Summary
Intraspinal injectie van recombinase afhankelijk recombinante adeno-associated virus (rAAV) kan worden gebruikt om te manipuleren alle genetisch gelabelde celtype in het ruggenmerg. Hier beschrijven we hoe transduce van neuronen in de dorsale Hoorn van het lumbale ruggenmerg. Deze techniek maakt functionele ondervraging van het subtype gemanipuleerde neuron.
Abstract
Selectieve manipulatie van spinale neuronale subpopulaties is hoofdzakelijk bereikt door twee verschillende methoden: 1) Intersectional genetica, waarbij dubbele of driedubbele transgene muizen worden gegenereerd met het oog op een selectieve uitdrukking van een verslaggever of effector gen (bijvoorbeelduit de Rosa26 locus) in de gewenste spinale bevolking. 2) intraspinal injectie van Cre-afhankelijke recombinante adeno-associated virus (rAAV); Hier worden Cre-afhankelijke AAV vectoren codering voor de verslaggever of effector gen keuze ingespoten in het ruggenmerg van muizen uiting van Cre recombinase in de gewenste neuronale subpopulatie. Dit protocol beschrijft hoe te genereren van Cre-afhankelijke rAAV vectoren en hoe transduce van neuronen in de dorsale Hoorn van het lumbale ruggenmerg segmenten L3-L5 met rAAVs. Als de lumbale spinale segmenten L3-L5 zijn geïnnerveerd door die perifere sensoriële neuronen die sensorische informatie van de hindlimbs zenden, kunnen spontane gedrag en reacties op zintuiglijke tests toegepast naar de stuk ipsilaterale aan de zijkant van de injectie worden geanalyseerd om de functie van de gemanipuleerde neuronen in de sensorische verwerking ondervragen. We bieden voorbeelden van hoe deze techniek kan worden gebruikt voor het analyseren van genetisch gedefinieerd deelverzamelingen van ruggenmerg neuronen. De belangrijkste voordelen van virus-gemedieerde transgenic expressie in transgene muizen Cre in vergelijking met klassieke verslaggever transgenic muis-geïnduceerde expressie zijn de volgende: 1) verschillende Cre-afhankelijke rAAVs codering van verschillende verslaggever of effector eiwitten kunnen in een enkele Cre transgene lijn, dus het overwinnen van de noodzaak te creëren verschillende meerdere transgene muis lijnen geïnjecteerd. 2) intraspinal injectie beperkt manipulatie van Cre-uiten cellen op de injectieplaats en de tijd na de injectie. De belangrijkste nadelen zijn: 1) de genexpressie verslaggever van rAAVs is meer variabele. 2) chirurgie is vereist voor de transduce van het ruggenmerg neuronen van belang. Welke van de twee methoden meer geschikt is, hangt af van het neuron bevolking en onderzoek vraag worden aangepakt.
Introduction
Het dorsale ruggenmerg is essentieel voor de uitwisseling van informatie tussen de periferie van het lichaam en de hersenen. Zintuiglijke prikkels zoals warmte, koude, aanraking, of schadelijke stimuli worden gedetecteerd door gespecialiseerde perifere neuronen, die deze informatie voor de neuronen van de dorsale Hoorn van het ruggenmerg. Hier, een complex netwerk van remmende en excitatory interneuronen moduleert en uiteindelijk de sensorische informatie relais via spinale projectie neuronen te supraspinal1,2sites. De berekeningen uitgevoerd door spinale inter- en projectie neuronen gate zintuiglijke informatie, dus bepalen welke informatie wordt onderdrukt of doorgegeven bij welke intensiteit. Wijzigingen in de integratie van sensorische stimuli, zoals een gewijzigd evenwicht tussen inhibitie en excitatie, kunnen leiden tot sensorische stoornissen zoals overgevoeligheid of allodynia (pijnlijke gewaarwordingen na normaal niet-pijnlijke stimulatie). Deze wijzigingen worden beschouwd als dat de onderliggende oorzaak van verschillende chronische pijn staat3,4. Spinale circuits zijn dus van groot belang zijn bij de verwerking van zintuiglijke en bijgevolg in de perceptie van een organisme milieu en zelf. Met de recente komst en combinatie van moleculaire, genetische, en chirurgische technieken waarmee de precieze manipulatie van genetisch geïdentificeerde spinale neuron subpopulaties, beginnen wetenschappers nu te begrijpen van de onderliggende spinale circuits verantwoordelijk voor de verwerking van de afzonderlijke zintuiglijke modaliteiten.
Intraspinal injectie van rAAV in wild-type of transgene muizen heeft bijgedragen aan de manipulatie, analyse en begrip van de functie van specifieke deelverzamelingen van ruggenmerg neuronen5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11. deze techniek maakt het mogelijk de levering van marker eiwitten (zoals GFP / GFP fusion eiwitten), verslaggever eiwitten (zoals GCaMP) of effector eiwitten (zoals bacteriële toxines, channelrhodopsin of Farmacogenetische receptoren) in een ruimtelijk beperkte wijze ruggenmerg neuronen. Lokale injectie van Cre-afhankelijke rAAVs in transgene muizen uiting van Cre recombinase in een specifieke subset van ruggenmerg neuronen kan de specifieke analyse van de respectieve neuronale bevolking. We hebben gebruikt deze techniek te etiketteren, lasertherapie, remmen of spinale glycinergic neuronen die aantonen dat zij zijn een essentieel onderdeel van de spinal gate beheersing van pijn en jeuk van transmissie7activeren. In deze experimenten, intraspinal injectie van Cre-afhankelijke rAAV in GlyT2::Cre muizen ingeschakeld de selectieve manipulatie van glycinergic neuronen in de lumbale ruggemerg. Gelijktijdige manipulatie van supraspinal circuits waarin glycinergic neuronen cruciaal voor de overleving van het dier kan worden vermeden.
Terwijl een intraspinal injectie van rAAVs infectie aan de plaats van injectie beperkt, kan virale transductie optreden niet alleen in lokale neuronen, maar ook in neuronen die verbinding met de injectieplaats via axonale projecties maken. De laatste wordt vaak gebruikt om trace CNS gebieden leveren van neuronale informatie aan een bepaalde kern in de hersenen. De besmetting van axonale projecties, maar ook kan een storende factor wanneer een gedefinieerde populatie van neuronen zal worden bestudeerd op een bepaalde site. Om deze kwesties te behandelen, hebben we onlangs een uitgebreide analyse van AAV serotypen en expressie cassettes te identificeren serotypes en initiatiefnemers die kunnen worden gebruikt om te minimaliseren of maximaliseren retrograde transductie uitgevoerd. In het kader van dit specifieke onderzoek in spinale circuits geanalyseerd wij het vermogen van verschillende serotypes en initiatiefnemers om retrogradely transduce neuronen in de achterwortelganglia, bevatten (DRG), de rostraal ventromediale medulla (RVM) en de Somatosensorische cortex 12. de techniek beschreven in dit protocol kan daarom worden gebruikt voor het analyseren van ruggenmerg neuronen op de injectieplaats of analyseren van projectie neuronen die inbreng op de ingespoten site van het ruggenmerg. In het protocol beschreven hier, worden drie injecties van rAAV in de linker kant van het lumbale ruggemerg uitgevoerd zodat transductie van neuronen in de drie lumbale segmenten (L3-L5). De L3-L5 segmenten ontvangen de meerderheid van de sensorische input het stuk ipsilaterale om de injectieplaats. Wij laten zien dat functionele manipulatie van genetisch gelabelde neuronen in L3-L5 voldoende te roepen robuuste gedragsveranderingen, waardoor het functionele bewijs voor de functie van de circuit van dergelijke een genetisch gelabelde neuron-subtype.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierproeven werden goedgekeurd door de Zwitserse kantonnale Veterinair Bureau (Zürich) en zijn overeenkomstig en naleving van alle relevante regelgevend en institutioneel richtsnoeren.
Opmerking: Alle materialen samen met respectievelijke fabrikanten en/of leveranciers worden weergegeven in de Tabel van materialen.
1. generatie van Cre-afhankelijke AAV vectoren
Opmerking: Een verscheidenheid van Cre-afhankelijke vectoren met verschillende initiatiefnemers kan worden gekocht (Zie Tabel van materialen) of, als de gewenste expressie constructie niet beschikbaar is, het kan worden gegenereerd door aanpassing van bestaande AAV constructies. Opmerking, de promotor en serotype kunnen een invloed hebben op de verspreiding van virale transductie (Zie 12). Het eerste deel van dit protocol beschrijft kort de generatie van twee verschillende Cre-afhankelijke AAV vectoren geschikt voor winst en verlies van functie experimenten, respectievelijk.
-
Farmacogenetische activering (winst van functie)
- Bestel pAAV.hSyn.flex.hM3D (Gq)-mCherry (Zie Tabel of Materials) voor ontwerper receptoren uitsluitend geactiveerd door "designer drugs" (DREADD)-gemedieerde activering.
- Na ontvangst van de bacteriële steek cultuur, streak uit bacteriën op LB platen (bacteriologische-grade agar opgelost in vloeistof Luria Bertani) aangevuld met de juiste antibioticum. Incubeer gedurende een nacht bij 37 ° C en een één kolonie te halen op de volgende dag.
Opmerking: Plasmiden met AAV vector genoom kunnen unstable en recombinatie van het virale genoom, vooral binnen de virale omgekeerde terminal herhaalt (ITR), kan zich voordoen tijdens de versterking in E. coli. Wij stellen voor met behulp van recA-deficiënte /-onderdrukt dergelijke stammen als MDS42 of Stbl3 om te voorkomen dat binnen de plasmide die het genoom van AAV recombinatie. - Versterken van de bacteriën na de instructies van de leverancier van de gekozen DNA-Maxi-Kit en hoge kwaliteit plasmide DNA met een commercieel beschikbare DNA-Maxi-Kit te bereiden (b.v., Zie Tabel van materialen). Uitvoeren van een kwaliteitscontrole van de plasmide DNA bereiding door te verifiëren van de integriteit en de identiteit van de plasmide DNA via beperking digest van een aliquoot deel van de plasmide DNA.
Opmerking: Er zijn erkenning sites voor de beperking endonuclease SmaI binnen de ITRs. Een samenvatting van de SmaI in de kwaliteitscontrole om te controleren of de integriteit van de ITRs opnemen. - Het DNA verzenden een virale vector kern faciliteit om het produceren van hoge kwaliteit rAAV.
Opmerking: Hoge titer, virale preps van hoge kwaliteit zijn van cruciaal belang voor het vermijden van verstorende fenotypen veroorzaakt door verontreinigingen in de virale prep. Wij adviseren daarom hebbend van de rAAV van keuze geproduceerd in een gevestigde vector kern faciliteit, tenzij de AAV-productie goed ingeburgerd in het laboratorium is.
-
Ablatie (verlies van functie)
Opmerking: Bacteriële toxines of toxine-receptoren kunnen worden gebruikt om te bemiddelen cel ablatie of neuronale zwijgen. Wij hebben pAAV.EF1α.flex.DTA aan uitdrukkelijke difterie toxine fragment A (DTA) gegenereerd op een Cre-afhankelijke manier.- Voor het genereren van een Cre-afhankelijke virale vector, kies een Cre-afhankelijke vector met een geschikt promotor (bijvoorbeeld, pAAV.EF1α.flex.hChR2(H134R)-eYFP). Versterken van de codering volgorde van keuze (bijvoorbeeldDTA) door de polymerase-kettingreactie met inleidingen die AscI en NheI of compatibel beperking endonuclease erkenning sites in hun overhangen opnemen (Zie Foster et al. 7)
- Beperking digests van de vector DNA met standaard moleculaire biologietechnieken, uitvoeren (pAAV.EF1α.FLEX.hChR2(H134R)-eYFP) en van de PCR-versterkte plaats (NheI-DTA-AscI) met de beperkingsendonucleases AscI en NheI. De gezuiverde fragmenten afbinden.
- Transformeren van de reactie van de afbinding in geschikte bacteriën, volgens het protocol gegeven door de leverancier van de bevoegde bacteriën van keuze en de bacteriën op LB platen plaat. Gebruik van recA-deficiënte /-onderdrukt stammen, zoals MDS42 of Stbl3, voor het klonen en verdere versterking van de plasmide DNA.
- Op de dag na de transformatie, kies klonen en enten ze in LB medium aangevuld met de juiste antibiotica overnachtingen bij 37 ° C. Op de volgende dag, pak u plasmide DNA uit gekweekte bacteriën. Controleer of succesvol klonen door beperking geklaard en het rangschikken van de uitgepakte plasmide DNA.
- Versterken van hoge kwaliteit, bacterieel plasmide DNA (zie stap 1.1.3). Versterkte DNA verzenden een virale vector kern faciliteit voor virus productie.
2. signaaltransductie van spinale cellen
- Bereiding van Virus-oplossing
Let op: Virussen besmettelijke reagentia zijn en moeten worden behandeld volgens de relevante richtlijnen. In de meeste gevallen kan rAAVs op bioveiligheidsniveau 1 (BSL1) worden beheerd.- Op de dag van de injectie, een voorraad aliquoot deel van het gewenste gezuiverde virus op ijs ontdooien en bewaar deze op ijs totdat direct vóór de injectie. Vermijd herhaalde bevriezen-ontdooien-cycli, omdat dit de effectieve titer van het virus verminderen zal.
Opmerking: Indien nodig, de ontdooide virus aliquoot kan worden bewaard bij 4 ° C tot 3 dagen. - Verdun de virusdeeltjes in steriele 0.9% NaCl of fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS).
Opmerking: De juiste titer afhankelijk van de experimentele doelstellingen en moet experimenteel worden bepaald. Een goede totaal virale lading is om te beginnen met 3 x 109 genoom kopieën (3.33x1012 van GC/mL, 3 x 300 nL geïnjecteerd). Nemen overtollige en sommige verlies tijdens het laden van het capillair in account, ongeveer 2,5 µL van virus oplossing nodig zal zijn voor elke muis.
- Op de dag van de injectie, een voorraad aliquoot deel van het gewenste gezuiverde virus op ijs ontdooien en bewaar deze op ijs totdat direct vóór de injectie. Vermijd herhaalde bevriezen-ontdooien-cycli, omdat dit de effectieve titer van het virus verminderen zal.
- Voorbereiding van micropipetten voor Intraspinal injecties
- "Pull" thin-muur glazen capillairen (buitendiameter 1 mm) op een trekker van de micropipet aan het maken van een ~5.5 mm lang, ondiep schacht. Gebruik een 3.0 mm kachel gloeidraad en instellingen van programma 00 met P(A) aangepast zoals in tabel 1.
Opmerking: Trekken kan worden gedaan op voorhand. De haarvaten getrokken moeten worden opgeslagen in een gesloten container Modeling klei zodat er geen stof, die later de micropipet kon verstoppen. Autoclaaf van micropipetten is niet nodig. - Clip de schacht van de getrokken capillair met een laminectomie Tang tot een lengte van ongeveer 4.5 tot en met 5 mm tot het maken van een opening met een binnendiameter van 25-35 μm tip. Met behulp van een microscoop met een schaal micrometer, meten de binnendiameter van verschillende micropipetten een gevoel voor hoe groot de opening moet worden, of -maatregel voor elke micropipet te krijgen.
Opmerking: Een kleine tip kan leiden tot verstopping; een grotere tip kan weefselschade en moeilijkheden te doordringen van het ruggenmerg.
- "Pull" thin-muur glazen capillairen (buitendiameter 1 mm) op een trekker van de micropipet aan het maken van een ~5.5 mm lang, ondiep schacht. Gebruik een 3.0 mm kachel gloeidraad en instellingen van programma 00 met P(A) aangepast zoals in tabel 1.
- Voorbereiding van chirurgische Setup en Tools
- Zorgen dat de apparatuur is schoon en klaar om te worden gebruikt. Het werkgebied door af te vegen met 70% ethanol desinfecteren en steriliseren van instrumenten door autoclaaf of hen te ontsmetten. Laat niet een ontsmettingsmiddel op de microliter spuit die schadelijk zou zijn voor de virale vector moet worden gebruikt.
- Narcose en voorbereiding van het dier voor chirurgie
Opmerking: De totale duur van de operatie is 60-90 min.- Kies 6 - tot 10 - weken oude muizen ter vergemakkelijking van de chirurgische ingreep.
Opmerking: Als de proefopzet vereist, is de injectie van jongere of oudere dieren mogelijk. Elke stam en beide geslachten kunnen in beginsel worden gebruikt, maar dezelfde achtergrond stam (b.v., C57BL/6J) voor vergelijking van gedrag tussen verschillende transgene muis lijnen gebruiken. Als seks verschillen worden verwacht of om te worden onderzocht, het analyseren van mannetjes en vrouwtjes in aparte groepen. - Anesthesie met behulp van ~ 5% Isofluraan induceren. Plaats het dier in het stereotaxic frame op een warmte-mat en onderhouden van verdoving bij 1-2,5% Isofluraan (luchtstroom tarief 900 mL/min). Controleren van de ademhalingsfrequentie gedurende de operatie.
- Toepassing smeermiddel oog zalf om te voorkomen dat het drogen van het hoornvlies tijdens de operatie.
- Scheren van het dier terug en verwijder haar zorgvuldig met natte weefsels. Desinfecteren van de geschoren huid met jodiumoplossing en laat de huid drogen.
- Pijnstillende behandeling geven (bijvoorbeeld, 0,1-0,2 mg/kg buprenorfine subcutaan).
- Kies 6 - tot 10 - weken oude muizen ter vergemakkelijking van de chirurgische ingreep.
- Blootstelling van de wervelkolom op het niveau van de lumbale ruggemerg
Opmerking: Als gevolg van de differentiële ontwikkeling van het ruggenmerg en de wervelkolom, de respectieve niveaus niet zijn uitgelijnd, maar de lumbale ruggemerg segment L4 is op hetzelfde niveau als de thoracale wervel T13.- Zoek de meest caudal rib paar door Palperende langs de wervelkolom. Met behulp van een scalpel, maken een longitudinale cut van 1,5 tot 2,5 cm in de huid vanaf slechts rostraal tot het meest caudal rib-paar.
- Til de huid met een tang en het loskoppelen van de onderliggende spier met een schaar. Tijdens de operatie, houden de blootgestelde weefsels vochtig met steriele 0.9% NaCl.
- Met behulp van fijne pincet en kleine schaar, maken van een incisie in de volgende, dunne membraanachtig laag rechts naast de middellijn en het afgesneden van de spinous processen. Het staat los van de onderliggende paraspinous spier, maar gekoppeld aan de spinous processen.
- Identificatie van de wervels op het niveau van de lumbale ruggemerg
Opmerking: Zodra de wervelkolom wordt blootgesteld, de intertransverse ligamenten en de dorsale spinous processen zichtbaar moeten zijn. Verschillende anatomische bezienswaardigheden kunnen helpen bij het identificeren van de juiste wervel naar doel (figuur 1B).- Trek de huid terug naar de staart om de iliacale crest bloot te stellen. Op hetzelfde niveau, het meest caudal paar zichtbaar intertransverse ligamenten sluit zich aan bij de L6 spinous proces. Tellen achteruit in een caudal naar rostraal richting te identificeren van de wervel van belang.
- Palperen langs de wervelkolom. Het meest caudal rib paar ligt net rostraal van de wervel T13 en het bekkenbeen hip niveau is op het niveau van de wervel L6.
- Zoek de plek waar de pees langs de kant van de wervelkolom witste en meest mediale is. De wervel T13 ligt net rostraal. De lumbale ruggemerg segment L4 ligt op deze wervel.
- Fixatie van de wervelkolom en de blootstelling van de lumbale ruggemerg
- Plaats het dier op een kussen opgerold tissues aan het te verheffen tot de spinale klemmen van het stereotaxic frame.
- Vaststellen van de wervel doel om te voorkomen dat de bewegingen van de wervelkolom als gevolg van ademhaling. Voor dit doel, uitlijnen van de klemmen grenzend aan de target-wervel, één klem in positie vast en houdt de wervelkolom met een Adson Tang terwijl de vaststelling van de tweede klem.
Opmerking: De kolom moet loodrecht op het vlak van de injectie en stevig zodat het niet op druk van bovenaf verschuift. Indien nodig, kan een tweede paar van klemmen worden bevestigd aan de wervelkolom. In dit geval is het handig om de twee paren van klemmen aan de twee wervels grenzend aan de wervel doel vast te stellen. - Verwijder de paraspinous spier boven de wervels van belang. Met behulp van een scalpel, maken een parallelle insnijding net mediale aan de pezen die parallel aan de wervelkolom, evenals loodrechte insnijdingen rostraal en caudal de doel-wervel. Wees voorzichtig niet te snijden te diep. Scheur/knippen weg de spier met behulp van rongeurs. Het gebruik van pincet zo nodig te verwijderen weefsel resterende op de wervel of boven de dura in de lat. ruimte.
- In de lat. ruimte moet het dorsale bloedvat zichtbaar markering van de middellijn van het ruggenmerg. Voor unilaterale injecties, door een partiële laminectomie uit te voeren door het boren van een gat in het midden van de kant van de doelgroep van de wervel. Gebruik een fijne tandheelkunde boren apparatuur met een 0.5 mm sferische cutter en boor vooral zorgvuldig bij het naderen van het ruggenmerg. Verwijder eventuele resterende botfragmenten met een schuine naald van 26G bloot van het ruggenmerg.
- Met behulp van een schuine naald van 26G, perforate de dura in het geboorde gat, inzonderheid de lat. ruimte rostraal en caudal naar de doel-wervel, alle ongeveer 200 µm lateral aan de dorsale bloedvat. Cerebrospinale vloeistof moet worden ontsnappen in de gaten en het ruggenmerg moet worden iets bolling uit.
- Voorbereiding van de injectiespuit
Opmerking: De injectiespuit moet bereid onmiddellijk vóór het begin van de injectie te verminderen het risico van stofdeeltjes die verstopping van de micropipet.- Het monteren van de glazen viscometerbuizen op een microliter spuit met behulp van de verwisselbare naald Knelkoppeling kit. Zet de moer stevig vast om te zorgen voor een strakke en veilige pasvorm vast.
- Vul de spuit microliter met steriel gedistilleerd water en beginnen te drukken het uit met de zuiger.
Opmerking: Als er teveel weerstand zodat het water niet gemakkelijk uit de tip komt, de micropipet is waarschijnlijk geblokkeerd en moet worden uitgewisseld. - Monteer de spuit op een micromanipulator aangesloten op een elektronisch gestuurde microinjector. Wees voorzichtig niet aan te raken om het even wat met de micropipet.
- Met behulp van de microinjector, opstellen van ongeveer 1 µL van lucht naar het maken van een zeepbel tussen het water en het virus.
- Plaats een droplet 2.5 µL van virus oplossing op een stuk van paraffine film, zorgvuldig verplaatst u het uiteinde van de micropipet in de druppel met behulp van het stereotaxic frame en het opstellen. Vervolgens zorgvuldig pers afzien tot een beetje virus oplossing naar voren komt op het puntje.
- De spuit intrekken en, met behulp van een pen, markeren de micropipet met een schaal en Let op het niveau van de oplossing van het virus; Dit vergemakkelijkt het toezicht of de infusie vordert geprogrammeerd.
- Intraspinal injecties
- Beweegt het puntje van de micropipet boven één van de gaatjes in de dura en vervolgens naar beneden tot een kleine deuk in de dura is genoteerd. Te richten op de injectie aan de spinale dorsale hoorn, omlaag 500 µm in opeenvolgende stappen van 100 µm (snelheid 1 mm/s) en vervolgens 200 µm omhoog te voorzien van mechanische stabilisatie van het weefsel.
Opmerking: De uiteindelijke diepte van het uiteinde is 300 µm in dit geval, maar kan worden aangepast afhankelijk van het doelgebied.- Als het weefsel resistent tegen penetratie is, kan de micropipet worden vangen op de dura. In dit geval intrekken en enigszins naar het gat te bedekken of de naald opnieuw met de dura goed perforate voordat de penetratie-poging herhaald.
- De pomp om een injectie doelvolume van 300 Program nL met een snelheid van de injectie van 50 nL/min en druk op de startknop om te beginnen de infusie.
- Nadat de injectie is voltooid, controleert u de schaal om te zien of het virus niveau is gedaald en de micropipet, laat staan voor een extra 3 min om de druk te equilibreer langzaam ingetrokken de spuit.
- Herhaal stap 2.9.1.-2.9.3. voor de andere twee injectie sites.
- Beweegt het puntje van de micropipet boven één van de gaatjes in de dura en vervolgens naar beneden tot een kleine deuk in de dura is genoteerd. Te richten op de injectie aan de spinale dorsale hoorn, omlaag 500 µm in opeenvolgende stappen van 100 µm (snelheid 1 mm/s) en vervolgens 200 µm omhoog te voorzien van mechanische stabilisatie van het weefsel.
- Hechten en herstel
- De spinale klemmen en het kussen onder de muis verwijderen.
- Sluit de wond in lagen met onderbroken hechtingen zette, wordt de huid en de lagen van de oppervlakkige weefsel met absorbeerbare draadjes met niet-absorbeerbare draadjes. Breng jodium ontsmettingsmiddel op de sutured wond.
- Beëindigen van de narcose en het dier te verlaten op de mat van de warmte tot het herstelt voordat hij het terugkeerde naar haar kooi.
- Postoperatieve zorg
- De monitor van de gezondheid van het dier op de dag van de operatie, de volgende dag en dan elke 2-3 dagen. Zorgen dat het dier heeft een normale gang, een gezond uiterlijk (gewicht, ogen, bont en gedrag), en dat de wondgenezing.
- Pijnstillende behandeling blijven (bijvoorbeeld0,1-0,2 mg/kg buprenorfine subcutaan) zo nodig, drie maal per dag.
3. gedrags en morfologische Analyses
-
Gedragsanalyse
Opmerking: Toestaan dat dieren voor de respectieve Setup voor ten minste 30 minuten vóór aanvang van de metingen om hen aan te passen aan de nieuwe experimentele omgeving te laten.-
von Frey testen
- Plaats van dieren afzonderlijk in afzonderlijke compartimenten van ongeveer 10 cm x 10 cm op een metalen raster vloer.
- Het stimuleren van de plantaire oppervlak van de hindpaw ipsilaterale om de injectieplaats met een dynamische von Frey gloeidraad. Opmerking de kracht waartegen het dier zich zijn poot uit de stimulus terugtrekt.
- Herhaal dit vijf keer en berekening van de drempel van de gemiddelde terugtrekking uit de zes metingen voor elk dier.
-
PIN Prick Test
- Plaats van dieren in afzonderlijke compartimenten van ongeveer 10 cm x 10 cm op een metalen raster vloer.
- Stimuleren de plantaire oppervlak van de hindpaw ipsilaterale om de injectieplaats met een afgestompte 26-G naald zonder penetratie van de huid. Scoren gedrag als nul (geen reactie) of een (reactie).
- Herhaal 9 keer met tussenpozen van 3 minuten tussen stimulaties en berekenen percentage reactie van de 10 metingen voor elk dier.
-
Injectie van DREADD-ligand clozapine-N-oxide (CNO)
- Ontbinden CNO in dimethylsulfoxide (DMSO) maken van een stamoplossing van 0,2 mg/µL, die kan worden opgeslagen op kamertemperatuur.
- Op de dag van het experiment, Verdun stockoplossing in steriele 0.9% NaCl naar 0,2 µg/µL en injecteren 10 µL/g lichaamsgewicht intraperitoneally. Injecteren van controledieren met voertuig (0,2% DMSO in 0,9% NaCl).
Opmerking: Volgens ervaring, piek effecten op gedrag kunnen worden verwacht 1-3 h na injectie, en effecten moeten volledig verdwijnen na 24 h. In het geval van activering van de glycinergic neuronen, waargenomen gedrag minder pijn en jeuk reacties omvatten. Gedrag opgeroepen door DREADD-gemedieerde activering van de neuronen zal afhangen van de gerichte subset van ruggenmerg neuronen.
-
Injectie van Pruritogens voor het opwekken van de jeuk
- Los pruritogens in 0.9% NaCl oplossingen van 8 mg/mL (chloroquine) of 10 mg/mL (histamine). 2 uur na toediening van de CNO, injecteren 10 µL van pruritogen of voertuig oplossing subcutaan de plantaire oppervlak van de hindpaw ipsilaterale om de spinale injectieplaats. U kunt ook injecteren intradermaal de pruritogen in het kalf, dat één dag vóór om aversieve gedrag veroorzaakt door het scheren zelf heeft zijn geschoren.
-
Video-opnamen om spontane Nocifensive of Pruritogen-geïnduceerde jeuk gedrag te analyseren
- Plaats dieren individueel in transparante compartimenten (ongeveer 10 cm diameter) met een beetje van beddengoed uit hun respectieve huis-kooi op de grond.
- Videoband de dieren gedurende 5 minuten aan record spontane en gedurende 30 minuten om te registreren pruritogen-geïnduceerde gedrag. Het analyseren van de video's offline in bakken van 5 min.
-
Pijn Versus jeuk gedrag
- Observeren en noteer spier, likken en bijten gedrag.
Opmerking: Spier en likken van de betrokken site worden beschouwd als reacties op pijn, overwegende dat bijten wordt geassocieerd met jeuk. - Analyseren van video's op een normale snelheid, meten van de tijd dat de muis likken of bijten van de betrokken site of meten in slow-motion voor een nauwkeuriger onderscheid tussen likken en bijten reflexen. U kunt ook het aantal likken/bijten/spier bouts.
- Observeren en noteer spier, likken en bijten gedrag.
-
von Frey testen
-
Morfologische analyse
- Morfologische analyses van één tot drie weken na de injectie van het virus of aan het einde van een gedrags experiment uitvoeren.
Opmerking: Wij hebben gedetecteerd eGFP expressie zo spoedig 48 h na de injectie, maar vond ook dat de expressie aanzienlijk binnen de volgende dagen en zelfs weken verhoogt. Voor cellen met sterke verslaggever expressie, een week na incubatie (vanaf intraspinal injectie tot perfusie) kan volstaan. Voor cellen met zwakke transgenic expressie, virussen met zwakke initiatiefnemers of zwakkere fluorophores, een langere expressie mogelijk moet zorgen detecteerbare niveaus. -
Weefsel fixatie
- Perfuse elk transcardially van de muis, eerst met 20 ml ijskoud kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF) oplossing (NaCl 125 mM, NaHCO3 25 mM, NaH2PO4 1.25 mM, D-glucose 20 mM, KCl 2.5 mM en CaCl2 2 mM MgSO4 1 mM), dan met 100 mL van 4% ijskoude paraformaldehyde (in 0.1 M natriumfosfaat buffer, pH 7.4).
Let op: Paraformaldehyde is giftig en moet met zorg worden behandeld. - Onmiddellijk ontleden de lumbale ruggemerg, en na het monteren van het weefsel voor 2 h met 4% paraformaldehyde op ijs. Kort wassen de post vaste weefsel met 0,1 M fosfaatbuffer sodium (pH 7.4) en het vervolgens uit te broeden in een 25% sacharoseoplossing (in 0.1 M natriumfosfaat buffer, pH 7.4) 's nachts bij 4 ° C.
- Snijd het cryoprotected weefsel op 30 μm op een cryostaat en bevestig de secties op Microscoop dia's.
- Perfuse elk transcardially van de muis, eerst met 20 ml ijskoud kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF) oplossing (NaCl 125 mM, NaHCO3 25 mM, NaH2PO4 1.25 mM, D-glucose 20 mM, KCl 2.5 mM en CaCl2 2 mM MgSO4 1 mM), dan met 100 mL van 4% ijskoude paraformaldehyde (in 0.1 M natriumfosfaat buffer, pH 7.4).
-
Immunofluorescentie kleuring
- Na korte wast in PBS, toepassing 300 μL van het blokkeren van de oplossing (10% normale ezel serum in 0,3% Triton-PBS) op de secties gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Incubeer de dia's met 300 μL van de respectieve combinaties van primaire antilichamen in het blokkeren van de oplossing (Zie Tabel van materialen) over nacht bij 4 ° C. Wassen van de secties 3 keer voor 5 min in PBS.
- Laat de dia's met de respectieve combinaties van secundaire antilichamen in blokkerende oplossing gedurende 1 uur bij kamertemperatuur inwerken. Wassen van de secties 3 keer voor 5 min in PBS.
- Kort spoelen van de dia's in ddH2O en monteren van de coverslips met behulp van fluorescerende montage medium.
- Fluorescerende beelden met behulp van een confocal microscoop voorzien van een 20 x en een 40 x doelstelling te verwerven.
- Morfologische analyses van één tot drie weken na de injectie van het virus of aan het einde van een gedrags experiment uitvoeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om te illustreren de niveaus van de expressie die kunnen worden verkregen door het intraspinal injectie van rAAV codering van een marker-eiwit, we eerst geïnjecteerd AAV1. CAG.eGFP in de lumbale ruggemerg van wild-type muizen. Drie injecties verdeeld ongeveer 1 mm uit elkaar geproduceerd een bijna continue infectie van lumbale spinale segmenten L3 L5 (figuur 1A-C). Injectie van het virus op een diepte van 300 µm van het spinale oppervlak leidt tot overheersende infectie van cellen in de dorsale Hoorn van het ruggenmerg. Geïnfecteerde cellen kunnen echter ook worden gevonden in de ventrale hoorn (Figuur 1 d). Vervolgens was het doel om te illustreren het verschil in rAAV-gemedieerde expressie bij het injecteren van een Cre-afhankelijke rAAV in een transgene muis van Cre. We daarom de Cre-afhankelijke AAV1 geïnjecteerd. CAG.flex.eGFP-vector in het ruggenmerg van GlyT2::Cre transgene muizen. Als werd voorheen, expressie van eGFP waargenomen in de dorsale en ventrale hoorn. Zoals verwacht, werd de expressie van eGFP echter beperkter, reflecterende van de verdeling van de GlyT2 + neuronen, d.w.z. de relatief schaars expressie in de oppervlakkige dorsale hoorn en dichte expressie in de diep dorsale hoorn (figuur 1E).
Vervolgens, om aan te tonen van de haalbaarheid van het aanpakken van circuit functie van spinale neuronale subpopulaties, twee verschillende Cre-afhankelijke AAVs coderen voor verschillende effector eiwitten (DTA en hM3Dq) werden ingespoten in GlyT2::Cre transgene muizen. Analoog aan de virale expressie waargenomen na drie injecties van AAV1. CAG.eGFP in wild-type muizen, er was robuust ablatie van remmende neuronen (Pax2 +) in de lumbale segmenten L3-L5 na de injectie van AAV1. EF1a.Flex.DTA in Glyt2::Cre muizen (figuur 2AC). Verlies van de remmende neuronen glycinergic in deze segmenten opgeroepen een gemarkeerde mechanische overgevoeligheid (figuur 2D) en spontane aversieve gedrag gericht op de ipsilaterale stuk (figuur 2E). De aversieve gedrag leidde tot zelfverwonding letsels, die kon worden waargenomen op de poten, kalf en dij (Zie voor meer gegevens, Foster et al. 7) tegenover effecten werden waargenomen bij het activeren van de glycinergic neuronen via injectie van AAV1.hSyn.flex.hM3Dq en latere intraperitoneale injectie van CNO (figuur 2B). Muizen werd ongevoelig voor schadelijke mechanische stimulatie (figuur 2F) en andere schadelijke stimuli (Zie Foster et al. 7) Bovendien als behandeld met de pruritogens histamine of chloroquine, hM3Dq-gemedieerde activering van glycinergic neuronen efficiënt onderdrukt prurifensive Reacties (Figuur 2 g). Deze resultaten tonen aan dat drie injecties van rAAV in het lumbale ruggenmerg kundig voor transduce van een ruimte van het lumbale ruggenmerg voldoende robuuste gedragsveranderingen opgeroepen door stimulatie van het desbetreffende stuk acht te nemen.
In een laatste reeks van experimenten wilden we aantonen dat de mogelijke verschillen in het gebruik van Cre reporter muizen ten opzichte van Cre verslaggever virussen. Daarom werd een Cre bestuurder gen gekozen die eerder werd beschreven als een beperkte-expressiepatroon in het ruggenmerg muis weer te geven. Het gen RORβ heeft gesuggereerd moet voornamelijk worden uitgedrukt in remmende interneuronen van de diep dorsale hoorn13,14. Deze studie gebruikt RORβCre knock-in muizen en stak ze aan Rosa26lox-STOP-lox-tdTomato (R26Tom) Cre reporter muizen, die leiden tot de uitdrukking van tdTomato in alle cellen weergeven van Cre-expressie op elk punt van de tijd vóór de analyse ( Figuur 3A). Karakterisering van tdTomato + cellen in RORβCre; R26Tom muizen bleek expressie in neuronen en astrocyten van de dorsale hoorn (figuur 3BC). In feite, voorgesteld kwantificering van de tdTomato +-cellen dat de meerderheid van de cellen ondergaan Cre-gemedieerde recombinatie (58%) non-neuronale waren. Wij vervolgens geïnjecteerd een Cre-afhankelijke tdTomato verslaggever rAAV (AAV1. CAG.flex.tdTomato) in het ruggenmerg van P40 RORβCre muizen (figuur 3D). In tegenstelling tot R26Tom-gemedieerde verslaggever expressie, vonden we alle tdTomato + cellen gelabeld door het virus van de verslaggever te worden neuronen (figuur 3EF). Tot slot, de identiteit van de tdTomato + neuronen werd geanalyseerd in beide sets van muizen (RORβCre; R26Tom en RORβCre ingespoten met AAV1. CAG.flex.tdTomato). In beide gevallen, de meerderheid van de neuronen waren remmende (> 85%) en de minderheid van neuronen excitatory (< 20%) (Figuur 3 G-ik), die is in overeenstemming met eerdere evaluaties van de identiteit van RORβ + neuronen13,14.
Figuur 1: Intraspinal injectie van AAV1-eGFP/AAV1-flex-eGFP
(A) Schematische illustratie van een intraspinal injectie van een AAV1. CAG.eGFP (AAV1-eGFP) in de lumbale ruggemerg, die wordt geïnnerveerd van het stuk. (B) anatomische locatie van de segmenten van de lumbale ruggemerg L3-L4 kan worden gezien in een top down view van de achterkant van een muis. De huid werd geopend om de wervelkolom bloot te stellen. Spinale processen van wervels T13-L6 zijn gekleurd als anatomische verwijzingen en een pijl geeft aan de iliacale kuif. (C) representatief beeld van een hele berg lumbale ruggemerg. Groene fluorescentie geeft virus-getransduceerde gebieden van het ruggenmerg. (D) representatief beeld van een doorsnede door middel van een AAV1-eGFP-getransduceerde lumbale ruggemerg van een wild-type muis. (E) representatieve afbeelding van een dwarsdoorsnede van een AAV1. CAG.flex.eGFP-getransduceerde ruggenmerg van een GlyT2::Cre muis. Onderbroken lijnen geven de schets van de grijze stof en oppervlakkige dorsale Hoorn van het ruggenmerg. Schaal bars C = 1 mm, D = 100 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: Functionele manipulatie spinale Cre-uiting te geven aan Glycinergic neuronen
(A + B) Schematische illustratie van een intraspinal injectie van een AAV1. EF1a.Flex.DTA (A) of een AAV1. EF1a.Flex.hM3Dq (B) in de lumbale ruggemerg. CRE-afhankelijke expressie van difterie toxine fragment A (DTA) zal leiden tot ablatie van de glycinergic neuronen (GlyT2 +) (A), terwijl Cre-afhankelijke uitdrukking van de Farmacogenetische ontwerper receptor hM3Dq GlyT2 neuronen gevechts door zal maken Clozapine-N-oxide (CNO) (B). (C) drie injecties van AAV1. EF1a.Flex.DTA in de segmenten van de L3-L5 van GlyT2::Cre muizen geleid tot een duidelijke verlies van remmende neuronen in de respectieve segmenten van de ipsilaterale maar niet van de contralaterale zijde. (D) verlies van GlyT2 neuronen opgeroepen een langdurige overgevoeligheid voor mechanische von Frey stimulatie in de ipsilaterale hind poot van GlyT2::Cre muizen ingespoten met AAV1. EF1a.Flex.DTA, maar geen verandering werd waargenomen als Cre-negatieve muizen werden ingespoten. (E) verlies van GlyT2 neuronen opgeroepen spontane aversieve gedrag denken aan chronische jeuk. (F) hM3Dq-gemedieerde activering van GlyT2 neuronen verminderd schadelijke mechanische pijn opgeroepen door stimulatie van de pinprick. (G) hM3Dq-gemedieerde activering van GlyT2 neuronen verminderd pruritogen (chloroquine of histamine)-opgeroepen aversieve gedrag. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM. *** p < 0.001; p < 0,01. Schaal bar C = 1 mm. g = gram. Beelden worden hergebruikt en vanaf Foster et al. gewijzigd 7 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: genetische en Virus-gemedieerde Labeling van uiting van de RORβ cellen. (A) Diagram waarop de strategie voor Cre-afhankelijke expressie van fluorescerende tdTomato reporter in RORβCre; Rosa26lox-STOP-lox-tdTomato (R26Tom) muizen. (B) immunokleuring op ruggenmerg secties van RORβCre; R26Tom muizen bleek dat NeuN + RORβ-Tom neuronen kunnen worden gevonden in laminae IV. (C) Cre-afhankelijke uitdrukking van tdTomato werd ook waargenomen in GFAP + cellen van RORβCre; R26Tom muizen, suggereren dat RORβ wordt uitgedrukt in astrocyten tijdens de ontwikkeling. Pijlpunten geven double-gelabeld astrocyten bij lamina III. (D) Diagram met intraspinal injectie van AAV-flex-Tom (rAAV1.CAG.flex.tdTomato) virus in RORβCre muizen tot station lokale Cre-afhankelijke uitdrukking van tdTomato. (E) immunokleuring op ruggenmerg secties van RORβCre muizen ingespoten met AAV-flex-Tom virus. RORβ-Tom neuronen waren gelokaliseerd op de oppervlakkige laminae van de spinale dorsale hoorn en expressie van tdTomato afwezig was van astrocyten. (F) Percentage van RORβ-Tom cellen uiten de neuronale markering NeuN in spinale secties van RORβCre; R26Tom muizen en RORβCre muizen ingespoten met AAV-flex-Tom virus. (G-H) Immunokleuring op ruggenmerg secties van (G) RORβCre; R26Tom muizen en (H) RORβCre muizen ingespoten met AAV-flex-Tom virus tonen colocalization tussen RORβ-Tom neuronen en de remmende markering Pax2 of de excitatory marker Lmx1b. (I) Percentage van RORβ-Tom neuronen die uiting geven aan Lmx1b en Pax2 in RORβCre; R26Tom muizen en RORβCre muizen ingespoten met AAV-Tom virus. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM. gegevens zijn afkomstig van 2-3 muizen en 1-3 secties per muis. Schaal staven 100 µm (B, E) en 20 µm (C, E in hoge vergroting afbeeldingen, G en H). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Variabele | Ingestelde waarde | Eenheid |
| warmte (H) | 450 | -(waarde evenredig aan de macht van de uitgestraalde warmte) |
| dwingen van voorlopige pull (F(TH)) | 20 | -(waarde evenredig met de spanning toegepast om af te dwingen van de spoel) |
| afstand drempel (s(TH)) | 25 | 0,12 mm |
| vertraging heatstop (t(H)) | 30 | 0.5 ms |
| afstand heatstop (s(H)) | 0 | 0,12 mm |
| vertraging Trek 1 (t(F1)) | 200 | 0.5 ms |
| dwingen Trek 1 (F1) | 300 | -(waarde evenredig met de spanning toegepast om af te dwingen van de spoel) |
| afstand trekken 2 (s(F2)) | 30 | 0,12 mm |
| dwingen trekken 2 (F2) | 600 | -(waarde evenredig met de spanning toegepast om af te dwingen van de spoel) |
| aanpassen (AD) | 0 | - |
Tabel 1: Trekker instellingen
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Intraspinal injectie van AAVs kan worden een krachtige techniek in een laboratorium van het onderzoek, waardoor de analyse van spinale cellen met een hoge temporele en ruimtelijke oplossing. Dit protocol maakt de transductie van de drie belangrijkste spinale segmenten wordt geïnnerveerd door de sensorische neuronen uitbreiding van hun perifere axonen naar de stuk. Transducing drie segmenten produceert robuuste en reproduceerbare gedrags-gegevens. Ook kunnen testen van een grotere sensorische ruimte dan mogelijk na een enkele intraspinal injectie. Dezelfde injectie regeling kan bijvoorbeeld voor het testen van de poot (von Frey, Hargreaves, etc.) en de dij (intradermale injecties, mechano-receptor stimulatie), dus uit te breiden de sensorische modaliteiten die kunnen worden aangepakt.
Kritische stappen:
Er zijn verschillende stappen kritisch voor het verkrijgen van betrouwbare morfologische en gedrags-gegevens en voor het vermijden van artefacten. Het ontwerp van de virale vector en de keuze van de promotor en serotype kunnen een sterke invloed hebben op transductie efficiëntie en de omvang van het getransduceerde gebied, en daarom op gedrags resultaten (Zie voor meer informatie over virale verspreiding en transductie efficiëntie, 12). virale preparaten van hoge kwaliteit nodig zijn om te minimaliseren van de bijwerkingen van de injectie van virus, die optreden kunnen als verontreinigingen of cel puin in de oplossing van het virus aanwezig zijn. De operatie die vereist is voor het injecteren van het ruggenmerg moet worden uitgevoerd met de grootste zorg teneinde morfologische en gedragsmatige artefacten geïntroduceerd door de operatie. Bijzondere aandacht is vereist bij de behandeling van het ruggenmerg, vooral tijdens de laminectomie en tijdens de perforatie van de dura met de naald. Schade aan het ruggenmerg kan afbreuk doen aan lichamelijke sensaties en motorische coördinatie van de muis, aldus afbreuk te doen aan alle geplande gedrags experimenten. Daarnaast is het belangrijk om zorgvuldig monteren van de spuit. Onjuiste montage of verstopping van de micropipet kan het belemmeren van het experiment. Spinale weefsel op de injectieplaats heeft aan het einde van het experiment worden onderzocht om na te gaan van de succesvolle injectie en transductie van het geïnjecteerde gebied en tot uitsluiting van buitensporige weefselschade als gevolg van de operatie. Dit protocol heeft gebruikt virale titers tot een concentratie van 1 x 1013 GC/mL zonder duidelijke toxiciteit, maar hogere titers van virus giftige op een bepaald punt van tijd zou kunnen worden. Daarnaast zal toxiciteit waarschijnlijk ook afhangen van het eiwit dat gecodeerd wordt door de ingespoten AAV.
Wijzigingen:
Verschillende parameters in het protocol kunnen worden aangepast aan de neuronale bevolking en de onderzoeksvraag worden bestudeerd. Injectie van 300 nL virus oplossing op een diepte van 300 µm leidt tot transductie van neuronen in de gehele, en voornamelijk in de dorsale hoorn. Als doel neuronen verder ventrale beoogt, kan de diepte worden aangepast. Injectie van grotere volumes van virus (hebben we gebruik gemaakt van maximaal 500 nL per injectie) zal leiden tot een grotere verspreiding in dorsoventral en rostrocaudal richtingen. Dit kan zinvol zijn om de doelgerichtheid van extra cellen in de mate van rostrocaudal, maar kan verhogen de spillover naar de contralaterale zijde, die kan nadelig zijn voor het gebruik van de contralaterale zijde als een interne controle. Bovendien, zal de dorsoventral mate van getransduceerde cellen toenemen, die het gewenste effect kan worden of dient te worden vermeden. Injectie van 300 nL op een diepte van 300 µm vermeden kant effecten op de motorische controle bij GlyT2::Cre muizen, terwijl injectie van 500 nL of injectie bij een grotere diepte af en toe geproduceerde motor fenotypen, zoals spastische uitbreiding van het stuk (gegevens niet worden weergegeven). Injectie van kleinere volumes kan worden gebruikt om te beperken gericht op naar nog meer beperkte gebieden5. De virale titer is een andere parameter die kan worden gewijzigd en moet in feite worden bepaald voor elke virus. Voor bacteriële toxines, zoals de zeer efficiënte DTA, kunnen lage expressie niveaus volstaan voor het opwekken van het gewenste effect, terwijl voor fluorescerende verslaggevers en DREADDs, hogere titers nodig voor aantoonbaar of effectief expressie zijn kunnen.
Betekenis van de methode met betrekking tot bestaande/alternatieve methoden:
Tot op heden, zijn voornamelijk twee technieken gebruikt om functioneel ondervragen de neuronale circuits die nodig zijn voor de transmissie van sensorische signalen. Veel onderzoekers hebben intraspinal injecties van rAAV dat codeert voor verslaggever en effector eiwitten in recombinase-uiten muizen om te etiketteren en manipuleren van spinale neuronale subpopulaties gebruikt. Intraspinal injectie als een techniek voor het manipuleren van de spinale cellen geweest eerder beschreven15,16. Het protocol hier geschetst werd specifiek ontworpen om genetisch gelabelde neuronen in drie opeenvolgende segmenten van de lumbale ruggemerg transduce terwijl het minimaliseren van chirurgische manipulatie. Dit wordt bereikt door het plaatsen van twee van de drie injecties in de lat. ruimte rostraal en caudal van de T13 wervels en ten tweede door het boren van een gat in T13 voor de derde injectie in plaats van verwijderen van de wervels. De gerichte L3-L5 segmenten zijn de belangrijkste beëindiging gebied van sensorische neuronen innervating het stuk. Wij laten zien dat dit soort transductie voldoende robuuste gedragsveranderingen na het manipuleren van de glycinergic neuronen veroorzaken te suggereren dat het geschikt voor de analyse van een verscheidenheid van verschillende genetisch gelabelde ruggenmerg neuronen is.
De tweede techniek die is gebruikt om te manipuleren van de functie van spinale neuron deelverzamelingen is gebaseerd op Overstekende transgene dieren. Hier, moeten muizen uiting van een recombinase in een specifieke subset van ruggenmerg neuronen worden overgestoken naar verslaggever muizen met het oog op de uitdrukking van de gewenste markering of effector eiwit in de respectieve neuronale deelverzameling17,18, 19. ter illustratie van enkele van de verschillen die optreden kunnen wanneer het vergelijken van de resultaten verkregen met behulp van verslaggever muizen of intraspinal virus injecties we stak RORβCre knock-in dieren een Cre-afhankelijke verslaggever muis of geïnjecteerd RORβ CRE muizen met een Cre-afhankelijke verslaggever rAAV. Wij vergeleken verslaggever genexpressie verkregen van de rAAV naar verslaggever genexpressie verkregen in RORβCre; R26Tom muizen. Verslaggever genexpressie verkregen uit de intraspinal injectie van een Cre-afhankelijke rAAV werd beperkt tot neuronen van het ruggenmerg, terwijl R26Tom verslaggever muis-opgeroepen tdTomato expressie wordt ook gevonden in astrocyten. Dit suggereert dat RORβ Transient wordt uitgedrukt in astrocyten. Evenzo Gutierrez-Mecinas et al. vond een beperktere verslaggever uitdrukking (ruimtelijk en celtype specifieke) na virale injectie in vergelijking met muis-opgeroepen verslaggever expressie in Tac1Cre muizen20. Met behulp van intraspinal injecties van een verslaggever van de rAAV in het ruggenmerg van volwassen muizen, kunnen verslaggever en/of effector genexpressie efficiënt beperkt tot de bevolking van cellen die het gen in de volwassene express en dus vermijden recombinatie/expressie in die populaties met eerdere voorbijgaande gene activiteit.
Een tweede belangrijkste voordeel van intraspinal rAAV injecties is de mogelijkheid om de uitdrukking van de genen rAAV-gecodeerd beperken tot de injectieplaats. In transgene muizen, Cre stuurprogramma-gemedieerde expressie is vaak niet alleen gevonden in de neuronale subpopulatie van belang, maar ook in andere populaties binnen het zenuwstelsel. Dymecki en collega's, evenals de soorten Ma en Goulding, hebben ontwikkeld elegante manieren van het gebruik van intersectional verslaggever muis-gebaseerde benaderingen die vermijden recombinatie in delen van het zenuwstelsel die ongewijzigde17, blijven 18,19,21,22,23. Met behulp van knock-in muizen te verkrijgen van de expressie van marker of effector eiwitten kan ook worden aangenomen dat minder variabele, aangezien er slechts één genomic exemplaar van de respectieve expressie cassette per cel en de expressie cassette aanwezig in alle cellen in het gebied van belang is . In tegenstelling, de aanwezigheid van een cassette respectieve expressie en ook het nummer van de kopie van de expressie cassette na virale transductie is afhankelijk van de efficiëntie van de signaaltransductie, die kan variëren van cel naar cel, van injectie te injectie, en hangt af van de veel van het virus. Tot slot, het belangrijkste nadeel van virus-gemedieerde genexpressie boven traditionele genetische methoden is de noodzaak van chirurgie. Chirurgie-gemedieerde letsel/ontsteking kan direct invloed op van neuronen en circuits. Integratie van control muizen die de dezelfde operatie hebben ondergaan is dus verplicht.
Toekomstige toepassingen:
Intraspinal injectie kan worden gebruikt om te analyseren en manipuleren van elke subpopulatie genetisch geïdentificeerde spinale via overexpressie van markering en effector eiwitten. Het is dus waarschijnlijk in de toekomst dat velen deze techniek om te bestuderen van neuronale populaties in hun specifieke focus zal aannemen. Bovendien, naast het gebruik van intraspinal injectie van rAAVs te bereiken overexpressie van exogene effector eiwitten, deze techniek kan ook worden gebruikt om te zwijgen of overexpress endogene eiwitten en dus te bestuderen van de functie van een bepaald gen met hoge ruimtelijke en temporele resolutie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken Hanns Ulrich Zeilhofer voor royaal ondersteunen dit werk. Hendrik Wildner werd gesteund door de Stichting Olga Mayenfisch. Wij danken Carmen Birchmeier voor het antilichaam Lmx1b.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| micropipette puller: DMZ-Universal-Electrode-Puller | Zeitz | NA | |
| anesthesia unit: Oxymat3 oxygen concentrator | Weinmann | NA | |
| anesthesia unit: VIP 3000 Veterinary Vaporizer | Midmark | NA | |
| Heat mat: Mio Star Thermocare 100 | Migros | 717614700000 | |
| Electric shaver | Philips | BT9290 | |
| surgical microscope (OPMI pico) | Zeiss | NA | |
| Small animal stereotaxic apparatus | Kopf | NA | |
| Neurostar StereoDrive (optional) | Neurostar | NA | |
| Model 51690 Cunningham mouse spinal adaptor | Harvard Apparatus | 72-4811 | |
| PHD Ultra syringe pump with nanomite | Harvard Apparatus | 70-3601 | |
| Hamilton 701 RN 10 μl glass microliter syringe | Hamilton | 7635-01 | |
| Hamilton Removable needle (RN) compression fitting 1 mm | Hamilton | 55750-01 | |
| fine dentistry drilling apparatus: Osada success 40 | Osada | OS-40 | |
| spherical cutter, 0.5mm | Busch | 12001005B | |
| electronic von Frey anesthesiometer | IITC | 23905 | |
| flexible von Frey hairs | IITC | #7 | |
| LSM710 Pascal confocal microscope | Zeiss | NA | |
| 0.8 NA × 20 Plan-apochromat objective | Zeiss | NA | |
| 1.3 NA × 40 EC Plan-Neofluar oil-immersion objective | Zeiss | NA | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Tools | |||
| Scalpel Handle #4, 13cm | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Adson forceps, 1 x 2 teeth, 12 cm | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Friedman-Pearson rongeurs, curved, 0.7 mm cup | Fine Science Tools | 16121-14 | |
| Dumont #2 laminectomy forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
| Olsen-Hegar needle holders, serrated, 8.5 mm clamp length | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| Fine forceps #5 | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables and Chemicals | |||
| Thin-wall glass capillary, 1mm outside diameter | World Precision Instruments | TW 100-3 | |
| Syringes (1, 5 and 20 ml) | B. Braun | (9166917V, 4606051V, 4606205V) | |
| 26G beveled needle | B. Braun | 4665457 | |
| Sterile scalpel blades | B. Braun | BB523 | |
| Surgical sutures Safil Quick+ 4/0, absorbable | B. Braun | C1046220 | |
| Surgical sutures Premilene 5/0, non-absorbable | B. Braun | C0932191 | |
| Sterile PBS or saline (0.9%) | NA | ||
| Ethanol, 70% (disinfectant) | NA | ||
| Iodine solution (e.g. Braunol) | B. Braun | 18380 | |
| Anaesthetics (e.g. Attane isoflurane) | Provet | 2222 | |
| Aldasorber | Provet | 333526 | |
| analgesics (e.g. buprenorphine: temgesic) | Indivior | GTIN: 7680419310018 | |
| Ophthalmic ointment (e.g. vita-pos) | Pharma medica | GTIN: 4031626710635 | |
| Cotton swabs (e.g. from) | IVF Hartmann | 1628100 | |
| Facial tissues (e.g. from) | Uehlinger AG | 2015.10018 | |
| Superfrost plus microscope slides | ThermoScientific | J1800AMNZ | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| C57BL/6J mice (wildtype) | The Jackson Laboratory | RRID:IMSR_JAX:000664 | |
| Rorbtm1.1(cre)Hze/J mice (RORβCre) | The Jackson Laboratory | RRID:IMSR_JAX:023526 | |
| Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J mice (R26Tom) | The Jackson Laboratory | RRID: IMSR_JAX:007914 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Viral vectors | |||
| AAV1.CB7.CI.eGFP.WPRE.rBG (AAV1.CAG.eGFP) | Penn Vector Core | AV-1-PV1963 | |
| AAV1.CAG.flex.eGFP.WPRE.bGH (AAV1.CAG.flex.eGFP) | Penn Vector Core | AV-1-ALL854 | |
| AAV1.CAG.flex.tdTomato.WPRE .bGH (AAV1.CAG.flex.tdTomato) |
Penn Vector Core | AV-1-ALL864 | |
| AAV1.EF1a.flex.DTA.hGH (AAV1.EF1a.flex.DTA) | Penn Vector Core | Custom production | |
| AAV1.hSyn.DIO.hM3D(Gq)-mCherry.hGH (AAV.flex.hM3D(Gi)) | Penn Vector Core | Custom production | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmids | |||
| pAAV.hSyn.flex.hM3D(Gq)-mCherry | Addgene | 44361 | |
| pAAV.EF1α.flex.hChR2(H134R)-eYFP | Addgene | 20298 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacteria | |||
| MDS42 | ScarabGenomics | ||
| Stbl3 | ThermoScientific | C737303 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Quiagen | 12362 | |
| NucleoBond PC 500 | Machery & Nagel | 740574 | |
| clozapine-N-oxide (CNO) | Enzo Life Sciences | BBL-NS105-0025 | |
| chloroquine diphosphate salt | Sigma | C6628 | |
| histamine | Sigma | H7125 | |
| Dapi | Invitrogen | D3571 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies (dilution) | |||
| Rabbit anti-GFP (1:1000) | Molecular Probes | RRID:AB_221570 | |
| Rabbit anti-NeuN (1:3000) | Abcam | RRID:AB_10711153 | |
| Goat anti-Pax2 (1 : 200) | R & D Systems | RRID:AB_10889828 | |
| Guinea pig anti-Lmx1b (1 : 10 000) | Dr Carmen Birchmeier | Muller et al. 2002 | |
| Rabbit anti-GFAP (1 : 1000) | DakoCytomation | RRID:AB_10013382 | |
| Secondary antibodies raised in donkey (1:800) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | NA |
References
- Goulding, M., Bourane, S., Garcia-Campmany, L., Dalet, A., Koch, S. Inhibition downunder: an update from the spinal cord. Curr Opin Neurobiol. 26, 161-166 (2014).
- Todd, A. J. Neuronal circuitry for pain processing in the dorsal horn. Nat Rev Neurosci. 11 (12), 823-836 (2010).
- Sandkuhler, J. Models and mechanisms of hyperalgesia and allodynia. Physiol Rev. 89 (2), 707-758 (2009).
- Zeilhofer, H. U., Wildner, H., Yevenes, G. E. Fast synaptic inhibition in spinal sensory processing and pain control. Physiol Rev. 92 (1), 193-235 (2012).
- Azim, E., Jiang, J., Alstermark, B., Jessell, T. M. Skilled reaching relies on a V2a propriospinal internal copy circuit. Nature. 508 (7496), 357-363 (2014).
- Cui, L., et al. Identification of Early RET+ Deep Dorsal Spinal Cord Interneurons in Gating Pain. Neuron. 91 (6), 1413 (2016).
- Foster, E., et al. Targeted ablation, silencing, and activation establish glycinergic dorsal horn neurons as key components of a spinal gate for pain and itch. Neuron. 85 (6), 1289-1304 (2015).
- Francois, A., et al. A Brainstem-Spinal Cord Inhibitory Circuit for Mechanical Pain Modulation by GABA and Enkephalins. Neuron. 93 (4), 822-839 (2017).
- Peirs, C., et al. Dorsal Horn Circuits for Persistent Mechanical Pain. Neuron. 87 (4), 797-812 (2015).
- Petitjean, H., et al. Dorsal Horn Parvalbumin Neurons Are Gate-Keepers of Touch-Evoked Pain after Nerve Injury. Cell Rep. 13 (6), 1246-1257 (2015).
- Zhang, Y., et al. Identifying local and descending inputs for primary sensory neurons. J Clin Invest. 125 (10), 3782-3794 (2015).
- Haenraets, K., et al. Spinal nociceptive circuit analysis with recombinant adeno-associated viruses: the impact of serotypes and promoters. J Neurochem. , (2017).
- Abraira, V. E., et al. The Cellular and Synaptic Architecture of the Mechanosensory Dorsal Horn. Cell. 168 (1-2), 295-310 (2017).
- Wildner, H., et al. Genome-wide expression analysis of Ptf1a- and Ascl1-deficient mice reveals new markers for distinct dorsal horn interneuron populations contributing to nociceptive reflex plasticity. J Neurosci. 33 (17), 7299-7307 (2013).
- Inquimbert, P., Moll, M., Kohno, T., Scholz, J. Stereotaxic injection of a viral vector for conditional gene manipulation in the mouse spinal cord. J Vis Exp. (73), e50313 (2013).
- Kohro, Y., et al. A new minimally-invasive method for microinjection into the mouse spinal dorsal horn. Sci Rep. 5, 14306 (2015).
- Bourane, S., et al. Gate control of mechanical itch by a subpopulation of spinal cord interneurons. Science. 350 (6260), 550-554 (2015).
- Bourane, S., et al. Identification of a spinal circuit for light touch and fine motor control. Cell. 160 (3), 503-515 (2015).
- Duan, B., et al. Identification of spinal circuits transmitting and gating mechanical pain. Cell. 159 (6), 1417-1432 (2014).
- Gutierrez-Mecinas, M., et al. Preprotachykinin A is expressed by a distinct population of excitatory neurons in the mouse superficial spinal dorsal horn including cells that respond to noxious and pruritic stimuli. Pain. 158 (3), 440-456 (2017).
- Awatramani, R., Soriano, P., Rodriguez, C., Mai, J. J., Dymecki, S. M. Cryptic boundaries in roof plate and choroid plexus identified by intersectional gene activation. Nat Genet. 35 (1), 70-75 (2003).
- Kim, J. C., et al. Linking genetically defined neurons to behavior through a broadly applicable silencing allele. Neuron. 63 (3), 305-315 (2009).
- Kim, J. C., Dymecki, S. M. Genetic fate-mapping approaches: new means to explore the embryonic origins of the cochlear nucleus. Methods Mol Biol. 493, 65-85 (2009).
