Summary
激しい腹痛、吐き気、嘔吐、便の通過を防止するを引き起こすことができる腸の部分的または完全な閉塞に腸内の障害物が。マウスの腸の部分的な obsructions を作成するこの手順は、病理細胞増殖と細胞死腸内の基になるメカニズムを勉強で信頼性の高いです。
Abstract
阻害や蠕動運動、腸の障害は、腹部の癒着や腫瘍増殖を含む最も胃腸の (GI) の病気によって引き起こされることができます。メカニズムを改造携帯が関与し、によって引き起こされる、腸の障害はよくわかっていません。腸障害のいくつかの動物モデルが開発されているが、マウス モデルが最もコスト/時間有効。マウス モデルは、それが正しく実行されない場合、高い死亡率を持つ腸部分閉塞 (PO) の外科的移植を使用します。また、PO 外科治療を受けたマウスは適切な封鎖が使用されていないまたはが正しく配置場合肥大を開発する失敗します。ここでは、非常に低い死亡率と信頼性が高く、再現性のある腸障害を生成する PO 手術のための詳しいプロトコルについて述べる。このプロトコルは、小腸で消化運動を部分的にブロックする回腸を囲む外科的に配置されたシリコーン リングを利用しています。部分的な閉塞は、腸の消化運動の停止による拡張になります。腸管の拡張は、徐々 に死を引き起こすそれまで 2 週間にわたって開発をしてリングの口側に平滑筋肥大を誘導します。手術の PO マウス モデル肥厚性腸組織平滑筋細胞 (SMC)、間質細胞のカハール (ICC) PDGFRα+を含む消化管細胞の病理学的変化を調べる場合に役立ちます体内のモデルを提供し、神経腸閉塞の開発中にセルです。
Introduction
イレウスは、腸1を介して移動から消化された食品・液体・ ガスを防止する小規模または大規模な腸の部分的または完全な閉塞です。、閉塞するため、閉塞はルーメン2を縮小に厚くなる腸壁を誘導します。腸閉塞は腹部癒着組織形成を引き起こす腹部や骨盤内の手術の結果として、または炎症性腸疾患 (クローン病)、憩室炎、ヘルニア、捻転、狭窄など消化管疾患から発生することが腸重積症、便秘、宿便、偽閉塞、癌および腫瘍の3,4,5。これらのケースでのイレウスはしばしば腸6筋肥大に します。
内腔の PO 腸の膨満感を誘発して蠕動運動機能7,8,9,10を続ける必要性への応答で閉塞の周りの平滑筋層の厚さを増加させる 11,12,13。猫13内同様肥大を一貫して開発、犬12、モルモット11ラット10マウス7平滑筋肥大を研究する腸の PO の動物モデルが開発されました、腸管の筋層。
腸 PO のマウス モデルは、生成し、生体内でのイレウスの勉強に最も費用効果的な方法です。小腸障害マウス回腸を囲むために外科シリコーン リングを使用して実行されます。PO マウスは、PO 手術8,15後、筋膜厚 (肥大) の初期 (過形成)、細胞数の増加と増加を示した。SMC は、14肥大条件に応えて平滑筋層内で成長している主なプラスチック製の電池が ICC など他のセルおよび SMC に密接に関連付けられて、また再設定 PDGFRα+セルです。PO マウスが、小腸の肥大を開発について報告した smc が、増殖性が高い7,15,16PDGFRα+細胞に脱分化型します。逆に、ICC は退化、肥大した平滑筋層内腸 obsruction7の開発中に失われました。PO モデルのもう一つの主要な利点は、腸神経系と伝達を行う神経因性の運動パターンの変化を誘導する能力です。主要な伝播マウス小腸の神経因性の運動パターン移行するモータです複雑な (MMC) 神経因性は、ICC や電気的徐波17は必要ありません。PO モデルは、部分的な閉塞で Mmc や腸の神経を改造する方法に明確な洞察力を提供できます。
ここでは、シリコン リングを使用して腸の PO 手術のためマウス プロトコルを提案する.確実に PO 手術を受けるマウス小腸の筋の肥大を生成します。肥大筋肉内 SMC、ICC、PDGFRα+、および神経細胞は劇的に改造しました。
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Protocol
次のプロトコルは機関動物ケアとネバダ大学リノ校動物資源使用委員会 (IACUC) によって承認されているし、研究の動物の使用に関するすべての制度的倫理的なガイドラインに準拠しています。
1. 動物。
- 20-30 g. 再発胃癌動物資源で一元的な動物施設で実験室マウスのコロニーの家間の重量を量る成熟した (4-6 週古い) c57bl/6 マウスを取得します。
2. 部分的な閉塞の手術
注: 手術は専用の手術室で行われます。すべての手術器具は、手術前にオートクレーブ。滅菌ガウンと手袋は、すべての回で手術室のすべてのスタッフが着用する必要があります。
- 手術のマウスのための準備
- 酸素の供給を確保するため麻酔の配信システムをチェックし、イソフルランはプロシージャの適切です。供給酸素を入れます。ガス流量計をオンし誘導室で動物の 500-1000 mL/分の場所にそれを調整し、上部をシールします。
- 5% にイソフルラン気化器をオンにし、側臥位になるまで動物を監視します。鼻の円錐形に麻酔の配信システムを切り替えます。
- 酸素は、任意の残留ガスの誘導部屋をフラッシュし、開いている鼻の円錐形のラインを維持しながら誘導室線をオフにします。
- 商工会議所から動物を削除し、動物の目に眼軟膏を慎重に配置します。
- ガスが流れ続けると、予熱した暖かいパッドに鼻の円錐形を配置します。
- 100-200 mL/分、2-3% イソフルランと酸素の流れを変更します。動物を移動する場合、gentlyrestrain までに鼻の円錐形の動物完全に麻酔再び。
- 呼吸およびプロシージャ中の刺激への応答を監視し、イソフルラン (2-5%) の割合を調整して、必要に応じて。手術を行う前に、動物の anesthetization レベルはつま先ピンチ反射の欠如によって監視されます。
- 鎮痛薬 (ブプレノルフィン、体重の 1 μ g/g) を切開部位から腹腔内に注入します。
- きれいな綿棒を使用して腹部にローションを適用します。ローション坐るようにマウスを 3-5 分のため、ガーゼや綿の綿棒を使って髪を削除します。マウスの腹部からすべての髪を削除するまで、この手順を繰り返します。
- 70% エタノール ガーゼと綿の綿棒を使って皮膚をきれい。腹部をきれいにする swabsticks またはポビドン ヨードのソリューションを適用します。
- 部分的な閉塞の手術
- 手術エリアの真ん中で開く 2.5 × 2.5 cm 25 × 50 cm 滅菌紙を使用して手術部位をドレープします。開口部と皮膚の境界で滅菌ストリップを配置することによって動物にドレープを保護します。
- 縦皮膚だけを切開することを確保し、この時点で musculoperitoneal 層に切断を回避する第 15 刃メスを使用して ~3.0 cm の腹部切開を確認します。
- 鉗子、手術用のはさみを使用して、皮膚の musculoperitoneal レイヤーに任意の切開を引き起こすことがなく慎重に musculoperitoneal 層から区切ります。レイヤーには、(約 1 cm × 4 cm) を十分に分離されている、特定、リネア musculoperitoneal 層と白線に沿ってカット 〜 2 cm にアルバ アルバ マイクロ鉗子、はさみを使用して腹腔を公開します。
- 慎重に検索し、盲腸を識別します。ゆっくりと優しく、マイクロ鉗子、近位結腸と滅菌ドレープに外盲腸と回腸をもたらすことで腹腔から盲腸を削除します。すぐに 0.9% 滅菌生理食塩水浸したガーゼで腸のティッシュを湿らせ、腹部キャビティの外、彼らすべての回で湿らせた露出した組織を維持します。
- 検索し、回腸と結腸の間の腸間膜を識別します。腸間膜のすぐ下、回腸に平行に、切開 (~ 1 cm) をして、血管を切断しないでください。
- オートクレーブのシリコーン リング (長さ、外装の直径を 4 mm、3.5 mm の内部の直径 6 mm) を取る。管を開き、マイクロ鉗子でリング縦カットします。
- 腸間膜組織に切開して開かれたリングの一方の端を挿入します。リングに囲まれた回腸と別の接触の 1 つの端を持って来ることによって完成したリング状にリングを返します。
- シリコン リングが回腸を完全に囲まれていることを確認、縫合糸でリングを閉じるし、慎重に腸を腹腔内の空洞に戻る場所します。
- 外科閉鎖
- 単純な実行白線に沿って musculoperitoneal 層に連続縫合吸収性縫合糸巻きアルバ、musculoperitoneal を閉じます。縫合が完了したら、任意の 0.9% 滅菌生理食塩水浸したガーゼで出血をクリーニングします。
- 完全に独立したナイロン縫合糸で、傷を閉じるため皮膚に単純な連続縫合を実行します。
- 両方の縫合が完了した後は、新しい swabstick またはポビドン ヨードと傷をきれい。
- 抗生物質 (ゲンタマイシン、20 ~ 30 g 体重に基づいてマウスあたり 150 μ L) を腹腔内注入します。
- プロシージャが完了イソフルラン気化器をオフにして流れる呼吸する動物を許可するしたらそれまで酸素開始意識を得ています。
- 動物は目を覚まし、一度熱をサポート完全に回復するまで別のリカバリ領域に動物を配置します。
3. 術後観察。
- 手術を終えて、温度・湿度が調整される回復室のインキュベーターに動物を移動します。動物、インキュベーターの中 2 番目の時間最初の 1 時間 30 分に、15 分ごとに術後の動物を監視します。
- 所定の観測が完了すると、すぐに彼らの自身の個々 のケージに動物を移動し、痛み18、手術の傷が (合併症の兆候なく適切に治癒ができるように臨床徴候のために毎日監視裂) 存在します。
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Representative Results
部分的な閉塞 (PO) 手術 1 ヶ マウス回腸盲括約筋の近くに周りのシリコン リングを配置することによって誘導されました。このリングは、回腸の部分的な閉塞を作成しました。偽オペレーション (SO) 年齢/性別もリングなし行った一致するマウスとこれらのマウスは徴候を示さない PO マウスで見つけられるそれらのよう。マウスはすぐには数時間以内 PO の手術から回復しました。彼らは示さなかった明白な行動の変化や弱さ、最初の週の内で、最初の週後に、彼らは徐々 に PO の兆しを見せ始めた: 腹部が膨らんで、少ないと小さく糞便のペレットの生産。PO マウスがポスト PO 外科手術などコントロール マウスと一緒に 8 13 日で犠牲になった。小腸だった部分的にいっぱい、ポスト PO 手術の 8 日間で膨張し完全に満たされて、制御 (図 1 a) マウスと比較して 13 日間ポスト PO 手術で膨張します。8 と 13 日ポスト PO 手術マウスの結腸に糞便ペレット形成 (図 1 b) などコントロール マウスと比較して減少しました。切開しリングの上流は回腸組織と平滑筋は、ヘマトキシリンとエオシン (H & E) 染色を用いて解析しました。平滑筋層は 8 日ポスト PO 手術で肥大され、13 日間ポスト PO 手術 (図 2) で大いにそれ以上に肥大します。また SMC、ICC、PDGFRα+、および免疫血清を使用して PO マウスにおける筋内神経細胞の変化が観測されました。各セルは特定の細胞タイプ マーカーが付いていた: PGP9.5 PDGFRA (PDGFRα+細胞)、キット (ICC) MYH11 (SMC) (神経細胞)。SMC は組織の 3 層に見られる: 縦筋 (LM)、輪状筋 (CM)、回腸 (MM) 粘膜筋板。SMC は徐々 に 8 と 13 日ポスト PO 手術 (図 3) ですべての 3 つの層で急速に育っていた。Icc、に関してはその亜集団は深い筋肉神経叢 (DMP)、腸管領域 (MY)、および漿膜下層 (SS) 地域に位置します。しかし、ICC DMP、ICC-私と ICC SS いた内/筋間層 (図 3) 内に堕落しました。ICC の集団と同様に、PDGFRα+細胞 (PαC) の集団は、DMP、私、SS にあります。PO マウス PαC DMP、PαC-私と PαC SS が動的に PO マウスの筋間層内改造した: 彼らはポスト PO 手術の 8 日間でだんだんと退化する 13 日間のポスト PO 手術 (図 3)。最後に、腸管神経叢 (MP)、粘膜下神経叢 (SP)、ニューロン漿膜下層 (SS)、および腸の運動ニューロン (:EMN) 大幅 PO マウス 8 と 13 日ポスト PO 手術 (図 3) の間/筋肉内の地域で失われました。
図 1。マウス モデル内腸の部分的な閉塞の外科的誘導。PO が PO 手術によって誘導されました。1 ヶ月古いマウス麻酔をかけられました、その腹部が切開によって開かれた、シリコン リングは、回腸を周囲に置かれた、開口部は縫合閉鎖。手術を受けたマウスは、8 または 13 日間の回復を許可されました。年齢、性別一致リングの配置がないを除けば、マウスが PO マウスと同じ方法でに作動しました。(A)総 PO を受けたマウスの消化管の画像や手術など。8 マウスの画像し 13 日 A. 小腸上流リングのマウス解剖手術後(B)の消化管は 8 と 13 日ポスト PO 手術で膨張したし、結腸に糞便のペレットは両方 8 時も小さかったと 13 日ポスト PO 手術として部分的に閉塞性シリコーン リングのため 13 日間ポストなど手術マウスと比較されました。スケール バーは、0.5 cmこの図の拡大版を表示するにはここをクリックしてください。 。
図 2。手術マウス モデルでは平滑筋層変更します。代表 H & E 染色だから腸 PO から回腸断面のと操作 (NO) マウスではないです。平滑筋 (SM) と粘膜 (Mu) 層は、8 と 13 日ポスト PO 手術で PO マウスでなど、マウスではないよりも厚いです。スケール バーは、50 μ mこの図の拡大版を表示するにはここをクリックしてください。 。
図 3。腸の部分的な閉塞による平滑筋肥大における動的細胞改造します。代表的な共焦点レーザーだから PO からの肥厚性回腸断面の画像をスキャンおよびマウスではないです。免疫組織化学的染色抗体 (レッド) MYH11 (SMC)、キット (ICC)、PDGFRA (PDGFRα+細胞) または (NC; 神経細胞), PGP9.5 共同で染色 DAPI (青)。粘膜筋板 (MM)、輪状筋 (CM) 縦筋 (LM) レイヤーで SMC と同様、深い筋肉神経叢 (DMP)、腸管領域 (MY)、および漿膜下層 (SS) 地域で PDGFRα+細胞は 8 と 13 日間ポスト PO で肥大性回腸で育ってください。腸の運動ニューロン (:EMN) NC (SS)、漿膜、粘膜下神経叢 (SP) DMP、私と SS は、腸管神経叢 (MP) ICC 中手術いた退化しました。スケール バーは、50 μ mこの図の拡大版を表示するにはここをクリックしてください。 。
図 4。大規模な小さすぎるかコロンに見当違いもシリコン リングの結果。(A)平滑筋肥大成長しない回腸閉塞を引き起こすには、リングが大きすぎる場合。回腸のない閉塞に少し作ったリング。(B)リングが小さすぎる場合に、回腸の腸管虚血が開発しています。リングは、組織が損傷し、肥大を開発する前に早期死亡につながる回腸のほぼ完全な閉塞で行います。(C)見当違いリングのために大腸の平滑筋肥大を開発しました。コロンのリングは内腔側のコンテンツ (糞便)、腸間膜血管を損傷し、コロンで大量出血の原因によって下へ移動されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
模倣する人間の腸閉塞、腸管平滑筋肥大を一貫して再現性をもって腸の PO 手術を受けるマウスに開発を実証しました。腸閉塞の手術は、犬12猫13モルモット11、ラット10マウス7を含むさまざまな動物の開発されています。腸閉塞のマウス モデルは、時間、コスト、サイズ、および他のより大きい動物モデルに表現型の利点を持って.マウスやラットの肥大の開発は、わずか 10 ~ 14 日10モルモット、犬及び猫111312,,の 2-4 週間と比較してです。購入およびマウスはまた、他のモデルと比較されたとき途方もない財政の利点を維持するためのコストします。さらに、マウスが小さくて PO 手術のため扱いやすいです。最も重要なは、他のより大きい動物は以下の広範な成長を開発しながら徐々 にかつ広範囲に PO 手術を受けるマウスは小腸で肥大を開発します。
腸 PO 手術を通して信頼性の高い肥大を生成しようとしてときに考慮するいくつかの要因があります。様々 なサイズのリングを使用し、リングを配置し、部分的な障害物7,9,10、11,12、腸に沿って様々 な場所でいくつかの研究グループ 13,14。ただし、最適なサイズのシリコーン リング使用してくださいマウスの大きなリングが回腸でほとんど、あるいは全く閉塞を作成、肥大、部分的にしか決して、開発または (図 4 a)。逆に、リングは小さすぎて、回腸腸管虚血の誘発および/または敗血症を引き起こしている粘膜を損傷の完全な閉塞に近いそれを作成したときは、(図 4 b) 1 週間以内の早期死亡に 。生後 1 ヵ月のマウス (材料表) の特定のサイズ (長さ、外装の直径を 4 mm、3.5 mm の内部の直径 6 mm) のシリコーン リングを使いました。リングのサイズが異なるをテストし、, 回腸に最適な閉塞を作成するためにさまざまなサイズのマウスを使用する必要があります。もう一つのキーファクターはある腸のリングの位置です。回盲弁に近い、回腸は確実部分的な障害を生成するためにリングを配置する最適な場所です。空腸や回腸, 回盲弁からのさまざまな地域など、その他の地域は、肥大7を誘導するためにそれらに置かれる同じようなリングがあった。ただし、非常に腹水によって潤滑されている腸の漿膜面、ため簡単に腸のこれらの部分に設置されたリングに糞便材料を押し進めたり腸の収縮力のため移動します。リングは、腸の長さをプッシュされると、出血を引き起こす腸の腸管領域に支配されている腸間膜動脈遮断します。回盲弁の横にある回腸の終わりにリングを挿入すると場合、それが物理的に移動不可能盲腸のかさばる性質によってさらに。盲腸を簡単に位置し、盲腸が回腸と結腸の両方に接続すると回盲弁部を見つけるために、手術で腹部から取られることができます。回腸と結腸の盲腸で接続して見て非常に似ているとリングは、回腸ではなく近位結腸に誤って配置ことができます。リングは、空腸にも見られる、近位結腸に置き違えられたリングは下方に押され、上腸間膜動脈、広範な出血 (図 4) を引き起こして破損しています。この紛失を避けるためには、回腸必要があります常がきちんと置かれ、場所にリングを置く前に識別します。大腸の盲腸袋の一方の側に実行中、盲腸の真ん中に回腸が実行されます。
この PO 外科プロトコルはマウスの大手術と見なされます。すべての手術器具と材料は、使用前に滅菌する必要があります、感染およびマウスにおける炎症につながることができる汚染を最小限にするため専用手術室のクリーンな環境で手術を実行する必要があります。さらに、鎮痛薬は、手術後マウスに提供する必要があります。7-8 h22まで効果的である、ブプレノルフィンの遅いリリース バージョンを使用するを選びました。また、手術後、咀嚼困難と固形食の嚥下にマウスがあります。手術、5 日後にマウスが軟化食品 (食品を柔らかくために水のビットを持つ固形飼料) で提供され、5 日後通常の固形飼料に切り替えた。
私たちの腸の PO 手術 smc が、ICC は、腸閉塞のため生体内で肥大モデルを提供します、PDGFRα+の細胞が異常に改造され。この PO モデルは、腸の神経細胞は、PO によって変更方法、および主要な運動活動は小規模および大規模な腸23を受ける理解にも理想的に適しています。これらの細胞は、培養条件15,16と同様に、病理学の条件で動的に改造することができます。などマウスのこれらの細胞が正常なマウス操作 (図 2および図 3) なしよりは少し異なるに行儀を見ました。人間のほとんどの腸閉塞は、平滑筋肥大3,4,5,21につながる手術後開発した腹部の癒着によって発生します。などの手術の後も分かった SMC、ICC、および PDGFRα+細胞が小腸で若干肥大腸管平滑筋肥大を引き起こすことができる (図 3) と比較して、その手術自体を示唆しています。この場合、手術はない PO 手術のため完全なネガティブ コントロールです。ないなど、PO 腸への比較として使用する必要があります。
要約すると、我々 は、ロバスト腸障害を生成するマウスのコスト/時間の効果的な信頼性と再現性のある PO 外科プロトコルを発見しました。閉塞の開発、中に神経細胞と同様に、SMC、ICC、PDGFRα+動的に様々 な組織層およびロケール内で改造されています。この vivo 閉塞モデル内でどのように表現型の変化の私達の知識に新たな洞察を提供していますが発生するは、細胞レベルで腸を妨げた。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
著者はベンジャミン ・ J Weigler、獣医、博士を感謝したいし、彼らの弁護士と同様に、マウスに提供されるウォルト ・ マンデヴィル、優秀な動物向け獣医 (動物資源・ キャンパスに通う獣医、ネバダ大学リノ)外科的処置。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical drape | Medical and veterinary supplies | SMS40 | 40”X100 yards |
| Underpad, econ, pro plus | Medical and veterinary supplies | MSC281224 | 17x24” |
| Iris scissors | Braintree scientific, Inc | SC-i-130 | |
| Iris scissors | Vantage | V95-304 | |
| Dumont electronic & jeweler tweezers | Dumont | 98-180-3 | |
| Braided absorbable suture | Covidien polysorb | SL-5687G | 5-0, polyglactin |
| Nylon non-absorbable mono filament | AD surgical | S-N618R13 | 6-0, nylon |
| Surgical blade | Dynarex | No.15 | |
| Needle holder | Jacobson microvascular | 36-1342TC | 8.5 inch |
| Scalpel handle | Flinn scientific | AB1049 | |
| Microsurgical scissor | WPI | 503305 | |
| Petrolatum ophthalmic ointment | Puralube VET | 3.5 g | |
| Fluriso (isoflurane) | Vetone | V1 502017 | 250 ml |
| Steri-strip reinforced skin closure | 3M | R1547 | |
| Surgical gloves | Medline | MSG2270 | |
| Ear loop face mask | The safety zone | RS700 | |
| Avant gauze non-woven sponges | Caring | PRM25444 | |
| Surgical cup | Admiral craft OYC-2 | 725-A42 | 2.5 oz |
| Swabstick | ChloraPrep | 260103 | 2% w/v Chlorhexidine Gluconate (CHG) and 70% v/v Isopropyl Alcohol (IPA) |
| Cotton tipped applicator | Puritan | 806-WC | |
| Buprenorphine | Zoo pharm | BZ8069317 | 1 mg/ml |
| Gentamycin sulfate | Vetone | G-6336-04 | 100 mg/ml |
| Fast acting gel cream remover | Veet | 8111002 | |
| Syringe | AHS | AH01T2516 | 1 ml with needle |
| Silicon ring | VWR | 60985-720 | 6 mm in length, 4 mm exterior diameter, 3.5 mm interior diameter |
| C57BL/6 mice | The Jackson Laboratory | 4-6 weeks old |
References
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