Summary
Dit artikel beschrijft de gedetailleerde methodologie ter voorbereiding van een Multiplexed kunstmatige cellulaire communicatie (MACME)-array voor high-throughput manipulatie van fysische en chemische cues nabootsen in vivo cellulaire microenvironments en aan het identificeren van de optimale cellulaire omgeving voor menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs) met eencellige profilering.
Abstract
Cellulaire microenvironments bestaan uit een aantal signalen, zoals groeifactoren, extracellulaire matrices en intercellulaire interacties. Deze signalen zijn goed georkestreerd en cruciaal bij het reguleren van de functies van de cel in een levend systeem. Hoewel een aantal onderzoekers hebben geprobeerd te onderzoeken van de correlatie tussen milieufactoren en gewenste cellulaire functies, er nog veel onbekend. Dit is grotendeels te wijten aan het ontbreken van een juiste methodologie te bootsen zo'n milieu signalen in vitro, gelijktijdig testen met verschillende milieu aanwijzingen op cellen. Wij rapporteren hier, een geïntegreerd platform van microfluidic kanalen en een array van de nanofiber, gevolgd door hoge-eencellige inhoudsanalyse, te onderzoeken van de stamcel fenotypen gewijzigd door verschillende omgevingsfactoren. Om aan te tonen van de toepassing van dit platform, deze studie concentreert zich op de fenotypen van zelf vernieuwen van menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs). Hier presenteren we de procedures van de voorbereiding voor een matrix van de nanofiber en de microfluidic-structuur in de fabricage van een array Multiplexed kunstmatige cellulaire communicatie (MACME). Bovendien de algemene stappen voor de eencellige profiling, cel kleuring met meerdere fluorescente markeringen, meerdere fluorescentie imaging en statistische analyses, worden beschreven.
Introduction
Menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs)1,2 zelf vernieuwen onbeperkt en onderscheid in verschillende geslachten van weefsel, die kunnen een revolutie Geneesmiddelenontwikkeling, cel-gebaseerde therapieën, weefselkweek en regeneratieve geneeskunde 3 , 4 , 5 , 6. algemene cultuur gerechten en microtiterplaat platen, echter zijn niet ontworpen om precieze cel van de fysische en chemische manipulatie op cellulair niveau met het bereik van nano - tot micro-meters, die een kritische factor voor cellulaire expansie is, zelf-vernieuwing en differentiatie. Om aan te pakken dit nadeel, hebben studies onderzocht de rol van cellulaire microenvironments bij het reguleren van de cel-lot besluiten en cel functies4. In de afgelopen jaren zijn een toenemend aantal studies uitgevoerd om te reconstrueren van cellulaire microenvironments in vitro7,8. Nano - en micro-fabricage processen hebben deze microenvironments door de manipulatie van chemische9,10,11,12,13, vastgesteld 14,,15,16,17 en fysieke18,19,20 milieu signalen. Tot nu toe waren er geen meldingen te systematisch onderzoeken van de onderliggende mechanismen van chemische en fysische milieu signalen op cel-lot besluiten en functies binnen een enkel platform.
Hier introduceren we een strategie gebaseerd op eenvoudig ontwerpprincipes om een robuuste screening platform (Figuur 1). Eerst beschrijven we de procedure van de ontwikkeling van een geïntegreerd platform voor het maken van de veelzijdige, kunstmatige cellulaire microenvironments met behulp van een nanofiber array en een microfluidic structuur: de Multiplexed kunstmatige cellulaire communicatie (MACME) matrix (Figuur 1A en 2A). De nanofiber array heeft 12 verschillende microenvironments in wisselende combinaties van nanofiber materialen en dichtheden. Electrospinning werd gebruikt om nanofibers te fabriceren. De nanofiber materialen, zoals polystyreen (PS)21, polymethylglutarimide (PMGI)22en gelatine (GT)23, werden ontworpen voor het testen van hun chemische eigenschappen, die later nog van invloed kunnen zijn op cel adhesie en het onderhoud van pluripotent ( Figuur 2B). Nanofiber dichtheden waren gevarieerd door het veranderen van electrospinning tijd en de geproduceerde nanofibers werden gedefinieerd volgens hun dichtheid (niet gefinisht, met D = XLow/Low/Mid/High). De microfluidic structuur bestaat uit Polydimethylsiloxaan (PDMS) 48 celkweek kamers, die kunnen worden geplaatst langs de standaard afmetingen van de 96-Wells-microplate herbergen. PDMS is een biocompatibel en gas-inwisselbaar polymeer gewoonlijk gebruikt voor het fabriceren van microfluidic apparaten24. Elk kanaal van de microfluidic werd ontworpen om 700-µm breed en 8.4-mm lang en had twee inhammen aan de randen (tabel 1). De kamers hadden verschillende hoogtes (250, 500 en 1000 µm) te manipuleren van de eerste cel-zaaien dichtheden (0.3 en 0.6 1,2 × 105 cellen/cm2), die met overleven, proliferatie en differentiatie van hPSCs25 correleren kunnen (Figuur 2C). Het aantal cellen zaadjes in een kamer is evenredig met de dichtheid van de kolom boven de vloer van de kamer, en dus de eerste cel zaaien dichtheid werd gecontroleerd door de invoering van de dezelfde celsuspensie in cultuur kamers met verschillende hoogtes. Alle zenders werden ontworpen om ≥ 250-µm hoge26 om te minimaliseren van de effecten van lage-zuurstof-spanning27 en schuifspanning28 op de cellen. Kanaal hoogten van 250, 500 en 1000 µm hier hierna afgekort als XCD met X = Low, Mid, en hoog, respectievelijk. De omgevingen met verschillende nanofiber dichtheden en eerste cel-zaaien dichtheden waren afgekort als "Material_NF density_Cell dichtheid" (bijvoorbeeld, GT_HighNF_HighCD: een milieu gekenmerkt door high-density GT nanofibers en hoge initiële cel-zaaien dichtheid).
Vervolgens beschrijven we hoe eencellige analyses voor het systematisch onderzoek naar cel gedrag in reactie op milieu-factoren (Figuur 1B) uitvoeren. Als een bewijs-van-concept geïdentificeerd we de optimale cellulaire omgeving voor hPSC zelf-vernieuwing, dat is een belangrijke functie voor hPSC onderhoud (Figuur 1B)29. Beeld-gebaseerde cytometry, gevolgd door statistische analyses, zorgt voor kwantitatieve interpretatie van individuele cellulaire fenotypische reacties op cellulaire omgevingen. Onder een verscheidenheid van cellulaire functies biedt dit Witboek een gedetailleerde procedure ter identificatie van de optimale voorwaarden voor het behoud van hPSC zelf-vernieuwing.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. fabricage van MACME matrix
Opmerking: Alle materialen en uitrusting worden opgesomd in de tabel van de materialen.
-
Voorbereiding van de maskers voor de array van een nanofiber en een mal voor een microfluidic structuur
- Het maken van driedimensionale (3D) beelden van maskers gebruikt voor de nanofiber arrays en mallen voor microfluidic structuren met behulp van 3D-computergraphics softwarepakketten (tabel 1).
Opmerking: De 3D-beelden worden gelezen of afgedrukt door een 3D-printer. De afgedrukte maskers en schimmel hebben dezelfde afmetingen met 3D-beelden die zijn gedefinieerd met behulp van de grafische software bij stap 1.1.1. - Maskers en een schimmel die op basis van deze ontwerpen met behulp van een 3D-printer afdrukken.
Opmerking: In dit protocol was een 3D-printer van de inkt-jet-achtige met UV-uithardende hars gebruikte30. De printerresolutie was 635 × 400 dpi en 15 µm in X, Y en Z, respectievelijk de werkelijke X, Y resolutie was echter ongeveer vier keer lager.
- Het maken van driedimensionale (3D) beelden van maskers gebruikt voor de nanofiber arrays en mallen voor microfluidic structuren met behulp van 3D-computergraphics softwarepakketten (tabel 1).
-
Nanofiber-matrix voorbereiding (Figuur 3A)
- Polymeeroplossingen voorbereiden op electrospinning.
- Verdun 13% PMGI vloeistof met tetrahydrofuraan door 9% (m/v)22.
- Los 0.08 g PS (aantalgemiddeld molecuulgewicht (Mn): 130.000) in THF:dimethylformamide (1:1 volumeverhouding)21, en THF:dimethylformamide om het volume tot de uiteindelijke 1 mL (8% (m/v) PS oplossing) toe te voegen.
- Los 0,1 g GT in water: acetic acid: ethylacetaat (1:1.6:2.1 volumeverhouding), en voeg water: acetic acid: ethylacetaat toe zodat het volume tot de uiteindelijke 1 mL (10% (m/v) GT-oplossing) als beschreven23,31.
- Gebruiken van een magnetron sputteren machine, een platina laagje storten met een dikte van 5-nm op een polystyreen (PS) basisplaat (127.7 × 85,5 mm), die als een kathode in het electrospinning-setup fungeert.
- Laad elke polymeeroplossing in een 5-mL injectiespuit voorzien van een 23-G roestvrij staal botte naald.
- Plaats en anker de spuit met de naald op een spuitpomp met 12 cm naast de verzamelaar van het electrospinning-apparaat.
- De naald van de spuit verbinden met een hoog-voltage power supply en ingesteld om te passen tot en met 11 kV.
- Stelt het pompen tarief van 0,2 mL/h.
- Houd de temperatuur en vochtigheid op 30 ° C en < 30% (v/v).
- Zet het masker op de basisplaat voorbereid op stap 1.2.2.
- Fabriceren nanofibers op de basisplaat door de gaatjes van masker met verschillende dichtheden door het veranderen van de electrospinning tijd (bijvoorbeeld 20, 60, 90 en 180 s).
- Verwijder het masker van de basisplaat.
Opmerking. Ethanol kan worden gespoten op de electrospun GT nanofibers voordat u het masker Voorkom peeling uit GT nanofibers samen met het masker verwijdert. - Herhaal stap 1.2.4-1.2.10 tot de voltooiingvan nanofiber-matrix fabricage.
- Plaats de nanofiber array in een exsiccator bij 25 ° C voor 16 h tot het resterende oplosmiddel te verdampen.
- Crosslink GT nanofibers met 0,2 M 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) en 0.2 M N-hydroxysuccinimide (NHS) in ethanol bij 25 ° C gedurende 4 h23.
- Spoel GT nanofibers tweemaal met 99,5% (v/v) ethanol en droog met een vacuüm bij 25 ° C voor 16 h.
- Polymeeroplossingen voorbereiden op electrospinning.
-
Vervaardiging van microfluidic structuren (Figuur 3B)
- Meng 2 g PDMS genezen agent en 20 g voor PDMS base (1:10 gewicht verhouding; Pre-PDMS). 24
- Giet het mengsel van de pre-PDMS op de mal vervaardigd in stap 1.2.
- Ambtshalve gas het pre-PDMS mengsel in een exsiccator gedurende 30 minuten.
- Het genezen van het pre-PDMS mengsel in een oven bij 65 ° C gedurende 16 h.
-
Montage van MACME arrays (Figuur 3B)
- De structuur van de PDMS genezen bij stap 1.3.4 van de schimmel en schoon met 70% (v/v) ethanol afschilferen.
- Traktatie atmosferische corona kwijting aan de onderzijde van het PDMS structuur32.
Opmerking: In dit protocol, wordt de corona geloosd op het gehele oppervlak een laag 3 of 4 keer met een "Handy" corona kwijting apparaat. Zuurstof plasma behandeling werd vervangen door atmosferische corona kwijting te wijzigen van de oppervlakte hechting. - De PDMS structuur met de nanofiber array snel monteren.
- Oven-bak bij 65° C gedurende 2 dagen.
2. laden hESCs in MACME Array
- Voor de routinematige cultuur van H9 menselijke embryonale stamcellen (hESCs), handhaven cellen in xeno-vrij chemisch welbepaald kweekmedium voor hPSC onderhoud33 aangevuld met 10 µM Y-27632 ROCK remmer34 (hPSC medium genoemd) in een celkweek voor 35-mm schotel bedekt met kelder membraan gel matrix (MG).
- Passage cellen elke 4 tot en met 7 dagen met behulp van een recombinant trypsine-achtige proteaseremmers toegediend krijgen.
- Een MACME matrix met 99,5% ethanol, steriliseren in laden in de kamers gedurende 10 minuten en verwijder de ethanol. Herhaal deze stap 3 keer.
- 12 µL van MG, 10 µg/mL vitronectin (viool), introduceren en 0,1% (g/v) GT in besturingselement cultuur kamers, en de kamers bij 37 ° C gedurende 1 h jas hen op de oppervlakken van de kamer uit te broeden.
Opmerking: In dit protocol, MG, VN en GT uitgekozen als referentie eiwitten voor cel adhesie en cultuur. Omdat MG en VN standaard celkweek-matrices gebruikt zijn voor het behoud van hPSC zelf-vernieuwing, worden ze gebruikt als positieve controle; tweedimensionale GT coating (2DGT) of niet-coating (NC) werden gebruikt als negatieve controles. - Voorverwarmde hPSC medium in alle kamers van MACME matrix introduceren. Incubeer de kamers gedurende 30 minuten bij 37 ° C.
- Wassen H9 hESC gekweekt op een 35-mm schotel met DPBS, 0,5 mL van een recombinant trypsine-achtige protease toevoegen aan de schotel en Incubeer bij 37 ° C gedurende 1 minuut en zorgvuldig alleen het supernatant gemengd met protease gecombineerd.
Opmerking: Bij de aspiratie stap, de cellen niet losgekoppeld. - Onmiddellijk toevoegen hPSC medium, zachtjes afzien van het medium tegen het oppervlak van de schotel herhaaldelijk te distantiëren van de cellen en de vrijstaande cellen overbrengen in een conische buis 15 mL.
- Centrifugeer bij 200 x g voor 3 min. Aspirate het supernatant en opschorten van cellen in een voorverwarmde hPSC medium.
- 12 µL van de celsuspensie (1,2 × 106 cellen/mL) in elke kamer van microfluidic te introduceren.
Opmerking: Cellen kennismaken met één kamer van een andere met behulp van een micropipet. Omdat het aantal cellen zaadjes aan kamers evenredig met de dichtheid van de kolom boven de vloer van de kamer is, kan de eerste cel-zaaien dichtheid worden gecontroleerd hoewel monsters van dezelfde celsuspensie werden gebruikt. Zorgen pipetteren voorzichtig wordt gedaan. Verwijder overtollige medium uit de kamers via een stick van katoen-tipped na het laden. De MACME matrix is compatibel met zowel gebruikte laboratorium pipetten en geautomatiseerde Pipetteer systemen, en het vereist geen speciale apparatuur. - Elke 12 h en cultuur hPSC medium wijzigen voor 4 dagen.
Opmerking: Constante volumes van het medium (1.6, 3.2 en 6,4 µL) worden bijgehouden met behulp van de kamers van verschillende grootte. De cellen van de cultuur onder een rusttoestand om te minimaliseren van shear stress met uitzondering van de uitwisseling van de cel kweekmedium35,36.
3. kwantitatieve eencellige profilering
-
Op-plaat fluorescerende cel kleuring
Opmerking: voor het analyseren van fenotypische veranderingen van het hPSCs zelf te vernieuwen, dit protocol geselecteerd drie belangrijke fenotypische markeringen voor dit protocol: OCT4, 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU), en Annexine V, voor het meten van de status van pluripotent, proliferatie, en apoptose , respectievelijk (Figuur 2b). 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) wordt gebruikt voor het identificeren van celkernen. OCT4 is één van de kritische transcriptiefactoren van pluripotent.- Incubeer H9 hESCs in MACME matrices in hPSC medium aangevuld met 10 µM EdU alkyn bij 37 ° C gedurende 30 minuten.
- Vlek na het wassen met Annexine-bindende buffer (10 mM HEPES (pH 7.4), 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCl2), de cellen met een oranje-belichting fluorescerende kleurstof-Annexine V-conjugaat bij 20 ° C gedurende 15 minuten.
- Los van de cellen in PBS met 4% (v/v) paraformaldehyde bij 20 ° C gedurende 15 minuten en spoel tweemaal op cellen met PBS.
- Permeabilize cellen met behulp van PBS met 0,3% (v/v) Triton X-100 bij 20 ° C voor 16 h.
Opmerking: Paraformaldehyde verzwakt de band tussen een kunststof grondplaat en een PDMS microfluidic structuur. Het detachement van de PDMS laag uit de array bij stap 3.2.1 kan dus ook worden uitgevoerd direct na deze stap. - Incubeer de cellen in Tris gebaseerde reactie buffer met een rood-fluorescerende kleurstof azide bij 20 ° C gedurende 30 minuten.
- Incubeer de cellen in de blokkeerbuffer (PBS met 5% (v/v) normale geit serum, 5% (v/v) normale ezel serum, 3% (m/v) bovien serumalbumine, 0,1% (v/v) Tween-20 en 0,1% (g/v) N-dodecyl-β-D-maltoside) bij 4 ° C voor 16 h.
- Incubeer in PBS met 0,5% (v/v) Triton X-100 oplossing en menselijke OCT3/4 antilichaam (muis IgG) bij 4 ° C voor 16 h.
- Incubeer in blokkeerbuffer met groen-fluorescerende kleurstof-geëtiketteerden ezel-antimuis IgG (H + L) bij 37 ° C gedurende 60 minuten.
- Incubeer in PBS met DAPI bij 20 ° C gedurende 30 minuten.
- PBS-DAPI vervangen door PBS.
- De matrix van de MACME bij 4 ° C tot Beeldacquisitie behouden.
-
Beeld van de overname (Figuur 4)
- Afschilferen van de PDMS microfluidic structuur van de MACME array.
- Verwijder de resterende PBS uit de MACME matrix, 90%(v/v) glycerol in PBS toepassen op de cellen en plaats van coverslips over de gekleurde cellen.
- Stel de plaat ondersteboven op het podium van een omgekeerde fluorescentie Microscoop.
- 12-bits kleurenafbeeldingen automatisch met behulp van alle gemotoriseerde onderdelen (toneel, filters, sluitertijd en focus systemen), die werden gecontroleerd door een Microscoop beeldbewerkingssoftware te verwerven.
Opmerking. In dit protocol blootstelling tijden zijn aangepast om in de buurt van maximale intensiteitswaarden bereiken (hoogste intensiteit van de pixel: 4096), maar geen verzadiging, voor elke afbeelding, DAPI, OCT4, Annexine V en EdU.
-
Computer-geleide beeldverwerking en fluorescentie signaal kwantificering (Figuur 5)
Opmerking: de volgende cel beeldanalyse wordt uitgevoerd op basis van een eerder beschreven methode37.- Kleurenafbeeldingen omzetten in grijswaarden.
- Een enkele drempelwaarde voor elke afbeelding DAPI berekenen met de methode Otsu en classificeren van pixels boven de drempel als voorgrond en hieronder als achtergrond. Zorg ervoor dat de voorgrond waarde komt met de fluorescerende intensiteit van de DAPI overeen.
Opmerking: De analyse van de installatiekopie bevat 5 stappen; identificatie van primaire objecten in de DAPI beelden, identificatie van secundaire objecten in OCT4, Annexine V en EdU beelden, respectievelijk, en meting van de intensiteit van het object. Figuur 3 biedt de beelden van de grafische gebruikersinterface (GUI) op de instelling van de beeldverwerking. - De fluorescerende intensiteiten van OCT4 en EdU op elke afbeelding te meten.
- De regio gekleurd met Annexine V met de voortplanting methode identificeren en kwantificeren van de fluorescerende intensiteit.
-
3.4. statistische analyse te visualiseren van individuele cellulaire fenotypen op eencellige imaging
- Normaliseren de input fluorescerende intensiteiten van iedere fenotypische markeerdraad door centreren en schalen van deze variabelen om hen gelijk gewicht.
- Zelf-organiserende kaart (SOM) analyses uit te voeren met behulp van een software-omgeving voor statistische berekeningen en afbeeldingen zoals beschreven door eerdere studies38,39.
- 25 SOM knooppunten maken met kenmerkende vier "codebook vectoren," overeenkomt met de fluorescerende intensiteiten van vier markeringen, DAPI, EdU, V Annexine en OCT4.
- Afzonderlijke cellen in elke communicatie toewijzen aan een "winnende" (meest vergelijkbaar) knooppunt, en plot als cel frequentie, volgens welke de codebook vectoren van het winnende knooppunt worden bijgewerkt met behulp van een gewogen gemiddelde, waar het gewicht is het tarief leren (hier, 0.05 als standaard).
Opmerking: Gegevens van kamers met minder dan 1000 cellen omdat datasets met een paar cellen niet statistisch relevante SOM resultaten verstrekten weglaten.
- Ongecontroleerde hiërarchische clustering met de waarden van de SOM-knooppunt met behulp van de methode van de gemiddelde-koppeling op basis van Pearson correlatie met een clustering software40uitvoeren
- De clustering gegevens renderen in dendrogram en heatmap beziet41.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
MACME arrays: ontwerp en fabricatie: In combinatie met nanofiber technologie gebruikten we de cultuur van de cel van de microfluidic- en screeningsprocedures van eerder gebruikte om te identificeren van de optimale omstandigheden voor hPSC zelf-vernieuwing of differentiatie35,36 (Figuur 1) technieken. Dit is zeer geschikt voor het opzetten van robuuste hoge gegevensdoorvoer cel-gebaseerde testen omdat de cel cultuur kamers en de voorwaarden precies controleerbaar en uitbreidbaar42,43,44. Hier, werd de nanofiber matrix voorbereid door een eenvoudige nanofiber afzetting methode, electrospinning met 3D-gedrukte maskers. Het deel van de microfluidic werd vervaardigd met een 3D-gedrukte schimmel aan de structuur van de kamer door vele proeven en fouten gemakkelijk te ontwerpen. De MACME matrix werd gebouwd door het combineren van de twee delen en bevatte 48 omgevingen, bieden verschillende biofysische en biochemische aanwijzingen door verschillende combinaties van beide nanofiber ECMs (3 soorten nanofiber materialen en 4 verschillende dichtheden of 4 controle matrix eiwitten) en cel-cel-interacties (3 bereiken van de eerste cel-zaaien dichtheid) als afgebeeld in Figuur 2.
Evaluatie van de algemene gevolgen van nanofiber eigenschappen en cellulaire dichtheid op hESC fenotypes: Naar aanleiding van de cultuur van de cel op een MACME array en op-plaat fluorescerende vlekken (Figuur 6A), eencellige metingen werden uitgevoerd met de verworven beelden. Dit protocol gebruikt voor het vergelijken van homogeniteit en heterogeniteit van expressie niveaus voor de vier fenotypische markers in elke dataset, SOM analyse38,39, die hoge-dimensionaal, multiparametric datasets in omzet laag-dimensionale 2D kaarten. Met name werden de resultaten van de nanofibers en 2DGT matrices PS weggelaten uit deze analyse gezien het feit dat de meeste cellen niet houden. Bovendien, uitgesloten van deze analyse werden die experimenten met lage CD waar cellen hadden geen genoeg direct (bijvoorbeeld juxtacrine) of de indirecte (paracrine) interacties te overleven. Na analyse van de SOM, ongecontroleerde hiërarchische clustering werd uitgevoerd voor de knooppunten van de SOM van alle geanalyseerde monsters (Figuur 6B). Door te overwegen de hoogte van de cluster dendrogram, de fenotypische verschillen konden we categoriseren van de monsters in drie groepen: groep i, allermeest naar de steekproef niches bestaande uit GT nanofibers, MG_HighCD, en VN_HighCD; Groep ii, monsters met GT nanofibers (GT_XLow en MidNF_MidCD), MG_MidCD of VN_MidCD; en groep iii, alle PMGI_NF monsters.
Om te bestuderen van de verschillen tussen de groepen, onderzochten we een representatieve steekproef uit elke groep (Figuur 6C; Groep i-GT_MidNF_HighCD, groep ii-GT_MidNF_MidCD en groep iii-PMGI_MidNF_HighCD). In termen van OCT4 signalen, alle groepen toonde een hogere uitdrukking dan die van MG (MG_MidCD). Groep die ik werd gekenmerkt door een hoge EdU signalen, die aangeeft dat de meeste cellen actief zijn prolifererende. Microenvironments in groep ik werden gekenmerkt als de omstandigheden geschikt voor hPSC onderhoud omdat ongedifferentieerde hPSCs meestal snel vermenigvuldigen wanneer celcyclus kloof fasen werden verkort dus45,46.
GT_MidNF_HighCD en GT_MidNF_MidCD van elkaar onderscheiden door hun verschillende dichtheden voor eerste cel-laden. Hoge initiële cel dichtheden meer cellen mogelijkheden om te communiceren met naburige cellen, die hun voortbestaan en verspreiding47verbeterd. Cellen zaadjes bij een onvoldoende oorspronkelijke dichtheid (3.0 × 104 cellen/cm2) overleefd noch groeide tijdens de proefperiode (4 dagen). Dus deed we niet nemen deze monsters in de analyse van de SOM; cel nummers waren onder de licht-donkerscheiding van 1000 levende cellen/kamer. De cellen op steigers van 2DGT waren ook gecategoriseerd als groep ii cellen; deze voorwaarden bieden geen ondersteuning voor hPSC zelf-vernieuwing48. De GT_MidNF_MidCD cellen EdU signaal was verloren en Annexine V niveaus werden iets verhoogd, die aangeeft dat de cellen hadden verloren hun stemness en geleidelijk apoptotic was geworden. PMGI_MidNF_HighCD, die de microenvironments bestaande uit PMGI nanofiber matrices vertegenwoordigt, toonde de grotere variaties in OCT4 en EdU signalen ten opzichte van de overige voorwaarden.
Figuur 1 . Screening van de strategie ter identificatie van de optimale cellulaire microenvironments voor de regulering van cellulaire functies. (A) overzicht van de onderdelen van de array multiplexed kunstmatige cellulaire communicatie (MACME). De array bestaat uit twee hoofdonderdelen: nanofiber bedden patroon op een basale substraat (nanofiber array) en een Polydimethylsiloxaan (PDMS)-gebaseerd microfluidic structuur. De MACME array is kundig voor voorbereiden nanofiber ECMs met een verscheidenheid aan functies (dat wil zeggen, nanofiber materialen en dichtheden) en verschillende cel zaaien dichtheden. De PDMS microfluidic structuur van de MACME matrix beschikt over drie hoogten van het microfluidic-kanaal (250, 500 en 1000 µm) voor het regelen van de eerste cel-zaaien dichtheid. (B) het effect van cellulaire microenvironments op cel fenotypen is kwantitatief geëvalueerd aan de hand van een eencellige beeld-gebaseerde bepaling en de statistische data-analyse door zelf-organiserende kaart (SOM) gevolgd door de hiërarchische clustering. Dit cijfer werd met toestemming van Wiley verwijzing €49 aangepast. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 . Ontwerp van de array MACME. (A) Overhead en hoge-hoek shots van de hele MACME array en het conceptueel diagram van een microfluidic-kanaal (lichtblauw) op een nanofiber matrix (roze). Elk kanaal is samengesteld uit een 700 µm breed en 8.4 mm lange cultuur kamer en twee baaien voor invoering van medium en cellen. (B) vergelijking van de grootte van cellen en nanofiber matrices. De hoogten van de cellen en nanofiber bedden variëren van 1-3 µm en 0,05-5.0 µm, respectievelijk. (C) een doorsnede van elk kanaal van de microfluidic met een hoogte van 250/500/1000 µm. Cellen en nanofiber bedden worden weergegeven als blauwe cirkels en oranje lijnen, respectievelijk. Elke kamer heeft het dezelfde breedte en lengte maar verschillende hoogtes (250, 500 en 1000 µm), en elk volume van de kamer was 1.6, 3.2 en 6,4 µL, respectievelijk. De zwarte gestippelde rechthoek in Figuur 2C duidt Figuur 2B. Figuur 2 werd met toestemming van Wiley verwijzing €49 aangepast. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 . Fabricage van MACME matrix. (A) productie van een nanofiber array. Patronen van meerdere nanofiber matrices op een basisplaat werd uitgevoerd door gewijzigde electrospinning met behulp van een set van maskers dragen gedessineerde gaten. Platina-coating werd uitgevoerd om nanofiber afzetting op een kunststof basisplaat. De maskers met verschillende gat-patronen werden voorbereid door een 3D-printer. Na maskers van het platina-gecoate oppervlak van de plaat, de plaat-masker set werd gezet op de collectie scherm en normale electrospinning werd uitgevoerd. De eerste nanofibers werden gevormd op de Pt-gecoate posities op de plaat door de gaten in het masker. Extra nanofiber bedden werden vervaardigd op de plaat door vervanging van het bestaande masker en herhalen van de procedure. (B) fabricage van een microfluidic structuur. De schimmel gedrukt door een 3D-printer met UV-uithardende hars vormige de PDMS laag van het microfluidic-apparaat. Na het gieten, werd de MACME array geassembleerd door het aanbrengen van een laag PDMS gebaseerde microfluidic met een oppervlak-geactiveerde nanofiber array. Figuur 3 werd met toestemming van Wiley verwijzing €49 aangepast. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 . Beelden van grafische gebruikersinterfaces (GUI) voor microscopische Beeldacquisitie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5 . Beelden van grafische gebruikersinterfaces (GUI) van de computer-geleide beeldverwerking voor eencellige fenotypering. De analyse van de installatiekopie bevat 5 stappen; (A) identificatie van primaire objecten in de DAPI beelden, (B-D) identificatie van secundaire objecten in OCT4, Annexin V en EdU beelden, respectievelijk, en meting van de intensiteit van het object. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6 . Fenotypering en classificatie van de fenotypen van H9 hESCs veranderd door microenvironmental factoren. (A) immunefluorescentie beelden van H9 hESCs gekweekt bij hoge initiële seeding dichtheid op gelatine (GT) nanofibers (GT_HighNF_HighCD), gekleurd met drie cellulaire fenotypische markeringen (OCT4, pluripotent; EdU, celproliferatie; Annexine V, apoptosis) en DAPI voor celkernen. (B) een heatmap en dendrograms van ongecontroleerde hiërarchische clustering. De geteste microenvironments waren ingedeeld in drie groepen met bijzondere kenmerken, gebaseerd op gelijkenissen van de fenotypen. Groep ik opgenomen GT nanofibers, MG_HighCD en VN_HighCD. Groep ii bestond uit monsters van GT nanofibers (GT_XLow en MidNF_MidCD), MG_MidCD, of VN_MidCD. Alle PMGI_NF monsters werden geclusterd in groep iii. In de heatmap, roze en blauwe kleuren geven aan hoge en lage cellulaire frequenties op de SOM graaf percelen, respectievelijk. (C) verdeling van de gekwantificeerde marker expressie niveaus van 1000 cellen bij een representatief monster uit elke groep (groep i-GT_MidNF_HighCD, groep ii-GT_MidNF_MidCD en groep iii-PMGI_MidNF_HighCD). De 25e en 75e percentiel werden aangeduid als de grenzen van het vak. De snorharen uit te breiden tot 1,5 keer de interkwartielafstand na de 25e en 75e percentiel. Experimenten werden driemaal herhaald voor elke groep. Figuur 6 A-C werden aangepast verwijzing €49 met toestemming van Wiley. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Naam | Kanaal lengte (mm) | Breedte van het kanaal (μm) | Kanaal, hoogte (μm) | De diameter van de inlaat/uitlaat (μm) | Inlaat/uitlaat hoogte (μm) | Mal lengte (mm) | Mal breedte (mm) | Mal hoogte (mm) |
| Schimmel | 8.4 | 700 | 250/500/1000 | 800 | 3000 | 127.76 | 85.48 | 14.35 |
| Naam | Dikte (μm) | Gat lengte (mm) | Gat breedte (mm) | Masker lengte (mm) | Masker breedte (mm) | Mal hoogte (mm) | Rij Offset (mm) | Kolom Offset (mm) |
| Masker | 1000 | 6 | 5 | 123,5 | 80.2 | 14.35 | 11.24 | 14.38 |
Tabel 1. Afmetingen van de mal voor een microfluidic structuur en een masker voor een nanofiber patronen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol wordt de eerste screeningsmethode om een systeem van de robuuste cultuur voor het onderhoud van gekwalificeerde hPSCs gedemonstreerd. Eerst, beschreven we hoe voor te bereiden op een platform met gevarieerde kunstmatige ECMs en cel dichtheden zaaien met behulp van een microfluidic apparaat geïntegreerd met een nanofiber-serie, de MACME array. Tweede, kwantitatieve beeld-gebaseerde eencellige fenotypering was uitgevoerd50 individuele cellulaire resultaten en gedrag veranderd door verschillende biochemische en biofysische functies te evalueren. In dit protocol, werd het milieu uit GT nanofiber en positieve controle ECM eiwitten in de voorwaarde van hoge initiële cel zaaien dichtheid gekenmerkt door de kenmerken van een ongedifferentieerde staat; snelle proliferatie45 en stabiel OCT4 expressie51. Deze opmerking aangegeven dat de moleculaire mechanismen met betrekking tot "cel-extracellulaire matrix" en "cel" interacties pluripotent van hPSCs kunnen beïnvloeden.
Deze strategie kan worden aangepast aan de gebruiker doel. Bijvoorbeeld kunnen cel manipulatie en doorvoer worden aangepast voor een verscheidenheid van experimentele instellingen door opnieuw ontwerpen van de vormen en de patronen van de microfluidic-structuur. Als een andere manier voor de verbetering van de doorvoer, zijn de inlaat en uitlaat standpunten van elke kamer ontworpen volgens de standaard microplate van 96-wells-platen, gestandaardiseerd door de maatschappij van biomoleculaire wetenschappen; Dus, kan een geautomatiseerde robot vloeistof dispenser worden gebruikt voor high-throughput screening. Om verder te onderzoeken het moleculaire mechanisme betreffende "Cel-ECM interactions", kunnen de kunstmatige cellulaire microenvironments worden gemaakt om preciezer in vivo omstandigheden nabootsen door de nanofibers met moleculen52 signalering chemisch te wijzigen .
Tot op heden de meeste platformen ontwikkeld voor het screenen van cellulaire microenvironments gericht op screening van oplosbare factoren (e.g., groeifactoren en chemische verbindingen)42,43,44, maar niet nanofiber ECMs ten gevolge moeilijkheden bij het combineren van de verschillende productie-technieken. Bijvoorbeeld een nanofiber blad produceert een kleine opening tussen de structuur van een microfluidic en een basisplaat en zorgt ervoor dat hun unstable bonding, waardoor kruisbesmetting tussen de verschillende monsters omdat een kweekmedium mengen met een andere kamer van een door de kleine opening. Onze nieuwe methode vergemakkelijkt de eenvoudige en nauwkeurige fabricage van nanofiber matrices op specifieke locaties en laat hun directe binding met de basisplaat, die zowel unstable hechting en kruisbesmetting voorkomen. Bovendien enkele platformen53 geïntegreerd met microfluidics en nanofiber matrices zijn toegankelijk voor de systematische manipulatie van zowel chemische en fysieke signalen om te onderzoeken op hun effecten op de functies van de cel, omdat de technologieën die nodig zijn voor de integratie waren gesofisticeerde. Onze eencellige profielen met de MACME array kan worden uitgevoerd met een eenvoudig apparaat en eenvoudige technieken en houdt groot potentieel voor gebruik in het modelleren van cellulaire omgevingen voor ontwikkelingsstoornissen en cel biologische studies en drugontdekking / screening.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen.
Acknowledgments
We bedanken Prof. N. Nakatsuji op iCeMS, de Universiteit van Kyoto, voor het verstrekken van menselijke ES-cellen. Wij danken ook Prof. A. Maruyama aan Tokyo Institute of Technology voor zijn ondersteuning bij het gebruik van de atomaire kracht Microscoop. Financiering was gulle wijze aangeboden door de vereniging van Japan voor de promotie van wetenschap (JSPS; 22350104, 23681028, 25886006 en 24656502); financiering werd ook verstrekt door de nieuwe energie en industriële technologie ontwikkeling organisatie (NEDO) en de Terumo Life Science Foundation. De WPI-iCeMS wordt ondersteund door de World Premier International Research Centrum initiatief (WPI), het ministerie van onderwijs, cultuur, sport, wetenschap en technologie (MEXT), Japan. Een deel van dit werk werd gesteund door de Kyoto Universiteit nanotechnologie Hub en het AIST Nano-Processing Facility in "Nanotechnologie Platform Project" gesponsord door MEXT, Japan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polystyrene (PS) | Sigma | #182435 | Average Mw: 290,000, average Mn: 130,000 |
| Polymethylglutarimide (PMGI) | MicroChem | G113113 | |
| Gelatin (GT) | Sigma | G2625 | From porcine skin, type A |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Doe Corning Toray | #1064291 | PDMS curing agent and silicone elastomer base are components of this kit. |
| OpenSCAD | This is a free 3D computer graphics software (http://www.openscad.org/) used for designing the mold of the microfluidic device. | ||
| AutoCAD 2014 | Autodesk | This is a 3D computer graphics software (https://www.autodesk.com/products/autocad/overview) used for design of the mask used on nanofiber-array preparation. | |
| 3D printer, AGILISTA-3000 | Keyence | ||
| UV-curable resin, AR-M2 | Keyence | This is used for 3D printing by Agilista. | |
| Acetic acid | Sigma | #338826 | ≥99.99% |
| Ethyl acetate | Sigma | #270989 | Anhydrous, 99.8% |
| Tetrahydrofuran (THF) | Sigma | #401757 | |
| MSP-30T | Vacuum Device | Magnetron sputtering machine | |
| Nunc OmniTray | Thermo Fisher Scientific | #242811 | This is a polystyrene baseplate on which the nanofiber array is created. This plate size is typically 127.7 x 85.5 mm. |
| Gun-type corona discharge machine | Shinko Electric & Instrumentation | CFG-500 | This handy device is used to generate corona for activation of the bottom surface of the PDMS layer at step 1.5 "Assembly of the MACME arrays" in the protocol. |
| 5 mL syringe | Terumo | SS-05SZ | |
| Stainless-steel blunt needle (23-gauge) | Nipro | #2166 | Outside diameter and length are 0.6 and 32 mm, respectively. |
| High-voltage power supply | TechDempaz | ||
| 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide, hydrochloride | Dojindo | W001 | |
| N-Hydroxysuccinimide | Sigma | #56480 | |
| Matrigel hESC-Qualified Matrix | Corning | #354277 | This protein is refered as basement membrane gel matrix in the protocol. |
| CellAdhere Vitronectin, Human, Solution | STEMCELL Technologies | #07004 | |
| TeSR-E8 | STEMCELL Technologies | #05940 | Feeder-free, xeno-free culture medium for maintenance of human ES and iPS cells |
| Y-27632 | Wako Pure Chemical Industries | #253-00513 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red | Thermo Fisher Scientific | #12605028 | This ia a recombinant trypsin-like protease for dissociation of adherant mammalian cells. |
| Click-iT EdU Imaging Kit with Alexa Fluor 647 Azides | Thermo Fisher Scientific | C10086 | The fluorescent labeling of proliferating cells in on-plate fluorescent staining was performed along the product manual of this kit. |
| Annexin V, Alexa Fluor 594 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A13203 | |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Oct-3/4 Antibody (C-10) | Santa Cruz Biotechnology | sc-5279 | |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (DyLight 488) | abcam | ab96875 | This is a secondary antibody used in on-plate fluorescent cell staining. |
| ECLIPSE Ti-E | Nikon | This is an inverted fluorescence microscope equipped with a CFI Plan Fluor 4×/0.13 N.A. objective lens (Nikon), CCD camera (ORCA-R2, Hamamatsu), mercury lamp (Intensilight, Nikon), XYZ automated stage (Ti-S-ER motorized stage with encoders, Nikon), and filter cubes for four fluorescence channels (DAPI, GFP HYQ, TRITC, Cy5; Nikon) | |
| NIS-Elements Advanced Research | Nikon | This is a microscope imaging software used for automatic image acquisition. | |
| CellProfiler, Version 2.1.0 | This is a free open software for cell image analysis (http://cellprofiler.org/). | ||
| R | SOM analysis is performed by kohonen package of this software. This is freely available (https://www.r-project.org/). | ||
| Cluster 3.0 | This is the open source clustering software (http://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster/software.htm). Unsupervised hierarchical clustering is performed with this software. | ||
| Java TreeView | This open source software (http://jtreeview.sourceforge.net/) is used to visualize clustering data as a heatmap and a dendrogram. | ||
| H9 human embryonic stem cell | WiCell Stem Cell Bank | WA09 |
References
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Ameen, C., et al. Human embryonic stem cells: Current technologies and emerging industrial applications. Crit Rev Oncol Hematol. 65 (1), 54-80 (2008).
- Nishikawa, S., Goldstein, R. A., Nierras, C. R. The promise of human induced pluripotent stem cells for research and therapy. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (9), 725-729 (2008).
- Robinton, D. A., Daley, G. Q. The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy. Nature. 481 (7381), 295-305 (2012).
- Sartipy, P., Bjorquist, P., Strehl, R., Hyllner, J. The application of human embryonic stem cell technologies to drug discovery. Drug Discovery Today. 12 (17-18), 688-699 (2007).
- Discher, D. E., Mooney, D. J., Zandstra, P. W. Growth factors, matrices, and forces combine and control stem cells. Science. 324 (5935), 1673-1677 (2009).
- Joyce, J. A., Pollard, J. W. Microenvironmental regulation of metastasis. Nat Rev Cancer. 9 (4), 239-252 (2009).
- Danhier, F., Feron, O., Preat, V. To exploit the tumor microenvironment: Passive and active tumor targeting of nanocarriers for anti-cancer drug delivery. J Control Release. 148 (2), 135-146 (2010).
- Murphy, W. L., McDevitt, T. C., Engler, A. J. Materials as stem cell regulators. Nat Mater. 13 (6), 547-557 (2014).
- Patel, A. K., et al. A defined synthetic substrate for serum-free culture of human stem cell derived cardiomyocytes with improved functional maturity identified using combinatorial materials microarrays. Biomaterials. 61, 257-265 (2015).
- Zhang, R., et al. A thermoresponsive and chemically defined hydrogel for long-term culture of human embryonic stem cells. Nat Commun. 4, (2013).
- Anderson, D. G., Putnam, D., Lavik, E. B., Mahmood, T. A., Langer, R. Biomaterial microarrays: rapid, microscale screening of polymer-cell interaction. Biomaterials. 26 (23), 4892-4897 (2005).
- Celiz, A. D., et al. Discovery of a Novel Polymer for Human Pluripotent Stem Cell Expansion and Multilineage Differentiation. Adv Mater. 27 (27), 4006-4012 (2015).
- Hansen, A., et al. High-Density Polymer Microarrays: Identifying Synthetic Polymers that Control Human Embryonic Stem Cell Growth. Adv Healthcare Mater. 3 (6), 848-853 (2014).
- Mei, Y., et al. A high throughput micro-array system of polymer surfaces for the manipulation of primary pancreatic islet cells. Biomaterials. 31 (34), 8989-8995 (2010).
- Saha, K., et al. Surface-engineered substrates for improved human pluripotent stem cell culture under fully defined conditions. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (46), 18714-18719 (2011).
- Bettinger, C. J., Langer, R., Borenstein, J. T. Engineering substrate topography at the micro- and nanoscale to control cell function. Angew Chem Int Ed Engl. 48 (30), 5406-5415 (2009).
- McMurray, R. J., et al. Nanoscale surfaces for the long-term maintenance of mesenchymal stem cell phenotype and multipotency. Nat Mater. 10 (8), 637-644 (2011).
- Sun, Y., Jallerat, Q., Szymanski, J. M., Feinberg, A. W. Conformal nanopatterning of extracellular matrix proteins onto topographically complex surfaces. Nat Methods. 12 (2), 134-136 (2015).
- Nitanan, T., et al. Effects of processing parameters on morphology of electrospun polystyrene nanofibers. Korean J Chem Eng. 29 (2), 173-181 (2012).
- Liu, L., et al. Chemically-defined scaffolds created with electrospun synthetic nanofibers to maintain mouse embryonic stem cell culture under feeder-free conditions. Biotechnol Lett. 34 (10), 1951-1957 (2012).
- Liu, L., et al. Nanofibrous gelatin substrates for long-term expansion of human pluripotent stem cells. Biomaterials. 35 (24), 6259-6267 (2014).
- Kamei, K., et al. Phenotypic and transcriptional modulation of human pluripotent stem cells induced by nano/microfabrication materials. Adv Healthcare Mater. 2 (2), 287-291 (2013).
- Peerani, R., et al. Niche-mediated control of human embryonic stem cell self-renewal and differentiation. EMBO J. 26 (22), 4744-4755 (2007).
- Yamamoto, K., et al. Fluid shear stress induces differentiation of Flk-1-positive embryonic stem cells into vascular endothelial cells in vitro. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 288 (4), 1915-1924 (2005).
- Charati, S. G., Stern, S. A. Diffusion of gases in silicone polymers: Molecular dynamics simulations. Macromolecules. 31 (16), 5529-5535 (1998).
- Prado-Lopez, S., et al. Hypoxia promotes efficient differentiation of human embryonic stem cells to functional endothelium. Stem Cells. 28 (3), 407-418 (2010).
- Yanagihara, K., et al. Prediction of Differentiation Tendency Toward Hepatocytes from Gene Expression in Undifferentiated Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cells and Development. 25 (24), 1884-1897 (2016).
- Kamei, K., et al. 3D printing of soft lithography mold for rapid production of polydimethylsiloxane-based microfluidic devices for cell stimulation with concentration gradients. Biomed Microdevices. 17 (2), (2015).
- Song, J. H., Kim, H. E., Kim, H. W. Production of electrospun gelatin nanofiber by water-based co-solvent approach. J Mater Sci Mater Med. 19 (1), 95-102 (2008).
- Owen, M. J., Smith, P. J. Plasma Treatment of Polydimethylsiloxane. J Adhes Sci Technol. 8 (10), 1063-1075 (1994).
- Chen, G. K., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nat Methods. 8 (5), 424-476 (2011).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25 (6), 681-686 (2007).
- Kamei, K., et al. An integrated microfluidic culture device for quantitative analysis of human embryonic stem cells. Lab Chip. 9 (4), 555-563 (2009).
- Kamei, K., et al. Microfluidic image cytometry for quantitative single-cell profiling of human pluripotent stem cells in chemically defined conditions. Lab Chip. 10 (9), 1113-1119 (2010).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7 (10), 100 (2006).
- Kohonen, T. Self-Organized Formation of Topologically Correct Feature Maps. Biol Cybern. 43 (1), 59-69 (1982).
- Wehrens, R., Buydens, L. M. C. Self- and super-organizing maps in R: The kohonen package. J Stat Softw. 21 (5), 1-19 (2007).
- Eisen, M. B., Spellman, P. T., Brown, P. O., Botstein, D. Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (25), 14863-14868 (1998).
- Saldanha, A. J. Java Treeview--extensible visualization of microarray data. Bioinformatics. 20 (17), 3246-3248 (2004).
- Du, G. S., Fang, Q., den Toonder, J. M. J. Microfluidics for cell-based high throughput screening platformsd-A review. Anal Chim Acta. 903, 36-50 (2016).
- Huang, S. B., et al. An integrated microfluidic cell culture system for high-throughput perfusion three-dimensional cell culture-based assays: effect of cell culture model on the results of chemosensitivity assays dagger. Lab Chip. 13 (6), 1133-1143 (2013).
- Wang, B. L., et al. Microfluidic high-throughput culturing of single cells for selection based on extracellular metabolite production or consumption. Nat Biotechnol. 32 (5), 473 (2014).
- Becker, K. A., et al. Self-renewal of human embryonic stem cells is supported by a shortened G1 cell cycle phase. J Cell Physiol. 209 (3), 883-893 (2006).
- Neganova, I., Lako, M. G1 to S phase cell cycle transition in somatic and embryonic stem cells. J Anat. 213 (1), 30-44 (2008).
- Fox, V., et al. Cell-cell signaling through NOTCH regulates human embryonic stem cell proliferation. Stem Cells. 26 (3), 715-723 (2008).
- Xu, C., et al. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 19 (10), 971-974 (2001).
- Kamei, K., et al. Microfluidic-Nanofiber Hybrid Array for Screening of Cellular Microenvironments. Small. 13 (18), (2017).
- Sun, J., et al. A Microfluidic Platform for Systems Pathology: Multiparameter Single-Cell Signaling Measurements of Clinical Brain Tumor Specimens. Cancer Res. 70 (15), 6128-6138 (2010).
- Theunissen, T. W., Jaenisch, R. Molecular Control of Induced Pluripotency. Cell Stem Cell. 14 (6), 720-734 (2014).
- Yoo, H. S., Kim, T. G., Park, T. G. Surface-functionalized electrospun nanofibers for tissue engineering and drug delivery. Adv Drug Del Rev. 61 (12), 1033-1042 (2009).
- Dixon, J. E., et al. Combined hydrogels that switch human pluripotent stem cells from self-renewal to differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (15), 5580-5585 (2014).
