Summary
Denne RNA pull-down metode giver mulighed for at identificere RNA mål for en lang tid ikke-kodende RNA (lncRNA). Baseret på hybridisering af hjemmelavet, designede anti-sense DNA oligonukleotid sonder bestemt til denne lncRNA i en passende fast væv eller cellelinie, tillader det effektivt opsamling af alle RNA mål af lncRNA.
Abstract
Længe ikke-kodende RNA (lncRNA), som er sekvenser af mere end 200 nucleotider uden en defineret læsning ramme, hører til den lovgivningsmæssige ikke-kodende RNAS familie. Selv om deres biologiske funktioner forbliver stort set ukendt, antallet af disse lncRNAs steget støt, og det anslås nu at mennesker kan have mere end 10.000 sådanne afskrifter. Nogle af disse er kendt for at være involveret i vigtige lovgivningsmæssige veje af genekspression, som finder sted på transkriptionel niveau, men også på forskellige trin i RNA co- og post-transcriptional modning. I sidstnævnte tilfælde har RNA'er, der er ramt af lncRNA kan identificeres. Det er grunden til hvorfor det er nyttigt at udvikle et middel, der muliggør identifikation af RNA'er forbundet direkte eller indirekte med en lncRNA af interesse.
Denne protokol, som var inspireret af tidligere publicerede protokoller tillader dyrkning af en lncRNA sammen med dens tilknyttede kromatin sekvenser, blev tilpasset til at tillade dyrkning af tilhørende RNA'er. Vi fast besluttet på at to trin er afgørende for effektiviteten af denne protokol. Først er designet af specifikke anti-sense DNA oligonukleotid sonder at krydse sig til lncRNA af interesse. Med henblik herpå, lncRNA sekundær struktur blev forudsagt af bioinformatik og anti-sense oligonukleotid sonder blev designet med en stærk affinitet for regioner, der viser en lav sandsynlighed for intern base parring. Det andet afgørende trin i proceduren bygger på Fikseringsvæske betingelser af væv eller kulturperler celler, som skal bevare netværk mellem alle molekylære partnere. Kombineret med høje overførselshastighed RNA sekventering, kan denne RNA pull-down protokol give den hele RNA interactome af en lncRNA af interesse.
Introduction
Det overordnede mål med metoden beskrevet her er at identificere RNA molekylære partnere af en længe noncoding RNA (lncRNA). LncRNA svarer til sekvenser af mere end 200 nucleotider uden en defineret læsning ramme. Nogle af dem har vist sig at være involveret i udtryk genregulering, ikke kun på transkriptionel niveau, men også på forskellige trin i RNA co- og post-transcriptional modning. I sidstnævnte tilfælde er Molekylær partnere af lncRNA RNA'er, der skal identificeres. Et middel, der muliggør identifikation af RNA'er forbundet direkte eller indirekte med en lncRNA af interesse ville det være vigtigt at udvikle.
Tidligere offentliggjort metoder, såsom kromatin isolering af RNA oprensning (pippe)1,2 og fange hybridisering analyse af RNA mål (diagram)3,4, tillade høj overførselshastighed opdagelsen af RNA-bundet proteiner og genomisk bindingssteder af en specifik lncRNA. I disse to metoder, lncRNA af interesse var først hybridiseret at biotinylated supplerende oligonukleotider, og komplekset blev derefter isoleret ved hjælp af streptavidin perler. Den væsentligste forskel mellem disse to teknikker er relateret til design af sonder, der er målrettet lncRNAs. Pippe, inspireret af RNA fisk, bestod i at designe en pulje af korte supplerende DNA oligonukleotid sonder til flise hele længden af lncRNA strategi. Derimod i diagrammet tilpasset forfatterne en RNase H kortlægning analyse på lncRNAs at sonde sites tilgængelige til hybridisering.
Den foreslåede her til design anti-sense DNA biotinylated oligonukleotid sonder bruger Bioinformatik modellering af lncRNA sekundær struktur5 for at vælge sonder med en stærk affinitet for regioner, der viser en lav sandsynlighed for intern procedure basere parring. Denne fremgangsmåde har fordelen at være billigere end dem, baseret på puljer af flisebelægning oligonukleotid sonder2 og mindre tidskrævende end dem baseret på RNAse-H følsomhed4.
Da der er en voksende mængde af beviser for post-transcriptional genregulering af lncRNAs6, er det meget nyttigt at udvikle en metode, der muliggør fangst af RNA'er, der er mål for en lncRNA. Desuden, for at være brugbar for de fleste applikationer, tilgangen blev optimeret både i kulturperler celler og væv ekstrakter.
Protocol
Alle procedurer blev udført i nøje overensstemmelse med europaeiske oekonomiske Faellesskab for pleje og anvendelse af forsøgsdyr (86/609/EØF og 2010/63/UE) og under en licens tildeles til D. Becquet (Préfecture des Bouches-du-Rhône, bevilling nr. 13-002).
1. sonden Design
-
Bruger den primære sekvens af lncRNA af interesse, generere sin sekundær struktur på "RNAstructure Webserver"5.
Bemærk: På dette site, forskellige algoritmer kan bruges. De tre forudsigelse værktøjer, der giver de bedste resultater for sonden designs er: "Fold" (laveste fri energi struktur), "MaxExpect" (højst sandsynligt basepar) og "Probnot" (sandsynlige basepar herunder pseudoknots). Disse tre analyser kan udføres og sammenlignet. Andre webservere, som Wien RNA websuite7, kan også bruges.- Vælg regioner, som viser en lav sandsynlighed for intern base parring og designe anti-sense oligonukleotid sonder 25 baser med en stærk affinitet for disse regioner.
Bemærk: GC indholdet af disse sonder bør bestå mellem 40 og 60%. Ved hjælp af en justering søgeværktøj (Blast), Sørg for at de valgte anti-sense oligonukleotid sonder ikke anerkender nukleotidsekvenser i andre RNA, udtrykt i den valgte celle system.
- Vælg regioner, som viser en lav sandsynlighed for intern base parring og designe anti-sense oligonukleotid sonder 25 baser med en stærk affinitet for disse regioner.
- Design også en ikke-specifik DNA oligonukleotid sonde af 25 baser som viser hverken affinitet til lncRNA af interesse eller til andre RNA sekvenser i genomet af interesse.
- Bestil sonder med biotin i 3'-enden.
Bemærk: For at reducere den sterisk hindring, afstanden mellem oligonukleotid og Biotin har skal øges med en triethyleneglycerol spacer. For et optimalt resultat, og at være i stand til at vurdere specificiteten af resultaterne af pull-down, det anbefales at design 3 forskellige anti-sense oligonukleotid sonder og derefter eksperimentelt sammenligne deres effektivitet.
2. tværbinding
-
Kulturperler celle tværbinding
- Kultur GH4C1 sommatolactotroph hypofyse celler i Hams F10 medium suppleret med 15% hest serum og 2% føtalt kalveserum. Vokse celler indtil sammenløbet i 78,5 cm2 kultur plader. Dette svarer ca til 1 x 107 celler.
- Fjern cellekulturmedium fra en sammenflydende GH4C1 78.5 cm2 kultur plade, derefter skylles med 1 x til medium volumen af phosphat bufferet saltvand (PBS)
- Fix cellerne med en 1% PARAFORMALDEHYD løsning i PBS (10 mL til en 78,5 cm2 retter); Denne løsning skal være frisk fremstillede fra en 4% PARAFORMALDEHYD stamopløsning. Krydse-link under omrøring i 10 min. ved stuetemperatur (RT).
Forsigtig: PARAFORMALDEHYD (PFA) er giftigt og skal håndteres med forsigtighed. - Dæmpning PARAFORMALDEHYD handling ved at tilføje 1/10 bind af glycin 1,25 M (1 mL pr 10 mL af PARAFORMALDEHYD løsning); agitere 5 min på RT.
- Kassér medier af aspiration og skyl, to gange (5 min) med 1 X til medium volumen af PBS.
- Tilføje et volumen på PBS svarende til 1/10th af mængden af medier, indsamle celler med celle skraber, og derefter overføres til et centrifugeglas.
- Spin på 510 g ved 4 ° C i 5 min.
- Fjern så meget supernatanten som muligt.
- Opbevare træpiller på ubestemt tid efter behov ved-80 ° C.
-
Væv tværbinding
- Sætte 5 mg frisk fremstillede mus hypofyse kirtel væv i en opløsning af 1% PARAFORMALDEHYD fortyndes i PBS (ca 10 x volumen af væv), agitere for 10 min på RT.
- Dæmpning PARAFORMALDEHYD handling ved at tilføje en 1,25 M Glycin løsning (1 mL pr 10 mL af PARAFORMALDEHYD løsning) og gnub 5 min på RT.
- Kassér mediet ved aspiration og skylles to gange med PBS (ca 10 x volumen af vævet). Fjern så meget supernatanten som muligt.
- Gemme de krydsrefererede væv på ubestemt tid ved-80 ° C.
3. celle eller væv Lysis
- Forberede lysisbuffer (50 mM Tris-HCl pH 7,0, 10 mM EDTA, 1% SDS suppleret med 200 U/mL af RNAse hæmmer opløsning og en cocktail af proteaser hæmmer 5 µL/mL).
- For at få mængden prøver uden forudgående optøning, genopslæmmes celle pellets eller tværbundet væv med denne buffer (ca 1 mL pr 100 mg af celle pellet eller væv). En celle pellet fra 1 x 107 celler giver anledning til en lysed prøve, der indeholder ca 20 mg protein.
Bemærk: Afhængigt af de væv bruges, et skridt af mekanisk afbrydelse skal tilføjes. I dette tilfælde er det vigtigt at undgå opvarmning af prøverne under denne ekstra trin.
4. sonikering
-
Optimering af sonikering betingelser
- Program sonikator med 2-5 række 30 s ON og 30 s OFF.
- Udføre test for at optimere sonikering betingelser på fortyndede mængden prøver (fortyndingsfaktoren ½ eller ¼ svarende til ca. 10 eller 5 mg protein). Sted fortyndet mængden prøver i 4 ° C vandbad og starte sonikering serie.
- Rense RNA'er, enten med en RNA oprensning kit eller med en RNA isolering reagens (f.eks.Trizol).
- Indlæse helheden af oprenset RNA på en 1% Agarosen gelelektroforese i TBE-buffer, kontrollere længden af RNA fragmenter. Denne længde bør variere mellem 200 og 800 bp.
Bemærk: Afhængigt af RNA fragment størrelse, anti-sense oligonukleotid sonder effektivitet kan variere. Det anbefales derefter at kontrollere effektiviteten af sonder under forskellige forhold af sonikering.
-
Sonikering af lysed prøver
- Sted mængden prøver svarende til 20 mg af proteiner (fremstillet efter trin 3.2) i 4 ° C vand bad og starte sonikering serie som optimeret taktfast 4.1.
- Umiddelbart efter ultralydbehandling, centrifugeres i 5 min på 12.000 g ved 4 ° C. Overføre analysere i nye centrifugeglas.
Bemærk: For at sikre ensartethed, Repliker analysere kan blive samlet og omfordelt på dette trin.
5. RNA Pull-down
-
Dag 1 – hybridisering trin
- Tilføj 2 bind af hybridisering buffer (50 mM Tris-HCl pH 7,0, 750 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% SDS, 15% formamid tilføjet dyrlægeordination) at analysere indsamlet efter ultralydbehandling trin. Vortex.
- Overføre 20 µL af hver prøve i et centrifugeglas (input prøver) og opbevares ved-20 ° C.
- Tilføje 100 pmol af biotinylated oligonukleotid sonder (specifikke eller ikke-specifikke; Se tabel 1) til hver prøve. Inkuber 4 til 6 h under moderat agitation på en tube rotator på RT.
- Tilsæt 50 µL af magnetisk streptavidin perler suppleret med 200 U/mL af RNAse hæmmer opløsning og en cocktail af proteaser hæmmer 5 µL/mL.
- Der inkuberes natten under moderat agitation på tube rotator på RT.
-
Dag 2-RNA isolering trin
- Bruge magnetisk støtte til at adskille perler fra celle lysate, supernatanten fjernes, og vaske perler med 900 µL af vaskebuffer (SDS 0,5%, SSC 2 x). Gentag afbrudt 5 gange med 5 min agitation på rotator på RT.
- Efter den sidste vask, dekanteres en sidste gang og tilføje 95 µL af Proteinease K buffer (10 mM Tris-HCl pH 7,0, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5% SDS) og 5 µL af proteinase-K (20 mg/mL) til prøverne.
- På is, tø input prøverne (20 μL) og tilføje 75 µL af Proteinease K buffer og 5 µL af proteinase-K (20 mg/mL).
- Inkuber alle prøver med proteinase K for 45 min ved 50 ° C, derefter 10 min. ved 95 ° C.
- Chill prøve på is i 3 min før adskille perler fra RNA'er med magnetisk støtte. Holde supernatanten og kassér perlerne.
- Rense RNA'er med en RNA oprensning kit, som bør omfatte en DNA fordøjelsen trin. Opbevar RNA'er ved-80 ° C.
- Udføre reverse transkription qPCR (RT-qPCR) ved hjælp af en RT kit efterfulgt af qPCR ved hjælp af specifikke primere (tabel 1).
- Konstruere to DNA biblioteker svarende til de to RNA pools fremstillet med hver af de specifikke Neat1 sonder (tabel 1). Udføre sekvenseringen på et næste-generations sekventering system.
Representative Results
Flere nyere undersøgelser har vist, at lncRNAs spiller en væsentlig rolle i næsten alle vigtige biologiske processer og at denne rolle er opnået gennem kontrol af genekspression opstår både på det transkriptionel og de post-transcriptional niveauer viser i dette sidstnævnte tilfælde at RNA'er kan være mål for lncRNAs6.
LncRNA nukleare beriget rigelige afskriften 1 (Neat1) er involveret i forskellige neuropathologies som frontotemporal demens, amyotrofisk lateral sklerose eller epilepsi8,9,10, og er også misregulated i forskellige kræftformer11,12.
Denne lncRNA er også kendt at være den strukturelle komponent af specifikke nukleare organer, paraspeckles, og at være involveret i post-transcriptional døgnrytmen regulering af gen expression13. Paraspeckles, der er fundet i hver cellekerne og er dannet omkring ikke kun Neat1, der er nødvendige for deres dannelse, men også omkring flere RNA-bindende proteiner (RBP)14, er faktisk kendt for at kunne bevare RNA mål inden for nucleus15 . Dannelsen af paraspeckles er opnået gennem sammenslutningen af de forskellige komponenter. Denne formation blev vist for at vise en døgnrytmen rytmiske mønster køre en rytmisk nukleare fastholdelse af RNA mål13. Den nukleare fastholdelse af RNA mål af paraspeckles kan opstå gennem binding til RBP eller direkte via RNA/RNA association, men omfanget af RNA'er rettet af paraspeckles måtte fastsættes. At identificere RNA målrettet direkte eller indirekte af Neat1, en RNA pull-down protokollen er udviklet at tillader isolering og identifikation af alle Neat1 RNA mål i kulturperler celler samt som vævsprøver (Se figur 1 for en grafisk præsentation af teknik).
Protokollen blev også anvendt til identifikation af RNA mål af en anden lncRNA metastaser forbundet lunge adenocarcinom udskrift 1 (Malat1). Malat1 er en yderst velbevarede og udtrykte lncRNA fundet i nukleare prikker sammen med flere RNA-splicing faktorer. Malat1 er kendt for at være involveret i reguleringen af splejsning af flere spirende pre-mRNA16,17.
Specifikke (så) og ikke-specifik oligonukleotid (NSO) sonder blev genereret ved hjælp af sonde design strategi beskrevet her. Denne strategi bygger på udvælgelsen af regioner, der viser en lav sandsynlighed for intern base parring som forudsagt af lncRNA sekundær struktur og udformning af specifikke sonder med en stærk affinitet for disse regioner. Som en repræsentant resultat af disse Bioinformatik forudsigelser, et billede af den forudsagte sekundær struktur af en sekvens af Neat1 (nukleotider 1,480 til 2.000) sammen med placeringen af to designet så sonder er angivet i figur 2.
De designede sonder var rettet til rotte Neat1 eller Malat1 for GH4C1 kulturperler celler og mus Neat1 for hypofyse væv ekstrakter (tabel 1). Den relative berigelse i Neat1 eller Malat1 blev beregnet for uspecifikke og specifikke sonder i forhold til de input prøver. Figur 3 viser effektiviteten af de specifikke sonder til pull-down Neat1 i rotte GH4C1 hypofyse cellelinje (figur 3A) og i mus hypofyse væv ekstrakter (figur 3B). Når sonden design protokol til at generere specifikke oligonukleotid (så) sonder rettet til Malat1, kasseret en effektiv sonde blev opnået, mens en anden var ikke effektive nok og blev (figur 4A).
Efter en RNA pull-down procedure efterfulgt af RT-qPCR eksperimenter, nogle RNA'er vurderet med specifikke primere (tabel 1) viste sig at være forbundet med Neat1 eller Malat1 i GH4C1 ekstrakter. RNA'er forbundet med Neat1 i GH4C1 celle ekstrakter blev også vist sig at være forbundet med Neat1 i hypofyse væv ekstrakter. Faktisk, efter Neat1 RNA pull-down, Malat1 blev anset for at være målrettet efter Neat1, såvel i den GH4C1 cellelinje i hypofyse mus væv ekstrakter (figur 5A). Indbygget, var Neat1 betydeligt beriget efter Malat1 RNA pull-down udføres med en specifik sonde i GH4C1 celler (figur 4B). Ved at fremhæve den tætte forbindelse mellem de to lncRNAs, disse resultater stemmer overens med den potentielle samregulerende rolle i Neat1 og Malat1 foreslået af Malat1 knockout mus, der viser variationer i Neat1 RNA udtryk18, 19. udskrifter af to vigtigste hypofyse hormoner, væksthormon (Gh) (figur 5B) og prolaktin (Prl) (figur 5 c) var betydeligt beriget efter Neat1 RNA pull-down med specifikke sonder i både GH4C1 celler og hypofyse ekstrakter, hvilket tyder på en eventuel regulering af de to hormoner ved Neat1. Når man sammenligner de to specifikke sonder anvendes, det viste sig, at deres effektivitet kan variere afhængigt af RNA-mål betragtes som (figur 5B og 5 c figur). Disse resultater understreger nødvendigheden af at designe flere specifikke sonder for at vælge dem, viser ikke kun den bedste effektivitet i berigelse af pull-down lncRNA, men også den bedste effektivitet i berigelse af sine mål for RNA.
RNA pull-down metode kan også følges af RNA høj overførselshastighed sekventering kan få den omfattende liste af RNA mål for en lncRNA af interesse13. RNA-seq analyse på GH4C1 hypofyse celler efter Neat1 RNA pull-down ved hjælp af de to specifikke sonder beskrevet ovenfor blev udført. Det skal bemærkes, at en negativ kontrol bruge en NSO også kunne blive udsat for RNA-seq analyse, hvis niveauet af RNA inddrives efter RNA rullemenuen med NSO er tilstrækkelige til at tillade opførelse af biblioteker. Dette var ikke tilfældet i tidligere erfaringer13. Biblioteker, der blev oprettet efter brug af specifikke sonder blev analyseret ved hjælp af Tophat/manchetknapper pipeline-20 og kun udskrifter med værdier af fragment per kilobase per million af tilknyttede læser (FPKM) højere end 1 blev taget i betragtning. Listerne opnået med de to specifikke prober rettet til Neat1 (tabel 1) blev krydset for at vurdere specificiteten af resultaterne. 4.268 gener blev fundet knyttet til paraspeckles, som udgjorde 28% af udtrykt afskrifter i GH4C1 celler13. Konsistent med resultater opnået ved hjælp af qPCR analyse (Figur 5A-C), udskrifter af Gh, Prl og Malat1 fandtes for at være forbundet med Neat1. RNA pull-down metode har derfor vist sig for at være et effektivt redskab til at udforske samspillet mellem lncRNAs og deres RNA mål.
Figur 1: grafisk repræsentation af RNA trække ned procedure. På den første dag, blev væv eller celler tværbundet med PARAFORMALDEHYD, mængden og sonicated før trinnet hybridisering, der blev udført ved at tilføje biotinylated specifikke sonder. Magnetisk streptavidin perler blev derefter tilføjet til at adskille bestemte materiale fra resten af cellen lysate. På andendagen, blev perler isoleret af en magnet og vasket flere gange. En de-crosslinking trin tilladt opsving RNA'er, der blev renset og brugt til RT-qPCR eller RNA-seq analyse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: sekundær struktur af en Neat1 sekvens (nukleotid 1,480 til 2.000) som forudsagt af Bioinformatik ressource (RNAstructure webserver, laveste fri energi struktur). Strukturen er farvet efter sandsynlighed base parring. De to oligonukleotider sonder (SO1 og SO2) i rød er placeret langs Neat1 RNA strukturen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: qPCR validering af Neat1 berigelse versus input. qPCR validering af Neat1 berigelse versus input efter Neat1 RNA trække ned af to forskellige specifikke sonder (SO1-rn og SO2-rn for GH4C1 celler og SO1-mm og SO2-mm for hypofyse væv) i forhold til en ikke-specifik en (NSO-rn for GH4C1 celler og NSO-mm for hypofyse væv) i GH4C1 rotte celler (A) og i mus hypofyse væv ekstrakter (B). Resultaterne er gennemsnit ± SEM fremstillet i 3 til 10 eksperimenter. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: qPCR validering af Malat1 og Neat1 berigelse versus input efter Malat1 RNA trække ned. qPCR validering af Malat1 (A) og Neat1 (B) berigelse versus input efter Malat1 RNA trække ned af to forskellige specifikke sonder (SO3-rn og SO4-rn) i forhold til en ikke-specifik en (NSO-rn) i GH4C1 rotte celler. Resultaterne er gennemsnit ± SEM fremstillet i 3 forsøg. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: qPCR validering af Malat1, Gh, Prl berigelse versus input efter Neat1 RNA trække ned. qPCR validering af Malat1 (A), Gh (B), Prl (C) berigelse versus input efter Neat1 RNA trække ned ved hjælp af forskellige specifikke sonder i forhold til en ikke-specifik ene i GH4C1 rotte celler og mus hypofyse væv ekstrakter. Resultaterne er gennemsnit ± SEM fremstillet i 3 til 8 eksperimenter. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| SONDEN NAVNE | Sekvenser | |
| NSO-Rn | TAAAATACCATTTGATGTTTGAAATTAT | |
| SO1-Rn | CTCCACCATCATCAATCCTCTGGAC | |
| SO2-Rn | GCCTTCCCACATTTAAAAACACAAC | |
| SO3-Rn | AACTCGTGGCTCAAGTGAGGTGACA | |
| SO4-Rn | AAGACTCTCAGGCTCCTGCTCATTC | |
| NSO-mm | GTTTGTGGTTTAACAGTGGGAAGGC | |
| SO1-mm | GCCTTCCCACTGTTAAACCACAAAC | |
| SO2-mm | CTCACCCGCACCCCGACTCCTTCAA | |
| qPCR PRIMERE: | ||
| Rattus norvegicus | ||
| Neat1 | AAGGCACGAGTTAGCCGCAAAT | |
| TGTGCACAGTCAGACCTGTCATTC | ||
| Malat1 | GAAGGCGTGTACTGCTATGCTGTT | |
| TCTCCTGAGGTGACTGTGAACCAA | ||
| Gh1 | CCGCGTCTATGAGAAACTGAAGGA | |
| GGTTTGCTTGAGGATCTGCCCAAT | ||
| PRL | TGAACCTGATCCTCAGTTTGGT | |
| AGCTGCTTGTTTTGTTCCTCAA | ||
| Mus musculus | ||
| Neat1 | TGGGCCCTGGGTCATCTTACTAGATA | |
| CACAGCTGTTCCAATGAGCGATCT | ||
| Gh1 | CTCGGACCGTGTCTATGAGAAACTGA | |
| TTTGCTTGAGGATCTGCCCAACAC | ||
| PRL | TGAACCTGATCCTCAGTTTGGT | |
| AGCTGCTTGTTTTGTTCCTCAA | ||
Tabel 1: Sekvenser af DNA oligonukleotid sonder og qPCR primere
Discussion
Længe noncoding RNA'er (lncRNAs) af deres antal og mangfoldighed udgør et stort felt af forskning og de fleste af deres roller er stadig at blive opdaget. Mange af disse lncRNAs har en nuklear lokalisering og blandt dem, nogle er impliceret i lovgivningsmæssige veje af genekspression gennem transcriptional eller posttranskriptionelle mekanismer. En af de aktuelle udfordringer på dette område er at forstå relevansen af disse lncRNAs i post-transcriptional behandling af RNA'er. Til dette formål har RNA'er målrettet ved lncRNAs kan identificeres. Inspireret af tidligere undersøgelser fokuseret på sammenslutningen af lncRNAs med kromatin, udviklede vi en procedure, der tillader identifikation af RNA'er forbundet med en lncRNA. Succes af denne protokol, opkaldt RNA pull-down, er primært afhængig af to afgørende skridt, nemlig udformningen af antisense DNA oligonukleotid sonder, skal specifikt og udelukkende krydse sig med lncRNA af interesse, og betingelserne for væv eller celle fiksering, som skal bevare integriteten af netværk mellem alle molekylære partnere.
Tidligere udgivet protokoller findes procedurer til at isolere en lncRNA sammen med dens tilknyttede kromatin sekvenser (pippe1,2, diagram3,4). I disse protokoller, blev forskellige strategier ansat til at design anti-sense DNA biotinylated oligonukleotid sonder. I proceduren pippe brugt forfatterne en pulje af DNA biotinylated oligonukleotid sonder omfatter hele længden af lncRNA af interesse efter udelukkelse af alle redundante og uspecifikke sonder1,2. I diagram-protokollen, forfatterne identificeret de regioner i lncRNA, der er mere tilgængelig for hybridisering og designet capture oligonukleotider, der målretter mod disse områder. Disse regioner blev udvalgt på grundlag af deres RNase-H følsomhed. Ja, ved hjælp af egenskaben for RNAse-H for at hydrolysere RNA'er på lokaliteter af RNA-DNA bindende, oligonukleotider at krydse til tilgængelige websteder i lncRNA producere RNA-DNA hybrider og føre til enzymatisk spaltning af lncRNA. Forfatterne valgt tre af disse kandidat capture oligonukleotider og brugte dem i en cocktail3,4.
Proceduren vi plejede at design anti-sense DNA biotinylated oligonukleotid sonder var tæt på, der bruges i diagrammet protokol, men de hybridisering-tilgængelige områder i den ønskede lncRNA blev ikke udvalgt på grundlag af deres RNAse-H følsomhed, men Ifølge deres lav sandsynlighed for intern base parring som fastlagt af Bioinformatik modellering af lncRNA sekundær struktur. Det skal blive bemærket, at forskellige sekundære strukturer vil forudsiges ved hjælp af forskellige algoritmer, og sonder vælges bør være dem, at krydse til rådighed sekvenser af lncRNA i det største antal sekundære strukturer forudsagt. Samme resultat blev opnået ved hjælp af enten en cocktail af tre designet, specifikke sonder eller en enkeltsonde individuelt. Dette bliver bedt om brugen af to separate, specifikke sonder og overvejelse af positive resultater som dem, der er fælles for disse to sonder. Endelig, det anbefales derfor i begyndelsen af udviklingen af metoden, for et optimalt resultat og være i stand til at vurdere specificiteten af resultaterne af pull-down, at designe 3 forskellige anti-sense oligonukleotid sonder og derefter at sammenligne eksperimentelt deres effektivitet, især da sonden effektivitet kan ændres af celle lysate forberedelse. Dog proceduren i sonden design baseret på bioinformatik modellering af lncRNA sekundær struktur vi brugte var billigere end at baseret på puljer af flisebelægning oligonukleotid sonder2, og dette var mindre tidskrævende end metoden baseret på RNAse-H følsomhed4.
En negativ kontrol bør også udføres ved hjælp af som negative capture oligonukleotid enten forstand DNA biotinylated oligonukleotid sonder eller scrambled oligonukleotid sonder, eller oligonukleotider rettet mod en ikke-forretningsmæssigt forbundne RNA. På grund af eksistensen af naturlige antisense udskrifter lncRNAs, kan anvendelse af forstand oligonukleotid sonder undertiden være utilstrækkelig. Uanset oligonukleotid sonden valgt for den negative kontrol, er det nødvendigt at kontrollere ved blast, at det ikke krydse sig med en kendt RNA og at huske, at denne oligonukleotid kan krydse sig til en stadig un-kommenteret lncRNA.
Cellelysater disse RNA pull-down forsøgsdyrene blev indhentet fra 106 107 celler når du arbejder med kulturperler celler, og fra 1 til 10 mg, når du arbejder med væv. Forberedelse af cellelysater skal være afpasset efter de væv eller celler anvendes med to hovedtrin, der er nødt til at være optimeret: nemlig den tværbindingsmidler skridt, der giver mulighed for dannelse af kovalente bindinger mellem lncRNA og dens molekylære partnere, og de sonikering skridt, der reducerer viskositeten af makulering kromatin.
Formålet med det tværbindingsmidler skridt er at sikre, at alle RNA mål forbliver lukket for lncRNA ved at inducere dannelse af et netværk mellem alle molekylære partnere. En PARAFORMALDEHYD behandling skridt, der vil danne kovalente bindinger mellem lncRNA og dets partnere giver netværket for at være retikulerede. I diagram-protokollen, blev det foreslået, hvis arbejder med nukleare lncRNA, for at udføre en første behandling med PARAFORMALDEHYD på hele celle lysate og en anden behandling på isolerede nukleinsyre brøkdel3,4. Vi bemærkede, at denne supplerende trin faldt effektivitet af sonder, formentlig ved at reducere lncRNA tilgængelighed i cellerne. Derfor, graden af forsyningsnet af PARAFORMALDEHYD har skal tilpasses under hensyntagen til cellen eller vævstype anvendes, lokalisering af lncRNA af interesse, og effektiviteten af de designede sonder.
Mens lysing celler, kromatin er udgivet i den lysate og øger dens viskositet; Det er så nødvendigt at sønderdele kromatin ved hjælp af sonikering at øge bevægeligheden af prøverne og dermed lette adgangen til oligonukleotid sonder til lncRNA af interesse. Dog vil sonikering også makulere RNA'er ekstraheres med lncRNA af interesse. Det er så vigtigt at minimere sonikering tid på en sådan måde, at mens det effektivt reducerer viskositet af den lysate, det giver også mulighed for opnåelse af RNA fragmenter med en længde består mellem 200-800 bp. Bemærk at sonikering tid vil være meget afhængig af både mængden og typen af væv eller kulturperler celler, der bruges.
Afslutningsvis kan proceduren beskrevet her i 2-3 dage erobringen af RNA mål af en ønsket lncRNA. Kombineret med RT-qPCR, vil disse metoder tillade Leder du efter en bestemt forening og regulering af et mRNA af den ønskede lncRNA som en kandidat tilgang. En genome-wide tilgang, kan RNA pull-down eksperimenter analyseres af høj overførselshastighed RNA-sekventering tillader hentning af alle RNA'er forbundet med den ønskede lncRNA. Uanset den analytiske strategi valgt, bør RNA pull-down procedure give nye betydelig viden om RNA regulering af lncRNAs.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Aix-Marseille Universitet og CNRS og finansieret af et tilskud fra Pfizer laboratorier.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bioruptor Plus | Diagenode | B01020001 | Sonicator |
| Dynabeads My One | Thermo-Fisher | 65001 | Magnetic streptavidin beads |
| Formamide | Thermo-Fisher | 15515-026 | |
| Gel electrophoresis apparatus | Advance | Mupid-One | Gel electrophoresis apparatus |
| Proteinase K | Sigma | P2308 | |
| RNA XS purification kit | Macherey-Nagel | 740902 | RNA purificationkit |
| RNAseOUT | Thermo-Fisher | 10777-019 | RNAse inhibitor |
| Trizol | Thermo-Fisher | 15596018 | RNA purification |
| Tube Rotator | Stuart | SB2 | Eppendorf tube rotator |
| RNA to DNA | Thermo-Fisher | 4387405 | Reverse transcription kit |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | BioRad | 1725124 | qPCR reagent |
| Applied 7500 Fast | Thermo-Fisher | 4351107 | qPCR apparatus |
| Illumina TruSeq Stranded mRNA Sample Preparation kit | Illumina | 20020594 | DNA library construction kit |
| Illumina NextSeq 500 | Illumina | SY-415-1002 | NGS system |
References
- Chu, C., Qu, K., Zhong, F. L., Artandi, S. E., Chang, H. Y. Genomic maps of long noncoding RNA occupancy reveal principles of RNA-chromatin interactions. Mol Cell. , 667-678 (2011).
- Chu, C., Quinn, J., Chang, H. Y. Chromatin isolation by RNA purification (ChIRP). J Vis Exp. , e3912 (2012).
- Simon, M. D., Wang, C. I., Kharchenko, P. V., West, J. A., Chapman, B. A., Alekseyenko, A. A., Borowsky, M. L., Kuroda, M. I., Kingston, R. E. The genomic binding sites of a noncoding RNA. Proc Natl Acad Sci U S A. , 20497-20502 (2011).
- Simon, M. D. Capture hybridization analysis of RNA targets (CHART). Curr Protoc Mol Biol. , Unit 21.25 (2013).
- Reuter, J. S., Mathews, D. H. RNAstructure: software for RNA secondary structure prediction and analysis. BMC Bioinformatics. 11, 129 (2010).
- Sun, X., Haider Ali, M. S. S., Moran, M. The role of interactions of long non-coding RNAs and heterogeneous nuclear ribonucleoproteins in regulating cellular functions. Biochem J. , 2925-2935 (2017).
- Gruber, A. R., Lorenz, R., Bernhart, S. H., Neuböck, R., Hofacker, I. L. The Vienna RNA websuite. Nucleic Acids Res. , W70-W74 (2008).
- Tollervey, J. R., Curk, T., Rogelj, B., Briese, M., Cereda, M., Kayikci, M., König, J., Hortobágyi, T., Nishimura, A. L., Zupunski, V., Patani, R., Chandran, S., Rot, G., Zupan, B., Shaw, C. E., Ule, J. Characterizing the RNA targets and position-dependent splicing regulation by TDP-43. Nat Neurosci. , 452-458 (2011).
- Riva, P., Ratti, A., Venturin, M. The long non-coding RNAs in neurodegenerative diseases: novel mechanisms of pathogenesis. Curr Alzheimer Res. (27338628), (2016).
- Barry, G., Briggs, J. A., Hwang, D. W., Nayler, S. P., Fortuna, P. R., Jonkhout, N., Dachet, F., Maag, J. L., Mestdagh, P., Singh, E. M., Avesson, L., Kaczorowski, D. C., Ozturk, E., Jones, N. C., Vetter, I., Arriola-Martinez, L., Hu, J., Franco, G. R., Warn, V. M., Gong, A., Dinger, M. E., Rigo, F., Lipovich, L., Morris, M. J., O'Brien, T. J., Lee, D. S., Loeb, J. A., Blackshaw, S., Mattick, J. S., Wolvetang, E. J. The long non-coding RNA NEAT1 is responsive to neuronal activity and is associated with hyperexcitability states. Sci Rep. , 40127 (2017).
- Adriaens, C., Standaert, L., Barra, J., Latil, M., Verfaillie, A., Kalev, P., Boeckx, B., Wijnhoven, P. W., Radaelli, E., Vermi, W., Leucci, E., Lapouge, G., Beck, B., van den Oord, J., Nakagawa, S., Hirose, T., Sablina, A. A., Lambrechts, D., Aerts, S., Blanpain, C., Marine, J. C. p53 induces formation of NEAT1 lncRNA-containing paraspeckles that modulate replication stress response and chemosensitivity. Nat Med. , (2016).
- Fang, J., Qiao, F., Tu, J., Xu, J., Ding, F., Liu, Y., Akuo, B. A., Hu, J., Shao, S. High expression of long non-coding RNA NEAT1 indicates poor prognosis of human cancer. Oncotarget. , (2017).
- Torres, M., Becquet, D., Blanchard, M. P., Guillen, S., Boyer, B., Moreno, M., Franc, J. L., François-Bellan, A. M. Circadian RNA expression elicited by 3'-UTR IRAlu-paraspeckle associated elements. Elife. , (2016).
- Fox, A. H., Lamond, A. I. Paraspeckles. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , Available from: http://cshperspectives.cshlp.org/content/2/7/a000687.long (2010).
- Chen, L. L., DeCerbo, J. N., Carmichael, G. G. Alu element-mediated gene silencing. EMBO J. , 1694-1705 (2008).
- Tripathi, V., Ellis, J. D., Shen, Z., Song, D. Y., Pan, Q., Watt, A. T., Freier, S. M., Bennett, C. F., Sharma, A., Bubulya, P. A., Blencowe, B. J., Prasanth, S. G., Prasanth, K. V. The nuclear-retained noncoding RNA MALAT1 regulates alternative splicing by modulating SR splicing factor phosphorylation. Mol Cell. , 925-938 (2010).
- Engreitz, J. M., Sirokman, K., McDonel, P., Shishkin, A. A., Surka, C., Russell, P., Grossman, S. R., Chow, A. Y., Guttman, M., Lander, E. S. RNA-RNA Interactions Enable Specific Targeting of Noncoding RNAs to Nascent Pre-mRNAs and Chromatin Sites. Cell. , 188-199 (2014).
- Nakagawa, S., Ip, J. Y., Shioi, G., Tripathi, V., Zong, X., Hirose, T., Prasanth, K. V. Malat1 is not an essential component of nuclear speckles in mice. RNA. , (2012).
- Zhang, B., Arun, G., Mao, Y. S., Lazar, Z., Hung, G., Bhattacharjee, G., Xiao, X., Booth, C. J., Wu, J., Zhang, C., Spector, D. L. The lncRNA Malat1 is dispensable for mouse development but its transcription plays a cis-regulatory role in the adult. Cell Rep. , 111-123 (2012).
- Trapnell, C., Roberts, A., Goff, L., Pertea, G., Kim, D., Kelley, D. R., Pimentel, H., Salzberg, S. L., Rinn, J. L., Pachter, L. Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks. Nat Protoc. , 562-578 (2012).
