özellikleri tarafından değiştirilmiş davranışları değerlendirmek için gerçekleştirilen50 oldu. Bu protokol için GT nanofiber ve olumlu denetim ECM proteinler yüksek ilk hücre yoğunluğu tohum durumda oluşan çevre farklılaşmamış bir devletin özellikleri tarafından karakterize edildi; hızlı yayılması45 ve istikrarlı OCT4 ifade51. Bu gözlem moleküler mekanizmaları "hücre-hücre dışı matriks" ve "hücre-hücre" etkileşimleri ile ilgili hPSCs pluripotency etkileyebilecek belirtti.
Bu strateji kullanıcının amacına uygun şekilde özelleştirilebilir. Örneğin, hücre manipülasyon ve işlem hacmi için deneysel ayarları çeşitli şekiller ve desenler mikrosıvısal yapısının yeniden tasarlayarak ayarlanabilir. Üretilen iş geliştirme için başka bir yolu her odası'nın giriş ve çıkış pozisyonlar Mikroplaka standart biyomoleküler Bilimler Derneği tarafından standardize 96-şey plakaların başı olarak tasarlanmıştır; Böylece, bir otomatik robot Sıvı Sabunluk yüksek üretilen iş tarama için kullanılabilir. Daha fazla "Hücre-ECM etkileşimleri" ile ilgili moleküler mekanizması incelemek için yapay hücresel microenvironments daha doğrusu kimyasal sinyal molekülleri52 ile nanofibers değiştirerek vivo içinde koşulları taklit için yapılabilir .
Bugüne kadar hücresel microenvironments eleme için geliştirilen en platformlar çözünür faktörler (örneğin, büyüme faktörleri ve kimyasal bileşikler)42,43,44, ama değil nanofiber ECMs owing için eleme nişan farklı imalat teknikleri birleştirerek zorluklar. Örneğin, bir nanofiber sayfa bir mikrosıvısal yapısı ve bir baseplate arasında küçük bir boşluk oluşturur ve başka bir odası 's bir kültür orta mix çünkü hangi farklı örnekleri arasında çapraz bulaşma olur onların kararsız bağlar, neden olur küçük boşluk. Yeni yöntemi basit ve hassas imalat nanofiber Matrislerin belirli sitelerde kolaylaştırır ve onların doğrudan bağ kararsız bağ ve çapraz bulaşma engeller baseplate ile sağlar. Ayrıca, birkaç platformlar53 Havacilik ile entegre ve teknolojileri için gerekli çünkü nanofiber matrisler hücre fonksiyonları üzerindeki etkileri araştırmak için kimyasal ve fiziksel ipuçları sistematik manipülasyon için erişilebilir olmuştur entegrasyonu son derece sofistike. Bizim tek hücreli MACME dizi ile profil oluşturma kolayca ulaşılabilir bir aparat ve basit teknikleri ile gerçekleştirilebilir ve gelişimsel hücresel ortamları için modelleme kullanmak için büyük bir potansiyele sahiptir ve hücre biyolojik çalışmalar ve ilaç keşif / Eleme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Hiçbiri.
Acknowledgments
Biz Prof. N. Nakatsuji iCeMS, Kyoto Üniversitesi, insan ES hücreleri verdiğiniz için teşekkür ederiz. Ayrıca Tokyo Teknoloji Enstitüsü'nde atomik kuvvet mikroskobu kullanımında verdiği destek için Prof. A. Maruyama teşekkür. Finansman cömertçe sağlanan Japonya Derneği tarafından bilim promosyon için (JSP'ler; 22350104, 23681028, 25886006 ve 24656502); fon ayrıca yeni enerji ve Endüstriyel teknoloji geliştirme organizasyonu (Ned-o) ve Terumo Life Science Foundation tarafından sağlandı. TEFE-iCeMS dünyanın önde gelen uluslararası araştırma merkezi girişimi (TEFE), Milli Eğitim Bakanlığı, kültür, spor, bilim ve teknoloji (MEXT), Japonya tarafından desteklenir. Bu çalışmanın bir parçası Kyoto Üniversitesi Nanoteknoloji Hub ve "Nanoteknoloji platformu Projesi" MEXT, Japonya sponsorluğunda AIST Nano-işleme tesisinde tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polystyrene (PS) | Sigma | #182435 | Average Mw: 290,000, average Mn: 130,000 |
| Polymethylglutarimide (PMGI) | MicroChem | G113113 | |
| Gelatin (GT) | Sigma | G2625 | From porcine skin, type A |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Doe Corning Toray | #1064291 | PDMS curing agent and silicone elastomer base are components of this kit. |
| OpenSCAD | This is a free 3D computer graphics software (http://www.openscad.org/) used for designing the mold of the microfluidic device. | ||
| AutoCAD 2014 | Autodesk | This is a 3D computer graphics software (https://www.autodesk.com/products/autocad/overview) used for design of the mask used on nanofiber-array preparation. | |
| 3D printer, AGILISTA-3000 | Keyence | ||
| UV-curable resin, AR-M2 | Keyence | This is used for 3D printing by Agilista. | |
| Acetic acid | Sigma | #338826 | ≥99.99% |
| Ethyl acetate | Sigma | #270989 | Anhydrous, 99.8% |
| Tetrahydrofuran (THF) | Sigma | #401757 | |
| MSP-30T | Vacuum Device | Magnetron sputtering machine | |
| Nunc OmniTray | Thermo Fisher Scientific | #242811 | This is a polystyrene baseplate on which the nanofiber array is created. This plate size is typically 127.7 x 85.5 mm. |
| Gun-type corona discharge machine | Shinko Electric & Instrumentation | CFG-500 | This handy device is used to generate corona for activation of the bottom surface of the PDMS layer at step 1.5 "Assembly of the MACME arrays" in the protocol. |
| 5 mL syringe | Terumo | SS-05SZ | |
| Stainless-steel blunt needle (23-gauge) | Nipro | #2166 | Outside diameter and length are 0.6 and 32 mm, respectively. |
| High-voltage power supply | TechDempaz | ||
| 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide, hydrochloride | Dojindo | W001 | |
| N-Hydroxysuccinimide | Sigma | #56480 | |
| Matrigel hESC-Qualified Matrix | Corning | #354277 | This protein is refered as basement membrane gel matrix in the protocol. |
| CellAdhere Vitronectin, Human, Solution | STEMCELL Technologies | #07004 | |
| TeSR-E8 | STEMCELL Technologies | #05940 | Feeder-free, xeno-free culture medium for maintenance of human ES and iPS cells |
| Y-27632 | Wako Pure Chemical Industries | #253-00513 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red | Thermo Fisher Scientific | #12605028 | This ia a recombinant trypsin-like protease for dissociation of adherant mammalian cells. |
| Click-iT EdU Imaging Kit with Alexa Fluor 647 Azides | Thermo Fisher Scientific | C10086 | The fluorescent labeling of proliferating cells in on-plate fluorescent staining was performed along the product manual of this kit. |
| Annexin V, Alexa Fluor 594 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A13203 | |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Oct-3/4 Antibody (C-10) | Santa Cruz Biotechnology | sc-5279 | |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (DyLight 488) | abcam | ab96875 | This is a secondary antibody used in on-plate fluorescent cell staining. |
| ECLIPSE Ti-E | Nikon | This is an inverted fluorescence microscope equipped with a CFI Plan Fluor 4×/0.13 N.A. objective lens (Nikon), CCD camera (ORCA-R2, Hamamatsu), mercury lamp (Intensilight, Nikon), XYZ automated stage (Ti-S-ER motorized stage with encoders, Nikon), and filter cubes for four fluorescence channels (DAPI, GFP HYQ, TRITC, Cy5; Nikon) | |
| NIS-Elements Advanced Research | Nikon | This is a microscope imaging software used for automatic image acquisition. | |
| CellProfiler, Version 2.1.0 | This is a free open software for cell image analysis (http://cellprofiler.org/). | ||
| R | SOM analysis is performed by kohonen package of this software. This is freely available (https://www.r-project.org/). | ||
| Cluster 3.0 | This is the open source clustering software (http://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster/software.htm). Unsupervised hierarchical clustering is performed with this software. | ||
| Java TreeView | This open source software (http://jtreeview.sourceforge.net/) is used to visualize clustering data as a heatmap and a dendrogram. | ||
| H9 human embryonic stem cell | WiCell Stem Cell Bank | WA09 |
References
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Ameen, C., et al. Human embryonic stem cells: Current technologies and emerging industrial applications. Crit Rev Oncol Hematol. 65 (1), 54-80 (2008).
- Nishikawa, S., Goldstein, R. A., Nierras, C. R. The promise of human induced pluripotent stem cells for research and therapy. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (9), 725-729 (2008).
- Robinton, D. A., Daley, G. Q. The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy. Nature. 481 (7381), 295-305 (2012).
- Sartipy, P., Bjorquist, P., Strehl, R., Hyllner, J. The application of human embryonic stem cell technologies to drug discovery. Drug Discovery Today. 12 (17-18), 688-699 (2007).
- Discher, D. E., Mooney, D. J., Zandstra, P. W. Growth factors, matrices, and forces combine and control stem cells. Science. 324 (5935), 1673-1677 (2009).
- Joyce, J. A., Pollard, J. W. Microenvironmental regulation of metastasis. Nat Rev Cancer. 9 (4), 239-252 (2009).
- Danhier, F., Feron, O., Preat, V. To exploit the tumor microenvironment: Passive and active tumor targeting of nanocarriers for anti-cancer drug delivery. J Control Release. 148 (2), 135-146 (2010).
- Murphy, W. L., McDevitt, T. C., Engler, A. J. Materials as stem cell regulators. Nat Mater. 13 (6), 547-557 (2014).
- Patel, A. K., et al. A defined synthetic substrate for serum-free culture of human stem cell derived cardiomyocytes with improved functional maturity identified using combinatorial materials microarrays. Biomaterials. 61, 257-265 (2015).
- Zhang, R., et al. A thermoresponsive and chemically defined hydrogel for long-term culture of human embryonic stem cells. Nat Commun. 4, (2013).
- Anderson, D. G., Putnam, D., Lavik, E. B., Mahmood, T. A., Langer, R. Biomaterial microarrays: rapid, microscale screening of polymer-cell interaction. Biomaterials. 26 (23), 4892-4897 (2005).
- Celiz, A. D., et al. Discovery of a Novel Polymer for Human Pluripotent Stem Cell Expansion and Multilineage Differentiation. Adv Mater. 27 (27), 4006-4012 (2015).
- Hansen, A., et al. High-Density Polymer Microarrays: Identifying Synthetic Polymers that Control Human Embryonic Stem Cell Growth. Adv Healthcare Mater. 3 (6), 848-853 (2014).
- Mei, Y., et al. A high throughput micro-array system of polymer surfaces for the manipulation of primary pancreatic islet cells. Biomaterials. 31 (34), 8989-8995 (2010).
- Saha, K., et al. Surface-engineered substrates for improved human pluripotent stem cell culture under fully defined conditions. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (46), 18714-18719 (2011).
- Bettinger, C. J., Langer, R., Borenstein, J. T. Engineering substrate topography at the micro- and nanoscale to control cell function. Angew Chem Int Ed Engl. 48 (30), 5406-5415 (2009).
- McMurray, R. J., et al. Nanoscale surfaces for the long-term maintenance of mesenchymal stem cell phenotype and multipotency. Nat Mater. 10 (8), 637-644 (2011).
- Sun, Y., Jallerat, Q., Szymanski, J. M., Feinberg, A. W. Conformal nanopatterning of extracellular matrix proteins onto topographically complex surfaces. Nat Methods. 12 (2), 134-136 (2015).
- Nitanan, T., et al. Effects of processing parameters on morphology of electrospun polystyrene nanofibers. Korean J Chem Eng. 29 (2), 173-181 (2012).
- Liu, L., et al. Chemically-defined scaffolds created with electrospun synthetic nanofibers to maintain mouse embryonic stem cell culture under feeder-free conditions. Biotechnol Lett. 34 (10), 1951-1957 (2012).
- Liu, L., et al. Nanofibrous gelatin substrates for long-term expansion of human pluripotent stem cells. Biomaterials. 35 (24), 6259-6267 (2014).
- Kamei, K., et al. Phenotypic and transcriptional modulation of human pluripotent stem cells induced by nano/microfabrication materials. Adv Healthcare Mater. 2 (2), 287-291 (2013).
- Peerani, R., et al. Niche-mediated control of human embryonic stem cell self-renewal and differentiation. EMBO J. 26 (22), 4744-4755 (2007).
- Yamamoto, K., et al. Fluid shear stress induces differentiation of Flk-1-positive embryonic stem cells into vascular endothelial cells in vitro. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 288 (4), 1915-1924 (2005).
- Charati, S. G., Stern, S. A. Diffusion of gases in silicone polymers: Molecular dynamics simulations. Macromolecules. 31 (16), 5529-5535 (1998).
- Prado-Lopez, S., et al. Hypoxia promotes efficient differentiation of human embryonic stem cells to functional endothelium. Stem Cells. 28 (3), 407-418 (2010).
- Yanagihara, K., et al. Prediction of Differentiation Tendency Toward Hepatocytes from Gene Expression in Undifferentiated Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cells and Development. 25 (24), 1884-1897 (2016).
- Kamei, K., et al. 3D printing of soft lithography mold for rapid production of polydimethylsiloxane-based microfluidic devices for cell stimulation with concentration gradients. Biomed Microdevices. 17 (2), (2015).
- Song, J. H., Kim, H. E., Kim, H. W. Production of electrospun gelatin nanofiber by water-based co-solvent approach. J Mater Sci Mater Med. 19 (1), 95-102 (2008).
- Owen, M. J., Smith, P. J. Plasma Treatment of Polydimethylsiloxane. J Adhes Sci Technol. 8 (10), 1063-1075 (1994).
- Chen, G. K., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nat Methods. 8 (5), 424-476 (2011).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25 (6), 681-686 (2007).
- Kamei, K., et al. An integrated microfluidic culture device for quantitative analysis of human embryonic stem cells. Lab Chip. 9 (4), 555-563 (2009).
- Kamei, K., et al. Microfluidic image cytometry for quantitative single-cell profiling of human pluripotent stem cells in chemically defined conditions. Lab Chip. 10 (9), 1113-1119 (2010).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7 (10), 100 (2006).
- Kohonen, T. Self-Organized Formation of Topologically Correct Feature Maps. Biol Cybern. 43 (1), 59-69 (1982).
- Wehrens, R., Buydens, L. M. C. Self- and super-organizing maps in R: The kohonen package. J Stat Softw. 21 (5), 1-19 (2007).
- Eisen, M. B., Spellman, P. T., Brown, P. O., Botstein, D. Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (25), 14863-14868 (1998).
- Saldanha, A. J. Java Treeview--extensible visualization of microarray data. Bioinformatics. 20 (17), 3246-3248 (2004).
- Du, G. S., Fang, Q., den Toonder, J. M. J. Microfluidics for cell-based high throughput screening platformsd-A review. Anal Chim Acta. 903, 36-50 (2016).
- Huang, S. B., et al. An integrated microfluidic cell culture system for high-throughput perfusion three-dimensional cell culture-based assays: effect of cell culture model on the results of chemosensitivity assays dagger. Lab Chip. 13 (6), 1133-1143 (2013).
- Wang, B. L., et al. Microfluidic high-throughput culturing of single cells for selection based on extracellular metabolite production or consumption. Nat Biotechnol. 32 (5), 473 (2014).
- Becker, K. A., et al. Self-renewal of human embryonic stem cells is supported by a shortened G1 cell cycle phase. J Cell Physiol. 209 (3), 883-893 (2006).
- Neganova, I., Lako, M. G1 to S phase cell cycle transition in somatic and embryonic stem cells. J Anat. 213 (1), 30-44 (2008).
- Fox, V., et al. Cell-cell signaling through NOTCH regulates human embryonic stem cell proliferation. Stem Cells. 26 (3), 715-723 (2008).
- Xu, C., et al. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 19 (10), 971-974 (2001).
- Kamei, K., et al. Microfluidic-Nanofiber Hybrid Array for Screening of Cellular Microenvironments. Small. 13 (18), (2017).
- Sun, J., et al. A Microfluidic Platform for Systems Pathology: Multiparameter Single-Cell Signaling Measurements of Clinical Brain Tumor Specimens. Cancer Res. 70 (15), 6128-6138 (2010).
- Theunissen, T. W., Jaenisch, R. Molecular Control of Induced Pluripotency. Cell Stem Cell. 14 (6), 720-734 (2014).
- Yoo, H. S., Kim, T. G., Park, T. G. Surface-functionalized electrospun nanofibers for tissue engineering and drug delivery. Adv Drug Del Rev. 61 (12), 1033-1042 (2009).
- Dixon, J. E., et al. Combined hydrogels that switch human pluripotent stem cells from self-renewal to differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (15), 5580-5585 (2014).
