Summary
Intraspinal injektion af recombinase afhænger af rekombinant adeno-associeret virus (rAAV) kan bruges til at manipulere nogen genetisk mærket celletype i rygmarven. Her beskriver vi, hvordan du transduce neuroner i dorsal Hornet af lumbal rygmarven. Denne teknik gør det muligt for funktionelle forhør af undertypen manipulerede neuron.
Abstract
Selektiv manipulation af spinal neuronal delpopulationer er hovedsagelig opnået ved hjælp af to forskellige metoder: 1) stilling genetik, hvorved dobbelt eller tredobbelt Transgene mus er genereret for at opnå selektiv udtryk for en journalist eller effektor gen (f.eks.fra Rosa26 locus) i den ønskede spinal befolkning. 2) intraspinal injektion af Cre-afhængige rekombinant adeno-associeret virus (rAAV); Her injiceres Cre-afhængige AAV vektorer kodning for reporter eller effektor gen valg i rygmarven af mus udtrykker Cre recombinase i den ønskede neuronal delpopulation. Denne protokol beskriver hvordan man kan generere Cre-afhængige rAAV vektorer og sådan transduce neuroner i dorsal Hornet af lumbal rygmarven segmenter L3-L5 med rAAVs. Som de lumbal spinal segmenter L3-L5 innerveres af disse perifere sensoriske neuroner, der sender sensorisk information fra hindlimbs, kan spontan adfærd og reaktioner på sensoriske tests anvendt til ipsilaterale til injektion side hindlimb være analyseret for at afhøre funktionen af de manipulerede neuroner i sensorisk forarbejdning. Vi giver eksempler på hvordan denne teknik kan bruges til at analysere genetisk defineret delmængder af spinal neuroner. De vigtigste fordele ved virus-medieret transgen udtryk i Cre Transgene mus i forhold til klassisk reporter mus-induceret transgen udtryk er følgende: 1) forskellige Cre-afhængige rAAVs kodning forskellige reporter eller effektor proteiner kan være injiceres en enkelt Cre transgene linje, således at overvinde behovet for at oprette flere flere Transgene mus linjer. 2) intraspinal injektion begrænser manipulation af Cre-udtrykker celler injektionsstedet og lang tid efter injektion. De største ulemper er: 1) Reporter gen expression fra rAAVs er mere variabel. 2) kirurgi er forpligtet til at transduce de spinal neuroner af interesse. Hvilken af de to metoder er mere passende, afhænger af neuron befolkning og forskning spørgsmål behandles.
Introduction
Den dorsale rygmarven er afgørende for informationsudvekslingen mellem periferien af kroppen og hjernen. Sensoriske stimuli som varme, kulde, tryk, eller skadelige stimuli er opdaget af specialiserede perifere neuroner, som formidler disse oplysninger til neuroner i rygmarven dorsal Hornet. Her, et komplekst netværk af hæmmende og excitatoriske interneurons modulerer og til sidst relæer sensorisk information via spinal projektion neuroner til supraspinal websteder1,2. Beregninger udført af spinal inter- og projektion neuroner gate sensorisk information, således bestemme hvilke er undertrykt eller videresendes på hvilken intensitet. Ændringer i integrationen af sensoriske stimuli, såsom en ændret balance mellem hæmning og excitation, kan forårsage sensoriske dysfunktioner som overfølsomhed eller allodyni (smertefulde sensationer efter normalt ikke-smertefuld stimulation). Disse ændringer er anset for at være den underliggende årsag til forskellige kroniske smerter hedder3,4. Spinal kredsløb er derfor af stor betydning i sensorisk forarbejdning og dermed i opfattelsen af en organisme miljø og self. Med de nylige fremkomsten og kombination af molekylære, genetiske og kirurgiske teknikker, der giver den præcise manipulation af genetisk identificerede spinal neuron delpopulationer, forskere nu begyndt at forstå de underliggende spinal kredsløb ansvarlig for behandlingen af forskellige sensoriske modaliteter.
Intraspinal injektion af rAAV i wild-type eller Transgene mus har i høj grad bidraget til manipulation, analyse og forståelse af funktionen af specifikke delmængder af spinal neuroner5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11. denne teknik giver mulighed for levering af markør proteiner (som normal god landbrugspraksis / normal god landbrugspraksis fusion proteiner), reporter proteiner (f.eks GCaMP) eller effektor proteiner (såsom bakteriel toksiner, channelrhodopsin eller en receptorer) i et rumligt begrænset måde til spinal neuroner. Lokal injektion af Cre-afhængige rAAVs i Transgene mus udtrykker Cre recombinase i et bestemt undersæt af spinal neuroner giver den specifikke analyse af de respektive neuronal befolkning. Vi har anvendt denne teknik til at mærke, ablate, hæmme eller aktivere spinal glycinergic neuroner påviser, at de er en væsentlig del af spinal porten kontrollere smerter og kløe transmission7. I disse eksperimenter aktiveret intraspinal injektion af Cre-afhængige rAAV i GlyT2::Cre mus selektiv manipulation af glycinergic neuroner i lumbal rygmarven. Dermed kan samtidige manipulation af supraspinal kredsløb, der indeholder glycinergic neuroner afgørende for overlevelse af dyret undgås.
Mens en intraspinal injektion af rAAVs begrænser infektion til webstedet af injektion, kan viral transduktion forekomme ikke blot i lokale neuroner, men også i neuroner, der tilsluttes injektionsstedet via cytoskeletale fremskrivninger. Sidstnævnte er ofte bruges til at spore CNS områder giver neuronal input til en bestemt kernen i hjernen. Infektion af cytoskeletale fremskrivninger kan dog også være en forstyrrende faktor når en afgrænset befolkning af neuroner skal undersøges på et bestemt websted. For at løse disse problemer, har vi for nylig gennemført en omfattende analyse af AAV serotyper og udtryk kassetter til at identificere serotyper og projektledere, der kan bruges til enten minimere eller maksimere retrograd transduktion. I forbindelse med denne specifikke forskning i spinal kredsløb analyserede vi forskellige serotyper og initiativtagere evne til at retrogradely transduce neuroner i dorsalrodsganglier (DRG), den rostralt ventromedial medulla (RVM) og den somatosensoriske cortex 12. den teknik, der er skitseret i denne protokol kan derfor bruges til at analysere spinal neuroner på injektionsstedet eller at analysere projektion neuroner, der giver input til webstedet injiceres i rygmarven. I protokollen beskrevet her, udføres tre injektioner af rAAV i venstre side af lumbal rygmarven for at aktivere transduktion af neuroner i de tre lumbale segmenter (L3-L5). L3-L5 segmenter modtage hovedparten af sensoriske input fra hindlimb ipsilaterale til injektionsstedet. Vi viser, at funktionel manipulation af genetisk mærket neuroner i L3-L5 er tilstrækkelig til at fremkalde robust adfærdsmæssige ændringer, hvilket giver funktionelle beviser for funktionen kredsløb af sådan en genetisk mærket neuron undertype.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg blev godkendt af det schweiziske kantonale Veterinærkontoret (Zürich) og er i overensstemmelse og overensstemmelse med alle relevante lovgivningsmæssige og institutionelle retningslinjer.
Bemærk: Alle materialer sammen med respektive producenter og/eller leverandører er angivet i Tabel af materialer.
1. generation af Cre-afhængige AAV vektorer
Bemærk: En bred vifte af Cre-afhængige vektorer med forskellige projektledere kan købes (Se Tabel af materialer) eller, hvis den ønskede udtryk konstruktion ikke er tilgængelig, den kan genereres ved at ændre eksisterende AAV konstruktioner. Bemærk, at initiativtageren og serotype kan have en indvirkning på spredningen af viral transduktion (Se 12). Den første del af denne protokol beskriver kort generation af to forskellige Cre-afhængige AAV vektorer egnet til gevinst og tab af funktion eksperimenter, henholdsvis.
-
En aktivering (gevinst af funktion)
- Bestil pAAV.hSyn.flex.hM3D (Gq)-mCherry (Se Tabel af materialer) for designer receptorer udelukkende aktiveres af designer medicin (DREADD)-medieret aktivering.
- Ved modtagelse af den bakterielle stab kultur, streak ud bakterier på LB plader (bakteriologiske-grade agar opløses i Luria-Bertani flydende medium) suppleres med passende antibiotika. Der inkuberes ved 37 ° C natten over og hente en enkelt koloni på den næste dag.
Bemærk: Plasmider indeholder AAV vektor genomer kan være ustabil og rekombination af det virale genom, især inden for den virale inverteret terminal gentager (ITR), kan forekomme under forstærkning i E. coli. Vi foreslår ved hjælp af recA-mangelfuld/undertrykt stammer sådan som MDS42 eller Stbl3 for at undgå rekombination inden for plasmid som indeholder AAV genom. - Forstærke bakterier følge anvisningerne fra leverandøren af valgt DNA-Maxi-Kit og forberede høj kvalitet plasmid DNA med en kommercielt tilgængelig DNA-Maxi-Kit (f.eks., se Tabel af materialer). Udføre en kvalitetskontrol af plasmid DNA forberedelse ved at verificere integritet og identitet af plasmid DNA gennem begrænsning udtog af en alikvot af plasmid DNA.
Bemærk: Der er anerkendelse websteder for begrænsning liv1975 SmaI inden for ITRs. Omfatte en SmaI digest i kvalitetskontrol til at verificere integriteten af ITRs. - Send DNA til en viral vektor core facilitet for at producere høj kvalitet rAAV.
Bemærk: Høj titer, høj kvalitet viral preps er afgørende for at undgå forstyrrende fænotyper skyldes forureninger i den virale prep. Vi anbefaler derfor, at have rAAV valg produceret i en etableret vektor core facilitet, medmindre AAV produktion er veletableret i laboratoriet.
-
Ablation (tab af funktion)
Bemærk: Bakteriel toksiner eller toksin receptorer kan bruges til at mægle celle ablation eller neuronal hæmning. Vi har genereret pAAV.EF1α.flex.DTA at udtrykke difteri toxin fragment A (DTA) på en måde, der Cre-afhængige.- For at generere en Cre-afhængige viral vektor, vælge en Cre-afhængige vektor med en egnet promotor (f.eks., pAAV.EF1α.flex.hChR2(H134R)-eYFP). Forstærke den kodende sekvens af valg (fxDTA) ved polymerase kæde reaktion med primere, der omfatter AscI og NheI eller kompatibel begrænsning liv1975 genkendelsessekvenser i deres udhæng (Se Foster et al. 7)
- Ved hjælp af standard molekylærbiologiske teknikker, udføre begrænsning fordøjer af vektor DNA (pAAV.EF1α.FLEX.hChR2(H134R)-eYFP) og af PCR-forstærket indsætte (NheI-DTA-AscI) med restriktionsendonukleaser AscI og NheI. Ligate renset fragmenter.
- Omdanne ligatur reaktion i passende bakterier, i henhold til protokollen, leverandøren af de kompetente bakterier af valg, og plade bakterier på LB plader. Bruge recA-mangelfuld/undertrykt stammer, såsom MDS42 eller Stbl3, til kloning og efterfølgende forstærkning af plasmid DNA.
- På dagen efter transformation, vælge kloner og podes dem i LB medium suppleret med de relevante antibiotika natten over ved 37 ° C. Den næste dag, uddrag plasmid DNA fra bakterier, kulturperler. Bekræft vellykket kloning af begrænsning fordøjer og sekventering af den udpakkede plasmid DNA.
- Forstærke høj kvalitet, bakterieplasmid DNA (Se trin 1.1.3). Send amplificerede DNA til en viral vektor core facilitet for virus produktion.
2. transduktion af Spinal celler
- Forberedelse af Virus opklaring
Forsigtig: Vira er smitsomme reagenser og skal håndteres efter de relevante retningslinjer. I de fleste tilfælde kan rAAVs håndteres på biosikkerhed niveau 1 (BSL1).- På dagen for injektion, afrim en stock alikvot af den ønskede renset virus på is og holde den på køl indtil umiddelbart før injektion. Undgå gentagne fryse-tø-cykler, da disse vil mindske den effektive titer af virus.
Bemærk: Hvis det er nødvendigt, optøet virus alikvot kan opbevares ved 4 ° C i op til 3 dage. - Fortynd viruspartikler i steril 0,9% NaCl eller phosphat bufferet saltvand (PBS).
Bemærk: Den passende titer afhænger af de eksperimentelle formål og skal bestemmes eksperimentelt. En god samlede viral belastning er at starte med 3 x 109 genom kopier (3.33x1012 GC/mL, 3 x 300 nL injiceres). At tage overskydende og nogle tab under indlæsning kapillær i konto, omkring 2,5 µL af virus løsning vil være behov for hver mus.
- På dagen for injektion, afrim en stock alikvot af den ønskede renset virus på is og holde den på køl indtil umiddelbart før injektion. Undgå gentagne fryse-tø-cykler, da disse vil mindske den effektive titer af virus.
- Forberedelse af Mikropipetter til Intraspinal injektioner
- 'Trække' tynd væg glas kapillærer (ydre diameter 1 mm) på en mikropipette aftrækker til at oprette en ~5.5 mm lang, lavvandede skaft. Bruge en 3,0 mm varmelegeme glødetråd og indstillinger af programmet 00 med P(A) tilpasset som i tabel 1.
Bemærk: Trække kan gøres på forhånd. De trak kapillærer skal opbevares i en lukket beholder på modeling ler for at undgå støv, som senere kunne tilstoppe mikropipette. Autoklavering af Mikropipetter er ikke nødvendigt. - Klip skanken af den trak kapillær med laminektomi pincet til en længde på omkring 4,5 til 5 mm til at oprette et tip åbning med en indre diameter på 25-35 μm. Ved hjælp af et mikroskop med en mikrometer skala, måle den indvendige diameter af flere Mikropipetter til at få en fornemmelse for hvor stor åbningen være eller måle for hver mikropipette.
Bemærk: En mindre tip kan føre til tilstopning; en større tip kan forårsage vævsskader og vanskeligheder med at trænge ind på rygmarven.
- 'Trække' tynd væg glas kapillærer (ydre diameter 1 mm) på en mikropipette aftrækker til at oprette en ~5.5 mm lang, lavvandede skaft. Bruge en 3,0 mm varmelegeme glødetråd og indstillinger af programmet 00 med P(A) tilpasset som i tabel 1.
- Forberedelse af kirurgisk Setup og værktøjer
- Sikre, at udstyret er ren og klar til brug. Desinficere arbejdsområdet ved aftørring med 70% ethanol og sterilisere værktøjer ved autoklavering eller desinficere dem. Lad ikke nogen desinfektionsmiddel på microliter sprøjten, der ville skade den virale vektor skal anvendes.
- Anæstesi og forberedelse af dyret for kirurgi
Bemærk: Den samlede varighed af kirurgi er 60-90 min.- Vælg 6 til 10 - uger gamle mus til at lette den kirurgiske procedure.
Bemærk: Hvis den eksperimentelle design kræver det, injektion af yngre eller ældre dyr er muligt. Enhver stamme og begge køn kan anvendes i princippet, men bruge samme baggrund stamme (f.eks. C57BL/6J) til sammenligning af adfærd mellem forskellige Transgene mus linjer. Hvis sex forskelle forventes eller undersøges, analysere hanner og hunner i separate grupper. - Fremkalde anæstesi ved hjælp af ~ 5% isofluran. Placere dyret i stereotaxisk rammen på en heat mat og opretholde anesthesia på 1-2,5% isofluran (air flow hastighed 900 mL/min). Overvåge åndedræt sats i hele operationen.
- Anvende smøremiddel øjet salve for at forhindre hornhinde tørring under operationen.
- Barbere dyrets ryg og fjerne hår grundigt med vådt væv. Desinficere glatbarberet huden med jodopløsning og tillader huden at tørre.
- Give smertestillende behandling (f.eks.0,1-0,2 mg/kg buprenorphin subkutant).
- Vælg 6 til 10 - uger gamle mus til at lette den kirurgiske procedure.
- Eksponering af rygsøjlen på niveauet lumbal rygmarven
Bemærk: På grund af differentieret udvikling af rygmarven og rygsøjle, de respektive niveauer er ikke justeret, men lumbal rygmarven segment L4 er på samme niveau som thorax ryghvirvel T13.- Find de mest caudale rib par af føles langs rygsøjlen. Ved hjælp af en skalpel, gøre en 1,5-2,5 cm langsgående snit i huden starter fra kun rostralt til de mest caudale rib par.
- Løft huden med tang og fjern det fra den underliggende muskel med en saks. Hele operationen, holde de udsatte væv fugtig med steril 0,9% NaCl.
- Bruger fine pincet og lille saks, gøre et snit i den næste, tynde hindeagtige lag lige ved siden af midterlinjen og afskåret fra torntappene. Det er adskilt fra den underliggende paraspinous muskel, men knyttet til torntappene.
- Identifikation af ryghvirvler på niveauet lumbal rygmarven
Bemærk: Når rygsøjlen er udsat, intertransverse ledbånd og de dorsale torntappene skal være synlige. Flere anatomiske landemærker kan støtte i at identificere de korrekte ryghvirvel til målet (figur 1B).- Trække huden tilbage mod halen at eksponere hoftebenskammen. På samme niveau slutter de mest caudale par af synlige intertransverse ledbånd L6 spinosus proces. Tælle baglæns i en caudale rostralt retning at identificere ryghvirvel af interesse.
- Palpere langs rygsøjlen. De mest caudale rib par ligger bare rostralt for T13 ryghvirvel og skinkeben ved hofte niveau er på niveau med L6 ryghvirvel.
- Find det sted hvor senen langs siden af rygsøjlen er hvideste og mest mediale. T13 ryghvirvel ligger bare rostralt. Lumbal spinal cord segment L4 ligger denne ryghvirvel.
- Fiksation af rygsøjlen og eksponering af lumbal rygmarven
- Placere dyr på en pude af opløftede væv til at ophøje det til spinal klemmerne af stereotaxisk rammen.
- Fix mål ryghvirvel for at undgå bevægelser af rygsøjlen på grund af vejrtrækning. I dette øjemed Juster klemmer støder op til målet ryghvirvel, lave en klemme i holdning og holde rygsøjlen med Adson pincet mens om fastsættelse af den anden klemme.
Bemærk: Kolonnen bør være vinkelret injektion og monteret fast således at den ikke bevæger sig efter pres fra oven. Hvis det er nødvendigt, kan der fastsættes et andet par af klemmer til rygsøjlen. I dette tilfælde er det nyttigt at fastsætte de to par af klemmer til to ryghvirvler støder op til målet ryghvirvel. - Fjerne paraspinous musklen over ryghvirvler af interesse. Ved hjælp af en skalpel, foretage en parallel indsnit bare mediale til sener, der er parallelle til rygsøjlen, samt vinkelrette snit rostralt og caudale target ryghvirvel. Pas på ikke at skære for dybt. Tåre/skære væk musklen ved hjælp af rongeurs. Bruge pincet som nødvendigt for at fjerne væv forbliver på ryghvirvel eller over dura i intervertebrale plads.
- I den intervertebrale plads, skal den dorsale blodkar være synlige mærkning midterlinjen af rygmarven. Udfør en delvis laminektomi for ensidige injektioner, ved at bore et hul i midten af den indskyde side af ryghvirvel. Brug en fin tandpleje boring apparater med en 0,5 mm sfæriske cutter og bore særligt omhyggeligt, når du nærmer rygmarven. Fjern eventuelle resterende knoglerester med 26G skrå nål til at eksponere rygmarven.
- Ved hjælp af en 26G skrå nål perforere dura i boret hul, og i den intervertebrale plads rostralt og caudale til target ryghvirvel, alle cirka 200 µm lateral til den dorsale blodkar. Cerebrospinalvæske bør flygter fra hullerne og rygmarven bør være lidt buler.
- Forberedelse af injektion sprøjte
Bemærk: Injektion sprøjte bør tilberedes umiddelbart før starten af injektion til at reducere risikoen for støvpartikler tilstopning af mikropipette.- Mount glas kapillær på en microliter sprøjte ved hjælp af flytbare nål klemringsforskruning kit. Fastgør møtrik stramt for at sikre en stram og sikker pasform.
- Fyld microliter sprøjte med sterilt, destilleret vand og begynde at trykke det ud med stemplet.
Bemærk: Hvis der er for meget modstand, så vandet ikke kommer nemt ud af spidsen, mikropipette blokeres sandsynligvis og bør udskiftes. - Montere sprøjte ind på en micromanipulator tilsluttet en elektronisk styret microinjector. Pas på ikke at røre noget med en mikropipette.
- Ved hjælp af microinjector, trække op omkring 1 µL af luft til at oprette en boble mellem vandet og virus.
- Omhyggeligt placere en 2,5 µL dråbe af virus løsning på et stykke af paraffin film, flytte spidsen af mikropipette i slipværktøjet ved hjælp af stereotaxisk rammen og trække det. Derefter forsigtigt tryk dispensere indtil lidt af virus løsning fremgår på spidsen.
- Trække sprøjten og bruger en pen, markere mikropipette med en skala og Bemærk niveauet af anti-virus løsning; Dette vil lette kontrollen med om infusionen skrider frem som programmeret.
- Intraspinal injektioner
- Flytte spidsen af mikropipette over et af hullerne i dura og derefter nedad indtil en lille bule er noteret i dura. For at målrette injektion til spinal dorsal Hornet, flytte ned 500 µm i 100 µm på hinanden følgende trin (hastighed 1 mm/s) og derefter 200 µm op til mekaniske stabilisering af væv.
NOTE: Den endelige dybde af spidsen er 300 µm i denne sag, men kan tilpasses afhængigt af målområdet.- Hvis væv, der er resistente over for penetration, kan mikropipette være fange på dura. I dette tilfælde trække og flytte lidt til ligger i hullet, eller bruge nålen igen for at perforere dura ordentligt før gentagelse af forsøg på indtrængen.
- Programmere pumpen til en target Injektionsvolumen på 300 nL injektion hastighed af 50 nL/min og tryk på start-knappen til at begynde infusion.
- Efter injektionen er færdig, tjek skala for at se om virus plan er faldet og efterlade mikropipette sted for en yderligere 3 min. så presset til Reagensglasset før langsomt tilbagetrækningskraften sprøjten.
- Gentag trin 2.9.1.-2.9.3. for de andre to injektionssteder.
- Flytte spidsen af mikropipette over et af hullerne i dura og derefter nedad indtil en lille bule er noteret i dura. For at målrette injektion til spinal dorsal Hornet, flytte ned 500 µm i 100 µm på hinanden følgende trin (hastighed 1 mm/s) og derefter 200 µm op til mekaniske stabilisering af væv.
- Suturering og opsving
- Fjerne de spinal klemmer og pude under musen.
- Lukke såret i lag med afbrudte masker, suturering overfladiske væv lag med resorberbare suturer og huden med ikke-resorberbare suturer. Anvende jod desinfektionsmiddel på syet såret.
- Opsige anæstesi og forlade dyret på heat mat, indtil den genindvinder før den returneres til sit hjem bur.
- Postoperativ pleje
- Overvåge sundheden for dyret på dagen for kirurgi, den næste dag og derefter hver 2-3 dage. Sikre, at dyret har en normal gangart, et sundt udseende (vægt, øjne, pels og opførsel), og at den sårheling.
- Fortsætte smertestillende behandling (f.eks.0,1-0,2 mg/kg buprenorphin subkutant) som nødvendigt, tre gange om dagen.
3. adfærdsmæssige og morfologiske analyser
-
Adfærdsanalyse
Bemærk: Mulighed for dyr til at rumme de respektive setup i mindst 30 min før påbegyndelse af målinger for at lade dem tilpasse sig den nye eksperimentelle miljø.-
von Frey Test
- Placere dyr individuelt i enkelte rum på ca 10 cm x 10 cm på en metal gitter sal.
- Stimulere plantar overfladen af hindpaw ipsilaterale til injektionsstedet med en dynamisk von Frey glødetråd. Bemærk den kraft, hvormed dyret trækker sin pote fra stimulus.
- Gentag fem gange og beregne den gennemsnitlige tilbagetrækning tærskel fra seks målinger for hvert dyr.
-
PIN priktest
- Placere dyr i enkelte rum på ca 10 cm x 10 cm på en metal gitter sal.
- Stimulere plantar overfladen af hindpaw ipsilaterale til injektionsstedet med en afrundede 26 G kanyle uden penetration af huden. Score adfærd som nul (ingen reaktion) eller en (reaktion).
- Gentag 9 gange med intervaller på 3 min mellem stimulering og Beregn procentdel svar fra de 10 målinger for hvert dyr.
-
Injektion af DREADD-ligand clozapin-N-oxid (CNO)
- Opløse CNO i dimethylsulfoxid (DMSO) til at oprette en stamopløsning af 0,2 mg/µL, der kan opbevares ved stuetemperatur.
- På dagen for eksperimentet, fortyndes stamopløsning i steril 0,9% NaCl til 0,2 µg/µL og injiceres 10 µL/g kropsvægt intraperitoneal. Injicere kontroldyr med køretøjet (0,2% DMSO i 0,9% NaCl).
Bemærk: Ifølge erfaring, peak virkninger på adfærd kan være forventede 1-3 h efter injektion, og virkninger bør helt aftager efter 24 h. I forbindelse med aktivering af glycinergic neuroner, observerede adfærd omfatter reduceret smerte og kløe svar. Adfærd fremkaldt ved DREADD-medieret aktivering af neuroner vil afhænge af den målrettede delmængde af spinal neuroner.
-
Injektion af Pruritogens til at fremkalde kløe
- Opløs pruritogens i 0,9% NaCl til løsninger på 8 mg/mL (chloroquin) eller 10 mg/mL (histamin). 2 timer efter administration af CNO Injicér 10 µL af pruritogen eller køretøjet løsning subkutant i plantar overfladen af hindpaw ipsilaterale til spinal injektionsstedet. Alternativt, injicere pruritogen intradermalt i læggen, som er blevet barberet én dag før for at reducere afskrækningsmiddel adfærd forårsaget af barbering, selv.
-
Videooptagelser for at analysere spontan Nocifensive eller Pruritogen-induceret kløe adfærd
- Placere dyr enkeltvis i gennemsigtig rum (ca. 10 cm i diameter) med en smule af sengetøj fra deres respektive hjem-bur på gulvet.
- Videobånd dyr for 5 min at optage spontane og 30 min for at optage pruritogen-induceret adfærd. Analysere de videoer offline i spande på 5 min.
-
Smerter Versus kløe adfærd
- Observere og Bemærk at blinke, slikke og bide adfærd.
Bemærk: Blinke og slikke på det berørte websted er betragtes som svar til smerter, mens bidende er forbundet med kløe. - Analysere videoer på normal hastighed, måler den tid at musen slikke eller bider det berørte websted eller måle i slowmotion for en mere præcis sondring mellem slikke og bide reflekser. Alternativt, tælle antallet af slikke/bide/blinke anfald.
- Observere og Bemærk at blinke, slikke og bide adfærd.
-
von Frey Test
-
Morfologisk analyse
- Udføre morfologiske analyser fra en til tre uger efter indsprøjtning af virus eller for enden af en adfærdsmæssige eksperiment.
Bemærk: Vi har fundet eGFP udtryk så snart 48 timer efter injektion, men også fundet at udtryk stiger markant inden for næste dage og endda uger. For celler med stærk reporter udtryk, en uge efter inkubation (fra intraspinal injektion indtil perfusion) kan være nok. For celler med svag transgen udtryk, vira med svag initiativtagere eller svagere fluorophores, kan en længere udtryk være nødvendigt at sikre påviselige mængder. -
Væv fiksation
- Perfuse hver mus transcardially, først med 20 ml iskold kunstige cerebrospinalvæske (ACSF) løsning (NaCl 125 mM, NaHCO3 25 mM, NaH2PO4 1,25 mM, D-glukose 20 mM, KCl 2,5 mM og CaCl2 2 mM MgSO4 1 mM), derefter med 100 mL af 4% iskolde PARAFORMALDEHYD (i 0,1 M natrium fosfat buffer, pH 7,4).
Forsigtig: PARAFORMALDEHYD er giftigt og skal håndteres med omhu. - Straks dissekere lumbal rygmarven, og post løse væv for 2 h med 4% PARAFORMALDEHYD på is. Kort vaske den efter faste væv med 0,1 M natrium fosfat buffer (pH 7,4) og derefter inkuberes det i 25% rørsukkeropløsning (i 0,1 M natrium fosfat buffer, pH 7,4) natten over ved 4 ° C.
- Skær cryoprotected væv på 30 μm på en kryostaten og montere sektionerne på objektglas.
- Perfuse hver mus transcardially, først med 20 ml iskold kunstige cerebrospinalvæske (ACSF) løsning (NaCl 125 mM, NaHCO3 25 mM, NaH2PO4 1,25 mM, D-glukose 20 mM, KCl 2,5 mM og CaCl2 2 mM MgSO4 1 mM), derefter med 100 mL af 4% iskolde PARAFORMALDEHYD (i 0,1 M natrium fosfat buffer, pH 7,4).
-
Immunfluorescens farvning
- Efter korte vasker i PBS, anvende 300 μL blokerende løsning (10% Normal æsel serum i 0,3% Triton-PBS) på afsnittene i 1 time ved stuetemperatur.
- Glassene inkuberes med 300 μL af de respektive kombinationer af primære antistoffer i blokerende løsning (Se Tabel af materialer) over nat ved 4 ° C. Vaske i afsnit 3 gange i 5 min i PBS.
- Glassene inkuberes med de respektive kombinationer af sekundære antistoffer i blokerende løsning i 1 time ved stuetemperatur. Vaske i afsnit 3 gange i 5 min i PBS.
- Kort skyl dias i ddH2O, derefter montere coverslips ved hjælp af fluorescerende montering medium.
- Erhverve fluorescerende billeder ved hjælp af en Konfokal mikroskop udstyret med en 20 x og en 40 x mål.
- Udføre morfologiske analyser fra en til tre uger efter indsprøjtning af virus eller for enden af en adfærdsmæssige eksperiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at illustrere de udtryk niveauer, der kan opnås af intraspinal injektion af rAAV kodning en markør protein, injiceres vi først AAV1. CAG.eGFP i lumbal rygmarv fra wild-type mus. Tre injektioner fordelt ca 1 mm fra hinanden produceret en næsten kontinuerlig infektion af lumbal spinal segmenter L3 til L5 (figur 1A-C). Virus injektion på en dybde på 300 µm fra spinal overfladen fører til dominerende infektion af celler i rygmarven dorsal Hornet. Inficerede celler kunne dog også findes i den ventrale horn (fig. 1 d). Næste, målet var at illustrere forskellen i rAAV-medieret udtryk når indsprøjte en Cre-afhængige rAAV i en Cre Transgene mus. Vi har derfor injiceres Cre-afhængige AAV1. CAG.flex.eGFP vektor i rygmarven af GlyT2::Cre Transgene mus. Som blev før, eGFP udtryk observeret i dorsal og ventral horn. Men som forventet, udtryk for eGFP blev mere begrænset, hvilket afspejler fordelingen af GlyT2 + neuroner, dvs det relativt sparsomme udtryk i overfladiske dorsal Hornet og tætte udtryk i dybe dorsal Hornet (figur 1E).
Næste, for at demonstrere mulighederne for adressering kredsløb funktion af spinal neuronal delpopulationer, to forskellige Cre-afhængige AAVs kodning for forskellige effektor proteiner (DTA og hM3Dq) blev tilført GlyT2::Cre Transgene mus. Svarer til udtrykket viral observeret efter tre injektioner af AAV1. CAG.eGFP i wild-type mus, der var robust ablation af hæmmende neuroner (Pax2 +) i lumbale segmenter L3-L5 efter injektion af AAV1. EF1a.Flex.DTA til Glyt2::Cre mus (figur 2AC). Tab af glycinergic hæmmende neuroner i disse segmenter fremkaldte en markant mekaniske overfølsomhed (figur 2D) og spontane afskrækningsmiddel adfærd rettet mod den ipsilaterale hindlimb (figur 2E). Afskrækningsmiddel adfærd førte til selvpåførte læsioner, som kan observeres på poter, læggen og låret (for data, se Foster et al. 7) overfor effekter blev observeret ved aktivering af glycinergic neuroner gennem indsprøjtning af AAV1.hSyn.flex.hM3Dq og efterfølgende intraperitoneal injektion af CNO (figur 2B). Mus blev desensibiliserede til skadelige mekaniske stimulation (figur 2F) og andre skadelige stimuli (Se Foster et al. 7) hertil kommer, når de behandles med pruritogens histamin eller chloroquin, hM3Dq-medieret aktivering af glycinergic neuroner effektivt undertrykt prurifensive svar (fig. 2 g). Disse resultater viser, at tre injektioner af rAAV i lumbal rygmarven er i stand til at transduce et område af lumbal rygmarven tilstrækkeligt at bemærke robust adfærdsændringer fremkaldt ved stimulering af den tilsvarende hindlimb.
I et endeligt sæt eksperimenter ønskede vi at vise de potentielle forskelle i brug af Cre reporter mus i forhold til Cre reporter vira. Derfor blev et Cre driver gen valgt, der tidligere er blevet beskrevet som viser et begrænset udtryk mønster i rygmarven mus. Gen RORβ er blevet foreslået for at udtrykkes overvejende i hæmmende interneurons dybe dorsal horn13,14. Denne undersøgelse bruges RORβCre knock-i mus og krydsede dem til Rosa26lox-STOP-lox-tdTomato (R26Tom) Cre reporter mus, der fører til ekspression af tdTomato i alle celler viser Cre udtryk på ethvert tidspunkt før analyse ( Figur 3A). Karakterisering af tdTomato + celler i RORβCre; R26Tom mus viste udtryk i neuroner og astrocytter af dorsal Hornet (figur 3BC). I virkeligheden, foreslog kvantificering af tdTomato + celler, at fleste celler gennemgår Cre-medieret rekombination (58%) var ikke-neuronal. Vi derefter injiceres en Cre-afhængige tdTomato reporter rAAV (AAV1. CAG.flex.tdTomato) i rygmarven af P40 RORβCre mus (figur 3D). I modsætning til R26Tom-medieret reporter udtryk, vi fandt alle tdTomato + celler mærket af virussen reporter at være neuroner (figur 3EF). Endelig, af tdTomato + neuroner identitet blev analyseret i begge sæt af mus (RORβCre; R26Tom og RORβCre injiceres med AAV1. CAG.flex.tdTomato). I begge tilfælde, fleste af neuroner var hæmmende (> 85%) og mindretallet af neuroner excitatoriske (< 20%) (Figur 3 G-jeg), som er i overensstemmelse med tidligere vurderinger af identiteten af RORβ + neuroner13,14.
Figur 1: Intraspinal injektion af AAV1-eGFP/AAV1-flex-eGFP
(A) skematisk illustration af en intraspinal injektion af en AAV1. CAG.eGFP (AAV1-eGFP) i lumbal rygmarven, som er innerveres af hindlimb. (B) anatomiske placering af lumbal rygmarven segmenter L3-L4 kan ses i en top-down syn på bagsiden af en mus. Huden blev åbnet for at udsætte rygsøjlen. Spinal tværtappe T13-L6 er farvet som anatomiske henvisninger og en pil angiver hoftebenskammen. (C) repræsentativt billede af et hele bjerget lumbal rygmarven. Grøn fluorescens viser virus-transduced områder af rygmarven. (D) repræsentativt billede af et tværsnit gennem en AAV1-eGFP-transduced lumbal rygmarv fra en wild-type mus. (E) repræsentativt billede af et tværsnit af en AAV1. CAG.flex.eGFP-transduced rygmarven GlyT2::Cre musen. Stiplede linjer repræsenterer omridset af det grå materie og overfladiske dorsale horn af rygmarven. Skalere barer C = 1 mm, D = 100 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Funktionel Manipulation af Spinal Cre-udtrykker Glycinergic neuroner
(A + B) Skematisk illustration af en intraspinal injektion af en AAV1. EF1a.Flex.DTA (A) eller en AAV1. EF1a.Flex.hM3Dq (B) i lumbal rygmarven. CRE-afhængige udtryk af difteri toxin fragment A (DTA) vil føre til ablation af glycinergic neuroner (GlyT2 +) (A), mens Cre-afhængige udtryk for en designer receptor hM3Dq vil gøre GlyT2 neuroner activatable af clozapin-N-oxid (CNO) (B). (C) tre injektioner af AAV1. EF1a.Flex.DTA i L3-L5 segmenter af GlyT2::Cre mus ført til en mærkbar tab af hæmmende neuroner i de respektive segmenter af den ipsilaterale men ikke af de kontralaterale side. (D) tab af GlyT2 neuroner fremkaldte en langvarig overfølsomhed over for mekanisk von Frey stimulation i ipsilaterale bagben pote af GlyT2::Cre musene injiceret med AAV1. EF1a.Flex.DTA, men ingen ændring blev observeret hvis Cre-negative mus blev injiceret. (E) tab af GlyT2 neuroner fremkaldte spontan afskrækningsmiddel adfærd minder om kronisk kløe. (F) hM3Dq-medieret aktivering af GlyT2 neuroner lindres skadelige mekanisk smerte fremkaldt ved nålestik stimulation. (G) hM3Dq-medieret aktivering af GlyT2 neuroner reduceret pruritogen (chloroquin eller histamin)-fremkaldte afskrækningsmiddel adfærd. Data repræsenteres som gennemsnit ± SEM. *** p < 0,001; p < 0,01. Skalere bar C = 1 mm. g = gram. Billeder er genbruges og ændret fra Foster et al. 7 Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: genetiske og Virus-medieret mærkning af RORβ-udtrykker celler. (A) Diagram, der viser strategien for Cre-afhængige udtryk af fluorescerende tdTomato reporter i RORβCre; Rosa26lox-STOP-lox-tdTomato (R26Tom) mus. (B) immunfarvning på rygmarven sektioner af RORβCre; R26Tom mus viste at NeuN + RORβ-Tom neuroner kan findes i bladplader I-IV. (C) Cre-afhængige udtryk af tdTomato blev også observeret i GFAP + celler af RORβCre; R26Tom mus, hvilket tyder på at RORβ kommer til udtryk i astrocytter under udvikling. Pilespidser angive dobbelt-mærket astrocytter i lamina III. (D) Diagram viser intraspinal injektion af AAV-flex-Tom (rAAV1.CAG.flex.tdTomato) virus i RORβCre mus at drive lokale Cre-afhængige udtryk for tdTomato. (E) immunfarvning på rygmarven sektioner af RORβCre musene injiceret med AAV-flex-Tom virus. RORβ-Tom neuroner er lokaliseret til de overfladiske bladplader af spinal dorsal Hornet og udtryk for tdTomato var fraværende fra astrocytter. (F) procent af RORβ-Tom celler, der udtrykker den neuronale markør NeuN i spinal sektioner af RORβCre; R26Tom mus og RORβCre musene injiceret med AAV-flex-Tom virus. (G-H) Immunfarvning på rygmarven sektioner af (G) RORβCre; R26Tom mus og (H) RORβCre musene injiceret med AAV-flex-Tom virus viser colocalization mellem RORβ-Tom neuroner og hæmmende markør Pax2 eller den excitatoriske markør Lmx1b. (I) procent af RORβ-Tom neuroner udtryk for Lmx1b og Pax2 i RORβCre; R26Tom mus og RORβCre musene injiceret med AAV-Tom virus. Data repræsenteres som gennemsnit ± SEM. Data er fra 2-3 mus og 1-3 dele per mus. Skala søjler repræsenterer 100 µm (B, E) og 20 µm (C, E i høj forstørrelse billeder, G og H). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Variabel | ØNSKEVÆRDI | Enhed |
| varme (H) | 450 | -(værdi proportional med styrken af den udstrålede varme) |
| tvinge foreløbige pull (F(TH)) | 20 | -(værdi proportional med spænding for at tvinge coil) |
| afstand tærskel (s(TH)) | 25 | 0,12 mm |
| forsinkelse heatstop (t(H)) | 30 | 0,5 ms |
| afstand heatstop (s(H)) | 0 | 0,12 mm |
| forsinkelse pull 1 (t(F1)) | 200 | 0,5 ms |
| tvinge pull 1 (F1) | 300 | -(værdi proportional med spænding for at tvinge coil) |
| afstand pull 2 (s(F2)) | 30 | 0,12 mm |
| tvinge pull 2 (F2) | 600 | -(værdi proportional med spænding for at tvinge coil) |
| justere (annonce) | 0 | - |
Tabel 1: Puller indstillinger
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Intraspinal injektion af AAVs kan blive en kraftfuld teknik i et forskningslaboratorium, gør det muligt for analysen af spinal celler med en høj tidsmæssige og rumlige opløsning. Denne protokol giver transduktion af de tre vigtigste spinale segmenter innerveres af sensoriske neuroner udvide deres perifere axoner til hindlimb. Transducing tre segmenter producerer robuste og reproducerbare adfærdsmæssige data. Det giver også mulighed for afprøvning af en større sensoriske område end muligt efter en enkelt intraspinal injektion. For eksempel, den samme indsprøjtning ordning giver mulighed for prøvning pote (von Frey, Hargreaves, etc.) og lår (intradermale indsprøjtninger, mekanisk-receptor stimulation), dermed udvide de sensoriske modaliteter, der kan adresseres.
Kritiske trin:
Der er flere trin afgørende for at opnå robuste morfologiske og adfærdsmæssige data og for at undgå artefakter. Udformningen af den virale vektor og valget af promotor og serotype kan have en stærk indvirkning på transduktion effektivitet og omfanget af det transduced område, og derfor på adfærdsmæssige resultater (for detaljer om viral spredning og transduktion effektivitetsgevinster, se 12). høj kvalitet viral præparater er forpligtet til at minimere bivirkninger af indsprøjtning af virus, som kan opstå, hvis forurenende stoffer eller celle debris er til stede i virus løsningen. Den operation, der er nødvendige for at injicere rygmarven har skal gennemføres med stor omhu for at undgå morfologiske og adfærdsmæssige artefakter indført ved operationen. Særlig opmærksomhed er påkrævet ved håndtering rygmarven, især under laminektomi og under perforation af dura med nålen. Skader på rygmarven kan forringe somatiske fornemmelser og motoriske koordination af mus, dermed at kompromittere nogen planlagte adfærdsmæssige eksperimenter. Derudover er det vigtigt at samle sprøjten grundigt. Forkert montering eller tilstopning af mikropipette kan hæmme eksperimentet. Spinal væv på injektionsstedet har undersøges i slutningen af forsøget for at kontrollere succes injektion og transduktion af det injicerede område og udelukke overdreven vævsskade som følge af operationen. Denne protokol har brugt viral titers en koncentration på 1 x 1013 GC/mL uden tilsyneladende toksicitet, endnu højere titers af virus kan blive giftig for nogle tidspunkt. Derudover vil toksicitet højst sandsynligt også afhænge af protein kodet af den injicerede AAV.
Ændringer:
Flere parametre i protokollen kan tilpasses til neuronal befolkning og problemformulering skal undersøges. Injektion af 300 nL virus løsning i en dybde på 300 µm fører til transduktion af neuroner i hele, og overvejende i den dorsale horn. Hvis formålet er at målrette neuroner yderligere ventrale, kan dybde justeres. Injektion af større mængder af virus (vi har brugt op til 500 nL pr. injektion) vil føre til en større spredning i dorsoventral og rostrocaudal retninger. Dette kan være gavnligt at opnå målretning af ekstra celler i rostrocaudal grad, men kan øge spillover til de kontralaterale side, som kan hæmme brugen af de kontralaterale side som en intern kontrol. Derudover øges den dorsoventral udstrækning af transduced celler, som kan være den ønskede virkning eller bør undgås. Injektion af 300 nL i en dybde på 300 µm undgået side effekter på motorisk kontrol i GlyT2::Cre mus, mens indsprøjtning af 500 nL eller injektion på en større dybde lejlighedsvis produceret motor fænotyper, som spastisk udvidelse af hindlimb (data ikke vist). Tilførsel af mindre mængder kan bruges til at begrænse målretning til endnu mere afgrænsede områder5. Viral titer er en anden parameter, der kan ændres og bør faktisk bestemmes for hver virus. For bakterielle toksiner, som den højeffektive DTA, kan lav udtryk niveauer være tilstrækkelig til at fremkalde den ønskede virkning, for fluorescerende reportere og DREADDs, højere titers kan blive noedvendigt for påviselige eller effektive udtryk.
Betydningen af metoden med hensyn til eksisterende/Alternative metoder:
Til dato, har hovedsagelig to teknikker været brugt funktionelt afhøre de neuronale kredsløb kræves for transmission af sensoriske signaler. Mange forskere har brugt intraspinal injektioner af rAAV kodning for reporter og effektor proteiner til at udtrykke recombinase mus for at mærke og manipulere spinal neuronal delpopulationer. Intraspinal injektion som en teknik til at manipulere spinal celler har tidligere været beskrevet15,16. Den protokol, der er skitseret her var specialdesignet til transduce genetisk mærket neuroner i tre på hinanden følgende segmenter af lumbal rygmarven samtidig minimere kirurgisk manipulation. Dette opnås ved at placere to af de tre indsprøjtninger i intervertebrale rummet rostralt og caudale T13 ryghvirvler og andet, ved at bore et hul i T13 for den tredje indsprøjtning i stedet for at fjerne ryghvirvler. De målrettede L3-L5 segmenter er det vigtigste opsigelse område af sensoriske neuroner, der innerverer hindlimb. Vi demonstrere, at denne type af transduktion er tilstrækkelig til at producere robust adfærdsmæssige ændringer efter manipulation af glycinergic neuroner og tyder på, at det er egnet til analyse af en række forskellige genetisk mærket spinal neuroner.
Den anden teknik, der har været anvendt for at manipulere funktion af spinal neuron delmængder er baseret på krydse transgene dyr. Her, har mus giver udtryk for en recombinase i et bestemt undersæt af spinal neuroner skulle krydses reporter mus for at opnå udtryk for at vælge den ønkede markør eller effektor protein i de respektive neuronal delmængde17,18, 19. for at illustrere nogle af de forskelle, der kan opstå, når man sammenligner resultaterne opnået ved hjælp af reporter mus eller intraspinal virus injektioner vi krydsede RORβCre knock-i dyr til en Cre-afhængige reporter mus eller injiceres RORβ CRE mus med en Cre-afhængige reporter rAAV. Vi sammenlignede reporter gen expression fremstillet af rAAV til reporter gen expression fremstillet i RORβCre; R26Tom mus. Reporter gen expression fremstillet af intraspinal injektion af en Cre-afhængige rAAV var begrænset til neuroner i rygmarven, mens R26Tom reporter mus-fremkaldte tdTomato udtryk er også fundet i astrocytter. Dette tyder på, at RORβ udtrykkes forbigående i astrocytter. Ligeledes Gutierrez-Mecinas et al. fandt en mere begrænset reporter udtryk (rumligt og celletype specifikke) efter viral injektion i forhold til mus-fremkaldte reporter udtryk i Tac1Cre mus20. Ved hjælp af intraspinal injektioner af rAAV reporter i rygmarven af voksen mus, kan reporter og/eller effektor genekspression effektivt begrænses til befolkningen i celler, der udtrykker genet i voksen og dermed undgå rekombination/udtryk i disse befolkninger med tidligere forbigående genaktivitet.
En anden primære fordel af intraspinal rAAV injektioner er evnen til at begrænse udtrykket af gener rAAV-kodet til injektionsstedet. I Transgene mus, er Cre driver-medieret udtryk ofte ikke kun fundet i de neuronale delpopulation af interesse, men også i andre populationer i nervesystemet. Dymecki og kolleger samt grupper af Ma og Goulding, har udviklet elegante måder at bruge stilling reporter mus-baserede tilgange, undgå rekombination i dele af nervesystemet, der forbliver uforandret17, 18,19,21,22,23. Bruge knock-i mus til at opnå udtryk for markør eller effektor proteiner kan også antages for at være mindre variabel, da der er kun én genomisk kopi af de respektive udtryk kassette pr. celle og udtryk kassette er til stede i alle celler i det pågældende område . I modsætning hertil er tilstedeværelsen af en respektive udtryk kassette og også kopi antal udtryk kassetten efter viral transduktion er afhængig af transduktion effektivitet, som kan variere fra celle til celle, fra injektion til injektion, og afhænger af den virus masse. Endelig, den største ulempe ved virus-medieret genekspression over traditionelle genetiske metoder er behovet for kirurgi. Kirurgi-medieret skade/betændelse kan påvirke neuroner og kredsløb direkte. Optagelse af kontrol mus, der har gennemgået den samme kirurgi er derfor obligatorisk.
Fremtidige ansøgninger:
Intraspinal injektion kan bruges til at analysere og manipulere nogen genetisk identificerede spinal delpopulation gennem overekspression af markør og effektor proteiner. I fremtiden er det derfor sandsynligt, at mange vil vedtage denne teknik til at studere neuronal populationer i deres særlige fokus. Desuden, foruden ved hjælp af intraspinal injektion af rAAVs for at opnå overekspression af eksogene effektor proteiner, denne teknik kan også bruges til tavshed eller overexpress endogene proteiner og derfor at studere funktionen af enhver given gen med høj fysisk og tidsmæssige opløsning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi takker Hanns Ulrich Zeilhofer for generøst støtter dette arbejde. Hendrik Wildner blev støttet af Olga Mayenfisch foundation. Vi takker Carmen Birchmeier for Lmx1b antistof.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| micropipette puller: DMZ-Universal-Electrode-Puller | Zeitz | NA | |
| anesthesia unit: Oxymat3 oxygen concentrator | Weinmann | NA | |
| anesthesia unit: VIP 3000 Veterinary Vaporizer | Midmark | NA | |
| Heat mat: Mio Star Thermocare 100 | Migros | 717614700000 | |
| Electric shaver | Philips | BT9290 | |
| surgical microscope (OPMI pico) | Zeiss | NA | |
| Small animal stereotaxic apparatus | Kopf | NA | |
| Neurostar StereoDrive (optional) | Neurostar | NA | |
| Model 51690 Cunningham mouse spinal adaptor | Harvard Apparatus | 72-4811 | |
| PHD Ultra syringe pump with nanomite | Harvard Apparatus | 70-3601 | |
| Hamilton 701 RN 10 μl glass microliter syringe | Hamilton | 7635-01 | |
| Hamilton Removable needle (RN) compression fitting 1 mm | Hamilton | 55750-01 | |
| fine dentistry drilling apparatus: Osada success 40 | Osada | OS-40 | |
| spherical cutter, 0.5mm | Busch | 12001005B | |
| electronic von Frey anesthesiometer | IITC | 23905 | |
| flexible von Frey hairs | IITC | #7 | |
| LSM710 Pascal confocal microscope | Zeiss | NA | |
| 0.8 NA × 20 Plan-apochromat objective | Zeiss | NA | |
| 1.3 NA × 40 EC Plan-Neofluar oil-immersion objective | Zeiss | NA | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Tools | |||
| Scalpel Handle #4, 13cm | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Adson forceps, 1 x 2 teeth, 12 cm | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Friedman-Pearson rongeurs, curved, 0.7 mm cup | Fine Science Tools | 16121-14 | |
| Dumont #2 laminectomy forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
| Olsen-Hegar needle holders, serrated, 8.5 mm clamp length | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| Fine forceps #5 | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables and Chemicals | |||
| Thin-wall glass capillary, 1mm outside diameter | World Precision Instruments | TW 100-3 | |
| Syringes (1, 5 and 20 ml) | B. Braun | (9166917V, 4606051V, 4606205V) | |
| 26G beveled needle | B. Braun | 4665457 | |
| Sterile scalpel blades | B. Braun | BB523 | |
| Surgical sutures Safil Quick+ 4/0, absorbable | B. Braun | C1046220 | |
| Surgical sutures Premilene 5/0, non-absorbable | B. Braun | C0932191 | |
| Sterile PBS or saline (0.9%) | NA | ||
| Ethanol, 70% (disinfectant) | NA | ||
| Iodine solution (e.g. Braunol) | B. Braun | 18380 | |
| Anaesthetics (e.g. Attane isoflurane) | Provet | 2222 | |
| Aldasorber | Provet | 333526 | |
| analgesics (e.g. buprenorphine: temgesic) | Indivior | GTIN: 7680419310018 | |
| Ophthalmic ointment (e.g. vita-pos) | Pharma medica | GTIN: 4031626710635 | |
| Cotton swabs (e.g. from) | IVF Hartmann | 1628100 | |
| Facial tissues (e.g. from) | Uehlinger AG | 2015.10018 | |
| Superfrost plus microscope slides | ThermoScientific | J1800AMNZ | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| C57BL/6J mice (wildtype) | The Jackson Laboratory | RRID:IMSR_JAX:000664 | |
| Rorbtm1.1(cre)Hze/J mice (RORβCre) | The Jackson Laboratory | RRID:IMSR_JAX:023526 | |
| Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J mice (R26Tom) | The Jackson Laboratory | RRID: IMSR_JAX:007914 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Viral vectors | |||
| AAV1.CB7.CI.eGFP.WPRE.rBG (AAV1.CAG.eGFP) | Penn Vector Core | AV-1-PV1963 | |
| AAV1.CAG.flex.eGFP.WPRE.bGH (AAV1.CAG.flex.eGFP) | Penn Vector Core | AV-1-ALL854 | |
| AAV1.CAG.flex.tdTomato.WPRE .bGH (AAV1.CAG.flex.tdTomato) |
Penn Vector Core | AV-1-ALL864 | |
| AAV1.EF1a.flex.DTA.hGH (AAV1.EF1a.flex.DTA) | Penn Vector Core | Custom production | |
| AAV1.hSyn.DIO.hM3D(Gq)-mCherry.hGH (AAV.flex.hM3D(Gi)) | Penn Vector Core | Custom production | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmids | |||
| pAAV.hSyn.flex.hM3D(Gq)-mCherry | Addgene | 44361 | |
| pAAV.EF1α.flex.hChR2(H134R)-eYFP | Addgene | 20298 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacteria | |||
| MDS42 | ScarabGenomics | ||
| Stbl3 | ThermoScientific | C737303 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Quiagen | 12362 | |
| NucleoBond PC 500 | Machery & Nagel | 740574 | |
| clozapine-N-oxide (CNO) | Enzo Life Sciences | BBL-NS105-0025 | |
| chloroquine diphosphate salt | Sigma | C6628 | |
| histamine | Sigma | H7125 | |
| Dapi | Invitrogen | D3571 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies (dilution) | |||
| Rabbit anti-GFP (1:1000) | Molecular Probes | RRID:AB_221570 | |
| Rabbit anti-NeuN (1:3000) | Abcam | RRID:AB_10711153 | |
| Goat anti-Pax2 (1 : 200) | R & D Systems | RRID:AB_10889828 | |
| Guinea pig anti-Lmx1b (1 : 10 000) | Dr Carmen Birchmeier | Muller et al. 2002 | |
| Rabbit anti-GFAP (1 : 1000) | DakoCytomation | RRID:AB_10013382 | |
| Secondary antibodies raised in donkey (1:800) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | NA |
References
- Goulding, M., Bourane, S., Garcia-Campmany, L., Dalet, A., Koch, S. Inhibition downunder: an update from the spinal cord. Curr Opin Neurobiol. 26, 161-166 (2014).
- Todd, A. J. Neuronal circuitry for pain processing in the dorsal horn. Nat Rev Neurosci. 11 (12), 823-836 (2010).
- Sandkuhler, J. Models and mechanisms of hyperalgesia and allodynia. Physiol Rev. 89 (2), 707-758 (2009).
- Zeilhofer, H. U., Wildner, H., Yevenes, G. E. Fast synaptic inhibition in spinal sensory processing and pain control. Physiol Rev. 92 (1), 193-235 (2012).
- Azim, E., Jiang, J., Alstermark, B., Jessell, T. M. Skilled reaching relies on a V2a propriospinal internal copy circuit. Nature. 508 (7496), 357-363 (2014).
- Cui, L., et al. Identification of Early RET+ Deep Dorsal Spinal Cord Interneurons in Gating Pain. Neuron. 91 (6), 1413 (2016).
- Foster, E., et al. Targeted ablation, silencing, and activation establish glycinergic dorsal horn neurons as key components of a spinal gate for pain and itch. Neuron. 85 (6), 1289-1304 (2015).
- Francois, A., et al. A Brainstem-Spinal Cord Inhibitory Circuit for Mechanical Pain Modulation by GABA and Enkephalins. Neuron. 93 (4), 822-839 (2017).
- Peirs, C., et al. Dorsal Horn Circuits for Persistent Mechanical Pain. Neuron. 87 (4), 797-812 (2015).
- Petitjean, H., et al. Dorsal Horn Parvalbumin Neurons Are Gate-Keepers of Touch-Evoked Pain after Nerve Injury. Cell Rep. 13 (6), 1246-1257 (2015).
- Zhang, Y., et al. Identifying local and descending inputs for primary sensory neurons. J Clin Invest. 125 (10), 3782-3794 (2015).
- Haenraets, K., et al. Spinal nociceptive circuit analysis with recombinant adeno-associated viruses: the impact of serotypes and promoters. J Neurochem. , (2017).
- Abraira, V. E., et al. The Cellular and Synaptic Architecture of the Mechanosensory Dorsal Horn. Cell. 168 (1-2), 295-310 (2017).
- Wildner, H., et al. Genome-wide expression analysis of Ptf1a- and Ascl1-deficient mice reveals new markers for distinct dorsal horn interneuron populations contributing to nociceptive reflex plasticity. J Neurosci. 33 (17), 7299-7307 (2013).
- Inquimbert, P., Moll, M., Kohno, T., Scholz, J. Stereotaxic injection of a viral vector for conditional gene manipulation in the mouse spinal cord. J Vis Exp. (73), e50313 (2013).
- Kohro, Y., et al. A new minimally-invasive method for microinjection into the mouse spinal dorsal horn. Sci Rep. 5, 14306 (2015).
- Bourane, S., et al. Gate control of mechanical itch by a subpopulation of spinal cord interneurons. Science. 350 (6260), 550-554 (2015).
- Bourane, S., et al. Identification of a spinal circuit for light touch and fine motor control. Cell. 160 (3), 503-515 (2015).
- Duan, B., et al. Identification of spinal circuits transmitting and gating mechanical pain. Cell. 159 (6), 1417-1432 (2014).
- Gutierrez-Mecinas, M., et al. Preprotachykinin A is expressed by a distinct population of excitatory neurons in the mouse superficial spinal dorsal horn including cells that respond to noxious and pruritic stimuli. Pain. 158 (3), 440-456 (2017).
- Awatramani, R., Soriano, P., Rodriguez, C., Mai, J. J., Dymecki, S. M. Cryptic boundaries in roof plate and choroid plexus identified by intersectional gene activation. Nat Genet. 35 (1), 70-75 (2003).
- Kim, J. C., et al. Linking genetically defined neurons to behavior through a broadly applicable silencing allele. Neuron. 63 (3), 305-315 (2009).
- Kim, J. C., Dymecki, S. M. Genetic fate-mapping approaches: new means to explore the embryonic origins of the cochlear nucleus. Methods Mol Biol. 493, 65-85 (2009).
