Summary
L'iniezione intraspinal di recombinase dipendente ricombinanti virus adeno-associato (rAAV) può essere utilizzato per manipolare qualsiasi tipo di cellula geneticamente etichettati nel midollo spinale. Qui descriviamo come trasduce neuroni nel corno dorsale del midollo spinale lombare. Questa tecnica consente funzionale interrogatorio del sottotipo del neurone manipolati.
Abstract
Manipolazione selettiva delle sottopopolazioni neuronali spinali è stato realizzato principalmente con due metodi differenti: 1) Intersezionali genetica, per cui vengono generati topi transgenici doppi o triplo per conseguire l'espressione selettiva di un giornalista o un effettore gene (ad es., dal locus Rosa26) nella popolazione spinale desiderata. 2) intraspinal iniezione di virus ricombinante adeno-associato Cre-dipendente (rAAV); qui vettori AAV Cre-dipendente che codifica per il gene reporter o effettore di scelta vengono iniettati nel midollo spinale di topi che esprimono Cre ricombinasi nella sottopopolazione neuronale desiderata. Questo protocollo viene descritto come generare dei vettori-rAAV Cre-dipendente e come trasduce neuroni nel corno dorsale del midollo spinale lombare L3-L5 dei segmenti con rAAVs. Come i segmenti spinali lombari L3-L5 sono innervate da quei neuroni sensoriali periferici che trasmettono informazioni sensoriali dalle zampe posteriori, comportamento spontaneo e le risposte al test sensoriali applicato per l'arto posteriore ipsilateral al lato di iniezione possono essere analizzati al fine di interrogare la funzione dei neuroni manipolati in elaborazione sensoriale. Forniamo esempi di come questa tecnica può essere utilizzata per analizzare geneticamente definita sottoinsiemi dei neuroni spinali. I principali vantaggi di espressione del transgene virus-mediate in topi transgenici Cre rispetto all'espressione indotta da mouse transgene reporter classica sono i seguenti: 1) diverse Cre-dipendente rAAVs codifica diverse proteine reporter o effettore può essere iniettato in una singola riga transgenica Cre, superando così la necessità di creare diversi mouse transgenico più linee. 2) intraspinal iniezione limita la manipolazione di cellule che esprimono Cre al sito di iniezione e per il tempo dopo l'iniezione. Gli svantaggi principali sono: 1) espressione di gene Reporter da rAAVs è più variabile. 2) chirurgia è necessaria per trasdurre i neuroni spinali di interesse. Quale dei due metodi è più appropriato dipende dalla domanda di ricerca e di popolazione di neurone da affrontare.
Introduction
Il dorsale del midollo spinale è essenziale per lo scambio di informazioni tra la periferia del corpo e il cervello. Stimoli sensoriali quali calore, freddo, toccare, o stimoli nocivi vengono rilevati da neuroni periferici specializzati, che trasmettono queste informazioni ai neuroni del corno dorsale del midollo spinale. Qui, una complessa rete di interneuroni inibitorie ed eccitatorie modula e alla fine il informazioni sensoriali relè tramite i neuroni di proiezione spinale di supraspinal siti1,2. I calcoli effettuati da midollo spinale inter- e neuroni di proiezione informazioni sensoriali, determinando così le informazioni che sono soppresso o inoltrate a quale intensità del cancello. Cambiamenti nell'integrazione degli stimoli sensoriali, come ad esempio un equilibrio alterato tra inibizione ed eccitazione, possono causare disfunzioni sensoriali quali ipersensibilità o allodynia (sensazioni dolorose dopo stimolo normalmente non doloroso). Questi cambiamenti sono probabilmente che la causa del dolore cronico vari stati3,4. Così, circuiti spinali sono di grande importanza nell'elaborazione sensoriale e di conseguenza nella percezione di sé e ambiente di un organismo. Con il recente avvento e combinazione di genetica, molecolare e le tecniche chirurgiche che consentono la manipolazione precisa delle sottopopolazioni di neuroni spinali geneticamente identificati, gli scienziati ora stanno cominciando a capire i circuiti spinali sottostanti responsabile per l'elaborazione di distinte modalità sensoriali.
Iniezione intraspinal di rAAV nei topi wild-type o transgenici ha notevolmente contribuito alla comprensione della funzione di sottoinsiemi specifici di neuroni spinali5,6,7, , l'analisi e manipolazione 8 , 9 , 10 , 11. questa tecnica permette la consegna delle proteine marker (come GFP / proteine di fusione di GFP), proteine reporter (ad esempio GCaMP), o proteine effettrici (ad esempio tossine batteriche, channelrhodopsin o recettori farmacogenetici) nello spazio modo limitato ai neuroni spinali. Iniezione locale di Cre-dipendente rAAVs in topi transgenici che esprimono Cre ricombinasi in un sottoinsieme specifico dei neuroni spinali permette l'analisi specifica della rispettiva popolazione neuronale. Abbiamo impiegato questa tecnica di un'etichetta, l'ablazione, inibire o attivare glycinergic spinale neuroni dimostrando che sono una parte essenziale del cancello spinale controllo del dolore e prurito trasmissione7. In questi esperimenti, iniezione intraspinal di rAAV Cre-dipendente nei topi GlyT2::Cre abilitato la manipolazione selettiva dei neuroni glycinergic nel midollo spinale lombare. Quindi, manipolazione simultanea dei circuiti sovraspinali che contengono glycinergic neuroni critici per la sopravvivenza dell'animale può essere evitato.
Mentre un'iniezione intraspinal di rAAVs limita l'infezione al sito di iniezione, trasduzione virale può verificarsi non solo nei neuroni locali, ma anche nei neuroni che si connettono al sito di iniezione tramite proiezioni assonali. Quest'ultimo viene spesso utilizzato per aree cerebrali traccia che fornisce l'input di un neurone a un particolare nucleo nel cervello. L'infezione delle proiezioni axonal può, tuttavia, essere anche un fattore di confusione quando una popolazione definita dei neuroni deve essere studiata presso un determinato sito. Per risolvere questi problemi, abbiamo recentemente condotto un'analisi completa di AAV sierotipi e cassette di espressione per identificare i sierotipi e promotori che possono essere utilizzati per minimizzare o massimizzare la trasduzione retrograda. Nell'ambito di questa specifica ricerca in circuiti spinali, abbiamo analizzato la capacità di diversi sierotipi e promotori di trasdurre retrogradely neuroni a livello dei gangli della radice dorsale (DRG), il midollo rostrale ventromediale (RVM) e la corteccia somatosensoriale 12. la tecnica descritta in questo protocollo può essere utilizzata quindi per analizzare i neuroni spinali al sito di iniezione o per analizzare i neuroni di proiezione che forniscono l'input per il sito iniettato del midollo spinale. Nel protocollo descritto qui, tre iniezioni di rAAV nel lato sinistro del midollo spinale lombare vengono eseguite per abilitare la trasduzione dei neuroni nei tre segmenti lombari (L3-L5). I segmenti di L3-L5 ricevono la maggior parte dell'input sensoriale dall'arto posteriore ipsilateral al sito di iniezione. Dimostriamo che la manipolazione funzionale dei neuroni geneticamente con etichettati in L3-L5 è sufficiente per evocare cambiamenti comportamentali robusti, così fornendo la prova funzionale per il circuito in funzione di un sottotipo di neurone geneticamente con etichetta.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dall'ufficio veterinario cantonale svizzero (Zurigo) e sono in accordo e in conformità con tutte le pertinenti orientamenti normativi e istituzionali.
Nota: Tutti i materiali con rispettivi produttori e/o fornitori sono elencati nella Tabella materiali.
1. generazione di vettori AAV Cre-dipendente
Nota: Una varietà di vettori di Cre-dipendente con differenti promotori possa essere acquistata (Vedi Tabella materiali) o, se il costrutto di espressione desiderata non è disponibile, può essere generato modificando costrutti AAV esistenti. Notare che il promotore e il sierotipo possono avere un impatto sulla diffusione della trasduzione virale (cfr. 12). La prima parte del presente protocollo descrive brevemente la generazione di due diversi vettori AAV Cre-dipendente adatti per guadagno e perdita di esperimenti di funzione, rispettivamente.
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Attivazione di farmacogenetica (guadagno di funzione)
- Ordine pAAV.hSyn.flex.hM3D (Gq)-mCherry (Vedi Tabella materiali) per progettazione recettori attivati esclusivamente da droghe di sintesi (DREADD)-attivazione mediata.
- Dopo aver ricevuto la cultura batterica pugnalata, striscia fuori batteri sulle piastre di LB (agar batteriologico-grade disciolte in mezzo liquido Luria-Bertani) completati con l'antibiotico adatto. Incubare per tutta la notte a 37 ° C e scegliere una singola Colonia il giorno successivo.
Nota: Plasmidi contenenti AAV genomi di vettore possono essere instabili e ricombinazione del genoma virale, soprattutto all'interno del terminale di invertito virale si ripete (ITR), può verificarsi durante l'amplificazione in Escherichia coli. Suggeriamo usando recA-carenti/soppresso ceppi tali come MDS42 o Stbl3 per evitare di ricombinazione all'interno del plasmide contenente il genoma AAV. - Amplificare i batteri seguendo le istruzioni fornite dal fornitore del scelto DNA-Maxi-Kit e preparare il DNA del plasmide di alta qualità con un DNA-Maxi-Kit disponibile in commercio (ad es., Vedi Tabella materiali). Eseguire un controllo di qualità della preparazione del DNA del plasmide verificando l'integrità e l'identità del plasmide DNA attraverso la raccolta di limitazione di un'aliquota del plasmide del DNA.
Nota: Ci sono siti di riconoscimento per l'endonucleasi di restrizione SmaI entro il ITRs. Includere un digest di SmaI nel controllo qualità per verificare l'integrità di ITRs. - Inviare il DNA in una struttura di nucleo del vettore virale al fine di produrre alta qualità rAAV.
Nota: Alto titolo, preps virale di alta qualità sono fondamentali per evitare confusione fenotipi causati da contaminazioni nel prep virale. Si consiglia pertanto di avere rAAV di scelta prodotto in un impianto di nucleo di vettore stabilito, a meno che la produzione di AAV è ben consolidata in laboratorio.
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Ablazione (perdita di funzione)
Nota: Le tossine batteriche o tossina recettori utilizzabile per mediare ablazione delle cellule o il silenziamento di un neurone. Abbiamo generato pAAV.EF1α.flex.DTA al frammento di tossina di difterite espressa A (DTA) in modo Cre-dipendente.- Per generare un vettore virale Cre-dipendente, selezionare un vettore di Cre-dipendente con un promotore adatto (ad es., pAAV.EF1α.flex.hChR2(H134R)-eYFP). Amplificare la sequenza codificante di scelta (ad es., DTA) da reazione a catena della polimerasi con gli iniettori che includono AscI e NheI o compatibile riconoscimento endonuclease di limitazione in loro sporgenze (Vedi Foster et al. 7)
- Utilizzando tecniche di biologia molecolare standard, eseguire digest di restrizione del DNA vettore (pAAV.EF1α.FLEX.hChR2(H134R)-eYFP) e di PCR-amplificato inserire (NheI-DTA-AscI) con l'endonucleasi di restrizione AscI e NheI. Legare i frammenti purificati.
- Trasformare la reazione di legatura in batteri adatti, secondo il protocollo dato dal fornitore dei batteri competenti della scelta e i batteri sui piatti della libbra della lastra. Utilizzare recA-carenti/soppresso per la clonazione, ad esempio MDS42 o Stbl3, ceppi e successiva amplificazione del DNA del plasmide.
- Il giorno dopo trasformazione, pick cloni e inoculare loro in LB medium completate con l'appropriato antibiotica durante la notte a 37 ° C. Il giorno successivo, è possibile estrarre il DNA del plasmide da batteri coltivati. Verificare successo clonazione di restrizione digest e sequenziamento del plasmide Estratto del DNA.
- Amplificare il DNA del plasmide batterico di alta qualità (Vedi punto 1.1.3). Invia DNA amplificato ad un impianto di nucleo di vettori virali per la produzione di virus.
2. trasduzione delle cellule spinali
- Preparazione della soluzione di Virus
Attenzione: Virus sono infettivi reagenti e devono essere smaltiti secondo le linee guida pertinenti. Nella maggior parte dei casi, rAAVs possono essere gestiti a livello di biosicurezza 1 (BSL1).- Il giorno dell'iniezione, sbrinamento un'aliquota di riserva del virus purificato desiderata sul ghiaccio e tenerlo su ghiaccio fino a quando non direttamente prima dell'iniezione. Evitare di gelo-disgelo-cicli ripetuti, come questi ridurrà il titolo efficace del virus.
Nota: Se necessario, il virus decongelato aliquota può tenuto a 4 ° C fino a 3 giorni. - Diluire le particelle di virus in sterile 0,9% NaCl o fosfato tampone salino (PBS).
Nota: Il titolo appropriato dipende gli obiettivi sperimentali e dovrebbe essere determinato sperimentalmente. Un buon carico virale totale è di iniziare con 3 x 109 copie del genoma (3.33x1012 GC/mL, 3 x 300 nL iniettato). Assunzione in eccesso e qualche perdita durante il caricamento il capillare in conto, saranno necessari circa 2,5 µ l di soluzione di virus per ogni mouse.
- Il giorno dell'iniezione, sbrinamento un'aliquota di riserva del virus purificato desiderata sul ghiaccio e tenerlo su ghiaccio fino a quando non direttamente prima dell'iniezione. Evitare di gelo-disgelo-cicli ripetuti, come questi ridurrà il titolo efficace del virus.
- Preparazione di Micropipette per iniezioni Intraspinal
- 'Tirare' tubi capillari in vetro a parete sottile (diametro esterno 1 mm) su un estrattore micropipetta per creare una lunghezza di mm ~5.5, superficiale tibia. Utilizzare un filamento riscaldatore di 3,0 mm e impostazioni di programma 00 con p (a) adattato come in tabella 1.
Nota: Tirare può essere fatto in anticipo. I capillari tirati devono essere conservati in un contenitore chiuso sulla modellazione di argilla per evitare la polvere, che più tardi potrebbe intasare la micropipetta. Sterilizzazione in autoclave di micropipette non è necessario. - Clip la tibia del capillare tirato con forcipe laminectomia per una lunghezza di circa 4,5-5 mm per creare una punta di apertura con un diametro interno di 25-35 μm. Usando un microscopio con una scala di micrometro, misurare il diametro interno di micropipette diversi per avere un'idea di quanto sia grande l'apertura dovrebbe essere, o misurare per ogni micropipetta.
Nota: Una punta più piccola può portare all'occlusione; una punta più grande potrebbe causare danni ai tessuti e difficoltà a penetrare il midollo spinale.
- 'Tirare' tubi capillari in vetro a parete sottile (diametro esterno 1 mm) su un estrattore micropipetta per creare una lunghezza di mm ~5.5, superficiale tibia. Utilizzare un filamento riscaldatore di 3,0 mm e impostazioni di programma 00 con p (a) adattato come in tabella 1.
- Preparazione dell'installazione chirurgica e strumenti
- Assicurarsi che l'apparecchiatura è pulito e pronto per essere utilizzato. Disinfettare la zona di lavoro strofinando con etanolo al 70% e sterilizzare strumenti di sterilizzazione in autoclave o disinfettarli. Non lasciare qualsiasi disinfettante sulla siringa microliter che danneggerebbe il vettore virale deve essere utilizzato.
- Preparazione dell'animale per la chirurgia e l'anestesia
Nota: La durata totale dell'intervento è di 60-90 min.- Scegli 6 - ai 10 - settimana-vecchi topi per facilitare la procedura chirurgica.
Nota: Se il disegno sperimentale lo richiede, l'iniezione degli animali più giovani o più vecchi è possibile. Qualsiasi ceppo ed entrambi i sessi possono essere utilizzati in linea di principio, ma utilizzano lo stesso ceppo di sfondo (ad es., C57BL/6J) per il confronto di comportamenti tra le linee di diverso tipo di mouse transgenici. Se le differenze del sesso sono attesi o da indagare, analizzare i maschi e le femmine in gruppi separati. - Indurre l'anestesia con isoflurano ~ 5%. Metti l'animale nella cornice stereotassica su una stuoia di calore e mantenere l'anestesia a 1-2,5% isoflurane (portata aria: 900 mL/min). Monitorare il tasso di respirazione durante l'intervento chirurgico.
- Applicare unguento oculare lubrificante per prevenire la secchezza della cornea durante l'intervento chirurgico.
- Radere la parte posteriore dell'animale e rimuovere i capelli accuratamente con tessuti bagnati. Disinfettare la pelle rasata con soluzione di iodio e consentire la pelle si asciughi.
- Dare il trattamento analgesico (per esempio, 0.1-0.2 mg/kg di buprenorfina per via sottocutanea).
- Scegli 6 - ai 10 - settimana-vecchi topi per facilitare la procedura chirurgica.
- Esposizione della colonna vertebrale a livello lombare del midollo spinale
Nota: A causa dello sviluppo differenziale del midollo spinale e la colonna vertebrale, dei rispettivi livelli non sono allineati, ma il segmento di midollo spinale lombare L4 è allo stesso livello come la vertebra toracica T13.- Individuare la coppia di costola più caudale di palpazione lungo la colonna vertebrale. Usando un bisturi, trasformare un taglio longitudinale di 1,5-2,5 cm per la pelle a partire da soli rostral alla coppia più caudale della nervatura.
- Sollevare la pelle con il forcipe e staccarlo dal muscolo sottostante con le forbici. Durante l'intervento chirurgico, mantenere i tessuti esposti umido con sterile 0,9% NaCl.
- Utilizzando una pinzetta e piccole forbici, fare un'incisione nel prossimo, sottile strato membranoso proprio accanto alla linea mediana e tagliarlo dai processi spinous. È separata dal sottostante muscolo paraspinali, ma associata ai processi spinous.
- Identificazione delle vertebre a livello lombare del midollo spinale
Nota: Una volta che la colonna vertebrale è esposta, i legamenti intertransverse e i processi spinous dorsali dovrebbe essere visibili. Diversi punti di riferimento anatomici può aiutare a identificare la vertebra corretta destinazione (Figura 1B).- Tirare la pelle indietro verso la coda per esporre la cresta iliaca. Allo stesso livello, la coppia più caudale dei legamenti intertransverse visibile si unisce il processo spinous L6. Conta all'indietro in un caudale alla direzione rostrale per identificare la vertebra di interesse.
- Palpare lungo la colonna vertebrale. La coppia di costola più caudale si trova appena rostral alla vertebra T13 e l'osso pelvico a livello dell'anca è al livello della vertebra L6.
- Individuare il punto dove il tendine lungo il lato della colonna vertebrale è più bianca e più mediale. La vertebra T13 si trova appena rostrale. Il segmento di midollo spinale lombare L4 si trova all'interno di questa vertebra.
- Fissazione della colonna vertebrale e l'esposizione del midollo spinale lombare
- Metti l'animale su un cuscino di tessuti arrotolati per elevarlo ai morsetti spinali della cornice stereotassica.
- Difficoltà della vertebra di destinazione per evitare movimenti della colonna vertebrale a causa di respirazione. Per questo scopo, allineare i morsetti adiacenti alla vertebra destinazione, fissare un morsetto in posizione e tenere la colonna vertebrale con forcipe Adson mentre il secondo morsetto di fissaggio.
Nota: La colonna dovrebbe essere perpendicolare al piano di iniezione e saldamente fissati in modo che non si muove su pressione dall'alto. Se necessario, una seconda coppia di morsetti può essere fissata alla colonna vertebrale. In questo caso, è utile fissare le due coppie di morsetti per le due vertebre adiacenti alla vertebra destinazione. - Rimuovere il muscolo paraspinous sopra le vertebre di interesse. Usando un bisturi, fare un'incisione parallela appena mediale ai tendini che sono paralleli alla colonna vertebrale, così come incisioni perpendicolare rostrale e caudale alla vertebra destinazione. Fare attenzione a non tagliare troppo in profondità. Lacrima/tagliato via il muscolo utilizzando Pinze ossivore. Utilizzare pinze necessari per rimuovere il tessuto rimanente sulla vertebra o sopra la dura madre nello spazio intervertebrale.
- Nello spazio intervertebrale, il vaso sanguigno dorsale dovrebbe essere visibile la marcatura della linea mediana del midollo spinale. Per preparazioni iniettabili unilaterale, eseguire un laminectomy parziale da un foro nel mezzo del lato destinazione della vertebra. Utilizzare un bene Odontoiatria apparecchi con una fresa sferica di 0,5 mm di perforazione e forare con particolare attenzione quando ci si avvicina al midollo spinale. Rimuovere eventuali frammenti di osso restante con un ago smussato 26G per esporre il midollo spinale.
- Utilizzando un ago smussato 26G, perforare la dura madre nel foro e nello spazio intervertebrale rostrale e caudale alla vertebra destinazione, distano circa 200 µm laterale al vaso sanguigno dorsale. Liquido cerebrospinale dovrebbe essere fuoriuscita dai fori e il midollo spinale dovrebbe essere leggermente sporgenti.
- Preparazione della siringa di iniezione
Nota: La siringa di iniezione dovrebbe essere preparata immediatamente prima dell'inizio dell'iniezione per ridurre il rischio di intasamento la micropipetta di particelle di polvere.- Montare il capillare di vetro su una siringa di microliter utilizzando la compressione di ago rimovibile kit di montaggio. Fissare il dado strettamente per assicurare una vestibilità sicura e stretta.
- Riempire la siringa di microliter con acqua distillata sterile e avviare premendo fuori con lo stantuffo.
Nota: Se c'è troppa resistenza in modo che l'acqua non esce facilmente la punta, la micropipetta probabilmente è bloccata e deve essere scambiata. - Montare la siringa un micromanipolatore collegato ad un microinjector controllato elettronicamente. Fare attenzione a non toccare nulla con la micropipetta.
- Utilizzando il microinjector, redigere circa 1 µ l di aria per creare una bolla tra l'acqua e il virus.
- Mettere una goccia di 2,5 µ l di soluzione di virus su un pezzo di pellicola di paraffina, muovere con cautela la punta della micropipetta nella gocciolina utilizzando la cornice stereotassica e aspirare la stessa. Quindi attentamente stampa erogare fino a quando un po' di soluzione virus emerge sulla punta.
- Ritrarre la siringa e, usando una penna, contrassegnare la micropipetta con una scala e notare il livello della soluzione virus; Questo faciliterà il monitoraggio di se l'infusione sta procedendo come programmato.
- Iniezioni intraspinal
- Spostare la punta della micropipetta di sopra di uno dei fori nella dura e poi giù fino a una lieve ammaccatura è notata nella dura. Per impostare come destinazione l'iniezione al corno dorsale spinale, Sposta giù 500 µm in incrementi consecutivi di 100 µm (velocità 1 mm/s) e poi 200 µm fino per consentire la stabilizzazione meccanica del tessuto.
Nota: La profondità finale della punta è 300 µm in questo caso, ma può essere adattata a seconda dell'area di destinazione.- Se il tessuto è resistente alla penetrazione, la micropipetta potrebbe essere prendendo piede la dura madre. In questo caso, ritirare e spostare leggermente verso il foro di overlie, o utilizzare l'ago di nuovo per perforare la dura madre correttamente prima di ripetere il tentativo di penetrazione.
- Programmare la pompa ad un volume di iniezione di destinazione di 300 nL ad una velocità di iniezione di 50 nL/min e premere il pulsante start per iniziare l'infusione.
- Una volta completata l'iniezione, controllare la scala per vedere se il livello di virus è sceso e lasciare la micropipetta in posto per altri 3 minuti permettere alla pressione di equilibrare prima lentamente ritraendo la siringa.
- Ripetere il passo 2.9.1.-2.9.3. per gli altri siti di due iniezione.
- Spostare la punta della micropipetta di sopra di uno dei fori nella dura e poi giù fino a una lieve ammaccatura è notata nella dura. Per impostare come destinazione l'iniezione al corno dorsale spinale, Sposta giù 500 µm in incrementi consecutivi di 100 µm (velocità 1 mm/s) e poi 200 µm fino per consentire la stabilizzazione meccanica del tessuto.
- Sutura e recupero
- Rimuovere i morsetti spinali e il cuscino sotto il mouse.
- Chiudere la ferita a strati con pinzature interrotti, suturare la pelle e gli strati di tessuto superficiale con suture assorbibili con suture non assorbibili. Applicare iodio disinfettante sulla ferita suturata.
- Terminare l'anestesia e lasciare l'animale sulla stuoia di calore fino a quando si recupera prima di restituirlo alla sua gabbia a casa.
- Cura postoperatoria
- Monitorare l'integrità dell'animale sul giorno dell'intervento, il giorno successivo e poi ogni 2-3 giorni. Garantire che l'animale ha un'andatura normale, un aspetto sano (peso, occhi, pelliccia e comportamento), e che la ferita sta guarendo.
- Continuare il trattamento analgesico (per esempio, 0.1-0.2 mg/kg di buprenorfina per via sottocutanea) se necessario, tre volte al giorno.
3. analisi comportamentali e morfologiche
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Analisi comportamentale
Nota: Permettere agli animali di ospitare per il rispettivo setup per almeno 30 min prima di iniziare le misurazioni per far loro di adattarsi al nuovo ambiente sperimentale.-
Test di von Frey
- Inserire animali individualmente i singoli raggruppamenti di circa 10 x 10 cm su un piano di griglia del metallo.
- Stimolare la superficie plantare dei hindpaw ipsilateral al sito di iniezione con un filamento di von Frey dinamico. Si noti la forza in cui l'animale si ritira la sua zampa dallo stimolo.
- Ripetere cinque volte e calcolare la soglia di ritiro medio da sei misurazioni per ogni animale.
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Pin Prick Test
- Inserire animali singoli compartimenti di circa 10 x 10 cm su un piano di griglia del metallo.
- Stimolare la superficie plantare dei hindpaw ipsilateral al sito di iniezione con un ago smussato-26g senza penetrazione della pelle. Punteggio di comportamento come zero (nessuna reazione) o uno (reazione).
- Ripetere 9 volte con intervalli di 3 minuti tra stimolazioni e calcolare la percentuale di risposta da 10 misurazioni per ogni animale.
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Iniezione di DREADD-ligando clozapine-N-ossido (CNO)
- Sciogliere CNO in dimetilsolfossido (DMSO) per creare una soluzione di 0,2 mg / µ l, che può essere conservato a temperatura ambiente.
- Il giorno dell'esperimento, diluire la soluzione di riserva nello sterile 0,9% NaCl a 0,2 µ g / µ l e iniettare 10 µ l/g del peso corpo intraperitonealmente. Iniettare gli animali di controllo con il veicolo (0,2% DMSO nello 0,9% NaCl).
Nota: Secondo esperienza, effetti di picco sui comportamenti possono essere previsto 1-3 h dopo l'iniezione, ed effetti dovrebbero abbassarsi completamente dopo 24 h. In caso di attivazione dei neuroni glycinergic, osservati comportamenti includono le risposte ridutrici di dolore e prurito. Comportamenti evocati da DREADD-ha mediato l'attivazione dei neuroni dipenderà il sottoinsieme mirato dei neuroni spinali.
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Iniezione di Pruritogens per indurre prurito
- Sciogliere pruritogens nello 0,9% NaCl alle soluzioni di 8 mg/mL (clorochina) o 10 mg/mL (istamina). 2 h dopo amministrazione del CNO, iniettare 10 µ l di soluzione di pruritogen o di un veicolo per via sottocutanea in superficie plantare dei hindpaw ipsilateral al sito di iniezione spinale. In alternativa, iniettare la pruritogen per via intradermica nel piccolo, che è stato rasato un giorno prima per ridurre il comportamento avversivo causata dalla rasatura stessa.
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Videoregistrazione per analizzare nocicettivi spontanea o indotta da Pruritogen prurito comportamenti
- Inserire animali individualmente in scomparti trasparenti (circa 10 cm di diametro) con un po' di biancheria da letto dai loro rispettivo casa-gabbia sul pavimento.
- Videocassetta gli animali per 5 min a record spontanea e per 30 min per registrare i comportamenti indotti da pruritogen. Analizzare i video off-line in bidoni di 5 min.
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Dolore contro comportamenti di prurito
- Osservare e prendere nota di batter ciglio, leccare e mordere i comportamenti.
Nota: Batter ciglio e la leccata del sito interessato sono considerati risposte al dolore, mentre morde è associata a prurito. - Analizzare il video a velocità normale, misurare il tempo che il mouse trascorso leccare o mordere il sito interessato o misurare al rallentatore per una più precisa distinzione tra leccare e mordere i riflessi. In alternativa, contare il numero di attacchi leccare/mordere/batter ciglio.
- Osservare e prendere nota di batter ciglio, leccare e mordere i comportamenti.
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Test di von Frey
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Analisi morfologica
- Eseguire analisi morfologiche da una a tre settimane dopo l'iniezione del virus o alla fine di un esperimento comportamentale.
Nota: Abbiamo rilevato espressione di eGFP in appena 48 ore dopo l'iniezione, ma anche trovato che l'espressione aumenta significativamente entro i prossimi giorni e addirittura settimane. Per le celle con espressione forte reporter, una settimana di incubazione (da iniezione intraspinal fino a perfusione) può essere sufficiente. Per le celle con l'espressione del transgene debole, virus con deboli promotori o fluorofori più debole, un'espressione più lunga potrebbe essere necessario garantire livelli rilevabili. -
Fissazione del tessuto
- Irrorare ogni via mouse, prima con 20 ml di soluzione ghiacciata del liquido cerebrospinale artificiale (ACSF) (NaCl 125mm, NaHCO3 25mm, NaH2PO4 1,25 mM, D-glucosio 20 mM, KCl 2.5 mM e CaCl2 2 mM MgSO4 1 mM), quindi con 100 mL di paraformaldeide 4% ghiacciata (in tampone di sodio fosfato 0,1 M, pH 7,4).
Attenzione: Paraformaldeide è tossico e deve essere maneggiato con cura. - Immediatamente sezionare il midollo spinale lombare e post-fissare il tessuto per 2 h con paraformaldeide al 4% sul ghiaccio. Lavare brevemente il tessuto post-fisso con tampone di fosfato di sodio 0.1 M (pH 7.4) e quindi viene quindi incubato in soluzione di 25% di saccarosio (in tampone di sodio fosfato 0,1 M, pH 7,4) durante la notte a 4 ° C.
- Tagliare il tessuto prelevate a 30 μm su un criostato e montare le sezioni su vetrini da microscopio.
- Irrorare ogni via mouse, prima con 20 ml di soluzione ghiacciata del liquido cerebrospinale artificiale (ACSF) (NaCl 125mm, NaHCO3 25mm, NaH2PO4 1,25 mM, D-glucosio 20 mM, KCl 2.5 mM e CaCl2 2 mM MgSO4 1 mM), quindi con 100 mL di paraformaldeide 4% ghiacciata (in tampone di sodio fosfato 0,1 M, pH 7,4).
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Colorazione di immunofluorescenza
- Dopo breve lavaggi in PBS, applicare 300 μL di soluzione bloccante (10% di siero normale asino in 0,3% Triton-PBS) sulle sezioni per 1 h a temperatura ambiente.
- Incubare i vetrini con 300 μL delle rispettive combinazioni di anticorpi primari nella soluzione di blocco (Vedi Tabella materiali) tutta la notte a 4 ° C. Lavare le sezioni 3 volte per 5 minuti ciascuno in PBS.
- Incubare i vetrini con le rispettive combinazioni di anticorpi secondari in soluzione bloccante per 1 h a temperatura ambiente. Lavare le sezioni 3 volte per 5 minuti ciascuno in PBS.
- Brevemente sciacquare le diapositive con ddH2O e poi montare i vetrini coprioggetti utilizzando il mezzo di montaggio fluorescente.
- Acquisire immagini fluorescenti utilizzando un microscopio confocale equipaggiato con un 20x e un obiettivo 40x.
- Eseguire analisi morfologiche da una a tre settimane dopo l'iniezione del virus o alla fine di un esperimento comportamentale.
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Representative Results
Al fine di illustrare i livelli di espressione che possono essere ottenuti tramite l'iniezione intraspinal di rAAV codifica una proteina marker, abbiamo iniettato prima AAV1. CAG.eGFP nel midollo spinale lombare di topi wild-type. Tre iniezioni a distanza di circa 1 mm prodotta un'infezione quasi continua dei segmenti spinali lombari L3 a L5 (Figura 1A-C). Iniezione di virus ad una profondità di 300 µm dalla superficie spinale conduce all'infezione predominante delle cellule nel corno dorsale del midollo spinale. Tuttavia, le cellule infettate potrebbero essere trovate anche nel corno ventrale (Figura 1). Successivamente, l'obiettivo era di illustrare la differenza nell'espressione rAAV-mediata quando si inietta un rAAV Cre-dipendente in un topo transgenico Cre. Pertanto abbiamo iniettato il AAV1 Cre-dipendente. Vettore di CAG.flex.eGFP nel midollo spinale di topi transgenici GlyT2::Cre. Come prima, espressione di eGFP è stata osservata nel corno dorsale e ventrale. Tuttavia, come previsto, l'espressione di eGFP è diventato più ristretta, che riflette la distribuzione di GlyT2 + neuroni, vale a dire l'espressione relativamente scarsa nel corno dorsale superficiale e densa espressione nel corno dorsale profonda (Figura 1E).
Successivamente, per dimostrare la fattibilità di indirizzamento funzione di circuito delle sottopopolazioni neuronali spinali, due diverse Cre-dipendente adenoassociati codificanti per proteine effettrici diverse (DTA e hM3Dq) sono state iniettate nei topi transgenici GlyT2::Cre. Analoga all'espressione virale osservata dopo tre iniezioni di AAV1. CAG.eGFP in topi wild-type, c'era robusto ablazione dei neuroni inibitori (Pax2 +) nei segmenti lombare L3-L5 dopo l'iniezione di AAV1. EF1a.Flex.dta in topi Glyt2::Cre (Figura 2AC). Perdita di neuroni inibitori glycinergic in questi segmenti evocato una marcata ipersensibilità meccanico (Figura 2D) e comportamento spontaneo che ha avversione diretto verso l'arto posteriore ipsilateral (Figura 2E). Il comportamento avversivo portato a lesioni autoinflitte, che ha potuto essere osservate sulle zampe, polpaccio e la coscia (per dati, vedere Foster et al. 7) effetti opposti sono stati osservati durante l'attivazione di neuroni glycinergic attraverso l'iniezione di AAV1.hSyn.flex.hM3Dq e successiva iniezione intraperitoneale di CNO (Figura 2B). Topi è diventato insensibili alla stimolazione meccanica nociva (Figura 2F) e altri stimoli nocivi (Vedi Foster et al. 7) Inoltre, quando vengono trattati con il pruritogens dell'istamina o clorochina, hM3Dq-ha mediato l'attivazione dei neuroni glycinergic soppresso efficientemente prurifensive risposte (Figura 2). Questi risultati dimostrano che tre iniezioni di rAAV nel midollo spinale lombare sono in grado di trasdurre una zona del midollo spinale lombare sufficiente per osservare i cambiamenti comportamentali robusti evocati da stimolo del hindlimb corrispondente.
In un ultimo gruppo di esperimenti, abbiamo voluto dimostrare le differenze potenziali utilizzando topi reporter Cre rispetto ai virus reporter Cre. Di conseguenza, un gene di driver Cre è stato scelto che precedentemente è stato descritto come la visualizzazione di un modello di espressione limitata nel midollo spinale del mouse. Il gene RORβ è stato suggerito per essere espresso principalmente in interneuroni inibitori del corno dorsale profonda13,14. Questo studio ha utilizzato RORβCre topi knock-in e li ha attraversato al Rosa26 topi reporter Crelox-STOP-salmone affumicato-tdTomato (R26Tom), che conducono all'espressione di tdTomato in tutte le cellule visualizzazione Cre espressione in qualsiasi momento prima analisi ( Figura 3A). Caratterizzazione di cellule tdTomato + in RORβCre; R26Tom topi ha rivelato l'espressione nei neuroni e astrociti del corno dorsale (Figura 3BC). Infatti, la quantificazione delle cellule tdTomato + ha suggerito che la maggior parte delle cellule che subiscono ricombinazione Cre-mediata (58%) era non neuronali. Abbiamo quindi iniettato un Cre-dipendente tdTomato reporter rAAV (AAV1. CAG.flex.tdTomato) nel midollo spinale dei topi P40 RORβCre (Figura 3D). In contrasto con la R26Tom-mediata espressione reporter, abbiamo trovato tutte le tdTomato + cellule identificate dal virus reporter di essere neuroni (Figura 3EF). Infine, l'identità dei neuroni tdTomato + è stato analizzato in entrambi i gruppi di topi (RORβCre; R26Tom e RORβCre iniettato con AAV1. CAG.flex.tdTomato). In entrambi i casi, la maggior parte dei neuroni era inibitoria (> 85%) e la minoranza dei neuroni eccitatori (< 20%) (Figura 3 G-io), che è in accordo con le precedenti valutazioni dell'identità di RORβ + neuroni13,14.
Figura 1: Iniezione Intraspinal di AAV1-eGFP/AAV1-flex-eGFP
(A) illustrazione schematica di un'iniezione intraspinal di un AAV1. CAG.eGFP (AAV1-eGFP) nel midollo spinale lombare, che è innervato dall'arto posteriore. (B) posizione anatomica dei segmenti del midollo spinale lombare L3-L4 può essere visto in un top-down vista della parte posteriore di un mouse. La pelle è stato aperto per esporre la colonna vertebrale. Spinali trasverse delle vertebre T13-L6 sono colorati come riferimenti anatomici e una freccia indica la cresta iliaca. (C) immagine rappresentativa di un intero supporto nel midollo spinale lombare. Fluorescenza verde indica virus trasdotte aree del midollo spinale. (D) l'immagine rappresentativa di una sezione trasversale attraverso un midollo spinale lombare AAV1-eGFP-trasdotte da un mouse di tipo selvatico. (E) immagine rappresentativa di una sezione trasversale di un AAV1. CAG.flex.eGFP-transduced del midollo spinale di un mouse GlyT2::Cre. Le linee tratteggiate rappresentano la struttura della materia grigia e superficiale corno dorsale del midollo spinale. Scala bar C = 1 mm, D = 100 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Manipolazione funzionale della colonna vertebrale che esprimono Cre Glycinergic neuroni
(A + B) Illustrazione schematica di un'iniezione intraspinal di un AAV1. EF1a.Flex.dta (A) o un AAV1. EF1a.Flex.hM3Dq (B) nel midollo spinale lombare. Espressione di cre-dipendente del frammento di tossina di difterite A (DTA) porterà ad ablazione della glycinergic neuroni (GlyT2 +) (A), mentre l'espressione di Cre-dipendente di hM3Dq la farmacogenetica recettore design renderà GlyT2 neuroni attivabili da Clozapine-N-ossido (CNO) (B). (C) tre iniezioni di AAV1. EF1a.Flex.dta nei segmenti L3-L5 di topi GlyT2::Cre hanno portati a una profonda perdita di neuroni inibitori nei rispettivi segmenti del ipsilateral ma non del lato controlaterale. (D) perdita di GlyT2 neuroni evocato un'ipersensibilità di lunga durata alla stimolazione meccanica di von Frey nella zampa posteriore ipsilateral di GlyT2::Cre topi iniettati con AAV1. EF1a.Flex.dta, ma nessun cambiamento è stato osservato se Cre-negativi topi sono stati iniettati. (E) perdita di GlyT2 neuroni evocato comportamento avversivo spontaneo che ricorda del prurito cronico. (F) hM3Dq-ha mediato l'attivazione dei neuroni GlyT2 alleviato dolore meccanico nocivo evocato da stimolo di puntura di spillo. (G) hM3Dq-ha mediato l'attivazione dei neuroni GlyT2 ridotto pruritogen (clorochina o istamina)-evocato comportamento avversivo. I dati sono rappresentati come media ± SEM. * * * p < 0,001; p < 0.01. Scala bar C = 1 mm. g = grammi. Immagini sono riutilizzati e modificati da Foster et al. 7 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: etichettatura di cellule che esprimono RORβ genetica e Virus-mediate. (A) diagramma mostra la strategia per l'espressione di Cre-dipendente del reporter fluorescente tdTomato nel RORβCre; Rosa26lox-STOP-salmone affumicato-tdTomato (R26Tom) topi. (B) Immunostaining su sezioni di midollo spinale di RORβCre; R26Tom topi ha rivelato che i neuroni NeuN + RORβ-Tom possono essere trovati in lamine IV. (C) espressione di Cre-dipendente di tdTomato inoltre è stata osservata in cellule GFAP + di RORβCre; R26Tom topi, suggerendo che RORβ è espresso in astrocytes durante lo sviluppo. Le frecce indicano double-labeled astrociti nella lamina III. Schema (D) iniezione intraspinal del virus AAV-flex-Tom (rAAV1.CAG.flex.tdTomato) in RORβCre topi per espressione di Cre-dipendente locale unità di tdTomato. (E) Immunostaining su sezioni di midollo spinale di RORβCre topi iniettati con virus AAV-flex-Tom. I neuroni RORβ-Tom sono stati localizzati a lamine superficiali del corno dorsale spinale ed espressione di tdTomato era assente dagli astrociti. (F) percentuale di RORβ-Tom le cellule che esprimono il marcatore di un neurone NeuN nelle sezioni spinali di RORβCre; R26Tom topi e RORβCre topi iniettati con virus AAV-flex-Tom. (G-H) Immunostaining su sezioni di midollo spinale di (G) RORβCre; R26Tom topi e (H) RORβCre topi iniettati con virus AAV-flex-Tom risultati colocalizzazione tra neuroni RORβ-Tom e il marcatore inibitorio Pax2 o il marcatore eccitatorio Lmx1b. (I) percentuale di RORβ-Tom neuroni che esprimono Lmx1b e Pax2 in RORβCre; R26Tom topi e RORβCre topi iniettati con virus AAV-Tom. I dati sono rappresentati come media ± SEM. dati sono da 2-3 topi e 1-3 sezioni per topo. Barre della scala rappresentano 100 µm (B, E) e 20 µm (C, E nelle immagini di alto ingrandimento, G e H). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Variabile | Valore impostato | Unità |
| calore (H) | 450 | -(valore proporzionale alla potenza del calore irradiato) |
| forza tirare preliminare (F(TH)) | 20 | -(valore proporzionale alla tensione applicata per forzare la bobina) |
| soglia di distanza (s(TH)) | 25 | 0,12 mm |
| ritardo heatstop (t(H)) | 30 | 0,5 ms |
| distanza heatstop (s(H)) | 0 | 0,12 mm |
| ritardo tirare 1 (t(F1)) | 200 | 0,5 ms |
| forza tirare 1 (F1) | 300 | -(valore proporzionale alla tensione applicata per forzare la bobina) |
| tirare di distanza 2 (s(F2)) | 30 | 0,12 mm |
| forza tirare 2 (F2) | 600 | -(valore proporzionale alla tensione applicata per forzare la bobina) |
| regolare (AD) | 0 | - |
Tabella 1: Estrattore impostazioni
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Discussion
Intraspinal iniezione di AAVs può diventare una tecnica potente in un laboratorio di ricerca, consentendo l'analisi delle cellule spinali con un'alta soluzione temporale e spaziale. Questo protocollo consente la trasduzione dei tre principali segmenti spinali innervati dai neuroni sensoriali, estendendo loro assoni periferici per l'arto posteriore. Transducing tre segmenti produce dati comportamentali robusti e riproducibili. Permette inoltre di test di un'area sensoriale più grande rispetto a possibili dopo una singola iniezione intraspinal. Ad esempio, lo stesso regime di iniezione consente di test la zampa (von Frey, Hargreaves, ecc.) e la coscia (iniezioni intradermiche, stimolazione dei meccano-recettori), ampliando così la modalità sensoriali che possono essere affrontate.
Fasi critiche:
Ci sono diversi passaggi critici per ottenere dati morfologici e comportamentali affidabile e per evitare artefatti. Il design del vettore virale e la scelta del promotore e sierotipo può avere un forte impatto sull'efficienza di trasduzione e misura della zona trasdotte e quindi sui risultati del comportamento (per informazioni dettagliate sulla diffusione virale e l'efficienza di trasduzione, vedere 12). preparati virali di alta qualità sono necessari per ridurre al minimo gli effetti collaterali dell'iniezione di virus, che può verificarsi se contaminanti o cella detriti sono presenti nella soluzione di virus. La chirurgia è necessaria per iniettare il midollo spinale è da intraprendere con grande cura al fine di evitare artefatti morfologiche e comportamentali, introdotti dalla chirurgia. Particolare attenzione è necessaria nel maneggiamento del midollo spinale, soprattutto durante la laminectomia e durante la perforazione della dura con l'ago. Danni al midollo spinale potrebbero compromettere sensazioni somatiche e coordinazione motoria del mouse, compromettendo qualsiasi pianificati esperimenti comportamentali. Inoltre, è importante montare con cura la siringa. Assemblaggio improprio o intasamento della micropipetta può ostacolare l'esperimento. Tessuto spinale al sito di iniezione deve essere esaminata alla fine dell'esperimento per verificare successo iniezione e trasduzione del sito di inoculo e per escludere danni di tessuto in eccesso come conseguenza della chirurgia. Questo protocollo è utilizzato titoli virali fino ad una concentrazione di 1 x 1013 GC/mL senza tossicità apparente, ancora più alti titoli del virus potrebbero diventare tossici ad un certo punto di tempo. Inoltre, tossicità molto probabilmente dipenderà anche la proteina codificata dall'AAV iniettato.
Modifiche:
Diversi parametri del protocollo possono essere adattati alla popolazione neuronale e la domanda di ricerca per essere studiato. Iniezione di 300 nL virus soluzione ad una profondità di 300 µm conduce alla trasduzione dei neuroni in tutto e principalmente nel corno dorsale. Se l'obiettivo è quello di neuroni bersaglio ulteriormente ventrali, la profondità può essere regolata. Iniezione di grandi volumi di virus (abbiamo usato fino a 500 nL per iniezione) porterà ad una maggiore diffusione in dorsoventral e rostrocaudal direzioni. Questo può essere utile per raggiungere il targeting di celle aggiuntive nella misura rostrocaudal, ma può aumentare la ricaduta sul lato controlaterale, che possono ostacolare l'uso del lato controlaterale come controllo interno. Inoltre, nella misura dorsoventral delle cellule trasdotte aumenterà, che può essere l'effetto desiderato o dovrebbe essere evitato. Iniezione di 300 nL ad una profondità di 300 µm evitato lato effetti sul controllo motorio in topi GlyT2::Cre, mentre l'iniezione di 500 nL o iniezione ad una maggior profondità occasionalmente prodotto motori fenotipi, come estensione spastica del hindlimb (dati non mostrati). Iniezione di volumi più piccoli può essere utilizzato per limitare il targeting a ancor più aree confinate5. Il titolo virale è un altro parametro che può essere modificato e in realtà dovrebbe essere determinato per ogni virus. Per le tossine batteriche, come ad esempio il DTA altamente efficiente, i livelli di espressione bassa potrebbero essere sufficienti per indurre l'effetto desiderato, mentre per reporter fluorescenti e DREADDs, più alti titoli possono essere necessari per espressione rilevabile o efficace.
Significato del metodo rispetto ai metodi esistenti/Alternative:
Ad oggi, sono stati utilizzati principalmente due tecniche funzionalmente interrogare i circuiti neuronali, necessari per la trasmissione dei segnali sensoriali. Molti ricercatori hanno usato le iniezioni intraspinal di rAAV codifica per reporter ed effettrici proteine in topi che esprimono recombinase per etichettare e manipolare le sottopopolazioni neuronali spinali. Intraspinal iniezione come una tecnica per manipolare le cellule spinali precedentemente è stato descritto15,16. Il protocollo descritto qui è stato specificamente progettato per trasducono i neuroni geneticamente con etichettati in tre segmenti consecutivi del midollo spinale lombare, riducendo al minimo la manipolazione chirurgica. Questo si ottiene inserendo due delle tre iniezioni nello spazio intervertebrale rostrale e caudale delle vertebre T13 e secondo, da un foro in T13 per la terza iniezione invece di rimuovere le vertebre. I segmenti mirati di L3-L5 sono l'area di terminazione principale dei neuroni sensoriali che innervano l'arto posteriore. Dimostriamo che questo tipo di trasduzione è sufficiente a produrre cambiamenti comportamentali robusti dopo la manipolazione dei neuroni glycinergic e suggerire che è adatto per l'analisi di una varietà di diversi neuroni spinali geneticamente con etichettati.
La seconda tecnica che è stata utilizzata al fine di manipolare la funzione dei sottoinsiemi di neuroni spinali si basa su attraversamento animali transgenici. Qui, topi che esprimono una ricombinasi in un sottoinsieme specifico dei neuroni spinali devono essere attraversati per topi reporter al fine di ottenere l'espressione del marcatore desiderato o proteine effettrici nel sottoinsieme di un neurone rispettivi17,18, 19. per illustrare alcune delle differenze che possono verificarsi quando confrontando i risultati ottenuti utilizzando topi reporter o iniezioni intraspinal virus abbiamo attraversato RORβCre knock-in animali a un topo reporter Cre-dipendente o iniettato RORβ Cre topi con un rAAV reporter Cre-dipendente. Abbiamo confrontato l'espressione del gene reporter ottenuto dalla rAAV di espressione del gene reporter ottenuto in RORβCre; R26Tom topi. Espressione del gene reporter ottenuto dall'iniezione intraspinal di un rAAV Cre-dipendente è stata limitata ai neuroni del midollo spinale, mentre R26Tom reporter tdTomato mouse-evocato espressione si trova anche negli astrociti. Ciò suggerisce che il RORβ è espresso transitoriamente negli astrociti. Allo stesso modo, Gutierrez-Mecinas et al. trovato un'espressione più ristretta di reporter (spazialmente e specifici del tipo di cellula) dopo l'iniezione virale rispetto all'espressione di reporter del mouse-evocato in Tac1Cre topi20. Utilizzando iniezioni intraspinal di un reporter di rAAV nel midollo spinale di topi adulti, espressione del gene reporter e/o dell'effettore in modo efficiente può essere limitato alla popolazione di cellule che esprimono il gene nell'adulto e quindi evitare di ricombinazione o espressione in quelle popolazioni con precedenti attività del gene transitoria.
Un secondo vantaggio principale delle iniezioni intraspinal rAAV è la possibilità di limitare l'espressione dei geni codificati rAAV al sito di iniezione. In topi transgenici, espressione di driver-mediata Cre spesso non è solo trovato nella sottopopolazione neuronale di interesse, ma anche in altre popolazioni all'interno del sistema nervoso. Dymecki e colleghi, come pure i gruppi di Ma e Goulding, hanno sviluppato modi eleganti dell'utilizzo di approcci basati su mouse Intersezionali reporter che evitare di ricombinazione in parti del sistema nervoso che deve rimanere inalterato17, 18,19,21,22,23. Utilizzando topi knock-in per ottenere l'espressione delle proteine marker o effettore può essere presupposto per essere meno variabile, come c'è solo una copia genomic della cassetta rispettivi espressione per la cellula e la cassetta di espressione è presente in tutte le cellule nella regione di interesse . Al contrario, la presenza di una cassetta di espressione rispettivi e anche il numero di copie della cassetta espressione dopo trasduzione virale dipende l'efficienza di trasduzione, che può variare da cella a cella, da iniezione per iniezione e dipende la sacco di virus. Infine, lo svantaggio principale dell'espressione genica mediata da virus rispetto ai tradizionali metodi genetici è la necessità di intervento chirurgico. Infiammazione/lesione chirurgia-mediata possano riguardare direttamente i neuroni e circuiti. L'inclusione dei topi di controllo che hanno subito lo stesso intervento chirurgico è pertanto obbligatorio.
Future applicazioni:
Iniezione intraspinal può essere utilizzato per analizzare e manipolare qualsiasi sottopopolazione spinale geneticamente identificati tramite sovraespressione di proteine effettrici e marker. È quindi probabile nel futuro che molti adotterà questa tecnica per studiare popolazioni neuronali nel loro fuoco specifico. Inoltre, oltre a utilizzare intraspinal iniezione di rAAVs per raggiungere la sovraespressione di proteine effettrici esogeno, questa tecnica può essere utilizzata anche al silenzio o iperesprimere proteine endogene e quindi di studiare la funzione di qualsiasi dato gene con alta spaziale e risoluzione temporale.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo Hanns Ulrich Zeilhofer per sostenere generosamente questo lavoro. Hendrik Wildner è stata sostenuta dalla Fondazione Olga Mayenfisch. Ringraziamo Carmen Birchmeier per l'anticorpo di Lmx1b.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| micropipette puller: DMZ-Universal-Electrode-Puller | Zeitz | NA | |
| anesthesia unit: Oxymat3 oxygen concentrator | Weinmann | NA | |
| anesthesia unit: VIP 3000 Veterinary Vaporizer | Midmark | NA | |
| Heat mat: Mio Star Thermocare 100 | Migros | 717614700000 | |
| Electric shaver | Philips | BT9290 | |
| surgical microscope (OPMI pico) | Zeiss | NA | |
| Small animal stereotaxic apparatus | Kopf | NA | |
| Neurostar StereoDrive (optional) | Neurostar | NA | |
| Model 51690 Cunningham mouse spinal adaptor | Harvard Apparatus | 72-4811 | |
| PHD Ultra syringe pump with nanomite | Harvard Apparatus | 70-3601 | |
| Hamilton 701 RN 10 μl glass microliter syringe | Hamilton | 7635-01 | |
| Hamilton Removable needle (RN) compression fitting 1 mm | Hamilton | 55750-01 | |
| fine dentistry drilling apparatus: Osada success 40 | Osada | OS-40 | |
| spherical cutter, 0.5mm | Busch | 12001005B | |
| electronic von Frey anesthesiometer | IITC | 23905 | |
| flexible von Frey hairs | IITC | #7 | |
| LSM710 Pascal confocal microscope | Zeiss | NA | |
| 0.8 NA × 20 Plan-apochromat objective | Zeiss | NA | |
| 1.3 NA × 40 EC Plan-Neofluar oil-immersion objective | Zeiss | NA | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Tools | |||
| Scalpel Handle #4, 13cm | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Adson forceps, 1 x 2 teeth, 12 cm | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Friedman-Pearson rongeurs, curved, 0.7 mm cup | Fine Science Tools | 16121-14 | |
| Dumont #2 laminectomy forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
| Olsen-Hegar needle holders, serrated, 8.5 mm clamp length | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| Fine forceps #5 | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables and Chemicals | |||
| Thin-wall glass capillary, 1mm outside diameter | World Precision Instruments | TW 100-3 | |
| Syringes (1, 5 and 20 ml) | B. Braun | (9166917V, 4606051V, 4606205V) | |
| 26G beveled needle | B. Braun | 4665457 | |
| Sterile scalpel blades | B. Braun | BB523 | |
| Surgical sutures Safil Quick+ 4/0, absorbable | B. Braun | C1046220 | |
| Surgical sutures Premilene 5/0, non-absorbable | B. Braun | C0932191 | |
| Sterile PBS or saline (0.9%) | NA | ||
| Ethanol, 70% (disinfectant) | NA | ||
| Iodine solution (e.g. Braunol) | B. Braun | 18380 | |
| Anaesthetics (e.g. Attane isoflurane) | Provet | 2222 | |
| Aldasorber | Provet | 333526 | |
| analgesics (e.g. buprenorphine: temgesic) | Indivior | GTIN: 7680419310018 | |
| Ophthalmic ointment (e.g. vita-pos) | Pharma medica | GTIN: 4031626710635 | |
| Cotton swabs (e.g. from) | IVF Hartmann | 1628100 | |
| Facial tissues (e.g. from) | Uehlinger AG | 2015.10018 | |
| Superfrost plus microscope slides | ThermoScientific | J1800AMNZ | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| C57BL/6J mice (wildtype) | The Jackson Laboratory | RRID:IMSR_JAX:000664 | |
| Rorbtm1.1(cre)Hze/J mice (RORβCre) | The Jackson Laboratory | RRID:IMSR_JAX:023526 | |
| Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J mice (R26Tom) | The Jackson Laboratory | RRID: IMSR_JAX:007914 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Viral vectors | |||
| AAV1.CB7.CI.eGFP.WPRE.rBG (AAV1.CAG.eGFP) | Penn Vector Core | AV-1-PV1963 | |
| AAV1.CAG.flex.eGFP.WPRE.bGH (AAV1.CAG.flex.eGFP) | Penn Vector Core | AV-1-ALL854 | |
| AAV1.CAG.flex.tdTomato.WPRE .bGH (AAV1.CAG.flex.tdTomato) |
Penn Vector Core | AV-1-ALL864 | |
| AAV1.EF1a.flex.DTA.hGH (AAV1.EF1a.flex.DTA) | Penn Vector Core | Custom production | |
| AAV1.hSyn.DIO.hM3D(Gq)-mCherry.hGH (AAV.flex.hM3D(Gi)) | Penn Vector Core | Custom production | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmids | |||
| pAAV.hSyn.flex.hM3D(Gq)-mCherry | Addgene | 44361 | |
| pAAV.EF1α.flex.hChR2(H134R)-eYFP | Addgene | 20298 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacteria | |||
| MDS42 | ScarabGenomics | ||
| Stbl3 | ThermoScientific | C737303 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Quiagen | 12362 | |
| NucleoBond PC 500 | Machery & Nagel | 740574 | |
| clozapine-N-oxide (CNO) | Enzo Life Sciences | BBL-NS105-0025 | |
| chloroquine diphosphate salt | Sigma | C6628 | |
| histamine | Sigma | H7125 | |
| Dapi | Invitrogen | D3571 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies (dilution) | |||
| Rabbit anti-GFP (1:1000) | Molecular Probes | RRID:AB_221570 | |
| Rabbit anti-NeuN (1:3000) | Abcam | RRID:AB_10711153 | |
| Goat anti-Pax2 (1 : 200) | R & D Systems | RRID:AB_10889828 | |
| Guinea pig anti-Lmx1b (1 : 10 000) | Dr Carmen Birchmeier | Muller et al. 2002 | |
| Rabbit anti-GFAP (1 : 1000) | DakoCytomation | RRID:AB_10013382 | |
| Secondary antibodies raised in donkey (1:800) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | NA |
References
- Goulding, M., Bourane, S., Garcia-Campmany, L., Dalet, A., Koch, S. Inhibition downunder: an update from the spinal cord. Curr Opin Neurobiol. 26, 161-166 (2014).
- Todd, A. J. Neuronal circuitry for pain processing in the dorsal horn. Nat Rev Neurosci. 11 (12), 823-836 (2010).
- Sandkuhler, J. Models and mechanisms of hyperalgesia and allodynia. Physiol Rev. 89 (2), 707-758 (2009).
- Zeilhofer, H. U., Wildner, H., Yevenes, G. E. Fast synaptic inhibition in spinal sensory processing and pain control. Physiol Rev. 92 (1), 193-235 (2012).
- Azim, E., Jiang, J., Alstermark, B., Jessell, T. M. Skilled reaching relies on a V2a propriospinal internal copy circuit. Nature. 508 (7496), 357-363 (2014).
- Cui, L., et al. Identification of Early RET+ Deep Dorsal Spinal Cord Interneurons in Gating Pain. Neuron. 91 (6), 1413 (2016).
- Foster, E., et al. Targeted ablation, silencing, and activation establish glycinergic dorsal horn neurons as key components of a spinal gate for pain and itch. Neuron. 85 (6), 1289-1304 (2015).
- Francois, A., et al. A Brainstem-Spinal Cord Inhibitory Circuit for Mechanical Pain Modulation by GABA and Enkephalins. Neuron. 93 (4), 822-839 (2017).
- Peirs, C., et al. Dorsal Horn Circuits for Persistent Mechanical Pain. Neuron. 87 (4), 797-812 (2015).
- Petitjean, H., et al. Dorsal Horn Parvalbumin Neurons Are Gate-Keepers of Touch-Evoked Pain after Nerve Injury. Cell Rep. 13 (6), 1246-1257 (2015).
- Zhang, Y., et al. Identifying local and descending inputs for primary sensory neurons. J Clin Invest. 125 (10), 3782-3794 (2015).
- Haenraets, K., et al. Spinal nociceptive circuit analysis with recombinant adeno-associated viruses: the impact of serotypes and promoters. J Neurochem. , (2017).
- Abraira, V. E., et al. The Cellular and Synaptic Architecture of the Mechanosensory Dorsal Horn. Cell. 168 (1-2), 295-310 (2017).
- Wildner, H., et al. Genome-wide expression analysis of Ptf1a- and Ascl1-deficient mice reveals new markers for distinct dorsal horn interneuron populations contributing to nociceptive reflex plasticity. J Neurosci. 33 (17), 7299-7307 (2013).
- Inquimbert, P., Moll, M., Kohno, T., Scholz, J. Stereotaxic injection of a viral vector for conditional gene manipulation in the mouse spinal cord. J Vis Exp. (73), e50313 (2013).
- Kohro, Y., et al. A new minimally-invasive method for microinjection into the mouse spinal dorsal horn. Sci Rep. 5, 14306 (2015).
- Bourane, S., et al. Gate control of mechanical itch by a subpopulation of spinal cord interneurons. Science. 350 (6260), 550-554 (2015).
- Bourane, S., et al. Identification of a spinal circuit for light touch and fine motor control. Cell. 160 (3), 503-515 (2015).
- Duan, B., et al. Identification of spinal circuits transmitting and gating mechanical pain. Cell. 159 (6), 1417-1432 (2014).
- Gutierrez-Mecinas, M., et al. Preprotachykinin A is expressed by a distinct population of excitatory neurons in the mouse superficial spinal dorsal horn including cells that respond to noxious and pruritic stimuli. Pain. 158 (3), 440-456 (2017).
- Awatramani, R., Soriano, P., Rodriguez, C., Mai, J. J., Dymecki, S. M. Cryptic boundaries in roof plate and choroid plexus identified by intersectional gene activation. Nat Genet. 35 (1), 70-75 (2003).
- Kim, J. C., et al. Linking genetically defined neurons to behavior through a broadly applicable silencing allele. Neuron. 63 (3), 305-315 (2009).
- Kim, J. C., Dymecki, S. M. Genetic fate-mapping approaches: new means to explore the embryonic origins of the cochlear nucleus. Methods Mol Biol. 493, 65-85 (2009).
