Summary
يسمح هذا الأسلوب المنسدلة الجيش الملكي النيبالي بتحديد أهداف الجيش الملكي النيبالي رنا الطويل غير الترميز (لنكرنا). استناداً إلى التهجين للصنع، ومصممة بمعنى المضادة الحمض النووي اليغنوكليوتيد تحقيقات محددة لهذا لنكرنا في الأنسجة الثابتة على النحو المناسب أو خط الخلية، فإنه يسمح لكفاءة القبض على جميع أهداف الجيش الملكي النيبالي لنكرنا.
Abstract
منذ فترة طويلة غير الترميز الحمض النووي الريبي (لنكرنا)، وتسلسل النيوكليوتيدات أكثر من 200 دون إطار قراءة معرفة، تنتمي إلى عائلة رنا الترميز غير التنظيمية. ورغم أن وظائفها البيولوجية لا تزال غير معروفة إلى حد كبير، قد ازداد باطراد العدد من هذه لنكرناس ويقدر الآن أن البشر قد 10,000 أكثر من هذه النصوص. وبعض هذه معروفة للمشاركة في مسارات تنظيمية هامة للتعبير الجيني التي تجري على المستوى النسخي، ولكن أيضا في خطوات مختلفة للجيش الملكي النيبالي المشارك-والنضج بوستترانسكريبشونال. وفي الحالتين، يكون الكشف التي تستهدفها في لنكرنا اسمه. هذا هو السبب في أنها مفيدة لتطوير طريقة تمكين تحديد للكشف المرتبطة مباشرة أو غير مباشرة مع لنكرنا للفائدة.
هذا البروتوكول، الذي استلهم من البروتوكولات نشرت سابقا السماح بعزل لنكرنا جنبا إلى جنب مع تسلسل الكروماتين المرتبط به، وقد تم تكييف للسماح بعزل الكشف المرتبطة بها. عقدنا العزم أن هاتين الخطوتين في غاية الأهمية للكفاءة لهذا البروتوكول. الأول هو تصميم محددة معنى المضادة الحمض النووي اليغنوكليوتيد المسابير قادرة على هجن إلى لنكرنا للفائدة. تحقيقا لهذه الغاية، كان توقع هيكل الثانوية لنكرنا بالمعلوماتية الحيوية والمسابير اليغنوكليوتيد المضادة معنى صممت مع صلة قوية للمناطق التي تعرض احتمال الضعيف لإقران قاعدة داخلية. الخطوة الحاسمة الثانية من الإجراءات تعتمد على شروط مثبت للأنسجة أو استزراع الخلايا التي تحتوي على الحفاظ على شبكة الاتصال بين جميع الشركاء الجزيئية. مقترنة بتسلسل الحمض النووي الريبي إنتاجية عالية، يمكن أن توفر هذا البروتوكول المنسدلة الجيش الملكي النيبالي إينتيراكتومي الجيش الملكي النيبالي كله من لنكرنا للفائدة.
Introduction
والهدف العام للأسلوب الموصوفة هنا تحديد شركاء الجزيئية الجيش الملكي النيبالي فضله منذ فترة طويلة في الجيش الملكي النيبالي (لنكرنا). وتناظر لنكرنا متواليات النيوكليوتيدات أكثر من 200 دون إطار قراءة محددة. البعض منهم قد ثبت أن تشارك في تنظيم تعبير الجينات، ليس فقط على المستوى النسخي، ولكن أيضا في خطوات مختلفة للجيش الملكي النيبالي المشارك-والنضج بوستترانسكريبشونال. وفي الحالتين، هي الجزيئية شركاء لنكرنا الكشف التي يمكن تحديدها. ثم سيكون وسيلة تمكن من تحديد هوية من الكشف المرتبطة مباشرة أو غير مباشرة مع لنكرنا لمصلحة أساسية لتطوير.
سبق نشرها الأساليب، مثل "العزلة الكروماتين" "تنقية الحمض النووي الريبي" (غرد)1،2 والتقاط التهجين تحليل للحمض النووي الريبي الأهداف (المخطط)3،4، السماح باكتشاف الفائق البروتينات المرتبطة الحمض النووي الريبي ومواقع الربط الجينوم من لنكرنا محددة. في هاتين الطريقتين، كان المهجنة لنكرنا الاهتمام أولاً إلى بيوتينيلاتيد النوكليوتيد التكميلية، وكان المجمع ثم عزل باستخدام الخرز ستريبتافيدين. والفرق الرئيسي بين هذه التقنيات اثنين تتصل بتصميم المجسات التي تستهدف لنكرناس. غرد، استراتيجية مستوحاة من "الأسماك الجيش الملكي النيبالي"، تألفت من تصميم حمام سباحة قصيرة الحمض النووي اليغنوكليوتيد تحقيقات تكميلية لتجانب على طول لنكرنا. على العكس من ذلك، تكييف الكتاب في المخطط، مقايسة رسم خرائط "رناسي ح" في لنكرناس للتحقيق في المواقع المتاحة التهجين.
الإجراء المقترح للتصميم معنى المضادة الحمض النووي بيوتينيلاتيد اليغنوكليوتيد هنا المسابير استخدامات النمذجة المعلوماتية الحيوية ل الهيكل الثانوي لنكرنا5 لتحديد تحقيقات مع صلة قوية للمناطق التي تعرض احتمال الضعيف للداخلية قاعدة الاقتران. هذا الإجراء قد تتميز بأنها أقل تكلفة من تلك التي تستند إلى تجمعات لتبليطٍ اليغنوكليوتيد المسابير2 وتستغرق وقتاً أقل من تلك التي تستند إلى حساسية رناسي-ح4.
كما أن هناك مجموعة متزايدة من الأدلة لتنظيم الجينات بوستترانسكريبشونال لنكرناس6، أنها مفيدة جداً لوضع نهج تمكين الاستيلاء على الكشف التي أهداف لنكرنا. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدامها لمعظم التطبيقات، كان النهج الأمثل سواء في استزراع الخلايا والأنسجة مقتطفات.
Protocol
جميع الإجراءات أجريت في صارم مع الجماعة الاقتصادية الأوروبية لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية (86/609/EEC و 2010/63/رق) وقيد ترخيص الممنوح إلى "بيكقويت دال" (اتبعها des بوش-دو-رون، إذن رقم 13-002).
1-التحقيق في التصميم
-
باستخدام تسلسل الأولية لنكرنا للفائدة، تولد هيكلها الثانوية على "خادم الويب رناستروكتوري"5.
ملاحظة: في هذا الموقع، يمكن استخدام خوارزميات مختلفة. أدوات التنبؤ الثلاثة التي تعطي أفضل النتائج لتصميمات التحقيق: "إضعاف" (هيكل الطاقة الحرة أدنى) و "ماكسيكسبيكت" (زوج قاعدي المحتمل جداً) "بروبنوت" (زوج قاعدي المحتملة بما في ذلك بسيودوكنوتس). ويمكن إجراء هذه التحاليل الثلاثة ومقارنة. يمكن أيضا استخدام ملقمات ويب الأخرى، مثل ويبسويتي "الجيش الملكي النيبالي فيينا"7،.- حدد المناطق التي عرض احتمال الضعيف لإقران قاعدة داخلية وتصميم المجسات اليغنوكليوتيد المضادة معنى القواعد 25 مع صلة قوية لهذه المناطق.
ملاحظة: يجب أن تتألف محتويات هذه المسابر GC بين 40 و 60 في المائة. باستخدام أداة بحث محاذاة (الانفجار)، تأكد من أن تحقيقات اليغنوكليوتيد المضادة معنى المحددة لا تعترف بتسلسل النوكليوتيدات في الحمض النووي الريبي الأخرى المعرب عنها في نظام الخلية المختارة.
- حدد المناطق التي عرض احتمال الضعيف لإقران قاعدة داخلية وتصميم المجسات اليغنوكليوتيد المضادة معنى القواعد 25 مع صلة قوية لهذه المناطق.
- تصميم أيضا الحمض النووي غير محددة اليغنوكليوتيد تحقيق القواعد 25 الذي يعرض أي تقارب لنكرنا للفائدة لا لتسلسل الحمض النووي الريبي الأخرى في جينوم الفائدة.
- تأمر التحقيقات مع البيوتين في 3 '--النهاية.
ملاحظة: قد المسافة بين اليغنوكليوتيد والبيوتين بغية الحد من إعاقة الفراغية، يتعين زيادة مع فاصل تريثيلينيجليسيرول. النتيجة مثلى، وأن تكون قادرة على تقييم خصوصية نتائج السحب إلى أسفل، من المستحسن أن تصميم 3 مختلفة يسبر اليغنوكليوتيد المضادة الشعور ومن ثم قارن تجريبيا كفاءتها.
2-العابرة للربط
-
خلية مثقف العابرة للربط
- الثقافة GH4C1 سوماتولاكتوتروف خلايا الغدة النخامية في F10 المتوسطة في لحم الخنزير وتستكمل مع مصل العجل الجنين 2% و 15% مصل الحصان. تنمو الخلايا حتى التقاء في 78.5 سم2 ثقافة لوحات. وهذا يناظر حوالي 1 × 107 الخلايا.
- إزالة مستنبت الخلية من روافد GH4C1 78.5 سم2 ثقافة اللوحة، ثم شطف مع 1 × متوسطة الحجم من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)
- إصلاح الخلايا مع حل بارافورمالدهيد 1% في برنامج تلفزيوني (10 مل لاطباق 78.5 سم2 )؛ يجب أن يكون هذا الحل طازج من حل أسهم بارافورمالدهيد 4%. تشابك تحت التحريض لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT).
تنبيه: بارافورمالدهيد (PFA) سامة، ويجب التعامل معها بحذر. - إخماد عمل بارافورمالدهيد بإضافة المجلد 1/10 من جليكاين 1.25 متر (1 مل كل 10 مل من محلول بارافورمالدهيد)؛ تحرض 5 دقيقة في الرايت
- تجاهل وسائل الإعلام بالطموح وشطف اثنين مرات (5 دقائق) مع 1 × متوسطة الحجم لبرنامج تلفزيوني.
- إضافة مجلد لبرنامج تلفزيوني الموافق 1/10 من الحجم لوسائط الإعلام، وجمع الخلايا مع مكشطة الخلية، ونقل بعد ذلك إلى أنبوب الطرد مركزي.
- تدور في 510 ز عند 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- إزالة المادة طافية قدر الإمكان.
- تخزين الكريات إلى أجل غير مسمى كما هو مطلوب في-80 درجة مئوية.
-
الأنسجة العابرة للربط
- وضعت 5 ملغ أنسجة الغدة النخامية الماوس التي تم الحصول عليها حديثا في حل من 1% بارافورمالدهيد المخفف في برنامج تلفزيوني (حوالي 10 × حجم الأنسجة)، وتحرض لمدة 10 دقائق في الرايت
- إخماد عمل بارافورمالدهيد بإضافة حل جليكاين 1.25 متر (1 مل كل 10 مل من محلول بارافورمالدهيد) وتحرض 5 دقيقة في الرايت
- تجاهل وسائل الإعلام بالطموح وشطف مرتين مع برنامج تلفزيوني (حوالي 10 × حجم الأنسجة). إزالة المادة طافية قدر الإمكان.
- تخزين الأنسجة cross-linked إلى أجل غير مسمى في-80 درجة مئوية.
3-الخلية أو تفسخ النسيج
- إعداد "المخزن المؤقت تحلل" (pH 50 مم تريس-HCl 7.0، 10 مم يدتا، 1% الحزب الديمقراطي الصربي وتستكمل مع 200 يو/مليلتر من حل المانع رناسي، ومزيج من البروتياز المانع 5 ميليلتر/mL).
- للحصول على عينات تفكيك دون ذوبان الجليد السابقة، إعادة تعليق الكريات الخلايا أو الأنسجة cross-linked مع هذا المخزن المؤقت (حوالي 1 مل كل 100 مغ بيليه الخلية أو النسيج). بيليه خلية التي تم الحصول عليها من 1 × 107 خلايا تثير عينة ليسيد التي تحتوي على ما يقرب من 20 ملغ بروتين.
ملاحظة: اعتماداً على الأنسجة المستخدمة، ينبغي إضافة خطوة لتعطيل الميكانيكية. وفي هذه الحالة، من المهم تجنب تدفئة العينات أثناء هذه الخطوة الإضافية.
4-سونيكيشن
-
الاستغلال الأمثل للظروف سونيكاتيون
- برنامج سونيكاتور مع سلسلة 2 إلى 5 من 30 ثانية على و 30 s إيقاف.
- إجراء اختبارات لتحسين ظروف سونيكيشن على عينات تفكيك المخفف (عامل إضعاف ½ أو ¼ المقابلة لحوالي 10 أو 5 ملغ من البروتين). مكان تضعف تفكيك عينات في حمام الماء 4 درجات مئوية، وبدء سلسلة sonication.
- تنقية الكشف مع مجموعة مواد تنقية الحمض النووي الريبي أو كاشف عزل الحمض النووي الريبي (مثلاً، تريزول).
- تحميل مجمل المنقي الجيش الملكي النيبالي على 1% [اغروس] هلام التفريد في TBE العازلة، والتحقق من طول الأجزاء رنا. يجب أن تتراوح هذه المدة بين 200 و 800 شركة بريتيش بتروليوم.
ملاحظة: تبعاً لحجم الشظايا الجيش الملكي النيبالي، يمكن أن تختلف كفاءة المسابير اليغنوكليوتيد المضادة معنى. ثم يوصي بالتحقق من كفاءة تحقيقات تحت ظروف مختلفة من sonication.
-
سونيكيشن عينات ليسيد
- المياه حمام عينات مكان تفكيك الموافق 20 ملغ بروتينات (التي تم الحصول عليها بعد الخطوة 3.2) في 4 درجات مئوية وتبدأ سلسلة sonication النحو الأمثل في الخطوة 4، 1.
- وفور سونيكاتيون، جهاز الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 12,000 ز في 4 درجات مئوية. نقل سوبيرناتانتس في أنابيب أجهزة طرد مركزي جديدة.
ملاحظة: لضمان التجانس، supernatants نسخ متماثل يمكن تجميعها وتوزيعها في هذه الخطوة.
5-الجيش الملكي النيبالي المنسدلة
-
1-التهجين خطوة في اليوم
- إضافة مجلدات 2 من التهجين المخزن المؤقت (50 مم تريس-HCl pH 7.0، 750 ملم كلوريد الصوديوم، 1 مم يدتا، الحزب الديمقراطي الصربي 1%، 15% إضافة ميثلامين اكستيمبورانيوسلي) إلى supernatants جمعها بعد الخطوة sonication. دوامة.
- نقل 20 ميليلتر لكل عينة في أنبوب الطرد مركزي (نماذج الإدخال) وتخزينها في-20 درجة مئوية.
- إضافة 100 بمول من بيوتينيلاتيد اليغنوكليوتيد المسابر (محدد أو غير محدد؛ انظر الجدول 1) لكل عينة. احتضان ح 4 إلى 6 تحت الانفعالات المعتدلة في دوار أنبوب في الرايت
- إضافة 50 ميليلتر من حبات ستريبتافيدين المغناطيسي وتستكمل مع 200 يو/مليلتر من حل المانع رناسي ومزيج من البروتياز المانع 5 ميليلتر/مل.
- تبني بين عشية وضحاها تحت الانفعالات المعتدلة على محور دوار أنبوب في الرايت
-
2 – يوم خطوة عزل الحمض النووي الريبي
- استخدام الدعم المغناطيسي لفصل حبات من الخلية ليستي وتجاهل المادة طافية، وتغسل الخرز مع ميليلتر 900 من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي (الحزب الديمقراطي الصربي 0.5%، SSC 2 x). كرر 5 مرات تتخللها الانفعالات 5 دقيقة على محور دوار في الرايت
- بعد الغسيل الأخير، صب آخر مرة واحدة وإضافة ميليلتر 95 ك بروتينيسي المخزن المؤقت (الرقم الهيدروجيني 10 ملم تريس-HCl 7.0، 100 ملم كلوريد الصوديوم، 1 مم يدتا، الحزب الديمقراطي الصربي 0.5 في المائة) و 5 ميليلتر من البروتيناز-ك (20 ملغ/مل) للعينات.
- على الجليد، وذوبان الجليد في نماذج الإدخال (20 ميكروليتر) وإضافة ميليلتر 75 من المخزن المؤقت ك بروتينيسي و 5 ميليلتر من البروتيناز-ك (20 ملغ/مل).
- احتضان جميع العينات مع بروتيناز ك لمدة 45 دقيقة عند 50 درجة مئوية ثم 10 دقيقة عند 95 درجة مئوية.
- البرد العينة على الجليد لمدة 3 دقائق قبل فصل الخرز من الكشف بدعم المغناطيسي. الاحتفاظ بالمادة طافية وتجاهل الخرز.
- تنقية الكشف مع مجموعة مواد تنقية الجيش الملكي النيبالي، الذي ينبغي أن يتضمن خطوة هضم الحمض النووي. تخزين الكشف في-80 درجة مئوية.
- إجراء النسخ العكسي qPCR (RT-قبكر) باستخدام مجموعة RT تليها qPCR استخدام محددة الإشعال (الجدول 1).
- إنشاء مكتبتين الحمض النووي المقابلة لاثنين من مجمعات الجيش الملكي النيبالي الحصول عليها مع كل من المسابر Neat1 محددة (الجدول 1). إجراء تسلسل على نظام تسلسل الجيل القادم.
Representative Results
وقد أظهرت عدة دراسات أجريت مؤخرا أن لنكرناس تلعب دوراً أساسيا في تقريبا كل عملية بيولوجية هامة وأن يتحقق هذا الدور من خلال التحكم في الجينات التي تحدث سواء على الصعيدين بوستترانسكريبشونال والنسخي تظهر في هذه الحالة الأخيرة أن الكشف قد يكون الهدف من لنكرناس6.
تورط في نيوروباثولوجيس مختلفة هو الخرف فرونتوتيمبورال أو التصلب العضلي الجانبي أو الصرع8،،من910لنكرنا النووي المخصب وفيرة النسخة 1 (Neat1)، وهو أيضا ميسريجولاتيد في أنواع مختلفة من السرطان11،12.
كما هو معروف هذا لنكرنا أن يكون العنصر الهيكلي لهيئات نووية محددة، باراسبيكليس، وأن تشارك في تنظيم التعبير الجيني13الإيقاعية بوستترانسكريبشونال. والواقع المعروف باراسبيكليس التي توجد في نواة كل خلية وتتشكل حول ليس فقط Neat1، الذي ضروري لتكونها، بل أيضا حول عدة الجيش الملكي النيبالي ملزم البروتينات (الممارسات التجارية التقييدية)14، ليتمكن من الاحتفاظ بأهداف الجيش الملكي النيبالي داخل نواة15 . تشكيل باراسبيكليس يتحقق من خلال رابطة المكونات المختلفة. وأبدى هذا تشكيل لعرض نمط إيقاعي الإيقاعية القيادة احتفاظ نووية إيقاعي بالحمض النووي الريبي الأهداف13. قد تحدث استبقاء النووية لأهداف الجيش الملكي النيبالي باراسبيكليس ملزم لمكافحة الممارسات التجارية التقييدية أو مباشرة من خلال رابطة الحمض النووي الريبي/الجيش الملكي النيبالي، ولكن مدى الكشف التي يستهدفها باراسبيكليس قد يتقرر. للتعرف الحمض النووي الريبي المستهدفة مباشرة أو غير مباشر ب Neat1، بروتوكولا منسدلة الحمض النووي الريبي تم تصميمه الذي يسمح بالعزل وتحديد جميع أهداف الجيش الملكي النيبالي Neat1 في الخلايا المستزرعة، وكذلك كما هو الحال في عينات الأنسجة (انظر الشكل 1 رسومية العرض التقديمي للتقنية).
وكان أيضا بنجاح تطبيق البروتوكول إلى تحديد أهداف الجيش الملكي النيبالي لنكرنا آخر خبيث المرتبطة الرئة غدية نسخة 1 (Malat1). Malat1 لنكرنا مصانة للغاية وأعرب عن الموجودة في البقع النووية جنبا إلى جنب مع الجيش النيبالي الملكي عدة عوامل الربط. ومن المعروف أن تشارك في تنظيم الربط عدة مرناً قبل الوليدة16،17Malat1.
محددة (هكذا) والمسابير اليغنوكليوتيد غير محددة (مكتب الإحصاء الوطني) تم إنشاؤها باستخدام استراتيجية تصميم المسبار الموصوفة هنا. وتعتمد هذه الاستراتيجية على اختيار المناطق التي تعرض احتمال الضعيف لقاعدة داخلية الأقران كما تنبأ بهيكل الثانوية لنكرنا، وعلى تصميم تحقيقات محددة مع صلة قوية لهذه المناطق. نتيجة ممثل لهذه التوقعات المعلوماتية الحيوية، صورة لهيكل تسلسل Neat1 الثانوية المتوقعة (النيوكليوتيدات 1,480 إلى 2,000) جنبا إلى جنب مع موقف اثنين مصممة بحيث تعطي المسابير في الشكل 2.
ووجهت المسابر المصممة الفئران Neat1 أو Malat1 للخلايا GH4C1 مثقف والماوس Neat1 لانسجة الغدة النخامية مقتطفات (الجدول 1). تم حساب إثراء النسبي في Neat1 أو Malat1 لتحقيقات غير محددة ومعينة بالنسبة للعينات المدخلات. ويبين الشكل 3 كفاءة تحقيقات محددة لسحب لأسفل Neat1 في الفئران GH4C1 خط خلايا الغدة النخامية (الشكل 3 ألف) وفي الماوس مقتطفات أنسجة الغدة النخامية (الشكل 3B). عند استخدام بروتوكول تصميم مسبار لتوليد اليغنوكليوتيد محددة (حيث) المجسات الموجهة إلى Malat1، واحد تم الحصول على التحقيق الفعال في حين آخر ليس من الكفاءة ما يكفي وتجاهل (الشكل 4 أ).
بعد الحمض النووي الريبي عرضت إجراء سحب لأسفل تليها تجارب RT-قبكر، بعض الكشف المقررة مع الإشعال محددة (الجدول 1) المراد إقرانها مع Neat1 أو Malat1 في مقتطفات GH4C1. وعرضت أيضا الكشف المرتبطة Neat1 في GH4C1 خلية مقتطفات المراد إقرانها مع Neat1 في أنسجة الغدة النخامية مقتطفات. وفي الواقع، بعد الجيش الملكي النيبالي Neat1 المنسدلة، تم العثور على Malat1 هدفا Neat1 في خط الخلية GH4C1 وفي مقتطفات أنسجة الغدة النخامية الماوس (الشكل 5A). المقابل، كان إلى حد كبير أثري Neat1 بعد تنفيذ الجيش الملكي النيبالي Malat1 المنسدلة مع تحقيق محددة في الخلايا GH4C1 (الشكل 4 باء). بتسليط الضوء على العلاقة الوثيقة بين لنكرناس اثنين، هذه النتائج تتسق مع الدور المحتمل كوريجولاتوري Neat1 واقترح بالفئران بالضربة القاضية Malat1 التي تعرض الاختلافات في الحمض النووي الريبي Neat1 التعبير18، Malat1 19-المحاضر المستنسخة لهرمونات الغدة النخامية الرئيسي هرمون النمو (غ) (الشكل 5B) والبرولاكتين (Prl) (الشكل 5) كانت أثرت إلى حد كبير عقب الجيش الملكي النيبالي Neat1 المنسدلة مع تحقيقات محددة في كل من الخلايا GH4C1 والغدة النخامية مقتطفات، مما يوحي بإمكانية تنظيم الهرمونات اثنين من Neat1. عند مقارنة تحقيقات محددة اثنين المستخدمة، ويبدو أن كفاءتها ويمكن أن تختلف تبعاً لهدف الجيش الملكي النيبالي نظرت (الشكل 5 (ب) و الشكل 5). وتبرز هذه النتائج ضرورة تصميم عدة تحقيقات محددة بغية تحديد تلك عرض أفضل كفاءة في إثراء لنكرنا المنسدلة، ليس فقط، بل أيضا أفضل كفاءة في إثراء أهدافها في الجيش الملكي النيبالي.
أيضا يمكن أن يتبع أسلوب المنسدلة الجيش الملكي النيبالي بتسلسل الحمض النووي الريبي الفائق للحصول على قائمة شاملة لأهداف الجيش الملكي النيبالي من لنكرنا لفائدة13. تحليل الحمض النووي الريبي seq في خلايا الغدة النخامية GH4C1 بعد أن أنجز الجيش الملكي النيبالي Neat1 المنسدلة استخدام المسابير محددة اثنين المذكورة أعلاه. من الجدير أن عنصر تحكم سلبية المكتب الوطني للإحصاءات باستخدام أيضا يمكن أن تخضع لتحليل الحمض النووي الريبي seq، إذا كان مستوى الحمض النووي الريبي استردادها بعد كافية للسماح ببناء مكتبات الحمض النووي الريبي المنسدلة مع المكتب الوطني للإحصاءات. وهذا لم يكن الحال في التجربة السابقة13. المكتبات التي تم إنشاؤها بعد استخدام المسابير محددة تم تحليلها باستخدام تفت/أزرار اكمام الأنبوب20 والنصوص فقط مع قيم الأجزاء في كل كيلوبس كل مليون القراءات المعينة (فبكم) أعلى من 1 أخذت في الاعتبار. الحصول على القوائم مع تحقيقات محددة اثنين الموجهة إلى Neat1 (الجدول 1) كانت عبرت لتقييم الطابع الخاص للنتائج. تم العثور على جينات 4,268 المرتبطة باراسبيكليس، التي تمثل 28% نصوص المعرب عنها في الخلايا GH4C113. تمشيا مع النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام تحليل قبكر (الشكل 5 ألف-جيم)، عثر على محاضر هرمون النمو و Prl و Malat1 أن تترافق مع Neat1. ولذلك ثبت الأسلوب المنسدلة الحمض النووي الريبي لتكون أداة فعالة لاستكشاف التفاعل بين لنكرناس وأهدافها الجيش الملكي النيبالي.
رقم 1: تمثيل رسومي للجيش الملكي النيبالي هدم الداخلي. اليوم الأول، خلايا أو أنسجة تم تصميمهما بارافورمالدهيد وتفكيك وسونيكاتيد قبل الخطوة التهجين التي كان يؤديها إضافة بيوتينيلاتيد تحقيقات محددة. ثم أضيفت حبات ستريبتافيدين المغناطيسي لفصل المواد المحددة من بقية الخلية ليستي. اليوم الثاني، تم عزلة بواسطة مغناطيس الخرز وغسلها عدة مرات. خطوة crosslinking دي يسمح استرداد الكشف التي تم تنقيتها ويستخدم RT qPCR أو تحليل الحمض النووي الريبي seq. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: الهيكل الثانوي من سلسلة Neat1 (النوكليوتيدات 1,480 إلى 2,000) كما تنبأ بالموارد المعلوماتية الحيوية (خادم الويب رناستروكتوري؛ وهيكل الطاقة الحرة أدنى)- هو لون الهيكل حسب درجة الاحتمال لإقران قاعدة. يتم وضع المسابر النوكليوتيد اثنين (SO1 و SO2) باللون الأحمر على طول بنية الحمض النووي الريبي Neat1. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: التحقق من صحة qPCR لتخصيب Neat1 مقابل المدخلات- التحقق من صحة qPCR تخصيب Neat1 مقابل المدخلات بعد رنا Neat1 هدم باثنين تحقيقات محددة مختلفة (SO1-rn و SO2-rn للخلايا GH4C1 و SO1 ملم و SO2 ملم لانسجة الغدة النخامية) مقارنة بغير محددة واحدة (المكتب الوطني للإحصاءات-rn للخلايا GH4C1 والمكتب الإحصائي الوطني-مم بالنسبة أنسجة الغدة النخامية) في خلايا الفئران GH4C1 (A) وفي الغدة النخامية الماوس تستخرج الأنسجة (ب). وتكون النتائج يعني ± ووزارة شؤون المرأة التي تم الحصول عليها في تجارب 3 إلى 10. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: التحقق من صحة qPCR تخصيب Malat1 و Neat1 مقابل المدخلات بعد رنا Malat1 هدم. التحقق من صحة قبكر من Malat1 (A) و Neat1 (ب) تخصيب اليورانيوم مقابل المدخلات بعد رنا Malat1 هدم باثنين تحقيقات محددة مختلفة (SO3-rn و SO4--rn) مقارنة بغير محددة واحدة (المكتب الوطني للإحصاءات-rn) في خلايا الجرذ GH4C1. وتكون النتائج يعني ± ووزارة شؤون المرأة التي تم الحصول عليها في 3 تجارب. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 5: التحقق من صحة قبكر من Malat1، هرمون النمو، Prl تخصيب اليورانيوم مقابل المدخلات بعد هدم الجيش الملكي النيبالي Neat1. التحقق من صحة قبكر من Malat1 (A)، هرمون النمو (ب)، Prl (ج) تخصيب اليورانيوم مقابل المدخلات بعد رنا Neat1 سحب إلى أسفل باستخدام المسابر محددة مختلفة بالمقارنة مع أحد غير محددة في خلايا الجرذ GH4C1 ومقتطفات من أنسجة الغدة النخامية الماوس. وتكون النتائج يعني ± ووزارة شؤون المرأة التي تم الحصول عليها في تجارب 3 إلى 8. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| أسماء مسبار | تسلسل | |
| المكتب الوطني للإحصاءات-Rn | تاااتاككاتتجاتجتتجااتات | |
| SO1-Rn | كتككاككاتكاتكاتككتكتجاك | |
| SO2-Rn | جككتكككاكاتتااااكاكاك | |
| SO3-Rn | آكتكجتجكتكاجتجاجتجاكا | |
| SO4--Rn | آجاكتكتكاجكتككتجكتكاتك | |
| المكتب الوطني للإحصاءات-مم | جتتجتجتتاكاجتججاجك | |
| SO1 ملم | جككتكككاكتجتااككاكااك | |
| SO2-مم | كتكاكككجكاككككجاكتككتكا | |
| قبكر كبسولة تفجير: | ||
| الجرذ النرويجي | ||
| Neat1 | آجكاكجاجتاجككجكاات | |
| تجتجكاكاجتكاجاككتجتكاتك | ||
| Malat1 | جاجكجتجتاكتجكتاتجكتجت | |
| تكتككتجاجتجاكتجتجاككا | ||
| Gh1 | ككجكجتكتاتجاجااكتجاجا | |
| جتتجكتجاجاتكتجكككات | ||
| Prl | تجاككتجاتككتكاجتتغت | |
| أجكتجكتتجتتتجتككتكا | ||
| موس موسكولوس | ||
| Neat1 | تججكككتججتكاتكتاكتاجاتا | |
| كاكاجكتجتككاتجاجكجاتكت | ||
| Gh1 | كتكجاككجتجتكتاتجاجااكتجا | |
| تتجكتجاجاتكتجكككاكاك | ||
| Prl | تجاككتجاتككتكاجتتغت | |
| أجكتجكتتجتتتجتككتكا | ||
الجدول 1: تسلسل الحمض النووي اليغنوكليوتيد المسابير والإشعال قبكر
Discussion
منذ فترة طويلة فضله الكشف (لنكرناس) بعدد وتنوع تمثل حقل كبير من البحوث، ومعظم أدوارها لا يزال يتم اكتشافها. العديد من هذه لنكرناس تعريب نووية وفيما بينها، بعض المتورطين في مسارات تنظيمية للتعبير الجيني من خلال آليات النسخي أو بوسترانسكريبشونال. واحدة من التحديات الحالية في هذا المجال أن نفهم أهمية تلك لنكرناس في المعالجة بوستترانسكريبشونال للكشف. لهذا الغرض، يكون الكشف التي يستهدفها لنكرناس اسمه. مستوحاة من الدراسات السابقة ركزت على ارتباط لنكرناس بلونين، وضعنا الداخلي الذي يسمح تحديد الكشف المقترنة لنكرنا. نجاح هذا البروتوكول، المسماة الجيش الملكي النيبالي سحب لأسفل، تعتمد أساسا على اثنين من الخطوات الحاسمة، إلا وهي تصميم مكافحة الشعور يسبر اليغنوكليوتيد الحمض النووي التي هجن حصرا وتحديداً مع لنكرنا للفائدة، وظروف الأنسجة أو تثبيت الخلية التي تحتوي على الحفاظ على سلامة الشبكة بين جميع الشركاء الجزيئية.
سبق نشر البروتوكولات التي توفر إجراءات لعزل لنكرنا جنبا إلى جنب مع تسلسل الكروماتين المرتبط به (غرد1،2،3،الرسم البياني4). في هذين البروتوكولين، استخدمت استراتيجيات مختلفة لتصميم يسبر اليغنوكليوتيد بيوتينيلاتيد الحمض النووي معنى لمكافحة. في الإجراء غرد، يستخدم المؤلفون مجموعة من الحمض النووي بيوتينيلاتيد اليغنوكليوتيد تحقيقات شاملة على طول لنكرنا للفائدة بعد استبعاد جميع المسابر زائدة عن الحاجة وغير محددة1،2. في بروتوكول مخطط، وحددت مناطق لنكرنا التي أيسر منالاً التهجين الكتاب وتصميم النوكليوتيد الالتقاط التي تستهدف هذه المناطق. تم اختيار هذه المناطق على أساس حساسيتها رناسي-ح. في الواقع، استخدام الخاصية رناسي ح أن يتحلل الكشف على مواقع لربط الحمض النووي الريبي، النوكليوتيد أن هجن إلى مواقع موجوداً في لنكرنا إنتاج هجن الحمض الريبي النووي ويؤدي إلى الانقسام الانزيمية لنكرنا. الكتاب تحديد ثلاثة من هذه النوكليوتيد القبض على المرشح، واستخدمها في كوكتيل3،4.
الإجراء علينا استخدامها لتصميم المسابير اليغنوكليوتيد بيوتينيلاتيد الحمض النووي معنى المضادة كانت قريبة من تلك المستخدمة في بروتوكول مخطط، ولكن مناطق التهجين المتاحة لنكرنا المرجوة لم اختيرت على أساس حساسيتها رناسي-ح، ولكن ووفقا لاحتمال منخفض لإقران قاعدة داخلية حسبما تقرره النمذجة المعلوماتية الحيوية للهيكل الثانوي لنكرنا. يجب أن يكون لاحظت أن مختلف الهياكل الثانوي سوف يمكن التنبؤ باستخدام خوارزميات مختلفة، وينبغي أن تكون تحقيقات تحديد تلك التي هجن إلى تسلسل المتاحة من لنكرنا في أكبر عدد من الهياكل الثانوية وتوقع. تم الحصول على نفس النتائج باستخدام أما كوكتيل من ثلاثة مصممة أو تحقيقات محددة أو إجراء تحقيق واحد على حدة. هذا ما دفع استخدام اثنين من تحقيقات منفصلة ومحددة، والنظر في نتائج إيجابية كتلك التي مشتركة بين هذه المسابر اثنين. وأخيراً، ولذلك ينصح في بداية تطوير الأسلوب، نتيجة مثلى ويَسْبِر ليتمكن من تقييم خصوصية نتائج السحب إلى أسفل، تصميم 3 اليغنوكليوتيد الإحساس بمكافحة مختلف ومن ثم مقارنة تجريبيا كفاءتها، لا سيما منذ أن يغير كفاءة التحقيق إعداد ليستي الخلية. ومع ذلك، إجراء تصميم المسبار على النمذجة المعلوماتية الحيوية من لنكرنا الثانوي ظل هيكل استخدمنا أقل تكلفة من التي تستند إلى تجمعات لتبليطٍ اليغنوكليوتيد المسابير2، وكان هذا أقل استهلاكاً للوقت من الطريقة القائمة على أساس وفي حساسية رناسي-ح4.
عنصر تحكم سلبية ينبغي أيضا إجراء استخدام كما يسبر التقاط السلبية اليغنوكليوتيد اليغنوكليوتيد بيوتينيلاتيد الحمض النووي معنى أو سارعت المسابير اليغنوكليوتيد، أو النوكليوتيد الموجهة ضد الحمض النووي الريبي لا علاقة لها. بسبب وجود النصوص العقاقير الطبيعية لنكرناس، قد يكون استخدام المسابير اليغنوكليوتيد الشعور أحياناً غير كافية. بغض النظر عن التحقيق اليغنوكليوتيد المحددة لعنصر التحكم السلبي، من الضروري للتحقق من الانفجار أنه لا هجن مع رنا معروفة ونضع في اعتبارنا أن يمكن هجن هذا اليغنوكليوتيد إلى لنكرنا لا تزال الأمم المتحدة مشروح.
وتم الحصول على ليساتيس الخلايا المستخدمة في هذه التجارب المنسدلة الجيش الملكي النيبالي من 106 إلى 107 الخلايا عند العمل مع الخلايا المستزرعة، ومن 1 إلى 10 مغ عند العمل مع الأنسجة. إعداد ليساتيس الخلية تحتاج إلى تكييفها وفقا لنوع النسيج أو الخلية المستخدمة مع اثنين من الخطوات الرئيسية التي يتعين أن يكون الأمثل: هي الخطوة cross-linking التي يسمح تكوين روابط تساهمية بين لنكرنا وشركائها الجزيئية، الخطوة سونيكاتيون الذي يقلل اللزوجة بتمزيق الكروماتين.
والهدف من هذه الخطوة cross-linking ضمان بقاء جميع أهداف الجيش الملكي النيبالي مغلقة إلى لنكرنا بتشكيل شبكة بين جميع الشركاء الجزيئية. خطوة معالجة بارافورمالدهيد التي سوف تشكل روابط تساهمية بين لنكرنا وشركائها تسمح الشبكة لتكون شبكية. في بروتوكول مخطط، واقترح إذا كانت تعمل مع لنكرنا النووية، لإجراء علاج أولى مع بارافورمالدهيد على العموم خلية ليساتي والثانية العلاج على كسر النووية المعزولة3،4. ولاحظنا أن هذه خطوة تكميلية انخفضت كفاءة التحقيقات، ربما بالحد من إمكانية الوصول إلى لنكرنا في الخلايا. ومن ثم، درجة تشابك بارافورمالدهيد إلى أن تتكيف مع مراعاة الخلية أو استخدام نوع الأنسجة، إضفاء الطابع المحلي على لنكرنا للفائدة، وكفاءة المسابر المصممة.
بينما ليسينج الخلايا، يتم تحريرها في ليساتي الكروماتين ويزيد عن اللزوجة؛ ومن ثم يسبر الضروري اجاد الكروماتين طريق سونيكيشن زيادة سيولة العينات و ومن ثم تسهيل إمكانية الحصول اليغنوكليوتيد إلى لنكرنا للفائدة. ومع ذلك، سوف أيضا اجاد sonication الكشف المستخرج مع لنكرنا للفائدة. ومن ثم تتألف المهم للتقليل من الوقت سونيكيشن في مثل هذه طريقة في حين أنه يقلل من كفاءة لزوجة، أنه أيضا يتيح الحصول على الحمض النووي الريبي الشظايا بطول بين 200-800 هناك علما بأن الوقت sonication ستكون عالية تعتمد على الكمية ونوع الأنسجة أو الخلايا المستزرعة المستخدمة.
وفي الختام، يتيح الإجراء الموضح هنا في 2-3 أيام القبض على أهداف الجيش الملكي النيبالي لنكرنا المرجوة. يقترن RT-قبكر، سوف تسمح هذه الأساليب تبحث عن رابطة محددة وتنظيم مرناً حسب لنكرنا المطلوبة كنهج مرشح. لاتباع نهج على نطاق الجينوم، يمكن تحليل الحمض النووي الريبي المنسدلة التجارب بالحمض النووي الريبي الفائق-تسلسل يتيح استرجاع جميع الكشف المرتبطة لنكرنا المطلوب. ينبغي أن توفر إجراء سحب لأسفل على الحمض النووي الريبي مهما كانت الاستراتيجية التحليلية المختارة، معارف هامة جديدة على لائحة الجيش الملكي النيبالي قبل لنكرناس.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
هذا العمل كان دعم من جامعة إيكس-مرسيليا ويزأر وممول بمنحه من "شركة فايزر مختبرات".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bioruptor Plus | Diagenode | B01020001 | Sonicator |
| Dynabeads My One | Thermo-Fisher | 65001 | Magnetic streptavidin beads |
| Formamide | Thermo-Fisher | 15515-026 | |
| Gel electrophoresis apparatus | Advance | Mupid-One | Gel electrophoresis apparatus |
| Proteinase K | Sigma | P2308 | |
| RNA XS purification kit | Macherey-Nagel | 740902 | RNA purificationkit |
| RNAseOUT | Thermo-Fisher | 10777-019 | RNAse inhibitor |
| Trizol | Thermo-Fisher | 15596018 | RNA purification |
| Tube Rotator | Stuart | SB2 | Eppendorf tube rotator |
| RNA to DNA | Thermo-Fisher | 4387405 | Reverse transcription kit |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | BioRad | 1725124 | qPCR reagent |
| Applied 7500 Fast | Thermo-Fisher | 4351107 | qPCR apparatus |
| Illumina TruSeq Stranded mRNA Sample Preparation kit | Illumina | 20020594 | DNA library construction kit |
| Illumina NextSeq 500 | Illumina | SY-415-1002 | NGS system |
References
- Chu, C., Qu, K., Zhong, F. L., Artandi, S. E., Chang, H. Y. Genomic maps of long noncoding RNA occupancy reveal principles of RNA-chromatin interactions. Mol Cell. , 667-678 (2011).
- Chu, C., Quinn, J., Chang, H. Y. Chromatin isolation by RNA purification (ChIRP). J Vis Exp. , e3912 (2012).
- Simon, M. D., Wang, C. I., Kharchenko, P. V., West, J. A., Chapman, B. A., Alekseyenko, A. A., Borowsky, M. L., Kuroda, M. I., Kingston, R. E. The genomic binding sites of a noncoding RNA. Proc Natl Acad Sci U S A. , 20497-20502 (2011).
- Simon, M. D. Capture hybridization analysis of RNA targets (CHART). Curr Protoc Mol Biol. , Unit 21.25 (2013).
- Reuter, J. S., Mathews, D. H. RNAstructure: software for RNA secondary structure prediction and analysis. BMC Bioinformatics. 11, 129 (2010).
- Sun, X., Haider Ali, M. S. S., Moran, M. The role of interactions of long non-coding RNAs and heterogeneous nuclear ribonucleoproteins in regulating cellular functions. Biochem J. , 2925-2935 (2017).
- Gruber, A. R., Lorenz, R., Bernhart, S. H., Neuböck, R., Hofacker, I. L. The Vienna RNA websuite. Nucleic Acids Res. , W70-W74 (2008).
- Tollervey, J. R., Curk, T., Rogelj, B., Briese, M., Cereda, M., Kayikci, M., König, J., Hortobágyi, T., Nishimura, A. L., Zupunski, V., Patani, R., Chandran, S., Rot, G., Zupan, B., Shaw, C. E., Ule, J. Characterizing the RNA targets and position-dependent splicing regulation by TDP-43. Nat Neurosci. , 452-458 (2011).
- Riva, P., Ratti, A., Venturin, M. The long non-coding RNAs in neurodegenerative diseases: novel mechanisms of pathogenesis. Curr Alzheimer Res. (27338628), (2016).
- Barry, G., Briggs, J. A., Hwang, D. W., Nayler, S. P., Fortuna, P. R., Jonkhout, N., Dachet, F., Maag, J. L., Mestdagh, P., Singh, E. M., Avesson, L., Kaczorowski, D. C., Ozturk, E., Jones, N. C., Vetter, I., Arriola-Martinez, L., Hu, J., Franco, G. R., Warn, V. M., Gong, A., Dinger, M. E., Rigo, F., Lipovich, L., Morris, M. J., O'Brien, T. J., Lee, D. S., Loeb, J. A., Blackshaw, S., Mattick, J. S., Wolvetang, E. J. The long non-coding RNA NEAT1 is responsive to neuronal activity and is associated with hyperexcitability states. Sci Rep. , 40127 (2017).
- Adriaens, C., Standaert, L., Barra, J., Latil, M., Verfaillie, A., Kalev, P., Boeckx, B., Wijnhoven, P. W., Radaelli, E., Vermi, W., Leucci, E., Lapouge, G., Beck, B., van den Oord, J., Nakagawa, S., Hirose, T., Sablina, A. A., Lambrechts, D., Aerts, S., Blanpain, C., Marine, J. C. p53 induces formation of NEAT1 lncRNA-containing paraspeckles that modulate replication stress response and chemosensitivity. Nat Med. , (2016).
- Fang, J., Qiao, F., Tu, J., Xu, J., Ding, F., Liu, Y., Akuo, B. A., Hu, J., Shao, S. High expression of long non-coding RNA NEAT1 indicates poor prognosis of human cancer. Oncotarget. , (2017).
- Torres, M., Becquet, D., Blanchard, M. P., Guillen, S., Boyer, B., Moreno, M., Franc, J. L., François-Bellan, A. M. Circadian RNA expression elicited by 3'-UTR IRAlu-paraspeckle associated elements. Elife. , (2016).
- Fox, A. H., Lamond, A. I. Paraspeckles. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , Available from: http://cshperspectives.cshlp.org/content/2/7/a000687.long (2010).
- Chen, L. L., DeCerbo, J. N., Carmichael, G. G. Alu element-mediated gene silencing. EMBO J. , 1694-1705 (2008).
- Tripathi, V., Ellis, J. D., Shen, Z., Song, D. Y., Pan, Q., Watt, A. T., Freier, S. M., Bennett, C. F., Sharma, A., Bubulya, P. A., Blencowe, B. J., Prasanth, S. G., Prasanth, K. V. The nuclear-retained noncoding RNA MALAT1 regulates alternative splicing by modulating SR splicing factor phosphorylation. Mol Cell. , 925-938 (2010).
- Engreitz, J. M., Sirokman, K., McDonel, P., Shishkin, A. A., Surka, C., Russell, P., Grossman, S. R., Chow, A. Y., Guttman, M., Lander, E. S. RNA-RNA Interactions Enable Specific Targeting of Noncoding RNAs to Nascent Pre-mRNAs and Chromatin Sites. Cell. , 188-199 (2014).
- Nakagawa, S., Ip, J. Y., Shioi, G., Tripathi, V., Zong, X., Hirose, T., Prasanth, K. V. Malat1 is not an essential component of nuclear speckles in mice. RNA. , (2012).
- Zhang, B., Arun, G., Mao, Y. S., Lazar, Z., Hung, G., Bhattacharjee, G., Xiao, X., Booth, C. J., Wu, J., Zhang, C., Spector, D. L. The lncRNA Malat1 is dispensable for mouse development but its transcription plays a cis-regulatory role in the adult. Cell Rep. , 111-123 (2012).
- Trapnell, C., Roberts, A., Goff, L., Pertea, G., Kim, D., Kelley, D. R., Pimentel, H., Salzberg, S. L., Rinn, J. L., Pachter, L. Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks. Nat Protoc. , 562-578 (2012).
