Summary
Cet article décrit la méthodologie détaillée pour préparer un tableau microenvironnement cellulaire artificiel multiplexés (MACME) pour le haut débit manipulation physique et chimique cues imitant en vivo microenvironnements cellulaires et à identifier l’environnement cellulaire optimal pour les cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs) avec le profilage de cellule unique.
Abstract
Microenvironnements cellulaires se composent d’une variété d’indices, comme des facteurs de croissance, matrices extracellulaires et interactions intercellulaires. Ces signaux est bien orchestré et ils est essentiels à la régulation des fonctions cellulaires dans un système vivant. Bien qu’un certain nombre de chercheurs ont tenté d’enquêter sur la corrélation entre les facteurs environnementaux et les fonctions cellulaires désirées, une grande partie reste inconnue. C’est en grande partie en raison de l’absence d’une méthodologie appropriée pour imiter ces signaux environnementaux in vitroet de tester simultanément les différents signaux environnementaux sur les cellules. Nous rapportons ici une plateforme intégrée de canaux microfluidiques et un tableau de nanofibres, suivie haute teneur unicellulaires analyse, afin d’examiner les phénotypes de cellules souches modifiées par des facteurs environnementaux distincts. Pour illustrer l’application de cette plate-forme, cette étude se concentre sur les phénotypes de renouvellement automatique des cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs). Nous présentons ici les procédures de préparation pour un tableau de nanofibres et de la structure de la microfluidique dans la fabrication d’un tableau du microenvironnement cellulaire artificiel multiplexés (MACME). En outre, les étapes globales de la seule cellule de profilage, cellule souillant avec plusieurs marqueurs fluorescents, imagerie de fluorescence multiples et des analyses statistiques, sont décrites.
Introduction
De1,(hPSCs) des cellules souches pluripotentes humaines2 se renouveler de manière illimitée et se différencient en diverses lignées de tissu, qui pourraient révolutionner le développement des médicaments, thérapies cellulaires, génie tissulaire et la médecine régénérative 3 , 4 , 5 , 6. plats de culture générale et de microplaques, cependant, ne sont pas conçus pour permettre la manipulation précise de cellules physiques et chimiques au niveau cellulaire avec la gamme de nano - de micromètres, qui est un facteur critique pour l’expansion cellulaire, l’auto-renouvellement et différenciation. Pour remédier à cet inconvénient, les études ont examiné le rôle des micro-environnements cellulaires dans la régulation des décisions de la cellule-destin et cellule fonctions4. Ces dernières années, un nombre croissant d’études ont été mené pour reconstruire des micro-environnements cellulaire in vitro7,8. Processus de nano - et microfabrication ont établi ces micro-environnements à travers la manipulation de produits chimiques9,10,11,12,13, 14,15,16,17 et physique18,19,20 signaux environnementaux. Jusqu'à présent, aucune n’a été d’étudier systématiquement les mécanismes sous-jacents des signaux environnementaux chimiques et physiques sur les décisions de la cellule-destin et fonctions au sein d’une plate-forme unique.
Ici, nous introduisons une stratégie fondée sur les principes de conception simple pour établir une plate-forme robuste de dépistage (Figure 1). Tout d’abord, les auteurs décrivent la procédure d’élaboration d’une plate-forme intégrée pour créer des micro-environnements cellulaires polyvalents, artificielles en utilisant un tableau de nanofibres et une structure microfluidique : tableau The multiplexés artificiel cellulaire microenvironnement (MACME) (Figure 1A et 2 a). Le tableau de nanofibres a 12 microenvironnements différents dans diverses combinaisons de matériaux de nanofibres et de densité. Électrofilage servait à fabriquer des nanofibres. Les matériaux de nanofibres, tels que le polystyrène (PS)21, polymethylglutarimide (PMGI)22et23de gélatine (GT), ont été conçus pour tester leurs propriétés chimiques, ce qui pourraient affecter adhésion cellulaire et maintien de la pluripotence ( Figure 2B). Les densités de nanofibres étaient variées en changeant de temps électrofilage et les nanofibres générés ont été définis selon leurs densités (DNF, avec D = XLow/Low/Mid/High). La structure de la microfluidique est composée de polydiméthylsiloxane (PDMS) hébergeant les 48 chambres de culture de cellules, qui peuvent être positionnés selon les dimensions standards de la Microplaque 96 puits. PDMS est un polymère biocompatible et gaz échangeable, généralement utilisé pour la fabrication de dispositifs microfluidiques24. Chaque canal microfluidique a été conçu pour être 700 µm large et 8,4 mm de long et avait deux anses sur ses bords (tableau 1). Les chambres ont des hauteurs différentes (250, 500 et 1000 µm) pour manipuler l’ensemencement des cellules densités initiales (0,3, 0,6 et 1,2 × 105 cellules/cm2), qui pourraient mettre en corrélation avec la survie, la prolifération et la différenciation des hPSCs25 (Figure 2C). Le nombre de cellules ensemencées dans une chambre est proportionnel à la densité de la colonne au-dessus du plancher de la chambre, et ainsi la cellule initiale, la densité de semis a contrôlé en introduisant la même suspension cellulaire dans des chambres de culture à différentes hauteurs. Tous les canaux ont été conçus pour être ≥ 250 µm-hauteur26 pour minimiser les effets de tension faible teneur en oxygène27 et contrainte de cisaillement28 sur les cellules. Hauteurs de canal de 250, 500 et 1000 µm sont abrégés ici comme XCD avec X = Low, Mid et High, respectivement. Les environnements avec des densités de nanofibres distinctes et densités d’ensemencement des cellules initiales ont été raccourcies comme « Material_NF density_Cell densité » (par exemple, GT_HighNF_HighCD : un environnement caractérisé par des nanofibres de GT haute densités et haute cellule-amorçage initial densité).
Par la suite, nous décrivons comment effectuer des analyses de cellules individuelles afin d’étudier systématiquement les comportement cellulaire en réponse à des facteurs environnementaux (Figure 1B). Comme une preuve de concept, nous avons identifié l’environnement cellulaire optimal pour hPSC autorenouvellement, qui est une fonction clée pour hPSC entretien (Figure 1B)29. Imageur cytométrie en flux, suivie d’analyses statistiques, permet une interprétation quantitative des réponses phénotypiques cellulaires individuelles aux environnements cellulaires. Parmi une variété de fonctions cellulaires, ce document fournit une procédure détaillée afin d’identifier les conditions optimales pour le maintien de hPSC l’auto-renouvellement.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. fabrication du tableau MACME
Remarque : Tous les matériaux et les équipements sont répertoriés dans la Table des matières.
-
Préparation de masques pour un tableau de nanofibres et un moule pour une structure de microfluidique
- Créer des images tridimensionnelles (3D) de masques utilisés pour les tableaux de nanofibres et les moules de microfluidique de structures à l’aide de paquets de logiciels 3D-infographie (tableau 1).
Remarque : Les images 3D sont lus et imprimés par une imprimante 3D. Les masques imprimés et la moisissure ont les mêmes dimensions avec des images 3D définis à l’aide du logiciel de graphisme à étape 1.1.1. - Imprimez des masques et un moule basé sur ces dessins à l’aide d’une imprimante 3D.
Remarque : Dans ce protocole, une imprimante 3D type-jet d’encre avec de la résine UV curable a été utilisé30. La résolution de l’imprimante était 635 × 400 dpi et 15 µm en X, Y et Z, respectivement, cependant, le réel X, Y de résolution est environ quatre fois plus faible.
- Créer des images tridimensionnelles (3D) de masques utilisés pour les tableaux de nanofibres et les moules de microfluidique de structures à l’aide de paquets de logiciels 3D-infographie (tableau 1).
-
Préparation de nanofibres-tableau (Figure 3A)
- Préparer des solutions de polymère électrofilage.
- Diluer 13 % PMGI liquide avec le tétrahydrofurane par 9 % (p/v)22.
- Dissoudre 0,08 g de PS (poids moléculaire de moyenne en nombre (Mn) : 130 000) en THF:dimethylformamide (ratio 1:1 volume)21et ajouter THF:dimethylformamide pour porter le volume jusqu'à la finale 1 mL (solution de PS de 8 % (p/v)).
- Dissoudre 0,1 g de GT dans l’eau : acétique acide : éthylacétate (rapport de volume de 1:1.6:2.1) et ajouter de l’eau : l’acide acétique : éthylacétate pour porter le volume jusqu'à la finale 1 mL (solution à 10 % (p/v) GT) comme décrit23,31.
- Utiliser un magnetron sputtering machine, déposer une fine couche de platine d’une épaisseur de 5 nm sur une platine de polystyrène (PS) (127,7 × 85,5 mm), qui sert une cathode dans le setup électrofilage.
- Chargez chaque solution de polymère dans une seringue de 5 mL équipée d’une aiguille émoussée inox de 23-G.
- Place et ancre la seringue avec l’aiguille sur un pousse-seringue avec 12 cm en plus du collecteur de l’appareil électrofilage.
- Connectez l’aiguille de la seringue à une alimentation haute tension et d’appliquer à 11 kV.
- Régler le débit de pompage de 0,2 mL/h.
- Maintenir la température et l’humidité à 30 ° C et < 30 % (v/v).
- Mettre le masque sur la plaque de base établi à l’étape 1.2.2.
- Fabriquer des nanofibres sur la plaque de base à travers les trous du masque avec des densités différentes en changeant le temps électrofilage (p. ex., 20, 60, 90 et 180 s).
- Retirer le masque de la plaque de base.
Remarque. L’éthanol peut être pulvérisé sur les nanofibres GT électrofilées avant d’enlever le masque pour éviter d’épluchage nanofibres GT ainsi que le masque. - Répétez l’étape 1.2.4-1.2.10 jusqu'à l’achèvement de la fabrication de nanofibres-tableau.
- Placer le tableau de nanofibres dans un dessicateur à 25 ° C pendant 16 h faire évaporer le solvant résiduel.
- Nanofibres Crosslink GT avec 0,2 M 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) et 0,2 M N-hydroxysuccinimide (NHS) dans l’éthanol à 25 ° C pendant 4 h23.
- Rincer les nanofibres GT deux fois avec 99,5 % (v/v) d’éthanol et de séchage sous vide à 25 ° C pendant 16 h.
- Préparer des solutions de polymère électrofilage.
-
Fabrication de structures microfluidiques (Figure 3B)
- Dissoudre 2 g de PDMS polymérisation agent et 20 g de base PDMS (01:10 poids ratio ; Pre-PDMS). 24
- Verser le mélange de pre-PDMS sur le moule fabriqué à l’étape 1.2.
- Dé-gaz du mélange de pre-PDMS dans un dessiccateur pendant 30 min.
- Guérir le mélange de pre-PDMS dans un four à 65 ° C pendant 16 h.
-
Baies de montage de MACME (Figure 3B)
- Décollez la structure PDMS guérie à étape 1.3.4 du moule et nettoyer avec de l’éthanol à 70 % (v/v).
- Traiter la décharge corona atmosphérique sur la face inférieure de la structure PDMS32.
Remarque : Dans ce protocole, la Couronne s’acquitte de la totalité de la surface d’une couche de 3 ou 4 fois avec un appareil à décharge corona « Handy ». Traitement au plasma d’oxygène a été remplacé par décharge corona atmosphérique d’altérer la surface de l’adhérence. - Assembler la structure PDMS avec le tableau de nanofibres de rapidement.
- Cuire au four à 65° C pendant 2 jours.
2. chargement CSEh en tableau MACME
- Pour la culture courante de H9 cellules souches embryonnaires humaines (CSEh), maintenir les cellules en xeno-free définies chimiquement milieu de culture pour l’entretien de hPSC33 additionné de 10 µM Y-27632 ROCK inhibiteur34 (nommé hPSC moyen) dans une culture cellulaire de 35 mm plat recouvert de matrice de gel de membrane basale (MG).
- Cellules de passage tous les jours 4 à 7 à l’aide d’une protéase recombinante de la trypsine.
- Stériliser un tableau MACME avec 99,5 % d’éthanol, de chargement dans les chambres pendant 10 min et retirez l’éthanol. Répétez cette opération 3 fois.
- Introduire 12 µL de MG, 10 µg/mL la vitronectine (VL), et 0,1 % (p/v) GT en contrôle culture chambers et incuber les chambres à 37 ° C pendant 1 h à enduisez-les sur les surfaces de la chambre.
Remarque : Dans ce protocole, MG, VN et GT ont été choisis comme protéines de référence pour l’adhésion cellulaire et de la culture. Parce que MG et VN sont des matrices de culture cellulaire standard utilisés pour maintenir les hPSC autorenouvellement, ils sont utilisés comme témoins positifs ; deux dimensions revêtement GT (2DGT) ou non-revêtement (NC) étaient utilisés comme témoins négatifs. - Introduire hPSC préchauffé moyen dans toutes les chambres du tableau MACME. Incuber les chambres pendant 30 min à 37 ° C.
- CSEh H9 laver cultivé sur un plat de 35 mm avec le SPD, ajouter 0,5 mL d’une protéase de trypsine recombinante au plat et incuber à 37 ° C pendant 1 min et aspirer soigneusement uniquement les fractions surnageantes mélangés avec la protéase.
Remarque : À l’étape de l’aspiration, les cellules ne sont pas détachés. - Ajouter immédiatement le hPSC moyen, verser doucement le support contre la surface de plat à plusieurs reprises pour dissocier les cellules et transférer les cellules individuelles dans un tube conique de 15 mL.
- Centrifuger à 200 x g pendant 3 min. aspirer le surnageant et suspendre les cellules dans un milieu hPSC préchauffé.
- Introduire 12 µL de la suspension cellulaire (1,2 × 106 cellules/mL) dans chaque chambre de la microfluidique.
Remarque : Introduire des cellules à une chambre de l’autre à l’aide d’une micropipette. Parce que le nombre de cellules ensemencées aux chambres est proportionnel à la densité de la colonne au-dessus du plancher de la chambre, la densité de semis cellule initiale pourrait être contrôlée même si des échantillons de la même suspension cellulaire ont été utilisés. Ce pipetage se fasse doucement. Supprimer les excès du milieu des chambres à l’aide d’un bâtonnet de coton-tige après le chargement. Le tableau MACME est compatible avec les pipettes de laboratoire couramment utilisés et les systèmes automatisés de pipette, et il ne nécessite aucun équipement spécial. - Changer hPSC moyenne chaque 12 h et la culture pendant 4 jours.
Remarque : Les volumes constantes du milieu (1.6, 3.2 et 6.4 µL) sont maintenues à l’aide de chambres de tailles différentes. Cellules en culture dans des conditions statiques pour minimiser les contraintes de cisaillement à l’exception de l’échange du milieu de culture cellulaire35,36.
3. quantitatives unicellulaires profilage
-
Coloration de cellules fluorescentes sur plaque
Remarque : pour analyser les changements phénotypiques du renouvellement automatique hPSCs, ce protocole sélectionné trois marqueurs phénotypiques clés de ce protocole : OCT4, éthynyl-5-2'-déoxyuridine (EdU) et l’annexine V, pour mesurer l’état de pluripotence, prolifération et apoptose , respectivement (Figure 2b). 4', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) est utilisé pour identifier des noyaux cellulaires. Oct4 est l’un des facteurs de transcription critique de pluripotence.- Incuber les CSEh H9 dans les baies de MACME dans hPSC additionné de 10 alcyne de EdU µM à 37 ° C pendant 30 min.
- Après le lavage avec le tampon de l’annexine-liaison (HEPES (pH 7,4), 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCl2de 10 mM), détachant les cellules avec un conjugué de V annexine-colorant orange fluorescente à 20 ° C pendant 15 min.
- Fixer les cellules dans du PBS avec paraformaldéhyde à 4 % (v/v) à 20 ° C pendant 15 min et deux fois, puis rincez les cellules avec du PBS.
- Permeabilize des cellules à l’aide de PBS avec 0,3 % (v/v) X-100 Triton à 20 ° C pendant 16 h.
Remarque : Paraformaldéhyde affaiblit la liaison entre une plaque de base en plastique et une structure de microfluidique PDMS. Ainsi, le détachement de la couche PDMS du tableau à l’étape 3.2.1 peut également être effectué juste après cette étape. - Incuber les cellules dans un tampon Tris-base réaction avec un azoture de colorant fluorescent rouge à 20 ° C pendant 30 min.
- Incuber les cellules dans un tampon bloquant (PBS avec sérum de chèvre normal de 5 % (v/v) de sérum de 5 % (v/v) âne normal, 3 % (p/v) d’albumine sérique bovine, 0,1 % (v/v) de Tween-20 et 0,1 % de (p/v) N-dodécyl-β-D-maltoside) à 4 ° C pendant 16 h.
- Incuber dans du PBS contenant 0,5 % (v/v) solution de Triton X-100 et humaines OCT3/4 anticorps (IgG de souris) à 4 ° C pendant 16 h.
- Incuber dans un tampon bloquant avec anti-souris vert fluorescent dye-labeled âne IgG (H + L) à 37 ° C pendant 60 min.
- Incuber dans du PBS au DAPI à 20 ° C pendant 30 min.
- Remplacez PBS-DAPI par PBS.
- Garder le tableau MACME à 4 ° C jusqu'à l’acquisition d’images.
-
Acquisition d’image (Figure 4)
- Décollez la structure microfluidique PDMS du tableau MACME.
- Supprimez le PBS résiduel du tableau MACME, appliquer 90%(v/v) glycérol dans du PBS aux cellules et placez les lamelles sur les cellules colorées.
- Mettre la plaque de tête en bas sur la scène d’un microscope à fluorescence inversé.
- Acquisition d’images de couleur 12-bit automatiquement à l’aide de tous les composants motorisés (scène, filtres, obturateur et les systèmes de mise au point) qui étaient contrôlés par un microscope, logiciels d’imagerie.
Remarque. Dans ce protocole, les temps d’exposition sont ajustées pour atteindre près de valeurs de l’intensité maximale (intensité maximale de pixel : 4096), mais aucune saturation, pour chaque image, DAPI, OCT4, Annexin V et EdU.
-
Traitement de l’image guidée par ordinateur et fluorescence signal quantification (Figure 5)
Remarque : l’analyse d’image cellule suivante est effectuée selon la méthode décrite précédemment37.- Convertir des images en couleur en niveaux de gris.
- Calculer une valeur de seuil unique pour chaque image DAPI avec la méthode d’Otsu et classer les pixels au-dessus du seuil comme de premier plan et en dessous comme toile de fond. Assurez-vous que la valeur foreground correspond à l’intensité de fluorescence de DAPI.
Remarque : Le processus d’analyse image contient 5 étapes ; identification des objets primaires au DAPI images, identification des objets secondaires OCT4, Annexin V et EdU images, respectivement et la mesure de l’intensité de l’objet. La figure 3 fournit les images de l’interface utilisateur graphique (GUI) sur le cadre du traitement de l’image. - Mesurer les intensités de fluorescence des OCT4 et EdU sur chaque image.
- Indiquez la région tachée avec annexine V avec la méthode de propagation et de quantifier l’intensité de fluorescence.
-
3.4. analyse statistique pour visualiser les différents phénotypes cellulaires sur l’imagerie de cellules individuelles
- Normaliser les intensités de fluorescence d’entrée de chaque marqueur phénotypique de centrage et de mise à l’échelle de ces variables pour leur donner un poids égal.
- Effectuer une analyse de carte (SOM) self-organizing en utilisant un environnement logiciel pour le calcul statistique et graphique tel que décrit par les précédentes études38,39.
- Créer 25 nœuds SOM avec distinctif quatre « codebook vecteurs » correspondant à l’intensité fluorescente des quatre marqueurs, DAPI, EdU, annexine V et OCT4.
- Assigner des cellules individuelles dans chaque microenvironnement vers un nœud « gagnante » (plus proche) et tracer comme fréquence de cellules, selon lequel les vecteurs codebook du nœud gagnant sont mises à jour à l’aide d’une moyenne pondérée, où le poids est le taux d’apprentissage (en l’occurrence, 0,05 comme valeur par défaut).
Remarque : Omettre les données de chambres contenant moins de 1 000 cellules, parce que les ensembles de données contenant quelques cellules n’a pas fourni de résultats statistiquement pertinents de SOM.
- Effectuer un regroupement hiérarchique sans surveillance avec les valeurs de SOM-nœud en utilisant la méthode de liaison moyenne basée sur la corrélation de Pearson par un regroupement de logiciels40.
- Afficher les données de clusters dans le dendrogramme et heatmap41vue (s).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tableaux MACME : conception et fabrication : En combinaison avec la technologie de nanofibres, nous avons utilisé la culture cellulaire microfluidique et dépistage des techniques employées précédemment pour identifier les conditions optimales pour hPSC l’auto-renouvellement ou différenciation35,36 (Figure 1). C’est bien adapté pour l’établissement robustes haut débit basés sur les cellules dosages car les chambres de culture cellulaire sont précisément contrôlable et extensible42,43,44. Ici, le tableau de nanofibres a été préparé par un procédé de dépôt simple nanofibres, électrofilage avec masques 3D-imprimés. Le cadre microfluidiques a été fabriqué avec un moule 3D-imprimés de facilement concevoir la structure de la chambre par le biais de nombreux essais et erreurs. Le tableau MACME a été construit en combinant les deux parties et figurant des 48 environnements, offrant différents indices biochimiques et biophysiques de diverses combinaisons de ces deux nanofibres ECMs (3 types de matériaux de nanofibres et 4 densités différentes ou 4 contrôle protéines de la matrice) et les interactions cellule-cellule (3 gammes de densité de semis cellule initiale) comme le montre la Figure 2.
Évaluation des effets d’ensemble des nanofibres propriétés et cellulaires de la densité sur les CSEh phénotypes : Suite à la culture cellulaire sur un tableau MACME et une coloration fluorescente sur la plaque (Figure 6A), mesures unicellulaires ont été réalisés avec les images acquises. Pour la comparaison de l’homogénéité et hétérogénéité des niveaux d’expression pour les quatre marqueurs phénotypiques dans chaque jeu de données, ce protocole utilisé SOM analyse38,39, qui convertit de grande dimension, multiparamétriques datasets dans faibles dimensions des cartes 2D. Notamment, les résultats des matrices de nanofibres et 2DGT PS ont été omis de cette analyse, étant donné que la plupart des cellules n’ont pas adhéré. En outre, exclus de cette analyse ont été ces expériences avec faible CD où les cellules n’ont pas assez directe (par exemple, juxtacrine) ou indirecte (paracrine) interactions pour survivre. Après analyse SOM, sans supervision hiérarchique a été réalisée pour les nœuds SOM de tous les échantillons analysés (Figure 6B). En tenant compte de la hauteur du dendrogramme de cluster, les différences phénotypiques nous a permis de classer les échantillons en trois groupes : groupe i, la plus grande partie de l’échantillon niches comprenant des nanofibres GT, MG_HighCD et VN_HighCD ; Groupe ii, échantillons contenant GT nanofibres (GT_XLow et MidNF_MidCD), MG_MidCD ou VN_MidCD ; et le groupe iii, tous les échantillons PMGI_NF.
Afin d’étudier les différences entre les groupes, nous avons examiné un échantillon représentatif de chaque groupe (Figure 6C; Groupe i-GT_MidNF_HighCD, le groupe ii-GT_MidNF_MidCD et le groupe iii-PMGI_MidNF_HighCD). En ce qui concerne les signaux OCT4, tous les groupes ont montré une expression plus élevée que celle de MG (MG_MidCD). Groupe que j’ai caractérisé par haute EdU signaux, indiquant que la plupart des cellules prolifèrent activement. Ainsi, micro-environnements en groupe je devais caractérisé comme conditions d’entretien hPSC parce que hPSCs indifférenciés prolifèrent généralement rapidement lorsque les phases du cycle cellulaire gap ont été raccourcies45,46.
GT_MidNF_HighCD et GT_MidNF_MidCD se distinguent par leurs densités distinctes de cellule de chargement initiales. Haute densité initiale accroître les possibilités de cellules d’interagir avec les cellules voisines, qui ont amélioré leur survie et la prolifération de47. Les cellules injectées à une densité initiale insuffisante (3,0 × 104 cellules/cm2) survécurent ni a augmenté au cours de la période expérimentale (4 jours). Par conséquent, nous n’incorporait pas ces échantillons pour l’analyse SOM ; nombre de cellules était sous le seuil de la vie de 1000 cellules/chambre. Les cellules sur des échafauds 2DGT étaient également classés en tant que cellules de groupe ii ; ces conditions ne supportent pas d’autorenouvellement hPSC48. Signal de LiPo GT_MidNF_MidCD EdU a été perdu et niveaux annexine V ont été légèrement augmentés, indiquant que les cellules avaient perdu leur stemness et qu’il étaient devenu progressivement apoptotic. PMGI_MidNF_HighCD, qui représente les micro-environnements comprenant des matrices de nanofibres PMGI, ont montré les grandes variations dans les signaux OCT4 et EdU, comparées aux autres conditions.
Figure 1 . Stratégie visant à identifier des micro-environnements cellulaires optimales pour la régulation des fonctions cellulaires de dépistage. (A) vue d’ensemble des composants du tableau multiplexé microenvironnement cellulaire artificiel (MACME). Le tableau est composé de deux parties principales : lits de nanofibres modelé sur un substrat basal (tableau de nanofibres) et un polydiméthylsiloxane (PDMS)-base de structure de la microfluidique. Le tableau MACME est en mesure de préparer des nanofibres SEGDA avec une variété de caractéristiques (matériaux de nanofibres et densités) et des cellules différentes densités de semis. La structure de microfluidique PDMS du tableau MACME dispose de trois hauteurs de canaux microfluidiques (250, 500 et 1000 µm) pour régler la densité de semis cellule initiale. (B), l’impact des micro-environnements cellulaires sur les phénotypes cellulaires est évaluée quantitativement à l’aide d’un test de cellule unique basé sur l’image et l’analyse de données statistiques par carte self-organizing (SOM) suivie de clustering hiérarchique. Ce chiffre est une adaptation de référence49 avec la permission de Wiley. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 . Conception du tableau MACME. (A) frais généraux et coups d’angle élevé de toute la gamme MACME et le schéma conceptuel d’un canal microfluidique (bleu clair) sur une matrice de nanofibres (rose). Chaque canal est composé d’un 700 µm de largeur et chambre de culture longue de 8,4 mm et deux entrées pour introduction de moyen et de cellules. (B) la comparaison des tailles des cellules et des matrices de nanofibres. Les hauteurs des cellules et des lits de nanofibres vont de 1 à 3 µm et 0,05 à 5,0 µm, respectivement. (C) un échantillon représentatif de chaque canal microfluidique avec une hauteur de 250/500/1000 µm. Cellules et lits de nanofibres sont représentés comme les cercles bleus et lignes orange, respectivement. Chaque chambre a la même largeur et la longueur mais différentes hauteurs (250, 500 et 1000 µm), et le volume de chaque chambre était 1.6, 3.2 et 6.4 µL, respectivement. Le rectangle en pointillé noir dans la Figure 2C indique la Figure 2B. La figure 2 est une adaptation de référence49 avec la permission de Wiley. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 . Fabrication du tableau MACME. (A) Fabrication d’un tableau de nanofibres. Le patterning plusieurs matrices de nanofibres sur une plaque de base a été réalisé par électrofilage modifié à l’aide d’un ensemble de masques portant des trous à motifs. Platine-revêtement a été réalisée afin de faciliter les dépôts de nanofibres sur un socle en plastique. Les masques avec trou-profils distincts ont été préparés par une imprimante 3D. Après masquage de la zone de platine-revêtement de la plaque, l’ensemble plaque-masque a été mis sur l’écran de la collection et électrofilage normal a été réalisée. Les nanofibres initiales ont été formés aux positions Pt-enduit sur la plaque à travers les trous dans le masque. Lits supplémentaires de nanofibres sont fabriqués sur la plaque en remplaçant le masque existant et en répétant la procédure. (B) Fabrication d’une structure de microfluidique. Le moule imprimé par une imprimante 3D avec résine durcissable UV en forme de la couche PDMS du dispositif microfluidique. Après la coulée, le tableau MACME a été assemblé en attachant une couche de base PDMS microfluidique avec un tableau de nanofibres activés par surface. La figure 3 est une adaptation de référence49 avec la permission de Wiley. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 . Images des interfaces graphiques (GUI) pour l’acquisition d’images microscopiques. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 . Images des interfaces graphiques (GUI) guidée par ordinateur de traitement d’image pour le phénotypage monocellulaires. Le processus d’analyse image contient 5 étapes ; (A) identification des objets primaires au DAPI images, (B-D) identification des objets secondaires OCT4, Annexin V et EdU images, respectivement et la mesure de l’intensité de l’objet. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 6 . Phénotypage et classification des phénotypes de CSEh H9 altérée par des facteurs micro-environnementales. (A) images par immunofluorescence des CSEh H9 cultivés à haute densité de semis initiale sur nanofibres de gélatine (GT) (GT_HighNF_HighCD), colorées avec trois marqueurs phénotypiques cellulaires (OCT4, pluripotence ; EdU, prolifération cellulaire ; Annexine V, apoptose) et DAPI pour noyaux cellulaires. (B) un heatmap et dendrogrammes de clustering hiérarchique sans surveillance. Les micro-environnements testés ont été classées en trois groupes avec des traits distinctifs, basés sur les similitudes des phénotypes. Groupe que j’ai inclus GT nanofibres, MG_HighCD et VN_HighCD. Groupe ii composait d’échantillons de nanofibres GT (GT_XLow et MidNF_MidCD), MG_MidCD ou VN_MidCD. Tous les échantillons PMGI_NF ont été regroupés dans le groupe iii. Dans le heatmap, couleurs roses et bleu indiquent les fréquences hautes et basses cellulaires dans les parcelles SOM de comte, respectivement. (C) Distribution des niveaux d’expression marqueur quantifiée de 1000 cellules dans un échantillon représentatif de chaque groupe (groupe i-GT_MidNF_HighCD, groupe ii-GT_MidNF_MidCD et groupe iii-PMGI_MidNF_HighCD). Les 25e et 75e centiles étaient indiqués comme les limites de la zone. Les moustaches s’étendent à 1,5 fois l’écart interquartile des 25e et 75e centiles. Expériences ont été répétés trois fois pour chaque groupe. Figure 6 A-C ont été adaptées de référence49 avec la permission de Wiley. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Nom | Longueur de chaîne (mm) | Largeur du chenal (μm) | Canal hauteur (μm) | Diamètre entrée/sortie (μm) | Hauteur d’entrée/sortie (μm) | Longueur (mm) du moule | Moule largeur (mm) | Hauteur (mm) du moule |
| Moule | 8.4 | 700 | 250/500/1000 | 800 | 3000 | 127,76 | 85.48 | 14 h 35 |
| Nom | Épaisseur (μm) | Longueur de trou (mm) | Largeur du trou (mm) | Masque de longueur (mm) | Masque de largeur (mm) | Hauteur (mm) du moule | Offset de ligne (mm) | Offset de colonne (mm) |
| Masque | 1000 | 6 | 5 | 123,5 | 80.2 | 14 h 35 | 11.24 | 14.38 |
Le tableau 1. Dimensions du moule pour une structure microfluidique et un masque pour une structuration de nanofibres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ce protocole illustre la première méthode de dépistage pour établir un système robuste de la culture pour l’entretien des hPSCs qualifiés. Tout d’abord, nous avons décrit comment préparer une plateforme mettant en vedette divers SEGDA artificiel et cellule ensemencement des densités à l’aide d’un dispositif microfluidique intégré avec un tableau de nanofibres, le tableau MACME. Deuxièmement, quantitative imageur unicellulaires phénotypage était effectué50 pour évaluer les résultats cellulaires individuels et les comportements altérés par des caractéristiques biochimiques et biophysiques distinctes. Dans ce protocole, l’environnement composé de nanofibres GT et protéines ECM contrôle positif dans l’état de la cellule initiale élevée, densité de semis a été caractérisée par des caractéristiques d’un État indifférencié ; une prolifération rapide45 et stable OCT4 expression51. Cette observation indique que les mécanismes moléculaires relatives à « la matrice extracellulaire-cellule » et les « cellules » interactions susceptibles d’affecter la pluripotence des hPSCs.
Cette stratégie peut être personnalisée en fonction de but de l’utilisateur. Par exemple, débit et manipulation de cellules peuvent être ajustés pour une variété de paramètres expérimentaux, de re-concevoir les formes et les modèles de la structure de la microfluidique. Comme un autre moyen d’amélioration de débit, les positions d’entrée et de sortie de chaque chambre sont conçues selon la norme de la microplaque de plaques à 96 puits, normalisée par la société des Sciences biomoléculaires ; ainsi, un distributeur de liquide robotique automatisé peut être utilisé pour le criblage à haut débit. Pour examiner davantage le mécanisme moléculaire concernant « Interactions cellule-ECM », les micro-environnements cellulaires artificielles peuvent être faits pour imiter plus précisément des conditions in vivo en modifiant chimiquement les nanofibres avec signalisation des molécules52 .
A ce jour, mis au point pour le dépistage des micro-environnements cellulaires plupart des plateformes sont adressent aux dépistage des facteurs solubles (par exemple, les facteurs de croissance et les composés chimiques)42,43,44, mais pas de nanofibres SEGDA en raison de difficultés en combinant les techniques de fabrication distinctes. Par exemple, une feuille de nanofibres produit un petit écart entre une structure microfluidique et une plaque de base et provoque leur collage instable, qui se traduit par la contamination croisée entre les différents échantillons parce qu’un milieu de culture mélanger avec un d’une autre chambre par le biais le petit espace. Notre nouvelle méthode permet une fabrication simple et précise de nanofibres matrices à des sites spécifiques et permet leur liaison directe avec la plaque de base, ce qui empêche la liaison instable et la contamination croisée. En outre, quelques plates-formes53 intégré avec microfluidique et matrices de nanofibres ont été accessibles pour la manipulation systématique des indices chimiques et physiques pour étudier leurs effets sur les fonctions des cellules, parce que les technologies nécessaires pour l’intégration étaient hautement sophistiqués. Notre cellule unique profilage avec le tableau MACME peuvent être réalisé avec un dispositif facilement accessible et des techniques simples et offre de grandes possibilités pour une utilisation dans la modélisation des environnements cellulaires pour développement et cellule études biologiques et découverte de médicaments / le dépistage.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Aucun.
Acknowledgments
Nous remercions Prof. N. Nakatsuji à SIGEI, Université de Kyoto, pour fournir les cellules ES humaines. Nous remercions également le Prof. A. Maruyama au Tokyo Institute of Technology pour son soutien dans l’utilisation du microscope à force atomique. A été généreusement financé par la société japonaise pour la Promotion de la Science (JSPS ; 22350104, 23681028, 25886006 et 24656502) ; le financement provient également de la nouvelle énergie et Industrial Technology développement Organization (NEDO) et la Fondation de sciences de la vie de Terumo. Le WPI-SIGEI est pris en charge par le monde Premier International Research Centre Initiative (WPI), le ministère de l’éducation, Culture, Sports, Science et technologie (MEXT), Japon. Une partie de ce travail a été soutenue par Kyoto University nanotechnologie Hub et l’installation de Nano-traitement AIST au « Projet de plate-forme de nanotechnologie » parrainé par le MEXT, Japon.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polystyrene (PS) | Sigma | #182435 | Average Mw: 290,000, average Mn: 130,000 |
| Polymethylglutarimide (PMGI) | MicroChem | G113113 | |
| Gelatin (GT) | Sigma | G2625 | From porcine skin, type A |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Doe Corning Toray | #1064291 | PDMS curing agent and silicone elastomer base are components of this kit. |
| OpenSCAD | This is a free 3D computer graphics software (http://www.openscad.org/) used for designing the mold of the microfluidic device. | ||
| AutoCAD 2014 | Autodesk | This is a 3D computer graphics software (https://www.autodesk.com/products/autocad/overview) used for design of the mask used on nanofiber-array preparation. | |
| 3D printer, AGILISTA-3000 | Keyence | ||
| UV-curable resin, AR-M2 | Keyence | This is used for 3D printing by Agilista. | |
| Acetic acid | Sigma | #338826 | ≥99.99% |
| Ethyl acetate | Sigma | #270989 | Anhydrous, 99.8% |
| Tetrahydrofuran (THF) | Sigma | #401757 | |
| MSP-30T | Vacuum Device | Magnetron sputtering machine | |
| Nunc OmniTray | Thermo Fisher Scientific | #242811 | This is a polystyrene baseplate on which the nanofiber array is created. This plate size is typically 127.7 x 85.5 mm. |
| Gun-type corona discharge machine | Shinko Electric & Instrumentation | CFG-500 | This handy device is used to generate corona for activation of the bottom surface of the PDMS layer at step 1.5 "Assembly of the MACME arrays" in the protocol. |
| 5 mL syringe | Terumo | SS-05SZ | |
| Stainless-steel blunt needle (23-gauge) | Nipro | #2166 | Outside diameter and length are 0.6 and 32 mm, respectively. |
| High-voltage power supply | TechDempaz | ||
| 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide, hydrochloride | Dojindo | W001 | |
| N-Hydroxysuccinimide | Sigma | #56480 | |
| Matrigel hESC-Qualified Matrix | Corning | #354277 | This protein is refered as basement membrane gel matrix in the protocol. |
| CellAdhere Vitronectin, Human, Solution | STEMCELL Technologies | #07004 | |
| TeSR-E8 | STEMCELL Technologies | #05940 | Feeder-free, xeno-free culture medium for maintenance of human ES and iPS cells |
| Y-27632 | Wako Pure Chemical Industries | #253-00513 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red | Thermo Fisher Scientific | #12605028 | This ia a recombinant trypsin-like protease for dissociation of adherant mammalian cells. |
| Click-iT EdU Imaging Kit with Alexa Fluor 647 Azides | Thermo Fisher Scientific | C10086 | The fluorescent labeling of proliferating cells in on-plate fluorescent staining was performed along the product manual of this kit. |
| Annexin V, Alexa Fluor 594 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A13203 | |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Oct-3/4 Antibody (C-10) | Santa Cruz Biotechnology | sc-5279 | |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (DyLight 488) | abcam | ab96875 | This is a secondary antibody used in on-plate fluorescent cell staining. |
| ECLIPSE Ti-E | Nikon | This is an inverted fluorescence microscope equipped with a CFI Plan Fluor 4×/0.13 N.A. objective lens (Nikon), CCD camera (ORCA-R2, Hamamatsu), mercury lamp (Intensilight, Nikon), XYZ automated stage (Ti-S-ER motorized stage with encoders, Nikon), and filter cubes for four fluorescence channels (DAPI, GFP HYQ, TRITC, Cy5; Nikon) | |
| NIS-Elements Advanced Research | Nikon | This is a microscope imaging software used for automatic image acquisition. | |
| CellProfiler, Version 2.1.0 | This is a free open software for cell image analysis (http://cellprofiler.org/). | ||
| R | SOM analysis is performed by kohonen package of this software. This is freely available (https://www.r-project.org/). | ||
| Cluster 3.0 | This is the open source clustering software (http://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster/software.htm). Unsupervised hierarchical clustering is performed with this software. | ||
| Java TreeView | This open source software (http://jtreeview.sourceforge.net/) is used to visualize clustering data as a heatmap and a dendrogram. | ||
| H9 human embryonic stem cell | WiCell Stem Cell Bank | WA09 |
References
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Ameen, C., et al. Human embryonic stem cells: Current technologies and emerging industrial applications. Crit Rev Oncol Hematol. 65 (1), 54-80 (2008).
- Nishikawa, S., Goldstein, R. A., Nierras, C. R. The promise of human induced pluripotent stem cells for research and therapy. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (9), 725-729 (2008).
- Robinton, D. A., Daley, G. Q. The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy. Nature. 481 (7381), 295-305 (2012).
- Sartipy, P., Bjorquist, P., Strehl, R., Hyllner, J. The application of human embryonic stem cell technologies to drug discovery. Drug Discovery Today. 12 (17-18), 688-699 (2007).
- Discher, D. E., Mooney, D. J., Zandstra, P. W. Growth factors, matrices, and forces combine and control stem cells. Science. 324 (5935), 1673-1677 (2009).
- Joyce, J. A., Pollard, J. W. Microenvironmental regulation of metastasis. Nat Rev Cancer. 9 (4), 239-252 (2009).
- Danhier, F., Feron, O., Preat, V. To exploit the tumor microenvironment: Passive and active tumor targeting of nanocarriers for anti-cancer drug delivery. J Control Release. 148 (2), 135-146 (2010).
- Murphy, W. L., McDevitt, T. C., Engler, A. J. Materials as stem cell regulators. Nat Mater. 13 (6), 547-557 (2014).
- Patel, A. K., et al. A defined synthetic substrate for serum-free culture of human stem cell derived cardiomyocytes with improved functional maturity identified using combinatorial materials microarrays. Biomaterials. 61, 257-265 (2015).
- Zhang, R., et al. A thermoresponsive and chemically defined hydrogel for long-term culture of human embryonic stem cells. Nat Commun. 4, (2013).
- Anderson, D. G., Putnam, D., Lavik, E. B., Mahmood, T. A., Langer, R. Biomaterial microarrays: rapid, microscale screening of polymer-cell interaction. Biomaterials. 26 (23), 4892-4897 (2005).
- Celiz, A. D., et al. Discovery of a Novel Polymer for Human Pluripotent Stem Cell Expansion and Multilineage Differentiation. Adv Mater. 27 (27), 4006-4012 (2015).
- Hansen, A., et al. High-Density Polymer Microarrays: Identifying Synthetic Polymers that Control Human Embryonic Stem Cell Growth. Adv Healthcare Mater. 3 (6), 848-853 (2014).
- Mei, Y., et al. A high throughput micro-array system of polymer surfaces for the manipulation of primary pancreatic islet cells. Biomaterials. 31 (34), 8989-8995 (2010).
- Saha, K., et al. Surface-engineered substrates for improved human pluripotent stem cell culture under fully defined conditions. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (46), 18714-18719 (2011).
- Bettinger, C. J., Langer, R., Borenstein, J. T. Engineering substrate topography at the micro- and nanoscale to control cell function. Angew Chem Int Ed Engl. 48 (30), 5406-5415 (2009).
- McMurray, R. J., et al. Nanoscale surfaces for the long-term maintenance of mesenchymal stem cell phenotype and multipotency. Nat Mater. 10 (8), 637-644 (2011).
- Sun, Y., Jallerat, Q., Szymanski, J. M., Feinberg, A. W. Conformal nanopatterning of extracellular matrix proteins onto topographically complex surfaces. Nat Methods. 12 (2), 134-136 (2015).
- Nitanan, T., et al. Effects of processing parameters on morphology of electrospun polystyrene nanofibers. Korean J Chem Eng. 29 (2), 173-181 (2012).
- Liu, L., et al. Chemically-defined scaffolds created with electrospun synthetic nanofibers to maintain mouse embryonic stem cell culture under feeder-free conditions. Biotechnol Lett. 34 (10), 1951-1957 (2012).
- Liu, L., et al. Nanofibrous gelatin substrates for long-term expansion of human pluripotent stem cells. Biomaterials. 35 (24), 6259-6267 (2014).
- Kamei, K., et al. Phenotypic and transcriptional modulation of human pluripotent stem cells induced by nano/microfabrication materials. Adv Healthcare Mater. 2 (2), 287-291 (2013).
- Peerani, R., et al. Niche-mediated control of human embryonic stem cell self-renewal and differentiation. EMBO J. 26 (22), 4744-4755 (2007).
- Yamamoto, K., et al. Fluid shear stress induces differentiation of Flk-1-positive embryonic stem cells into vascular endothelial cells in vitro. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 288 (4), 1915-1924 (2005).
- Charati, S. G., Stern, S. A. Diffusion of gases in silicone polymers: Molecular dynamics simulations. Macromolecules. 31 (16), 5529-5535 (1998).
- Prado-Lopez, S., et al. Hypoxia promotes efficient differentiation of human embryonic stem cells to functional endothelium. Stem Cells. 28 (3), 407-418 (2010).
- Yanagihara, K., et al. Prediction of Differentiation Tendency Toward Hepatocytes from Gene Expression in Undifferentiated Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cells and Development. 25 (24), 1884-1897 (2016).
- Kamei, K., et al. 3D printing of soft lithography mold for rapid production of polydimethylsiloxane-based microfluidic devices for cell stimulation with concentration gradients. Biomed Microdevices. 17 (2), (2015).
- Song, J. H., Kim, H. E., Kim, H. W. Production of electrospun gelatin nanofiber by water-based co-solvent approach. J Mater Sci Mater Med. 19 (1), 95-102 (2008).
- Owen, M. J., Smith, P. J. Plasma Treatment of Polydimethylsiloxane. J Adhes Sci Technol. 8 (10), 1063-1075 (1994).
- Chen, G. K., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nat Methods. 8 (5), 424-476 (2011).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25 (6), 681-686 (2007).
- Kamei, K., et al. An integrated microfluidic culture device for quantitative analysis of human embryonic stem cells. Lab Chip. 9 (4), 555-563 (2009).
- Kamei, K., et al. Microfluidic image cytometry for quantitative single-cell profiling of human pluripotent stem cells in chemically defined conditions. Lab Chip. 10 (9), 1113-1119 (2010).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7 (10), 100 (2006).
- Kohonen, T. Self-Organized Formation of Topologically Correct Feature Maps. Biol Cybern. 43 (1), 59-69 (1982).
- Wehrens, R., Buydens, L. M. C. Self- and super-organizing maps in R: The kohonen package. J Stat Softw. 21 (5), 1-19 (2007).
- Eisen, M. B., Spellman, P. T., Brown, P. O., Botstein, D. Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (25), 14863-14868 (1998).
- Saldanha, A. J. Java Treeview--extensible visualization of microarray data. Bioinformatics. 20 (17), 3246-3248 (2004).
- Du, G. S., Fang, Q., den Toonder, J. M. J. Microfluidics for cell-based high throughput screening platformsd-A review. Anal Chim Acta. 903, 36-50 (2016).
- Huang, S. B., et al. An integrated microfluidic cell culture system for high-throughput perfusion three-dimensional cell culture-based assays: effect of cell culture model on the results of chemosensitivity assays dagger. Lab Chip. 13 (6), 1133-1143 (2013).
- Wang, B. L., et al. Microfluidic high-throughput culturing of single cells for selection based on extracellular metabolite production or consumption. Nat Biotechnol. 32 (5), 473 (2014).
- Becker, K. A., et al. Self-renewal of human embryonic stem cells is supported by a shortened G1 cell cycle phase. J Cell Physiol. 209 (3), 883-893 (2006).
- Neganova, I., Lako, M. G1 to S phase cell cycle transition in somatic and embryonic stem cells. J Anat. 213 (1), 30-44 (2008).
- Fox, V., et al. Cell-cell signaling through NOTCH regulates human embryonic stem cell proliferation. Stem Cells. 26 (3), 715-723 (2008).
- Xu, C., et al. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 19 (10), 971-974 (2001).
- Kamei, K., et al. Microfluidic-Nanofiber Hybrid Array for Screening of Cellular Microenvironments. Small. 13 (18), (2017).
- Sun, J., et al. A Microfluidic Platform for Systems Pathology: Multiparameter Single-Cell Signaling Measurements of Clinical Brain Tumor Specimens. Cancer Res. 70 (15), 6128-6138 (2010).
- Theunissen, T. W., Jaenisch, R. Molecular Control of Induced Pluripotency. Cell Stem Cell. 14 (6), 720-734 (2014).
- Yoo, H. S., Kim, T. G., Park, T. G. Surface-functionalized electrospun nanofibers for tissue engineering and drug delivery. Adv Drug Del Rev. 61 (12), 1033-1042 (2009).
- Dixon, J. E., et al. Combined hydrogels that switch human pluripotent stem cells from self-renewal to differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (15), 5580-5585 (2014).
