Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

एक मल्टीप्लेक्स कृत्रिम सेलुलर MicroEnvironment सरणी का निर्माण

Published: September 7, 2018 doi: 10.3791/57377
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 1, 1, 1, 1, 3, 2, 4, 1,5, 1,6, 1
1Institute for Integrated Cell-Material Sciences (WPI-iCeMS), Kyoto University, 2Department of Life Science and Technology, School of Life Science and Technology, Tokyo Institute of Technology, 3Biomaterials Center for Regenerative Medical Engineering, Foundation for Advancement of International Science, 4Faculty of Science and Natural Resources, Universiti Malaysia Sabah, 5Institute for Chemical Research, Kyoto University, 6Ecole Normale Supérieure

Summary

इस लेख में vivo सेलुलर microenvironments में नकल उतार शारीरिक और रासायनिक cues के उच्च प्रवाह हेरफेर के लिए एक मल्टीप्लेक्स कृत्रिम सेलुलर MicroEnvironment (MACME) सरणी तैयार करने के लिए विस्तृत पद्धति का वर्णन है और एकल सेल रूपरेखा के साथ मानव pluripotent स्टेम सेल (hPSCs) के लिए इष्टतम सेलुलर वातावरण की पहचान ।

Abstract

सेलुलर microenvironments कई संकेतों की एक किस्म से मिलकर बनता है, जैसे वृद्धि कारकों, extracellular मैट्रिक्स, और सेलुलर बातचीत. इन cues अच्छी तरह से आर्केस्ट्रा और एक जीवित प्रणाली में सेल कार्यों को विनियमित करने में महत्वपूर्ण हैं । हालांकि शोधकर्ताओं के एक नंबर पर्यावरण कारकों और वांछित सेलुलर कार्यों के बीच संबंध की जांच करने का प्रयास किया है, बहुत अज्ञात रहता है । यह काफी हद तक एक उचित पद्धति की कमी के कारण है इन विट्रो मेंऐसे पर्यावरणीय cues नकल, और एक साथ कोशिकाओं पर विभिंन पर्यावरणीय cues परीक्षण । यहां, हम microfluidic चैनल के एक एकीकृत मंच और एक nanofiber सरणी, उच्च सामग्री एकल सेल विश्लेषण के बाद की रिपोर्ट, स्टेम सेल की जांच करने के लिए विशिष्ट पर्यावरणीय कारकों द्वारा बदल phenotypes । इस मंच के आवेदन को प्रदर्शित करने के लिए, यह अध्ययन स्व-नवीनीकरण मानव pluripotent स्टेम सेल (hPSCs) के phenotypes पर केंद्रित है । यहां, हम एक nanofiber सरणी के लिए तैयारी प्रक्रियाओं और एक मल्टीप्लेक्स कृत्रिम सेलुलर MicroEnvironment (MACME) सरणी के निर्माण में microfluidic संरचना प्रस्तुत करते हैं । इसके अलावा, एकल सेल रूपरेखा के समग्र कदम, कई फ्लोरोसेंट मार्करों, एकाधिक प्रतिदीप्ति इमेजिंग, और सांख्यिकीय विश्लेषण के साथ सेल धुंधला, वर्णित हैं ।

Introduction

मानव pluripotent स्टेम सेल (hPSCs)1,2 स्वयं को सीमित रूप से नए सिरे से और विभिंन ऊतक वंश है, जो दवा के विकास में क्रांतिकारी बदलाव सकता है, कोशिका आधारित चिकित्सा, ऊतक इंजीनियरिंग, और अपक्षयी दवा में अंतर 3 , 4 , 5 , 6. सामांय संस्कृति व्यंजन और microtiter प्लेटें, तथापि, नैनो की सीमा के साथ सेलुलर स्तर पर सटीक शारीरिक और रासायनिक सेल हेरफेर सक्षम करने के लिए डिजाइन नहीं कर रहे है माइक्रो मीटर, जो सेलुलर विस्तार के लिए एक महत्वपूर्ण कारक है, स्व नवीकरण, और भेदभाव । इस खामी को हल करने के लिए, अध्ययनों ने सेल-भाग्य फैसलों और सेल4कार्यों को विनियमित करने में सेलुलर microenvironments की भूमिकाओं की जांच की है । हाल के वर्षों में, अध्ययनों की एक बढ़ती हुई संख्या में सेलुलर microenvironments पुनर्निर्माण करने के लिए आयोजित किया गया है इन विट्रो7,8. नैनो और सूक्ष्म निर्माण प्रक्रियाओं रासायनिक9,10,11,12,13के हेरफेर के माध्यम से इन microenvironments की स्थापना की है, 14,15,16,17 और शारीरिक18,19,20 पर्यावरण cues । अब तक, वहां के लिए व्यवस्थित सेल पर रासायनिक और भौतिक पर्यावरण cues के अंतर्निहित तंत्र की जांच करने के लिए कोई रिपोर्ट थे भाग्य फैसलों और कार्यों के भीतर एक ही मंच ।

यहां, हम एक मजबूत स्क्रीनिंग प्लेटफॉर्म (चित्रा 1) स्थापित करने के लिए सरल डिजाइन सिद्धांतों के आधार पर एक रणनीति का परिचय । सबसे पहले, हम एक nanofiber सरणी और एक microfluidic संरचना का उपयोग करके बहुमुखी, कृत्रिम सेलुलर microenvironments बनाने के लिए एक एकीकृत मंच के विकास की प्रक्रिया का वर्णन: मल्टीप्लेक्स कृत्रिम सेलुलर MicroEnvironment (MACME) सरणी (चित्रा 1ए और 2a) । nanofiber सरणी nanofiber सामग्री और घनत्व के संयोजन अलग करने में 12 विभिंन microenvironments है । Electrospinning का उपयोग nanofibers किर करने के लिए किया जाता था । nanofiber सामग्री, जैसे polystyrene (PS)21, polymethylglutarimide (PMGI)22, और जिलेटिन (GT)23, उनके रासायनिक गुण है, जो सेल आसंजन और pluripotency के रखरखाव को प्रभावित हो सकता है परीक्षण के लिए डिजाइन किए गए थे ( चित्रा 2बी) । Nanofiber घनत्व electrospinning समय बदलकर विविध थे और उत्पन्न nanofibers उनके घनत्व के अनुसार परिभाषित किए गए थे (DNF, with D = XLow/कम/मध्य/ microfluidic संरचना polydimethylsiloxane (PDMS) ४८ सेल-संस्कृति कक्षों, जो ९६-well microplate के मानक आयामों के साथ तैनात किया जा सकता है बंदरगाह से बना है । PDMS एक और संगत है गैस विनिमेय बहुलक आम तौर पर microfluidic उपकरणों24बनाना इस्तेमाल किया । प्रत्येक microfluidic चैनल को ७००-µm चौड़ा और ८.४-mm लंबा बनाया गया था और इसके किनारों (टेबल 1) पर दो की सुविधा थी । कक्षों अलग ऊंचाइयों था (२५०, ५००, और १००० µm) प्रारंभिक सेल में हेरफेर करने के लिए घनत्व सीडिंग (०.३, ०.६, और १.२ × 105 कोशिकाओं/मुख्यमंत्री2), जो अस्तित्व के साथ सहसंबंधी हो सकता है, प्रसार, और hPSCs के भेदभाव25 (चित्रा 2सी) । एक कक्ष में वरीयता प्राप्त कोशिकाओं की संख्या चैंबर फर्श के ऊपर स्तंभ घनत्व के लिए आनुपातिक है, और इस प्रकार प्रारंभिक कोशिका बोने घनत्व अलग ऊंचाइयों के साथ संस्कृति मंडलों में एक ही सेल निलंबन शुरू करने से नियंत्रित किया गया था । सभी चैनलों के लिए डिज़ाइन किया गया ≥ २५०-µm-उच्च26 कम ऑक्सीजन तनाव के प्रभाव को कम करने के लिए27 और कतरनी28 कोशिकाओं पर तनाव. २५०, ५००, और १००० µm के चैनल हाइट्स यहां एक्स के साथ XCD के रूप में संक्षिप्त कर रहे है = कम, मध्य, और उच्च, क्रमशः । अलग nanofiber घनत्व और प्रारंभिक कोशिका बोने घनत्व के साथ वातावरण "Material_NF density_Cell घनत्व" (जैसे, GT_HighNF_HighCD: एक उच्च घनत्व जीटी nanofibers और उच्च प्रारंभिक कोशिका बोने की विशेषता पर्यावरण के रूप में छोटा किया गया घनत्व) ।

बाद में, हम वर्णन कैसे एकल सेल विश्लेषण करने के लिए व्यवस्थित करने के लिए पर्यावरण कारकों के जवाब में सेल व्यवहार की जांच (चित्रा 1ख) । एक सबूत की अवधारणा के रूप में, हम hPSC आत्म नवीकरण, जो hPSC रखरखाव (चित्रा 1ख)29के लिए एक महत्वपूर्ण कार्य है के लिए इष्टतम सेलुलर वातावरण की पहचान की । छवि आधारित cytometry, सांख्यिकीय विश्लेषण के बाद, सेलुलर वातावरण के लिए व्यक्तिगत सेलुलर phenotypic प्रतिक्रियाओं की मात्रात्मक व्याख्या के लिए अनुमति देता है । सेलुलर कार्यों की एक किस्म के बीच, इस कागज hPSC आत्म नवीकरण को बनाए रखने के लिए इष्टतम स्थितियों की पहचान करने के लिए एक विस्तृत प्रक्रिया प्रदान करता है ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. MACME सरणी का निर्माण

नोट: सभी सामग्री और उपकरण सामग्री तालिका में सूचीबद्ध हैं ।

  1. एक nanofiber सरणी और एक microfluidic संरचना के लिए एक सांचे में ढालना के लिए मास्क की तैयारी
    1. 3 डी-कंप्यूटर ग्राफिक्स सॉफ्टवेयर संकुल (तालिका 1) का उपयोग microfluidic संरचनाओं के लिए nanofiber arrays और molds के लिए इस्तेमाल किया मास्क के तीन आयामी (3 डी) छवियों बनाएं ।
      नोट: 3 डी छवियों को पढ़ने और एक 3 डी प्रिंटर द्वारा मुद्रित कर रहे हैं । मुद्रित मास्क और मोल्ड 3d चित्र 1.1.1 कदम पर ग्राफिक्स सॉफ्टवेयर का उपयोग परिभाषित के साथ एक ही आयाम है ।
    2. प्रिंट मास्क और एक 3 डी प्रिंटर का उपयोग कर इन डिजाइनों के आधार पर ढालना ।
      नोट: इस प्रोटोकॉल में, एक स्याही जेट-यूवी का इलाज राल के साथ 3 डी प्रिंटर की तरह30इस्तेमाल किया गया था । प्रिंटर संकल्प था ६३५ × ४०० डीपीआई और 15 µm में एक्स, वाई और जेड, क्रमशः, तथापि, वास्तविक एक्स, वाई संकल्प लगभग चार बार कम था ।
  2. Nanofiber-सरणी तैयारी (चित्रा 3ए)
    1. electrospinning के लिए बहुलक समाधान तैयार करें ।
      1. 9% (डब्ल्यू/वी)22द्वारा tetrahydrofuran के साथ 13% PMGI तरल पतला ।
      2. पी एस के ०.०८ जी भंग (संख्या औसत आणविक वजन (Mn): १३०,०००) THF में: dimethylformamide (1:1 volume अनुपात)21, और जोड़ें THF: dimethylformamide खंड लाने के लिए अंतिम 1 मिलीलीटर (8% (डब्ल्यू/वी) पी एस समाधान) ।
      3. पानी में GT के ०.१ जी भंग: एसिटिक एसिड: एथिल एसीटेट (1:1.6:2.1 वॉल्यूम अनुपात), और पानी जोड़ें: एसिटिक एसिड: एथिल एसीटेट वॉल्यूम को अंतिम 1 मिलीलीटर (10% (डब्ल्यू/जीटी समाधान) के रूप में लाने के लिए वर्णित के रूप में23,31।
    2. एक magnetron sputtering मशीन का प्रयोग करें, एक polystyrene पर 5 एनएम मोटाई के साथ एक पतली प्लेटिनम परत जमा (PS) baseplate (१२७.७ × ८५.५ mm), जो electrospinning सेटअप में एक कैथोड के रूप में कार्य करता है ।
    3. एक 5 मिलीलीटर एक 23-जी स्टेनलेस स्टील कुंद सुई से सुसज्जित सिरिंज में प्रत्येक बहुलक समाधान लोड ।
    4. प्लेस और electrospinning डिवाइस के कलेक्टर के अलावा 12 सेमी के साथ एक सिरिंज पंप पर सुई के साथ सिरिंज लंगर ।
    5. एक उच्च वोल्टेज बिजली की आपूर्ति करने के लिए सिरिंज सुई कनेक्ट, और 11 केवी के लिए लागू करने के लिए सेट.
    6. निर्धारित पंपिंग दर ०.२ एमएल/
    7. तापमान और आर्द्रता 30 डिग्री सेल्सियस और < 30% (v/
    8. कदम 1.2.2 पर तैयार baseplate पर मुखौटा रखो ।
    9. electrospinning समय (जैसे, 20, ६०, ९०, और १८० s) बदलकर अलग घनत्व के साथ मुखौटा के छेद के माध्यम से baseplate पर nanofibers किर ।
    10. baseplate से मास्क निकालें ।
      ध्यान दें । इथेनॉल मास्क के साथ बंद जीटी nanofibers छीलने से बचने के लिए मुखौटा हटाने से पहले electrospun gt nanofibers पर छिड़काव किया जा सकता है ।
    11. nanofiber-सरणी निर्माण के पूरा होने तक चरण 1.2.4-1.2.10 दोहराएँ ।
    12. शेष विलायक लुप्त हो जाना 16 एच के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर एक desiccator में nanofiber सरणी प्लेस ।
    13. Crosslink GT nanofibers के साथ ०.२ एम 1-एथिल-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide हाइडरोक्लॉराइड (EDC) और ०.२ एम एन-hydroxysuccinimide (एन एस) इथेनॉल में 25 डिग्री सेल्सियस पर 4 ज23के लिए ।
    14. कुल्ला GT nanofibers दो बार ९९.५% (वी/वी) के साथ इथेनॉल और निर्वात-सूखी 25 डिग्री सेल्सियस पर 16 के लिए एच ।
  3. microfluidic संरचनाओं का निर्माण (चित्रा 3बी)
    1. मिश्रण PDMS इलाज एजेंट के 2 जी और PDMS बेस के 20 जी (1:10 वजन अनुपात; प्रीती PDMS). 24
    2. मोल्ड पर पूर्व PDMS मिश्रण डालो १.२ कदम में गढ़े ।
    3. De-गैस 30 मिनट के लिए एक desiccator में पूर्व PDMS मिश्रण ।
    4. 16 एच के लिए ६५ डिग्री सेल्सियस पर एक ओवन में पूर्व PDMS मिश्रण का इलाज ।
  4. MACME arrays के विधानसभा (चित्रा 3बी)
    1. PDMS संरचना से कदम 1.3.4 पर ठीक छील मोल्ड और ७०% (v/वी) इथेनॉल के साथ साफ ।
    2. PDMS संरचना३२के नीचे की ओर वायुमंडलीय कोरोना का स्राव समझो ।
      नोट: इस प्रोटोकॉल में, कोरोना एक "काम" कोरोना निर्वहन उपकरण के साथ एक परत 3 या 4 बार की पूरी सतह पर छुट्टी दे दी है । ऑक्सीजन प्लाज्मा उपचार सतह चिपचिपाहट को बदलने के लिए वायुमंडलीय कोरोना निर्वहन के साथ प्रतिस्थापित किया गया था ।
    3. जल्दी से nanofiber सरणी के साथ PDMS संरचना इकट्ठा ।
    4. ओवन-2 दिनों के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर सेंकना ।

2. MACME सरणी में hESCs लोड हो रहा है

  1. H9 मानव भ्रूण स्टेम सेल (hESCs) की दिनचर्या संस्कृति के लिए, एक्सो में कोशिकाओं को बनाए रखने के hPSC रखरखाव३३ के लिए मुक्त रासायनिक परिभाषित संस्कृति माध्यम 10 µ एम वाई के साथ पूरक-२७६३२ रॉक अवरोधक३४ (नाम hPSC माध्यम) में एक ३५ मिमी सेल संस्कृति तहखाने झिल्ली जेल मैट्रिक्स (एमजी) के साथ लेपित डिश ।
  2. एक रिकॉमबिनेंट trypsin का उपयोग करते हुए हर 4 से 7 दिनों के लिए यात्रा की तरह-छेड़ने ।
  3. ९९.५% इथेनॉल के साथ एक MACME सरणी निष्फल, 10 मिनट के लिए कक्षों में लोड हो रहा है, और फिर इथेनॉल को हटा दें । इस चरण को 3 बार दोहराएं ।
  4. परिचय मिलीग्राम की 12 µ l, 10 µ g/एमएल vitronectin (VN), और ०.१% (डब्ल्यू/वी) जीटी नियंत्रण संस्कृति कक्षों में, और 1 ज के लिए ३७ ° c पर कक्षों मशीन उंहें चैंबर सतहों पर कोट करने के लिए ।
    नोट: इस प्रोटोकॉल में, एमजी, VN, और जीटी सेल आसंजन और संस्कृति के लिए संदर्भ प्रोटीन के रूप में चुना गया था । क्योंकि एमजी और VN hPSC स्व-नवीकरण को बनाए रखने के लिए इस्तेमाल किया मानक कोशिका संस्कृति मैट्रिक्स हैं, वे सकारात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोग किया जाता है; ऋणात्मक नियंत्रणों के रूप में दो-आयामी जीटी कोटिंग (2DGT) या गैर-कोटिंग (NC) का उपयोग किया गया ।
  5. MACME सरणी के सभी मंडलों में पूर्व गर्म hPSC माध्यम परिचय । ३७ डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए कक्षों की मशीन ।
  6. धो H9 hESC DPBS के साथ एक ३५-mm डिश पर कल्चरित, एक रिकॉमबिनेंट trypsin की ०.५ मिलीलीटर जोड़ने के लिए पकवान और 1 मिनट के लिए ३७ ° c पर मशीन को छेड़ने की तरह और ध्यान से ही महाप्राण
    नोट: आकांक्षा कदम पर, कोशिकाओं को अलग नहीं कर रहे हैं ।
  7. तुरंत hPSC माध्यम जोड़ें, धीरे से डिश सतह के खिलाफ मध्यम बार अलग कर देना कोशिकाओं और एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब के लिए अलग कोशिकाओं को स्थानांतरित करने के लिए वितरण ।
  8. २०० के लिए एक्स जी पर केंद्रापसारक 3 min. महाप्राण supernatant और निलंबित कोशिकाओं में एक पूर्व गर्म hPSC माध्यम ।
  9. परिचय 12 µ एल सेल निलंबन (१.२ × 106 कोशिकाओं/एमएल) प्रत्येक microfluidic कक्ष में ।
    नोट: एक micropipette का उपयोग करके अंय कक्षों से एक कक्ष में परिचय कराएं । कक्षों के लिए वरीयता प्राप्त कोशिकाओं की संख्या चैंबर फर्श के ऊपर स्तंभ घनत्व के लिए आनुपातिक है, क्योंकि एक ही सेल निलंबन से नमूने इस्तेमाल किया गया था, भले ही प्रारंभिक कोशिका बोने घनत्व नियंत्रित किया जा सकता है. सुनिश्चित pipetting धीरे किया जाता है । लोड करने के बाद एक कपास ढोने वाली छड़ी का उपयोग कर कक्षों से अतिरिक्त माध्यम निकालें । MACME सरणी दोनों आमतौर पर इस्तेमाल किया प्रयोगशाला पिपेट और स्वचालित पिपेट प्रणालियों के साथ संगत है, और यह किसी विशेष उपकरण की आवश्यकता नहीं है ।
  10. बदलें hPSC मध्यम हर 12 एच और 4 दिनों के लिए संस्कृति ।
    नोट: मध्यम के निरंतर वॉल्यूम (१.६, ३.२, और ६.४ µ l) विशिष्ट आकारों के कक्षों का उपयोग करके बनाए रखे जाते हैं । कक्ष संस्कृति माध्यम३५,३६के आदान प्रदान के अलावा कतरनी तनाव को कम करने के लिए एक स्थिर शर्त के तहत संस्कृति कोशिकाओं ।

3. मात्रात्मक एकल सेल profiling

  1. पर प्लेट फ्लोरोसेंट सेल धुंधला
    नोट:     स्व-नवीनीकरण hPSCs के phenotypic परिवर्तनों का विश्लेषण करने के लिए, इस प्रोटोकॉल के लिए तीन प्रमुख phenotypic मार्कर का चयन किया गया: OCT4, 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU), और Annexin V, pluripotency, प्रसार, और apoptosis की स्थिति मापने के लिए , क्रमशः (चित्रा २बी). 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) सेल नाभिक की पहचान करने के लिए प्रयोग किया जाता है । OCT4 pluripotency के महत्वपूर्ण प्रतिलेखन कारकों में से एक है ।
    1. hPSC मध्यम में MACME सरणियों में H9 hESCs की मशीन 30 मिनट के लिए ३७ ° c पर 10 µ m EdU alkyne के साथ पूरक है ।
    2. annexin-बाध्यकारी बफर के साथ धोने के बाद (10 मिमी HEPES (पीएच ७.४), १४० मिमी NaCl, २.५ मिमी CaCl2), 15 मिनट के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर एक नारंगी फ्लोरोसेंट डाई-annexin वी संयुग्मी के साथ कोशिकाओं दाग.
    3. 15 मिनट के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर 4% (वी/वी) paraformaldehyde के साथ पंजाब में कोशिकाओं को ठीक करें, और फिर दो बार पंजाबियों के साथ कोशिकाओं कुल्ला ।
    4. 16 ज के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर ०.३% (v/v) ट्राइटन X-१०० के साथ पंजाबियों का उपयोग कर Permeabilize सेल
      नोट: Paraformaldehyde एक प्लास्टिक बेस प्लेट और एक PDMS microfluidic संरचना के बीच बांड को कमजोर करता है । इस प्रकार, कदम 3.2.1 पर सरणी से PDMS परत की टुकड़ी भी सही इस कदम के बाद किया जा सकता है ।
    5. 30 मिनट के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर एक लाल फ्लोरोसेंट डाई azide के साथ Tris आधारित प्रतिक्रिया बफर में गर्मी कोशिकाओं ।
    6. अवरुद्ध बफर में कोशिकाओं की मशीन (5% के साथ पंजाब (वी/सामान्य बकरी सीरम, 5% (v/v) सामांय गधा सीरम, 3% (डब्ल्यू/वी) गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन, ०.१% (वी/वी) के बीच-20, और ०.१% (डब्ल्यू/वी) एन-dodecyl-β-D-maltoside) 4 ° c पर 16 के लिए एच.
    7. ०.५% (v/v) ट्राइटन X-१०० समाधान और मानव OCT3/4 एंटीबॉडी (माउस आईजीजी) के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 16 ज के साथ पंजाब में मशीन ।
    8. ग्रीन फ्लोरोसेंट डाई लेबल गधा विरोधी माउस आईजीजी (एच + एल) 37 डिग्री सेल्सियस पर ६० मिनट के लिए के साथ बफर अवरुद्ध में मशीन ।
    9. 30 मिनट के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर DAPI के साथ पंजाब में मशीन ।
    10. पंजाबियों के साथ DAPI बदलें ।
    11. छवि अधिग्रहण तक 4 ° c पर MACME सरणी की रक्षा करना ।
  2. छवि अधिग्रहण (चित्रा 4)
    1. MACME सरणी से PDMS microfluidic संरचना को छील लें ।
    2. अवशिष्ट पंजाबियों को MACME सरणी से निकालें, 90% (v/v) ग्लिसरॉल को पंजाबियों में कोशिकाओं और दाग-धब्बों पर coverslips जगह पर लागू करें ।
    3. एक औंधा प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के मंच पर प्लेट उल्टा सेट करें ।
    4. एक माइक्रोस्कोप इमेजिंग सॉफ्टवेयर द्वारा नियंत्रित किया गया है कि सभी मोटर चालित घटकों (चरण, फिल्टर, शटर, और फोकस सिस्टम) का उपयोग कर स्वचालित रूप से 12 बिट रंग छवियों मोल.
      ध्यान दें । इस प्रोटोकॉल में, एक्सपोज़र बार अधिकतम तीव्रता मानों (उच्चतम पिक्सेल तीव्रता: ४०९६) के निकट पहुंचने के लिए समायोजित किया जाता है, लेकिन प्रत्येक छवि, DAPI, OCT4, Annexin V, और EdU के लिए कोई संतृप्ति नहीं ।
  3. कंप्यूटर निर्देशित छवि प्रसंस्करण और प्रतिदीप्ति संकेत ठहराव (चित्रा 5)
    नोट:     निम्न कक्ष छवि विश्लेषण पहले वर्णित विधि३७पर आधारित किया जाता है ।
    1. रंग छवियों को ग्रेस्केल में कनवर्ट करें ।
    2. Otsu विधि के साथ प्रत्येक DAPI छवि के लिए एकल थ्रेशोल्ड मान परिकलित करें और थ्रेशोल्ड के ऊपर और पृष्ठभूमि के रूप में नीचे अग्रभूमि के रूप में पिक्सेल्स वर्गीकृत करें. सुनिश्चित करें कि अग्रभूमि मान DAPI की फ्लोरोसेंट तीव्रता से मेल खाती है ।
      नोट: छवि विश्लेषण प्रक्रिया में 5 चरण होते हैं; DAPI छवियों में प्राथमिक वस्तुओं की पहचान, OCT4 में माध्यमिक वस्तुओं की पहचान, Annexin वी, और EdU छवियों, क्रमशः, और वस्तु तीव्रता का माप । चित्रा 3 छवि प्रसंस्करण की स्थापना पर ग्राफिकल यूजर इंटरफेस (जीयूआई) की छवियों को प्रदान करता है ।
    3. प्रत्येक छवि पर OCT4 और EdU के फ्लोरोसेंट तीव्रता को मापने ।
    4. प्रचार विधि के साथ Annexin वी के साथ दाग क्षेत्र की पहचान, और फ्लोरोसेंट तीव्रता मात्रा ।
  4. ३.४. सांख्यिकीय विश्लेषण एकल सेल इमेजिंग पर व्यक्तिगत सेलुलर phenotypes कल्पना करने के लिए
    1. केंद्र और इन चर स्केलिंग उंहें बराबर वजन देने के द्वारा प्रत्येक phenotypic मार्कर के इनपुट फ्लोरोसेंट तीव्रता को सामान्य ।
    2. पिछले अध्ययनों३८,३९द्वारा वर्णित के रूप में सांख्यिकीय कंप्यूटिंग और ग्राफिक्स के लिए एक सॉफ्टवेयर पर्यावरण का उपयोग करके आत्म-आयोजन मानचित्र (सोम) विश्लेषण करते हैं ।
      1. विशिष्ट चार "codebook वैक्टर" चार मार्करों, DAPI, EdU, Annexin वी, और OCT4 की फ्लोरोसेंट तीव्रता के लिए इसी के साथ 25 सोम नोड्स बनाएं ।
      2. प्रत्येक microenvironment में एक "जीतना" (सबसे समान) नोड के लिए व्यक्तिगत कोशिकाओं को निरुपित, और सेल आवृत्ति के रूप में भूखंड, जिसके अनुसार जीतने नोड के codebook वैक्टर एक भारित औसत का उपयोग कर अद्यतन कर रहे हैं, जहां वजन सीखने की दर है (यहां, के रूप में ०.०५ डिफ़ॉल्ट) ।
        नोट: १,००० कक्ष से कम वाले कक्षों से डेटा छोड़ें क्योंकि कुछ कक्षों वाले डेटासेट ने सांख्यिकीय रूप से प्रासंगिक सोम परिणाम प्रदान नहीं किया.
    3. किसी क्लस्टरिंग सॉफ़्टवेयर४०द्वारा पियरसन सहसंबंध पर आधारित औसत-लिंकेज विधि का उपयोग करके सोम-नोड मानों के साथ क्लस्टरिंग पर्यवेक्षित पदानुक्रमित निष्पादित करें ।
    4. clustering डेटा dendrogram और हीटमैप४१दृश्य में रेंडर करें ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

MACME arrays: डिजाइन और निर्माण: nanofiber प्रौद्योगिकी के साथ संयोजन में, हम microfluidic सेल संस्कृति और स्क्रीनिंग पहले नियोजित hPSC स्व के लिए इष्टतम स्थितियों के नवीकरण या भेदभाव३५,३६ (चित्रा 1) की पहचान तकनीकों का इस्तेमाल किया । यह अच्छी तरह से मजबूत उच्च प्रवाह सेल की स्थापना के लिए अनुकूल है आधारित परख क्योंकि सेल संस्कृति मंडलों और शर्तों को ठीक नियंत्रणीय और विस्तार योग्य४२,४३,४४हैं । यहाँ, nanofiber सरणी एक सरल nanofiber जमाव विधि, 3d मुद्रित मास्क के साथ electrospinning द्वारा तैयार किया गया था । microfluidic हिस्सा एक 3d मुद्रित मोल्ड के साथ गढ़े को आसानी से कई परीक्षणों और त्रुटियों के माध्यम से चैंबर संरचना डिजाइन किया गया था । MACME सरणी के दो भागों के संयोजन के द्वारा निर्माण किया गया था और ४८ वातावरण समाहित, दोनों nanofiber ECMs के संयोजन अलग करके विभिंन जैव रासायनिक cues प्रदान (nanofiber सामग्री और 4 अलग घनत्व या 4 नियंत्रण के 3 प्रकार मैट्रिक्स प्रोटीन) और सेल सेल बातचीत (प्रारंभिक कोशिका के 3 पर्वतमाला-बीज घनत्व) चित्रा 2में दिखाया गया है ।

hESC phenotypes पर nanofiber संपत्तियों और सेलुलर घनत्व के समग्र प्रभावों का मूल्यांकन: एक MACME सरणी और पर प्लेट फ्लोरोसेंट धुंधला (चित्रा 6ए) पर सेल संस्कृति के बाद, एकल सेल माप अधिग्रहीत छवियों के साथ प्रदर्शन किया गया । एकरूपता और प्रत्येक डेटासेट में चार phenotypic मार्करों के लिए अभिव्यक्ति के स्तर की विविधता तुलना के लिए, इस प्रोटोकॉल सोम विश्लेषण३८,३९, जो उच्च आयामी, multiparametric डेटासेट में धर्मांतरित इस्तेमाल कम आयामी 2 डी नक्शे । विशेष रूप से, पुनश्च nanofibers और 2DGT मैट्रिक्स के परिणाम यह देखते हुए कि ज्यादातर कोशिकाओं का पालन नहीं किया विश्लेषण से छोड़ दिया गया । इसके अलावा, इस विश्लेषण से बाहर रखा कम सीडी जहां कोशिकाओं को पर्याप्त प्रत्यक्ष (जैसे, juxtacrine) या अप्रत्यक्ष (paracrine) बातचीत के लिए जीवित नहीं था के साथ उन प्रयोगों थे । सोम विश्लेषण के बाद, पर्यवेक्षणीय पदानुक्रमित clustering सभी विश्लेषण नमूनों की सोम नोड्स (चित्रा 6ख) के लिए किया गया था । क्लस्टर dendrogram की ऊंचाई पर विचार करके, phenotypic मतभेद हमें तीन समूहों में नमूनों को वर्गीकृत करने की अनुमति दी: समूह मैं, के नमूने जीटी nanofibers, MG_HighCD के शामिल niches, और VN_HighCD; समूह द्वितीय, जीटी nanofibers युक्त नमूने (GT_XLow और MidNF_MidCD), MG_MidCD, या VN_MidCD; और समूह iii, सभी PMGI_NF नमूने ।

समूहों के बीच मतभेदों का अध्ययन करने के लिए, हम प्रत्येक समूह से एक प्रतिनिधि नमूने की जांच (चित्रा 6सी; ग्रुप i-GT_MidNF_HighCD, ग्रुप ii-GT_MidNF_MidCD, और ग्रुप iii-PMGI_MidNF_HighCD) । OCT4 संकेतों के संदर्भ में, सभी समूहों के एमजी (MG_MidCD) की तुलना में एक उच्च अभिव्यक्ति दिखाया. समूह मैं उच्च EdU संकेतों की विशेषता थी, जो यह दर्शाता है कि अधिकांश कक्ष सक्रिय रूप से proliferating थे । इस प्रकार, समूह में microenvironments मैं hPSC रखरखाव के लिए उपयुक्त शर्तों के रूप में विशेषता थे क्योंकि विभेदित hPSCs आम तौर पर तेजी से पैदा करना जब सेल चक्र अंतर चरणों४५,४६छोटा किया गया ।

GT_MidNF_HighCD और GT_MidNF_MidCD अपने विशिष्ट प्रारंभिक सेल-लोडिंग घनत्व द्वारा प्रतिष्ठित हैं । उच्च प्रारंभिक कोशिका घनत्व कोशिकाओं के अवसरों को पड़ोसी कोशिकाओं है, जो उनके अस्तित्व और प्रसार४७बढ़ाया के साथ बातचीत करने के लिए वृद्धि हुई है । कोशिकाओं को एक अपर्याप्त प्रारंभिक घनत्व पर वरीयता प्राप्त (३.० × 104 कोशिकाओं/न तो बच गया और न ही प्रयोगात्मक अवधि (4 दिन) के दौरान बढ़ी । इसलिए, हम सोम विश्लेषण में इन नमूनों को शामिल नहीं किया; कक्ष संख्या कट से नीचे थे १००० जीवित कोशिकाओं के बंद कक्ष/ 2DGT पाड़ों पर कोशिकाओं को भी समूह द्वितीय कोशिकाओं के रूप में वर्गीकृत किया गया; इन शर्तों hPSC स्व-नवीनीकरण४८का समर्थन नहीं करते । GT_MidNF_MidCD ' कोशिकाओं EdU संकेत खो गया था और Annexin वी स्तर थोड़ा बढ़ गया था, यह दर्शाता है कि कोशिकाओं को अपने तने खो दिया था और धीरे-अपोप्तोटिक हो गया था । PMGI_MidNF_HighCD, जो PMGI nanofiber मैट्रिक्स शामिल microenvironments का प्रतिनिधित्व करता है, अंय शर्तों के साथ तुलना में OCT4 और EdU संकेतों में बड़े बदलाव दिखाया ।

Figure 1
चित्रा 1 . स्क्रीनिंग रणनीति सेलुलर कार्यों को विनियमित करने के लिए इष्टतम सेलुलर microenvironments की पहचान करने के लिए । (क) मल्टीप्लेक्स्ड आर्टिफिशियल सेलुलर microenvironment (MACME) सरणी के घटकों का अवलोकन. सरणी के दो मुख्य भागों शामिल है: nanofiber एक बेसल सब्सट्रेट (nanofiber सरणी) पर नमूनों और एक polydimethylsiloxane (PDMS) आधारित microfluidic संरचना । MACME सरणी nanofiber ECMs को तैयार करने में सक्षम है जो विभिन्न प्रकार की सुविधाओं के साथ (अर्थात, nanofiber सामग्री और घनत्व) और विभिंन कोशिका सीडिंग घनत्व है । MACME सरणी के PDMS microfluidic संरचना तीन microfluidic चैनल हाइट्स (२५०, ५००, और १००० µm) सुविधाओं के प्रारंभिक कोशिका बोने की सघनता को विनियमित करने के लिए । (ख) सेल phenotypes पर सेलुलर microenvironments के प्रभाव को मात्रात्मक एक छवि आधारित एकल-सेल परख और स्वयं द्वारा सांख्यिकीय डेटा विश्लेषण-आयोजन नक्शा (सोम) पदानुक्रमित clustering के बाद का उपयोग कर मूल्यांकन किया है । यह आंकड़ा विले से अनुमति के साथ संदर्भ४९ से अनुकूलित किया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 . MACME सरणी के डिजाइन । (क) ऊपरी और पूरे MACME सरणी के उच्च कोण शॉट्स और एक microfluidic चैनल के वैचारिक आरेख (हल्का नीला) एक nanofiber मैट्रिक्स (गुलाबी) पर । प्रत्येक चैनल एक ७०० µm चौड़ा और ८.४ मिमी लंबे संस्कृति कक्ष और मध्यम और कोशिकाओं की शुरूआत के लिए दो की सुविधा से बना है । (ख) कोशिकाओं और nanofiber मैट्रिक्स के आकार की तुलना । कोशिकाओं और nanofiber बेड की ऊंचाइयों 1-3 µm और 0.05-5.0 µm, क्रमशः से सीमा । (ग) एक 250/500/1000 µm ऊंचाई के साथ प्रत्येक microfluidic चैनल के एक पार अनुभाग । कोशिकाओं और nanofiber बेड क्रमशः नीला हलकों और नारंगी लाइनों के रूप में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं । प्रत्येक कक्ष एक ही चौड़ाई और लंबाई लेकिन अलग ऊंचाइयों (२५०, ५००, और १००० µm) है, और प्रत्येक कक्ष मात्रा १.६, ३.२, और ६.४ µ एल, क्रमशः था । चित्रा 2सी में काले बिंदीदार आयत चित्रा 2बीअर्थ । चित्रा 2 के संदर्भ४९ से विले से अनुमति के साथ अनुकूलित किया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 . MACME सरणी का निर्माण । (क) एक nanofiber सरणी के निर्माण । एक baseplate पर एकाधिक nanofiber मैट्रिक्स patterning संशोधित electrospinning द्वारा प्रदर्शन नमूनों छेद असर मास्क का एक सेट का उपयोग किया गया । प्लैटिनम कोटिंग के लिए एक प्लास्टिक baseplate पर nanofiber जमाव की सुविधा का प्रदर्शन किया गया । अलग छेद के साथ मास्क-पैटर्न एक 3 डी प्रिंटर द्वारा तैयार किया गया । थाली के प्लेटिनम-लेपित क्षेत्र के मास्किंग के बाद, प्लेट-मास्क सेट संग्रह स्क्रीन पर रखा गया था, और सामांय electrospinning प्रदर्शन किया गया था । प्रारंभिक nanofibers मुखौटा में छेद के माध्यम से थाली पर पीटी लेपित पदों पर गठित किए गए थे । अतिरिक्त nanofiber बिस्तर मौजूदा मुखौटा की जगह और प्रक्रिया दोहरा द्वारा प्लेट पर गढ़े थे । (ख) एक microfluidic संरचना का निर्माण । यूवी का इलाज राल के साथ एक 3 डी प्रिंटर द्वारा मुद्रित मोल्ड microfluidic डिवाइस के PDMS परत के आकार का । कास्टिंग के बाद, MACME सरणी एक सतह सक्रिय nanofiber सरणी के साथ एक PDMS-आधारित microfluidic परत संलग्न द्वारा इकट्ठा किया गया था । चित्रा 3 विले से अनुमति के साथ संदर्भ४९ से अनुकूलित किया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 . ग्राफिकल यूजर इंटरफेस की छवियां (जीयूआई) सूक्ष्म छवि अधिग्रहण के लिए । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5 . एकल-कक्ष phenotyping के लिए कंप्यूटर निर्देशित छवि संसाधन के ग्राफ़िकल यूज़र इंटरफ़ेस (GUI) की छवियां । छवि विश्लेषण प्रक्रिया में 5 चरण होते हैं; (A) DAPI छवियों में प्राथमिक ऑब्जेक्ट्स की पहचान, (B-D) OCT4, Annexin V और EdU छवियों में द्वितीयक ऑब्जेक्ट्स की पहचान, क्रमशः, और ऑब्जेक्ट तीव्रता का मापन. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6 . Phenotyping और H9 hESCs के phenotypes के वर्गीकरण microenvironmental कारकों द्वारा बदल दिया है । (क) जिलेटिन (GT) nanofibers (GT_HighNF_HighCD) पर उच्च प्रारंभिक बीज घनत्व पर H9 hESCs के Immunofluorescent छवियों, तीन सेलुलर phenotypic मार्करों के साथ दाग (OCT4, pluripotency; EdU, सेल प्रसार; Annexin वी, apoptosis) और DAPI सेल नाभिक के लिए । (ख) पर्यवेक्षणीय पदक्रम clustering का एक हीटमैप और dendrograms. परीक्षण microenvironments phenotypes की समानता के आधार पर विशिष्ट सुविधाओं के साथ तीन समूहों में वर्गीकृत किया गया । समूह मैं जीटी nanofibers, MG_HighCD, और VN_HighCD शामिल थे । समूह द्वितीय जीटी nanofibers (GT_XLow और MidNF_MidCD), MG_MidCD, या VN_MidCD के नमूने शामिल हैं । सभी PMGI_NF नमूनों को समूह iii में संकुलित किया गया. हीटमैप में, गुलाबी और नीले रंग सोम गिनती भूखंडों में उच्च और निंन सेलुलर आवृत्तियों, क्रमशः संकेत मिलता है । (ग) प्रत्येक समूह से एक प्रतिनिधि नमूने में १००० कोशिकाओं के quantified मार्कर अभिव्यक्ति स्तर का वितरण (समूह i-GT_MidNF_HighCD, समूह द्वितीय-GT_MidNF_MidCD, और समूह iii-PMGI_MidNF_HighCD). 25 और 75 वां शतमक बॉक्स सीमाओं के रूप में दर्शाया गया था. मूंछों को १.५ बार interquartile की सीमा 25 वीं और 75 वें प्रतिशत से बढ़ाती है । प्रयोग प्रत्येक समूह के लिए तीन बार दोहराया गया । चित्रा 6 ए-सी विले से अनुमति के साथ संदर्भ४९ से अनुकूलित थे । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

नाम चैनल लंबाई (मिमी) चैनल चौड़ाई (माइक्रोन) चैनल ऊंचाई (माइक्रोन) प्रवेश/आउटलेट व्यास (माइक्रोन) प्रवेश/आउटलेट ऊंचाई (माइक्रोन) ढालना लंबाई (मिमी) ढालना चौड़ाई (मिमी) ढालना ऊंचाई (मिमी)
मोल्ड ८.४ ७०० 250/500/1000 ८०० ३००० १२७.७६ ८५.४८ १४.३५
नाम मोटाई (माइक्रोन) होल लंबाई (मिमी) होल चौड़ाई (मिमी) मास्क लंबाई (मिमी) मास्क चौड़ाई (मिमी) ढालना ऊंचाई (मिमी) पंक्ति ऑफ़सेट (मिमी) स्तंभ ऑफ़सेट (मिमी)
मास्क १००० 6 5 १२३.५ ८०.२ १४.३५ ११.२४ १४.३८

तालिका 1. एक microfluidic संरचना और एक nanofiber पैटर्न के लिए मुखौटा के लिए मोल्ड के आयाम ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

यह प्रोटोकॉल योग्य hPSCs के रखरखाव के लिए एक सुदृढ़ संस्कृति प्रणाली स्थापित करने के लिए पहली स्क्रीनिंग विधि को दर्शाता है । सबसे पहले, हम एक nanofiber सरणी, MACME सरणी के साथ एकीकृत एक microfluidic डिवाइस का उपयोग करके विविध कृत्रिम ECMs और कोशिका बोने घनत्व की विशेषता एक मंच तैयार करने के लिए कैसे वर्णित. दूसरा, मात्रात्मक छवि आधारित एकल सेल phenotyping५० प्रदर्शन के लिए व्यक्तिगत सेलुलर परिणामों और व्यवहार अलग जैव रासायनिक और भौतिक सुविधाओं द्वारा बदल मूल्यांकन किया गया । इस प्रोटोकॉल में, जीटी nanofiber से मिलकर पर्यावरण और उच्च प्रारंभिक कोशिका बोने की सघनता की स्थिति में सकारात्मक नियंत्रण ECM प्रोटीन एक विभेदित राज्य की सुविधाओं की विशेषता थी; तेजी से प्रसार४५ और स्थिर OCT4 अभिव्यक्ति५१. इस निरीक्षण से संकेत दिया कि आणविक तंत्र से संबंधित "सेल-extracellular मैट्रिक्स" और "सेल सेल" बातचीत hPSCs के pluripotency को प्रभावित कर सकता है ।

इस रणनीति के लिए उपयोगकर्ता के उद्देश्य के अनुरूप अनुकूलित किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, सेल हेरफेर और प्रवाह फिर से आकार और microfluidic संरचना के पैटर्न डिजाइन द्वारा प्रयोगात्मक सेटिंग्स की एक किस्म के लिए समायोजित किया जा सकता है । प्रवाह में सुधार के लिए एक और तरीका के रूप में, प्रवेश और प्रत्येक कक्ष के आउटलेट पदों ९६ के microplate मानक के अनुसार तैयार कर रहे है अच्छी तरह से प्लेटें, जैव आणविक विज्ञान के समाज द्वारा मानकीकृत; इस प्रकार, एक स्वचालित रोबोट तरल मशीन उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । आगे आणविक तंत्र की जांच करने के लिए "सेल-ECM बातचीत", कृत्रिम सेलुलर microenvironments करने के लिए किया जा सकता है और अधिक सटीकता से vivo स्थितियों में नकल करने के लिए रासायनिक संकेत के साथ nanofibers को संशोधित करने के अणुओं५२ .

तारीख करने के लिए, सेलुलर microenvironments स्क्रीनिंग के लिए विकसित अधिकांश प्लेटफार्मों घुलनशील कारकों स्क्रीनिंग के उद्देश्य से किया गया है (जैसे, विकास कारकों और रासायनिक यौगिकों)४२,४३,४४, लेकिन नहीं nanofiber ECMs के कारण अलग निर्माण तकनीकों के संयोजन में कठिनाइयों । उदाहरण के लिए, एक nanofiber शीट एक microfluidic संरचना और एक baseplate के बीच एक छोटे से अंतराल पैदा करता है और उनके अस्थिर संबंध है, जो विभिंन नमूनों के बीच परस्पर संदूषण में परिणाम क्योंकि एक संस्कृति माध्यम के माध्यम से एक और चैंबर के माध्यम से मिश्रण का कारण बनता है छोटे अंतर । हमारी नई विधि विशिष्ट स्थलों पर nanofiber मैट्रिक्स के सरल और सटीक निर्माण की सुविधा और baseplate, जो दोनों अस्थिर संबंध और पार-संदूषण रोकता के साथ उनके प्रत्यक्ष संबंध की अनुमति देता है । इसके अलावा, कुछ प्लेटफार्मों५३ microfluidics और nanofiber मैट्रिक्स के साथ एकीकृत दोनों रासायनिक और भौतिक cues के व्यवस्थित हेरफेर के लिए सुलभ हो गया है सेल कार्यों पर उनके प्रभाव की जांच, क्योंकि प्रौद्योगिकियों के लिए आवश्यक एकीकरण अत्यधिक परिष्कृत थे । MACME सरणी के साथ हमारे एकल सेल रूपरेखा एक आसानी से प्राप्य उपकरण और सरल तकनीक के साथ प्रदर्शन किया जा सकता है और विकास और सेल जैविक अध्ययन और दवा खोज के लिए सेलुलर वातावरण मॉडलिंग में उपयोग के लिए महान क्षमता रखती है/ स्क्रीनिंग.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

कोई.

Acknowledgments

हम iCeMS, क्योटो विश्वविद्यालय में प्रो एन Nakatsuji, मानव ES कोशिकाओं को उपलब्ध कराने के लिए धंयवाद । हम भी टोक्यो प्रौद्योगिकी संस्थान में प्रो Maruyama परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोप के उपयोग में उनके समर्थन के लिए धंयवाद । धन उदारता विज्ञान के संवर्धन के लिए जापान सोसायटी द्वारा प्रदान की गई (JSPS; २२३५०१०४, २३६८१०२८, २५८८६००६, और २४६५६५०२); नई ऊर्जा एवं औद्योगिक प्रौद्योगिकी विकास संगठन (नेदो) और Terumo लाइफ साइंस फाउंडेशन द्वारा भी धन प्रदान किया गया । WPI-iCeMS विश्व प्रीमियर अंतर्राष्ट्रीय अनुसंधान केंद्र पहल (WPI), शिक्षा, संस्कृति, खेल, विज्ञान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय (MEXT), जापान द्वारा समर्थित है । इस काम का एक हिस्सा क्योटो विश्वविद्यालय नैनो हब और MEXT, जापान द्वारा प्रायोजित "नैनो प्लेटफ़ॉर्म प्रोजेक्ट" में AIST नैनो-प्रोसेसिंग सुविधा द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Polystyrene (PS) Sigma #182435 Average Mw: 290,000, average Mn: 130,000
Polymethylglutarimide (PMGI) MicroChem G113113
Gelatin (GT) Sigma G2625 From porcine skin, type A
Sylgard 184 silicone elastomer kit Doe Corning Toray #1064291 PDMS curing agent and silicone elastomer base are components of this kit.
OpenSCAD This is a free 3D computer graphics software (http://www.openscad.org/) used for designing the mold of the microfluidic device.
AutoCAD 2014 Autodesk This is a 3D computer graphics software (https://www.autodesk.com/products/autocad/overview) used for design of the mask used on nanofiber-array preparation.
3D printer, AGILISTA-3000 Keyence
UV-curable resin, AR-M2 Keyence This is used for 3D printing by Agilista.
Acetic acid Sigma #338826 ≥99.99%
Ethyl acetate Sigma #270989 Anhydrous, 99.8%
Tetrahydrofuran (THF) Sigma #401757
MSP-30T Vacuum Device Magnetron sputtering machine
Nunc OmniTray Thermo Fisher Scientific #242811 This is a polystyrene baseplate on which the nanofiber array is created. This plate size is typically 127.7 x 85.5 mm. 
Gun-type corona discharge machine Shinko Electric & Instrumentation CFG-500 This handy device is used to generate corona for activation of the bottom surface of the PDMS layer at step 1.5 "Assembly of the MACME arrays" in the protocol.
5 mL syringe Terumo SS-05SZ
Stainless-steel blunt needle (23-gauge) Nipro #2166 Outside diameter and length are 0.6 and 32 mm, respectively.
High-voltage power supply TechDempaz
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide, hydrochloride Dojindo W001
N-Hydroxysuccinimide Sigma #56480
Matrigel hESC-Qualified Matrix Corning #354277 This protein is refered as basement membrane gel matrix in the protocol.
CellAdhere Vitronectin, Human, Solution STEMCELL Technologies #07004
TeSR-E8 STEMCELL Technologies #05940 Feeder-free, xeno-free culture medium for maintenance of human ES and iPS cells
Y-27632 Wako Pure Chemical Industries #253-00513
TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red Thermo Fisher Scientific #12605028 This ia a recombinant trypsin-like protease for dissociation of adherant mammalian cells.
Click-iT EdU Imaging Kit with Alexa Fluor 647 Azides Thermo Fisher Scientific C10086 The fluorescent labeling of proliferating cells in on-plate fluorescent staining was performed along the product manual of this kit.
Annexin V, Alexa Fluor 594 conjugate Thermo Fisher Scientific A13203
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Thermo Fisher Scientific D1306
Oct-3/4 Antibody (C-10) Santa Cruz Biotechnology sc-5279
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (DyLight 488) abcam ab96875 This is a secondary antibody used in on-plate fluorescent cell staining.
ECLIPSE Ti-E Nikon This is an inverted fluorescence microscope equipped with a CFI Plan Fluor 4×/0.13 N.A. objective lens (Nikon), CCD camera (ORCA-R2, Hamamatsu), mercury lamp (Intensilight, Nikon), XYZ automated stage (Ti-S-ER motorized stage with encoders, Nikon), and filter cubes for four fluorescence channels (DAPI, GFP HYQ, TRITC, Cy5; Nikon)
NIS-Elements Advanced Research Nikon This is a microscope imaging software used for automatic image acquisition.
CellProfiler, Version 2.1.0 This is a free open software for cell image analysis (http://cellprofiler.org/).
R SOM analysis is performed by kohonen package of this software. This is freely available (https://www.r-project.org/).
Cluster 3.0 This is the open source clustering software (http://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster/software.htm). Unsupervised hierarchical clustering is performed with this software.
Java TreeView This open source software (http://jtreeview.sourceforge.net/) is used to visualize clustering data as a heatmap and a dendrogram.
H9 human embryonic stem cell WiCell Stem Cell Bank WA09

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  2. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  3. Ameen, C., et al. Human embryonic stem cells: Current technologies and emerging industrial applications. Crit Rev Oncol Hematol. 65 (1), 54-80 (2008).
  4. Nishikawa, S., Goldstein, R. A., Nierras, C. R. The promise of human induced pluripotent stem cells for research and therapy. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (9), 725-729 (2008).
  5. Robinton, D. A., Daley, G. Q. The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy. Nature. 481 (7381), 295-305 (2012).
  6. Sartipy, P., Bjorquist, P., Strehl, R., Hyllner, J. The application of human embryonic stem cell technologies to drug discovery. Drug Discovery Today. 12 (17-18), 688-699 (2007).
  7. Discher, D. E., Mooney, D. J., Zandstra, P. W. Growth factors, matrices, and forces combine and control stem cells. Science. 324 (5935), 1673-1677 (2009).
  8. Joyce, J. A., Pollard, J. W. Microenvironmental regulation of metastasis. Nat Rev Cancer. 9 (4), 239-252 (2009).
  9. Danhier, F., Feron, O., Preat, V. To exploit the tumor microenvironment: Passive and active tumor targeting of nanocarriers for anti-cancer drug delivery. J Control Release. 148 (2), 135-146 (2010).
  10. Murphy, W. L., McDevitt, T. C., Engler, A. J. Materials as stem cell regulators. Nat Mater. 13 (6), 547-557 (2014).
  11. Patel, A. K., et al. A defined synthetic substrate for serum-free culture of human stem cell derived cardiomyocytes with improved functional maturity identified using combinatorial materials microarrays. Biomaterials. 61, 257-265 (2015).
  12. Zhang, R., et al. A thermoresponsive and chemically defined hydrogel for long-term culture of human embryonic stem cells. Nat Commun. 4, (2013).
  13. Anderson, D. G., Putnam, D., Lavik, E. B., Mahmood, T. A., Langer, R. Biomaterial microarrays: rapid, microscale screening of polymer-cell interaction. Biomaterials. 26 (23), 4892-4897 (2005).
  14. Celiz, A. D., et al. Discovery of a Novel Polymer for Human Pluripotent Stem Cell Expansion and Multilineage Differentiation. Adv Mater. 27 (27), 4006-4012 (2015).
  15. Hansen, A., et al. High-Density Polymer Microarrays: Identifying Synthetic Polymers that Control Human Embryonic Stem Cell Growth. Adv Healthcare Mater. 3 (6), 848-853 (2014).
  16. Mei, Y., et al. A high throughput micro-array system of polymer surfaces for the manipulation of primary pancreatic islet cells. Biomaterials. 31 (34), 8989-8995 (2010).
  17. Saha, K., et al. Surface-engineered substrates for improved human pluripotent stem cell culture under fully defined conditions. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (46), 18714-18719 (2011).
  18. Bettinger, C. J., Langer, R., Borenstein, J. T. Engineering substrate topography at the micro- and nanoscale to control cell function. Angew Chem Int Ed Engl. 48 (30), 5406-5415 (2009).
  19. McMurray, R. J., et al. Nanoscale surfaces for the long-term maintenance of mesenchymal stem cell phenotype and multipotency. Nat Mater. 10 (8), 637-644 (2011).
  20. Sun, Y., Jallerat, Q., Szymanski, J. M., Feinberg, A. W. Conformal nanopatterning of extracellular matrix proteins onto topographically complex surfaces. Nat Methods. 12 (2), 134-136 (2015).
  21. Nitanan, T., et al. Effects of processing parameters on morphology of electrospun polystyrene nanofibers. Korean J Chem Eng. 29 (2), 173-181 (2012).
  22. Liu, L., et al. Chemically-defined scaffolds created with electrospun synthetic nanofibers to maintain mouse embryonic stem cell culture under feeder-free conditions. Biotechnol Lett. 34 (10), 1951-1957 (2012).
  23. Liu, L., et al. Nanofibrous gelatin substrates for long-term expansion of human pluripotent stem cells. Biomaterials. 35 (24), 6259-6267 (2014).
  24. Kamei, K., et al. Phenotypic and transcriptional modulation of human pluripotent stem cells induced by nano/microfabrication materials. Adv Healthcare Mater. 2 (2), 287-291 (2013).
  25. Peerani, R., et al. Niche-mediated control of human embryonic stem cell self-renewal and differentiation. EMBO J. 26 (22), 4744-4755 (2007).
  26. Yamamoto, K., et al. Fluid shear stress induces differentiation of Flk-1-positive embryonic stem cells into vascular endothelial cells in vitro. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 288 (4), 1915-1924 (2005).
  27. Charati, S. G., Stern, S. A. Diffusion of gases in silicone polymers: Molecular dynamics simulations. Macromolecules. 31 (16), 5529-5535 (1998).
  28. Prado-Lopez, S., et al. Hypoxia promotes efficient differentiation of human embryonic stem cells to functional endothelium. Stem Cells. 28 (3), 407-418 (2010).
  29. Yanagihara, K., et al. Prediction of Differentiation Tendency Toward Hepatocytes from Gene Expression in Undifferentiated Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cells and Development. 25 (24), 1884-1897 (2016).
  30. Kamei, K., et al. 3D printing of soft lithography mold for rapid production of polydimethylsiloxane-based microfluidic devices for cell stimulation with concentration gradients. Biomed Microdevices. 17 (2), (2015).
  31. Song, J. H., Kim, H. E., Kim, H. W. Production of electrospun gelatin nanofiber by water-based co-solvent approach. J Mater Sci Mater Med. 19 (1), 95-102 (2008).
  32. Owen, M. J., Smith, P. J. Plasma Treatment of Polydimethylsiloxane. J Adhes Sci Technol. 8 (10), 1063-1075 (1994).
  33. Chen, G. K., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nat Methods. 8 (5), 424-476 (2011).
  34. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25 (6), 681-686 (2007).
  35. Kamei, K., et al. An integrated microfluidic culture device for quantitative analysis of human embryonic stem cells. Lab Chip. 9 (4), 555-563 (2009).
  36. Kamei, K., et al. Microfluidic image cytometry for quantitative single-cell profiling of human pluripotent stem cells in chemically defined conditions. Lab Chip. 10 (9), 1113-1119 (2010).
  37. Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7 (10), 100 (2006).
  38. Kohonen, T. Self-Organized Formation of Topologically Correct Feature Maps. Biol Cybern. 43 (1), 59-69 (1982).
  39. Wehrens, R., Buydens, L. M. C. Self- and super-organizing maps in R: The kohonen package. J Stat Softw. 21 (5), 1-19 (2007).
  40. Eisen, M. B., Spellman, P. T., Brown, P. O., Botstein, D. Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (25), 14863-14868 (1998).
  41. Saldanha, A. J. Java Treeview--extensible visualization of microarray data. Bioinformatics. 20 (17), 3246-3248 (2004).
  42. Du, G. S., Fang, Q., den Toonder, J. M. J. Microfluidics for cell-based high throughput screening platformsd-A review. Anal Chim Acta. 903, 36-50 (2016).
  43. Huang, S. B., et al. An integrated microfluidic cell culture system for high-throughput perfusion three-dimensional cell culture-based assays: effect of cell culture model on the results of chemosensitivity assays dagger. Lab Chip. 13 (6), 1133-1143 (2013).
  44. Wang, B. L., et al. Microfluidic high-throughput culturing of single cells for selection based on extracellular metabolite production or consumption. Nat Biotechnol. 32 (5), 473 (2014).
  45. Becker, K. A., et al. Self-renewal of human embryonic stem cells is supported by a shortened G1 cell cycle phase. J Cell Physiol. 209 (3), 883-893 (2006).
  46. Neganova, I., Lako, M. G1 to S phase cell cycle transition in somatic and embryonic stem cells. J Anat. 213 (1), 30-44 (2008).
  47. Fox, V., et al. Cell-cell signaling through NOTCH regulates human embryonic stem cell proliferation. Stem Cells. 26 (3), 715-723 (2008).
  48. Xu, C., et al. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 19 (10), 971-974 (2001).
  49. Kamei, K., et al. Microfluidic-Nanofiber Hybrid Array for Screening of Cellular Microenvironments. Small. 13 (18), (2017).
  50. Sun, J., et al. A Microfluidic Platform for Systems Pathology: Multiparameter Single-Cell Signaling Measurements of Clinical Brain Tumor Specimens. Cancer Res. 70 (15), 6128-6138 (2010).
  51. Theunissen, T. W., Jaenisch, R. Molecular Control of Induced Pluripotency. Cell Stem Cell. 14 (6), 720-734 (2014).
  52. Yoo, H. S., Kim, T. G., Park, T. G. Surface-functionalized electrospun nanofibers for tissue engineering and drug delivery. Adv Drug Del Rev. 61 (12), 1033-1042 (2009).
  53. Dixon, J. E., et al. Combined hydrogels that switch human pluripotent stem cells from self-renewal to differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (15), 5580-5585 (2014).

Tags

अभियांत्रिकी अंक १३९ microfluidic nanofiber भ्रूण स्टेम सेल सेलुलर microenvironment एकल सेल profiling स्व नवीकरण
एक मल्टीप्लेक्स कृत्रिम सेलुलर MicroEnvironment सरणी का निर्माण
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mashimo, Y., Yoshioka, M., Tokunaga, … More

Mashimo, Y., Yoshioka, M., Tokunaga, Y., Fockenberg, C., Terada, S., Koyama, Y., Shibata-Seki, T., Yoshimoto, K., Sakai, R., Hakariya, H., Liu, L., Akaike, T., Kobatake, E., How, S. E., Uesugi, M., Chen, Y., Kamei, K. i. Fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment Array. J. Vis. Exp. (139), e57377, doi:10.3791/57377 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter