Summary
Denna artikel beskriver den detaljerna metoden för att förbereda en multiplex konstgjorda cellulära närmiljön (MACME)-matris för hög genomströmning manipulation av fysikaliska och kemiska signaler symtom liknande i vivo cellulära mikromiljö och till identifiera den optimala cellulära miljön för mänskliga pluripotenta stamceller (hPSCs) med encelliga profilering.
Abstract
Cellulära mikromiljö består av en mängd olika tecken, till exempel tillväxtfaktorer, extracellulära matriser och intercellulära interaktioner. Dessa signaler är väl iscensatt och är avgörande för att reglera cellfunktioner i ett levande system. Även om ett antal forskare har försökt att undersöka sambandet mellan miljöfaktorer och önskad cellulära funktioner, förblir mycket okänd. Detta beror till stor del på bristen på en lämplig metod att efterlikna sådana miljömässiga ledtrådar i vitrooch samtidigt testa olika miljömässiga ledtrådar på celler. Vi rapporterar här, en integrerad plattform av mikrofabricerade kanaler och en nanofiber array, följt av hög-encelliga innehållsanalys, att undersöka stamceller fenotyper ändras av olika miljöfaktorer. För att demonstrera tillämpning av denna plattform, fokuserar denna studie på fenotyperna själv förnya mänskliga pluripotenta stamceller (hPSCs). Här presenterar vi förberedelse förfarandena för en nanofiber array och mikroflödessystem strukturen vid tillverkning av en multiplex konstgjorda cellulära närmiljön (MACME)-matris. Dessutom beskrivs övergripande steg av de encelliga profilering, cell färgning med flera fluorescerande markörer, flera fluorescens imaging och statistiska analyser.
Introduction
Mänskliga pluripotenta stamceller (hPSCs)1,2 själv förnya obegränsat och differentieras till olika vävnad härstamningar, som kan revolutionera läkemedelsutveckling, cellbaserade terapier, vävnadsteknik och regenerativ medicin 3 , 4 , 5 , 6. allmänna kulturen rätter och mikrotiter plattor, dock är inte utformade att möjliggöra exakta fysiska och kemiska cell manipulation på cellnivå med utbud av nano - till mikro-meter, som är en kritisk faktor för cellulära expansion, självförnyelse och differentiering. För att lösa denna nackdel, har studier undersökt av cellulära mikromiljö reglera cell-öde beslut och cell funktioner4roller. Under de senaste åren har ett ökande antal studier genomförts för att rekonstruera cellulära mikromiljö in vitro7,8. Nano - och micro-tillverkning processer har upprättat dessa mikromiljö genom manipulering av kemiska9,10,11,12,13, 14,15,16,17 och fysiska18,19,20 miljömässiga ledtrådar. Tills nu fanns det inga rapporter att systematiskt undersöka de bakomliggande mekanismerna av kemiska och fysiska miljön ledtrådar på cell-öde beslut och funktioner inom en enda plattform.
Här, införa vi en strategi som bygger på enkel designprinciper för att upprätta en robust screening plattform (figur 1). Först beskriver vi proceduren utveckling av en integrerad plattform för att skapa mångsidiga, konstgjorda cellulära mikromiljö med hjälp av en nanofiber-matris och en mikroflödessystem struktur: The Multiplexed konstgjorda cellulära närmiljön (MACME) array (Figur 1A och 2A). Nanofiber matrisen har 12 olika mikromiljö i varierande kombinationer av nanofiber material och densiteter. Electrospinning användes för att fabricera nanofibrer. Nanofiber material, såsom polystyren (PS)21, polymethylglutarimide (PMGI)22och gelatin (GT)23, utformades för att testa sina kemiska egenskaper, vilket kan påverka celladhesion och underhåll av pluripotency ( Figur 2B). Nanofiber tätheter varierades genom att ändra electrospinning tid och de genererade nanofibrer definierades enligt deras densiteter (DNF, med D = XLow/låg/mellan/hög). Mikroflödessystem strukturen består av Polydimetylsiloxan (PDMS) härbärgerat 48 cellkultur kammare, som kan placeras längs 96 brunnar mikroplattan standard dimensioner. PDMS är ett biokompatibelt och gas-utbytbara polymer som allmänt används för att tillverka mikroflödessystem enheter24. Varje mikroflödessystem kanal var avsedd att vara 700 µm breda och 8,4-mm lång och hade två vikar vid kanterna (tabell 1). Kamrarna hade olika höjder (250, 500 och 1000 µm) att manipulera den initiala cell-sådd tätheter (0,3 0,6 och 1,2 × 105 celler/cm2), som kan korrelera med överlevnad, proliferation och differentiering av hPSCs25 (Figur 2C). Antalet celler som seedade in i en kammare är proportionell till kolumn tätheten över kammaren golvet och därmed första cellen sådd densitet kontrollerades genom att införa samma cellsuspensionen i kultur avdelningar med olika höjder. Alla kanaler utformades för att vara ≥ 250-µm hög26 att minimera effekterna av låg-syre spänning27 och skjuvspänning28 på cellerna. Kanal höjder av 250, 500 och 1000 µm är förkortade här som XCD med X = Low, Mid, High, respektive. Miljöerna med distinkta nanofiber tätheter och inledande cell-sådd densiteter förkortades som ”Material_NF density_Cell täthet” (t.ex. GT_HighNF_HighCD: en miljö som kännetecknas av hög densitet GT nanofibrer och hög initial cell-sådd densitet).
Därefter beskriver vi hur du utför encelliga analyser för att systematiskt undersöka cell beteende som svar på miljöfaktorer (figur 1B). Som ett proof-of-concept identifierat vi den optimala cellulära miljön för hPSC självförnyelse, vilket är en nyckelfunktion för hPSC underhåll (figur 1B)29. Image-baserad flödescytometri, följt av statistiska analyser, möjliggör kvantitativ tolkning av enskilda cellulära fenotypiska svar till cellulära miljöer. Bland en mängd olika cellulära funktioner ger detta dokument en detaljerad för att identifiera de optimala förutsättningarna för att upprätthålla hPSC självförnyelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. tillverkning av MACME Array
Obs: Alla material och utrustning listas i tabellen material.
-
Beredning av masker för en nanofiber-matris och en form för en mikroflödessystem struktur
- Skapa tredimensionella (3D) bilder av masker som används för nanofiber matriser och formar för mikroflödessystem strukturer med hjälp av 3D-datorgrafik programvarupaket (tabell 1).
Obs: 3D-bilder läses och skrivs ut av en 3D-skrivare. De tryckta masker och mögel har samma dimensioner med 3D-bilder definieras med hjälp av grafik programvara vid steg 1.1.1. - Skriva ut masker och en mögel baserat på dessa mönster med hjälp av en 3D-skrivare.
Obs: I detta protokoll var en ink-jet-liknande 3D-skrivare med UV-härdande resin används30. Skrivarens upplösning var 635 × 400 dpi och 15 µm i X, Y och Z, respektive, men den faktiska X, Y-upplösning var ungefär fyra gånger lägre.
- Skapa tredimensionella (3D) bilder av masker som används för nanofiber matriser och formar för mikroflödessystem strukturer med hjälp av 3D-datorgrafik programvarupaket (tabell 1).
-
Nanofiber-array förberedelse (figur 3A)
- Förbereda polymerlösningar för electrospinning.
- Späd 13% PMGI vätska med tetrahydrofuran av 9% (w/v)22.
- Lös 0.08 g PS (antal genomsnittlig molekylvikt (Mn): 130.000) i THF:dimethylformamide (1:1 volym ratio)21, och lägga till THF:dimethylformamide för att få volymen upp till den slutliga 1 mL (8% (w/v) PS lösning).
- Lös 0,1 g GT i vatten: acetic acid: etylacetat (1:1.6:2.1 volym förhållande), och tillsätt vatten: acetic acid: etylacetat att få volymen upp till den slutliga 1 mL (10% (w/v) GT lösning) som beskrivs23,31.
- Använda en magnetron sputtering maskin, sätta in platina tunt med en 5-nm tjocklek på en polystyren (PS) bottenplatta (127,7 × 85,5 mm), som fungerar som katod i inställningen för electrospinning.
- Fyll varje polymer lösning i en 5 mL spruta försedd med en 23-G rostfritt stål trubbig nål.
- Placera och förankra sprutan med nålen på en sprutpumpen med 12 cm förutom samlaren av electrospinning enheten.
- Anslut sprutans nål till en högspänning strömförsörjning och ange för att gälla 11 kV.
- Ange pumpning av 0,2 mL/h.
- Hålla temperatur och luftfuktighet vid 30 ° C och < 30% (v/v).
- Sätt masken på bottenplattan beredd vid steg 1.2.2.
- Fabricera nanofibrer i bottenplattan genom hålen i mask med olika tätheter av electrospinning tiden förändras (t.ex. 20, 60, 90 och 180 s).
- Ta bort masken från bottenplattan.
Not. Etanol kan sprayas på den electrospun GT nanofibrer innan du tar bort masken för att undvika skalar av GT nanofibrer tillsammans med masken. - Upprepa steg 1.2.4-1.2.10 fram till slutförandet av nanofiber-array fabrication.
- Placera matrisen nanofiber i exsickator vid 25 ° C i 16 h avdunsta resterande lösningsmedel.
- Crosslink GT nanofibrer med 0,2 M 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydroklorid (EDC) och 0,2 M N-hydroxysuccinimide (NHS) i etanol vid 25 ° C i 4 h23.
- Skölj GT nanofibrer två gånger med 99,5% (v/v) etanol och vakuum-torr vid 25 ° C i 16 h.
- Förbereda polymerlösningar för electrospinning.
-
Tillverkning av mikrofabricerade strukturer (figur 3B)
- Blanda 2 g av PDMS bota agent och 20 g för PDMS base (1:10 vikt förhållande; Pre-PDMS). 24
- Häll pre-PDMS blandningen på mögel fabricerade i steg 1.2.
- Avinstallation gas pre-PDMS blandningen i exsickator för 30 min.
- Bota pre-PDMS blandningen i en ugn vid 65 ° C i 16 h.
-
Montering av MACME matriser (figur 3B)
- Skrapa av PDMS strukturen härdas vid steg 1.3.4 från mögel och ren med 70% (v/v) etanol.
- Behandla atmosfäriska coronaurladdning på undersidan av den PDMS struktur32.
Obs: I detta protokoll, är corona urladdat på hela ytan av ett lager 3 eller 4 gånger med en ”Handy” coronaurladdning apparat. Syre plasmabehandling ersattes med atmosfäriska coronaurladdning att förändra den ytan vidhäftning. - Montera PDMS struktur med arrayen nanofiber snabbt.
- Ugn-baka vid 65° C i 2 dagar.
2. Ladda hESCs till MACME Array
- För rutinmässiga kulturen i H9 mänskliga embryonala stamceller (hESCs), upprätthålla celler i xeno-free kemiskt definierade odlingsmedium för hPSC underhåll33 kompletteras med 10 µM Y-27632 ROCK hämmare34 (heter hPSC medium) i en 35 mm cellkultur maträtt belagd med basalmembranet gelmatrisen (MG).
- Passagen celler varje 4 till 7 dagar med hjälp av ett rekombinant trypsin-liknande proteas.
- Sterilisera en MACME matris med 99,5% etanol, av lastning in i kamrarna i 10 min och ta sedan bort etanol. Upprepa detta 3 gånger.
- Införa 12 µL av MG, 10 µg/mL Aktiebolaget Trav & Galopp (VN), och 0,1% (w/v) GT i kontroll kultur chambers och inkubera kamrarna vid 37 ° C för 1 h att bestryka dem på avdelningen ytor.
Obs: I detta protokoll valdes MG, VN och GT som referens proteiner för celladhesion och kultur. Eftersom MG och VN är standard cell-kultur-matriser som används för att upprätthålla hPSC självförnyelse, används de som positiva kontroller; tvådimensionell GT beläggning (2DGT) eller icke-beläggning (NC) användes som negativa kontroller. - Införa pre värmde hPSC medium i alla avdelningar med MACME matris. Inkubera kamrarna under 30 minuter vid 37 ° C.
- Tvätta H9 hESC odlade på en 35 mm maträtt med DPBS, tillsätt 0,5 mL av ett rekombinant trypsin-liknande proteas till skålen och inkubera vid 37 ° C i 1 min och sug noga ut endast supernatanterna blandas med proteashämmare.
Obs: Vid aspiration steg, är cellerna inte fristående. - Lägg omedelbart till hPSC medium, försiktigt dosera medlet mot skålen ytan upprepade gånger att separera celler och överföra fristående cellerna till en 15 mL koniska rör.
- Centrifugera vid 200 x g i 3 min. Aspirera supernatanten och avbryta celler i ett pre värmde hPSC medium.
- Införa 12 µL cellsuspension (1,2 × 106 celler/mL) i varje mikroflödessystem kammare.
Obs: Presentera en kammare celler från en annan med hjälp av en mikropipett. Eftersom antalet celler seedade till chambers är proportionell mot kolumnen täthet över kammaren golvet, kunde den initiala cell-sådd tätheten kontrolleras även om prover från samma cellsuspension användes. Säkerställa pipettering ske försiktigt. Ta bort överflödigt medel från kamrarna med en bomull spets pinne efter lastning. Arrayen MACME är kompatibel med både vanliga laboratorium pipetter och automatiserade pipett system, och det kräver inte någon särskild utrustning. - Ändra hPSC medium varje 12 h och kultur i 4 dagar.
Obs: Konstant volymer av medium (1,6 3,2 och 6,4 µL) upprätthålls med hjälp av kamrarna i olika storlekar. Kultur celler under ett statiskt tillstånd att minimera skjuvspänningen utom för utbyte av den cell odlingsmedium35,36.
3. kvantitativa Single-cell profilering
-
På-tallrik fluorescerande cell färgning
Obs: för att analysera fenotypiska förändringar själv förnya hPSCs, detta protokoll valt tre viktiga fenotypiska markörer för detta protokoll: OCT4, 5-ethynyl-2'-deoxiuridin (EdU), och Annexin V, att mäta status för pluripotens, spridning och apoptos , respektive (figur 2b). 4', 6-diamidin-2-fenylindol (DAPI) används för att identifiera cellkärnor. OCT4 är en av de kritiska transkriptionsfaktorerna för pluripotens.- Inkubera H9 hESCs i MACME matriser i hPSC medium kompletteras med 10 µM EdU alkynen vid 37 ° C i 30 min.
- Efter tvätt med annexin-bindande buffert (10 mM HEPES (pH 7,4), 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCl2), färga cellerna med en orange fluorescerande färgämne-Annexin V konjugat vid 20 ° C under 15 minuter.
- Fixa celler i PBS med 4% (v/v) PARAFORMALDEHYD vid 20 ° C under 15 minuter, och skölj sedan celler med PBS två gånger.
- Permeabilize celler som använder PBS med 0,3% (v/v) Triton x-100 vid 20 ° C för 16 h.
Obs: PARAFORMALDEHYD försvagar banden mellan en plast bottenplattan och en PDMS mikroflödessystem struktur. Avskildheten av PDMS lagret från array vid steg 3.2.1 kan således också utföras direkt efter detta steg. - Inkubera cellerna i Tris-baserade reaktion buffert med en röd fluorescerande färgämne natriumazid vid 20 ° C i 30 min.
- Inkubera cellerna i blockerande buffert (PBS med 5% (v/v) normala get serum, 5% (v/v) normala åsna serum, 3% (w/v) bovint serumalbumin, 0,1% (v/v) Tween-20 och 0,1% (w/v) N-dodecyl-β-D-maltoside) vid 4 ° C för 16 h.
- Inkubera i PBS med 0,5% (v/v) Triton x-100 lösning och human OCT3/4 antikropp (mus IgG) vid 4 ° C för 16 h.
- Inkubera i blockerande buffert med grönt fluorescerande färgämne-märkt åsna antimus IgG (H + L) vid 37 ° C i 60 min.
- Inkubera i PBS med DAPI vid 20 ° C i 30 min.
- Ersätta PBS-DAPI med PBS.
- Bevara MACME matrisen vid 4 ° C tills bild förvärv.
-
Bild förvärv (figur 4)
- Skrapa av PDMS mikroflödessystem strukturen från arrayen MACME.
- Ta bort återstående PBS från arrayen MACME, gälla cellerna 90%(v/v) glycerol i PBS och placera coverslips över de färgade cellerna.
- Ställ in plattan uppochner på scenen av en inverterad fluorescens Mikroskop.
- Förvärva 12-bitars färgbilder automatiskt med alla motordrivna komponenter (scenen, filter, slutare och fokus system) som kontrollerades av Mikroskop bildhanteringsprogram.
Not. I detta protokoll, exponeringstiderna justeras för att nå nära maximal intensitetsvärden (högsta pixel intensitet: 4096), men ingen mättnad, för varje bild, DAPI, OCT4, Annexin V och EdU.
-
Dator-guidad bildbehandling och fluorescens signal kvantifiering (figur 5)
Obs: följande cell bildanalys utförs utifrån en tidigare beskrivna metoden37.- Konvertera färgbilder till gråskala.
- Beräkna ett enda tröskelvärde för varje DAPI bild med metoden Otsu och klassificera pixlar över tröskelvärdet som förgrund och nedan som bakgrund. Säkerställa att förgrunden värdet motsvarar fluorescerande intensiteten av DAPI.
Obs: Analys av avbildningen innehåller 5 steg; identifiering av primära objekt i DAPI bilder, identifiering av sekundära objekt i OCT4, Annexin V och EdU bilder, respektive, och mätning av objekt intensitet. Figur 3 ger bilder av grafiskt användargränssnitt (GUI) på inställningen av bildbehandling. - Mäta OCT4 och EdU fluorescerande stödnivåerna på varje bild.
- Identifiera regionen fläckade av Annexin V med metoden förökning och kvantifiera fluorescerande intensiteten.
-
3.4. statistisk analys att visualisera enskilda cellulära fenotyper på encelliga imaging
- Normalisera varje fenotypiska markör ingående fluorescerande stödnivåerna av centrering och skalning dessa variabler för att ge dem lika vikt.
- Utföra självorganiserande karta (SOM) analys genom att använda en programmiljö för statistiska beräkningar och grafik som beskrivs av tidigare studier38,39.
- Skapa 25 SOM noder med distinkt fyra ”kodbok vektorer” motsvarar fyra markörer, DAPI, EdU, Annexin V och OCT4 fluorescerande stödnivåerna.
- Tilldela enskilda celler i varje närmiljön till en ”vinnande” (mest liknande) nod och rita som cellen frekvens, enligt vilken kodbok vektorerna av vinnande noden uppdateras använder ett viktat medelvärde, där vikten är den lärande skattesatsen (här, 0,05 som standard).
Obs: Utelämna data från chambers som innehåller mindre än 1 000 celler att datamängder som innehåller några celler inte statistiskt relevanta SOM resultat.
- Utföra oövervakade hierarkisk klustring med SOM-nod värdena med den genomsnit-koppling metod baserad på Pearson korrelation av ett kluster programvara40.
- Återge klustring data i dendrogram och heatmap visningar41.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
MACME matriser: Design och tillverkning: I kombination med nanofiber teknik använde vi mikroflödessystem cellkultur och screening tekniker anställd tidigare identifiera optimala förhållanden för hPSC självförnyelse eller differentiering35,det36 (figur 1). Detta är väl lämpad för att fastställa robust hög genomströmning cellbaserade analyser eftersom cell kultur chambers och villkor är just kontrollerbar och utbyggbart42,43,44. Här förbereddes arrayen nanofiber av en enkel nanofiber nedfall metod, electrospinning med 3D-tryckt masker. Den mikroflödessystem delen var fabricerade med en 3D-tryckt mögel att enkelt utforma kammaren struktur igenom många prövningar och fel. Matrisen MACME konstruerades genom att kombinera de två delarna och innehöll 48 miljöer, som tillhandahåller olika biofysiska och biokemiska signaler av olika kombinationer av båda nanofiber ECMs (3 typer av nanofiber material och 4 olika tätheter eller 4 kontroll Matrix proteiner) och cell-cell interaktioner (3 spänner av initial cell-sådd densitet) som visas i figur 2.
Utvärdering av övergripande effekter av nanofiber boenden och cellulära täthet på hESC fenotyper: Efter cellkultur på en MACME matris och på-tallrik fluorescerande färgning (figur 6A), encelliga mätningar utfördes med de förvärvade bilderna. För att jämföra homogenitet och heterogenitet uttrycksnivåerna för de fyra fenotypiska markörerna i varje datamängd, används detta protokoll SOM analys38,39, som omvandlar högdimensionella, multiparametric datamängder i låg-dimensionell 2D-kartor. Särskilt, uteslöts resultaten av PS nanofibrer och 2DGT matriser från denna analys med tanke på att de flesta celler inte klibbade. Dessutom var undantas från denna analys dessa experiment med låga CD där cellerna inte hade tillräckligt direkt (t.ex. juxtacrine) eller indirekt (parakrin) interaktioner att överleva. Efter SOM analys, oövervakade hierarkisk klustring utfördes för noderna SOM av alla analyserade prover (figur 6B). Av med tanke på höjden av den kluster dendrogram, fenotypiska skillnader tillät oss att kategorisera proverna i tre grupper: grupp i, de flesta av det provet nischer bestående av GT nanofibrer, MG_HighCD och VN_HighCD; Grupp ii, prover som innehåller GT nanofibrer (GT_XLow och MidNF_MidCD), MG_MidCD eller VN_MidCD; och grupp iii, alla PMGI_NF prover.
För att studera skillnaderna mellan grupperna, granskat vi ett representativt prov från varje grupp (enligtfigur 6C; Grupp i-GT_MidNF_HighCD, grupp ii-GT_MidNF_MidCD och grupp iii-PMGI_MidNF_HighCD). När det gäller OCT4 signaler, alla grupper visade en högre uttryck än den mg (MG_MidCD). Gruppen jag har präglats av hög EdU signaler, som visar att de flesta celler aktivt frodas. Därmed förkortas mikromiljö i grupp jag karakteriserades som villkor för hPSC underhåll eftersom odifferentierade hPSCs vanligtvis föröka sig snabbt när cellcykeln gap faser var45,46.
GT_MidNF_HighCD och GT_MidNF_MidCD kännetecknas av sin distinkta inledande cell-beläggningsgrader. Hög initial cell tätheter ökade cellernas möjligheter att interagera med angränsande celler, som förbättrade sin överlevnad och spridning47. Celler som seedade på en otillräcklig initiala densitet (3,0 × 104 celler/cm-2) överlevde varken växte under försöksperioden (4 dagar). Därför har vi inte tagit med dessa prover i SOM analysen; cellantal var under cut-off av 1000 levande celler/kammare. Cellerna i 2DGT ställningar var också kategoriseras som grupp ii celler; dessa villkor stöder inte hPSC självförnyelse48. GT_MidNF_MidCD cellernas EdU signal var förlorat och Annexin V nivåer var något ökade, vilket visar att cellerna hade förlorat sin stemness och gradvis hade blivit apoptotiska. PMGI_MidNF_HighCD, som representerar de mikromiljö bestående av PMGI nanofiber matriser, visade större variationer i OCT4 och EdU signaler jämfört med övriga villkor.
Figur 1 . Screening strategi för att identifiera optimal cellulär mikromiljö för reglering av cellulära funktioner. (A) översikt av komponenterna i arrayen multiplexade konstgjorda cellulära närmiljön (MACME). Matrisen består av två huvuddelar: nanofiber sängar mönstrade på en basal substrat (nanofiber array) och ett Polydimetylsiloxan (PDMS)-baserat mikroflödessystem struktur. Matrisen MACME är kunna förbereda nanofiber ECMs med en mängd funktioner (dvs nanofiber material och tätheter) och olika cell sådd tätheter. PDMS mikroflödessystem strukturen på matrisen MACME har tre mikroflödessystem-kanal höjder (250, 500 och 1000 µm) att reglera det initiala cellen-sådd densitet. (B) effekterna av cellulära mikromiljö på cell fenotyper utvärderas kvantitativt med en image-baserad single-cell-analys och statistisk dataanalys av självorganiserande kartan (SOM) följt av hierarkisk klustring. Denna siffra var anpassad från referens49 med tillstånd från Wiley. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 . Utformningen av matrisen MACME. (A) Overhead och hög vinkel skott av hela MACME array och det konceptuella diagrammet över en mikroflödessystem kanal (ljusblå) på en nanofiber matris (rosa). Varje kanal består av en 700 µm breda och 8,4 mm lång kultur avdelningen och två vikar för införandet av medium och celler. (B) jämförelse av storleken på cellerna och nanofiber matriser. Celler och nanofiber sängar höjder varierar från 1-3 µm och 0,05-5,0 µm, respektive. (C) ett tvärsnitt av varje mikroflödessystem kanal med en höjd på 250/500/1000 µm. Celler och nanofiber sängar är representerade som blå cirklar och orange linjer, respektive. Varje avdelning har samma bredd och längd men olika höjder (250, 500 och 1000 µm), och varje kammare volym var 1,6, 3,2 6,4 µL, respektive. Svart prickade rektangeln i figur 2C betecknar figur 2B. Figur 2 anpassades från referens49 med tillstånd från Wiley. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 . Tillverkning av MACME array. (A) tillverkning av en nanofiber-matris. Mönstring flera nanofiber matriser på en bottenplatta utfördes av modifierad electrospinning med en uppsättning masker med mönstrade hål. Platina-beläggning utfördes för att underlätta nanofiber nedfall på en plast bottenplatta. Maskerna med distinkta hål-mönster har utarbetats av en 3D-skrivare. Efter maskering av platina-belagda området av plattan, den platta-mask som sattes på skärmen insamling och normala electrospinning utfördes. De inledande nanofibrer bildades vid Pt-belagd positioner på tallriken genom hålen i masken. Ytterligare nanofiber sängar var fabricerade på plattan genom att ersätta befintliga masken och upprepa proceduren. (B) tillverkning av en mikroflödessystem struktur. Mögel tryckt av en 3D-skrivare med UV-härdande resin formade PDMS lagret av mikrofabricerade enheten. Efter gjutningen sammanställdes arrayen MACME genom att fästa ett PDMS-baserade mikroflödessystem lager med en surface-aktiverat nanofiber-matris. Figur 3 anpassades från referens49 med tillstånd från Wiley. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 . Bilder av grafiska användargränssnitt (GUI) för mikroskopisk bild förvärvandet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 . Bilder av grafiska användargränssnitt (GUI) av dator-guidad bildbehandling för encelliga fenotypning. Analys av avbildningen innehåller 5 steg; (A) identifiering av primära objekt i DAPI bilder, (B-D) identifiering av sekundära objekt i OCT4, Annexin V och EdU bilder, respektive, och mätning av objekt intensitet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6 . Fenotypning och klassificering av fenotyperna av H9 hESCs ändras av microenvironmental faktorer. (A) Immunofluorescerande bilder av H9 hESCs odlade på hög initial sådd densitet på gelatin (GT) nanofibrer (GT_HighNF_HighCD), målat med tre cellulära fenotypiska markörer (OCT4, pluripotency; EdU, cellproliferation; Annexin V, apoptos) och DAPI för cellkärnor. (B) en heatmap och dendrograms av oövervakade hierarkisk klustring. De testade mikromiljö var kategoriseras i tre grupper med distinkta funktioner baserat på likheterna mellan fenotyperna. Grupp som jag ingår GT nanofibrer, MG_HighCD och VN_HighCD. Grupp ii bestod av prover av GT nanofibrer (GT_XLow och MidNF_MidCD), MG_MidCD eller VN_MidCD. Alla PMGI_NF prover var grupperat i grupp iii. I heatmap anger rosa och blå färgerna höga och låga cellulära frekvenser i SOM antal tomter, respektive. (C) fördelning av kvantifierade markör uttrycksnivåerna för 1000 celler i ett representativt prov från varje grupp (grupp i-GT_MidNF_HighCD, grupp ii-GT_MidNF_MidCD och grupp iii-PMGI_MidNF_HighCD). 25: e och 75: e percentilerna indikerades som box gränserna. Morrhåren omfatta 1,5 gånger interkvartilintervall från 25: e och 75: e percentilerna. Experimenten upprepades tre gånger för varje grupp. Figur 6 A-C anpassades från referens49 med tillstånd från Wiley. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Namn | Kanal längd (mm) | Kanalbredd (μm) | Kanal höjd (μm) | Inlopp/utlopp diameter (μm) | Inlopp/utlopp höjd (μm) | Gjuter längd (mm) | Gjuter bredd (mm) | Gjuter höjd (mm) |
| Mögel | 8,4 | 700 | 250/500/1000 | 800 | 3000 | 127.76 | 85.48 | 14,35 |
| Namn | Tjocklek (µm) | Hål längd (mm) | Hål bredd (mm) | Masklängd (mm) | Masken bredd (mm) | Gjuter höjd (mm) | Rad Offset (mm) | Kolumner, förskjutning (mm) |
| Masken | 1000 | 6 | 5 | 123,5 | 80,2 | 14,35 | 11.24 | 14.38 |
Tabell 1. Dimensioner av mögel för en mikroflödessystem struktur och mask för en nanofiber mallning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll visar den första screeningmetoden för att upprätta ett robust kultur system för underhåll av kvalificerad hPSCs. Först beskrev vi hur man förbereder en plattform med olika konstgjorda ECMs och cell sådd densiteter med hjälp av en mikroflödessystem-enhet som är integrerad med en nanofiber array, MACME matrisen. Andra, kvantitativa bildbaserade encelliga fenotypning var utfört50 att utvärdera enskilda cellulära resultat och beteenden förändras genom olika biokemiska och biofysiska egenskaper. I detta protokoll präglades miljön bestående av GT nanofiber och positiv kontroll ECM proteiner i villkora av hög initial cell sådd densitet av funktioner i en odifferentierad staten; snabb spridning45 och stabil OCT4 uttryck51. Denna observation anges att molekylära mekanismer avser ”cell-extracellulära matrix” och ”cell-cell” interaktioner kan påverka pluripotency av hPSCs.
Denna strategi kan anpassas för att passa användarens syfte. Till exempel kan cell manipulation och genomströmning justeras för olika experimentella inställningar av omformningen av former och mönster av mikrofabricerade struktur. Som ett annat sätt för genomströmning förbättring, är inlopp och utlopp positionerna för varje kammare utformade enligt standarden mikroplattan 96 brunnar plattor, standardiserats av samhället av Biomolekylär vetenskaperna; en automatiserad robot flytande dispenser kan således användas för high-throughput screening. För att ytterligare studera den molekylära mekanismen om ”cell-ECM interaktioner”, kan de konstgjorda cellulära mikromiljö göras att närmare efterlikna i vivo villkor genom att kemiskt ändra nanofibrer med signalmolekyler52 .
Hittills har har de flesta plattformar som utvecklats för screening cellulära mikromiljö varit syftar till screening lösliga faktorer (t.ex., tillväxtfaktorer och kemiska föreningar)42,43,44, men inte nanofiber ECMs på grund av svårigheter att kombinera de distinkta fabrication teknikerna. Exempelvis ett nanofiber blad producerar ett litet mellanrum mellan en mikroflödessystem struktur och en bottenplatta och orsakar deras instabila limning, vilket resulterar i korskontaminering mellan olika prover eftersom ett odlingsmedium blanda med en annan avdelningens en genom en liten lucka. Vår nya metod underlättar enkel och exakt tillverkning av nanofiber matriser på specifika platser och ger deras direkta bindning med bottenplattan, vilket förhindrar både instabil limning och korskontaminering. Dessutom några plattformar53 integrerat med mikrofluidik och nanofiber matriser har varit tillgängliga för systematisk manipulation av både kemiska och fysiska ledtrådar att undersöka deras effekter på cellfunktioner, eftersom teknik behövs för integration var mycket sofistikerade. Våra encelliga profilering med arrayen MACME kan utföras med en lätt uppnåeliga apparat och enkla tekniker och har stor potential för användning i modellering cellulära miljöer för utveckling och cell biologiska studier och läkemedelsutveckling / screening.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
Vi tackar Prof. N. Nakatsuji på iCeMS, Kyoto University, för att ge mänskliga ES-celler. Vi tackar också Prof. A. Maruyama vid Tokyo Institute of Technology för hans stöd i användningen av mikroskopet atomic force. Generöst finansieringen tillhandahölls av Japan Society för främjande av vetenskap (JSPS; 22350104, 23681028, 25886006 och 24656502); finansiering tillhandahålls var också av den nya energin och Industrial Technology Development Organization (NEDO) och Terumo Life Science Foundation. Den WPI-iCeMS stöds av världen Premier International Research Centre initiativ (WPI), ministeriet för utbildning, kultur, sport, vetenskap och teknik (MEXT), Japan. En del av detta arbete stöds av Kyoto universitet nanoteknik Hub och AIST Nano-Processing Facility i ”nanoteknik plattform-projekt” som sponsras av MEXT, Japan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polystyrene (PS) | Sigma | #182435 | Average Mw: 290,000, average Mn: 130,000 |
| Polymethylglutarimide (PMGI) | MicroChem | G113113 | |
| Gelatin (GT) | Sigma | G2625 | From porcine skin, type A |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Doe Corning Toray | #1064291 | PDMS curing agent and silicone elastomer base are components of this kit. |
| OpenSCAD | This is a free 3D computer graphics software (http://www.openscad.org/) used for designing the mold of the microfluidic device. | ||
| AutoCAD 2014 | Autodesk | This is a 3D computer graphics software (https://www.autodesk.com/products/autocad/overview) used for design of the mask used on nanofiber-array preparation. | |
| 3D printer, AGILISTA-3000 | Keyence | ||
| UV-curable resin, AR-M2 | Keyence | This is used for 3D printing by Agilista. | |
| Acetic acid | Sigma | #338826 | ≥99.99% |
| Ethyl acetate | Sigma | #270989 | Anhydrous, 99.8% |
| Tetrahydrofuran (THF) | Sigma | #401757 | |
| MSP-30T | Vacuum Device | Magnetron sputtering machine | |
| Nunc OmniTray | Thermo Fisher Scientific | #242811 | This is a polystyrene baseplate on which the nanofiber array is created. This plate size is typically 127.7 x 85.5 mm. |
| Gun-type corona discharge machine | Shinko Electric & Instrumentation | CFG-500 | This handy device is used to generate corona for activation of the bottom surface of the PDMS layer at step 1.5 "Assembly of the MACME arrays" in the protocol. |
| 5 mL syringe | Terumo | SS-05SZ | |
| Stainless-steel blunt needle (23-gauge) | Nipro | #2166 | Outside diameter and length are 0.6 and 32 mm, respectively. |
| High-voltage power supply | TechDempaz | ||
| 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide, hydrochloride | Dojindo | W001 | |
| N-Hydroxysuccinimide | Sigma | #56480 | |
| Matrigel hESC-Qualified Matrix | Corning | #354277 | This protein is refered as basement membrane gel matrix in the protocol. |
| CellAdhere Vitronectin, Human, Solution | STEMCELL Technologies | #07004 | |
| TeSR-E8 | STEMCELL Technologies | #05940 | Feeder-free, xeno-free culture medium for maintenance of human ES and iPS cells |
| Y-27632 | Wako Pure Chemical Industries | #253-00513 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red | Thermo Fisher Scientific | #12605028 | This ia a recombinant trypsin-like protease for dissociation of adherant mammalian cells. |
| Click-iT EdU Imaging Kit with Alexa Fluor 647 Azides | Thermo Fisher Scientific | C10086 | The fluorescent labeling of proliferating cells in on-plate fluorescent staining was performed along the product manual of this kit. |
| Annexin V, Alexa Fluor 594 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A13203 | |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Oct-3/4 Antibody (C-10) | Santa Cruz Biotechnology | sc-5279 | |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (DyLight 488) | abcam | ab96875 | This is a secondary antibody used in on-plate fluorescent cell staining. |
| ECLIPSE Ti-E | Nikon | This is an inverted fluorescence microscope equipped with a CFI Plan Fluor 4×/0.13 N.A. objective lens (Nikon), CCD camera (ORCA-R2, Hamamatsu), mercury lamp (Intensilight, Nikon), XYZ automated stage (Ti-S-ER motorized stage with encoders, Nikon), and filter cubes for four fluorescence channels (DAPI, GFP HYQ, TRITC, Cy5; Nikon) | |
| NIS-Elements Advanced Research | Nikon | This is a microscope imaging software used for automatic image acquisition. | |
| CellProfiler, Version 2.1.0 | This is a free open software for cell image analysis (http://cellprofiler.org/). | ||
| R | SOM analysis is performed by kohonen package of this software. This is freely available (https://www.r-project.org/). | ||
| Cluster 3.0 | This is the open source clustering software (http://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster/software.htm). Unsupervised hierarchical clustering is performed with this software. | ||
| Java TreeView | This open source software (http://jtreeview.sourceforge.net/) is used to visualize clustering data as a heatmap and a dendrogram. | ||
| H9 human embryonic stem cell | WiCell Stem Cell Bank | WA09 |
References
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Ameen, C., et al. Human embryonic stem cells: Current technologies and emerging industrial applications. Crit Rev Oncol Hematol. 65 (1), 54-80 (2008).
- Nishikawa, S., Goldstein, R. A., Nierras, C. R. The promise of human induced pluripotent stem cells for research and therapy. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (9), 725-729 (2008).
- Robinton, D. A., Daley, G. Q. The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy. Nature. 481 (7381), 295-305 (2012).
- Sartipy, P., Bjorquist, P., Strehl, R., Hyllner, J. The application of human embryonic stem cell technologies to drug discovery. Drug Discovery Today. 12 (17-18), 688-699 (2007).
- Discher, D. E., Mooney, D. J., Zandstra, P. W. Growth factors, matrices, and forces combine and control stem cells. Science. 324 (5935), 1673-1677 (2009).
- Joyce, J. A., Pollard, J. W. Microenvironmental regulation of metastasis. Nat Rev Cancer. 9 (4), 239-252 (2009).
- Danhier, F., Feron, O., Preat, V. To exploit the tumor microenvironment: Passive and active tumor targeting of nanocarriers for anti-cancer drug delivery. J Control Release. 148 (2), 135-146 (2010).
- Murphy, W. L., McDevitt, T. C., Engler, A. J. Materials as stem cell regulators. Nat Mater. 13 (6), 547-557 (2014).
- Patel, A. K., et al. A defined synthetic substrate for serum-free culture of human stem cell derived cardiomyocytes with improved functional maturity identified using combinatorial materials microarrays. Biomaterials. 61, 257-265 (2015).
- Zhang, R., et al. A thermoresponsive and chemically defined hydrogel for long-term culture of human embryonic stem cells. Nat Commun. 4, (2013).
- Anderson, D. G., Putnam, D., Lavik, E. B., Mahmood, T. A., Langer, R. Biomaterial microarrays: rapid, microscale screening of polymer-cell interaction. Biomaterials. 26 (23), 4892-4897 (2005).
- Celiz, A. D., et al. Discovery of a Novel Polymer for Human Pluripotent Stem Cell Expansion and Multilineage Differentiation. Adv Mater. 27 (27), 4006-4012 (2015).
- Hansen, A., et al. High-Density Polymer Microarrays: Identifying Synthetic Polymers that Control Human Embryonic Stem Cell Growth. Adv Healthcare Mater. 3 (6), 848-853 (2014).
- Mei, Y., et al. A high throughput micro-array system of polymer surfaces for the manipulation of primary pancreatic islet cells. Biomaterials. 31 (34), 8989-8995 (2010).
- Saha, K., et al. Surface-engineered substrates for improved human pluripotent stem cell culture under fully defined conditions. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (46), 18714-18719 (2011).
- Bettinger, C. J., Langer, R., Borenstein, J. T. Engineering substrate topography at the micro- and nanoscale to control cell function. Angew Chem Int Ed Engl. 48 (30), 5406-5415 (2009).
- McMurray, R. J., et al. Nanoscale surfaces for the long-term maintenance of mesenchymal stem cell phenotype and multipotency. Nat Mater. 10 (8), 637-644 (2011).
- Sun, Y., Jallerat, Q., Szymanski, J. M., Feinberg, A. W. Conformal nanopatterning of extracellular matrix proteins onto topographically complex surfaces. Nat Methods. 12 (2), 134-136 (2015).
- Nitanan, T., et al. Effects of processing parameters on morphology of electrospun polystyrene nanofibers. Korean J Chem Eng. 29 (2), 173-181 (2012).
- Liu, L., et al. Chemically-defined scaffolds created with electrospun synthetic nanofibers to maintain mouse embryonic stem cell culture under feeder-free conditions. Biotechnol Lett. 34 (10), 1951-1957 (2012).
- Liu, L., et al. Nanofibrous gelatin substrates for long-term expansion of human pluripotent stem cells. Biomaterials. 35 (24), 6259-6267 (2014).
- Kamei, K., et al. Phenotypic and transcriptional modulation of human pluripotent stem cells induced by nano/microfabrication materials. Adv Healthcare Mater. 2 (2), 287-291 (2013).
- Peerani, R., et al. Niche-mediated control of human embryonic stem cell self-renewal and differentiation. EMBO J. 26 (22), 4744-4755 (2007).
- Yamamoto, K., et al. Fluid shear stress induces differentiation of Flk-1-positive embryonic stem cells into vascular endothelial cells in vitro. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 288 (4), 1915-1924 (2005).
- Charati, S. G., Stern, S. A. Diffusion of gases in silicone polymers: Molecular dynamics simulations. Macromolecules. 31 (16), 5529-5535 (1998).
- Prado-Lopez, S., et al. Hypoxia promotes efficient differentiation of human embryonic stem cells to functional endothelium. Stem Cells. 28 (3), 407-418 (2010).
- Yanagihara, K., et al. Prediction of Differentiation Tendency Toward Hepatocytes from Gene Expression in Undifferentiated Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cells and Development. 25 (24), 1884-1897 (2016).
- Kamei, K., et al. 3D printing of soft lithography mold for rapid production of polydimethylsiloxane-based microfluidic devices for cell stimulation with concentration gradients. Biomed Microdevices. 17 (2), (2015).
- Song, J. H., Kim, H. E., Kim, H. W. Production of electrospun gelatin nanofiber by water-based co-solvent approach. J Mater Sci Mater Med. 19 (1), 95-102 (2008).
- Owen, M. J., Smith, P. J. Plasma Treatment of Polydimethylsiloxane. J Adhes Sci Technol. 8 (10), 1063-1075 (1994).
- Chen, G. K., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nat Methods. 8 (5), 424-476 (2011).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25 (6), 681-686 (2007).
- Kamei, K., et al. An integrated microfluidic culture device for quantitative analysis of human embryonic stem cells. Lab Chip. 9 (4), 555-563 (2009).
- Kamei, K., et al. Microfluidic image cytometry for quantitative single-cell profiling of human pluripotent stem cells in chemically defined conditions. Lab Chip. 10 (9), 1113-1119 (2010).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7 (10), 100 (2006).
- Kohonen, T. Self-Organized Formation of Topologically Correct Feature Maps. Biol Cybern. 43 (1), 59-69 (1982).
- Wehrens, R., Buydens, L. M. C. Self- and super-organizing maps in R: The kohonen package. J Stat Softw. 21 (5), 1-19 (2007).
- Eisen, M. B., Spellman, P. T., Brown, P. O., Botstein, D. Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (25), 14863-14868 (1998).
- Saldanha, A. J. Java Treeview--extensible visualization of microarray data. Bioinformatics. 20 (17), 3246-3248 (2004).
- Du, G. S., Fang, Q., den Toonder, J. M. J. Microfluidics for cell-based high throughput screening platformsd-A review. Anal Chim Acta. 903, 36-50 (2016).
- Huang, S. B., et al. An integrated microfluidic cell culture system for high-throughput perfusion three-dimensional cell culture-based assays: effect of cell culture model on the results of chemosensitivity assays dagger. Lab Chip. 13 (6), 1133-1143 (2013).
- Wang, B. L., et al. Microfluidic high-throughput culturing of single cells for selection based on extracellular metabolite production or consumption. Nat Biotechnol. 32 (5), 473 (2014).
- Becker, K. A., et al. Self-renewal of human embryonic stem cells is supported by a shortened G1 cell cycle phase. J Cell Physiol. 209 (3), 883-893 (2006).
- Neganova, I., Lako, M. G1 to S phase cell cycle transition in somatic and embryonic stem cells. J Anat. 213 (1), 30-44 (2008).
- Fox, V., et al. Cell-cell signaling through NOTCH regulates human embryonic stem cell proliferation. Stem Cells. 26 (3), 715-723 (2008).
- Xu, C., et al. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 19 (10), 971-974 (2001).
- Kamei, K., et al. Microfluidic-Nanofiber Hybrid Array for Screening of Cellular Microenvironments. Small. 13 (18), (2017).
- Sun, J., et al. A Microfluidic Platform for Systems Pathology: Multiparameter Single-Cell Signaling Measurements of Clinical Brain Tumor Specimens. Cancer Res. 70 (15), 6128-6138 (2010).
- Theunissen, T. W., Jaenisch, R. Molecular Control of Induced Pluripotency. Cell Stem Cell. 14 (6), 720-734 (2014).
- Yoo, H. S., Kim, T. G., Park, T. G. Surface-functionalized electrospun nanofibers for tissue engineering and drug delivery. Adv Drug Del Rev. 61 (12), 1033-1042 (2009).
- Dixon, J. E., et al. Combined hydrogels that switch human pluripotent stem cells from self-renewal to differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (15), 5580-5585 (2014).
