Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Adeno-assosiert Virus-mediert Transgene uttrykk i genetisk definerte nerveceller i ryggmargen

Published: May 12, 2018 doi: 10.3791/57382
Automatic Translation
*1,2, *1, 1, 1
1Institute of Pharmacology and Toxicology, University of Zurich, 2Institute of Pharmaceutical Sciences, Swiss Federal Institute (ETH) Zurich
* These authors contributed equally

Summary

Intraspinal injeksjon av recombinase avhengig av rekombinant adeno-assosiert virus (rAAV) kan brukes til å manipulere en genetisk merket celle type i ryggmargen. Her beskriver vi hvordan transduce nerveceller i dorsal horn i lumbal ryggmargen. Denne teknikken gjør funksjonelle avhør av manipulert Nevron undertypen.

Abstract

Selektiv manipulering av spinal neuronal subpopulasjoner har hovedsakelig blitt oppnådd av to ulike metoder: 1) interseksjonell genetikk, der doble eller tredoble transgene mus genereres for å oppnå selektiv uttrykk for en reporter eller effektor Gene (f.eksfra Rosa26 locus) i ønsket spinal befolkningen. 2) intraspinal injeksjon av grobunn-avhengige rekombinant adeno-assosiert virus (rAAV); Her er grobunn-avhengige AAV vektorer koding for reporter eller effektor genet av valget injisert i ryggmargen mus uttrykke grobunn recombinase i den ønskede neuronal subpopulasjon. Denne protokollen beskriver hvordan å generere grobunn-avhengige rAAV vektorer og hvordan transduce nerveceller i dorsal horn i lumbal ryggmargen segmenter L3-L5 med rAAVs. Som lumbale spinal segmentene L3-L5 er innerveres av de perifere sensoriske neurons som overfører sensoriske informasjonen fra hindlimbs, kan spontan opptreden og svar på sensoriske tester på hindlimb ipsilateral til injeksjon side være analysert for å avhøre funksjon manipulert neurons i Sensorisk prosessering. Vi gir eksempler på hvordan denne teknikken kan brukes til å analysere genetisk definert delsett av spinal neurons. De viktigste fordelene med virus-mediert transgene uttrykk i grobunn transgene mus sammenlignet med klassisk reporter mus-indusert transgene uttrykk er følgende: 1) forskjellige grobunn-avhengige rAAVs koding ulike reporter eller effektor proteiner kan være injisert i én grobunn transgene linje, dermed overvinne behovet for å opprette flere flere transgene musen linjer. 2) intraspinal injeksjon begrenser manipulering av grobunn-uttrykke celler injeksjonsstedet og tiden etter injeksjon. De viktigste ulempene er: 1) Reporter genuttrykk fra rAAVs er mer variabel. 2) kirurgi er nødvendig å transduce spinal neurons rundt. Hvilke av de to metodene er mer hensiktsmessig, avhengig av Nevron befolkningen og forskning spørsmålet tas.

Introduction

Dorsal ryggmargen er viktig for informasjonsutveksling mellom utkanten av kroppen og hjernen. Sensoriske stimuli som varme, kulde, rør, eller skadelige stimuli oppdages av spesialiserte eksterne neurons, som formidler denne informasjonen til nerveceller i ryggmargen dorsal Hornet. Her et kompleks nettverk av hemmende og eksitatoriske interneurons modulerer og til slutt reléer sensoriske informasjonen via spinal projeksjon neurons å supraspinal nettsteder1,2. Beregninger utføres spinal inter- og projeksjon neurons gate sensoriske informasjonen, dermed å bestemme hvilken er undertrykt eller videresendt som intensitet. Endringer i integrering av sensoriske stimuli, som en endret balansen mellom hemming og eksitasjon, kan forårsake sensoriske dysfunksjoner som overfølsomhet eller allodynia (smertefulle opplevelser etter normalt ikke-smertefulle stimulering). Disse endringene er antatt å være den underliggende årsaken til ulike kroniske smerter sier3,4. Dermed spinal kretser er av høy betydning i Sensorisk prosessering og dermed i oppfatningen av en organismes omgivelser og selv. Med det nylig advent kombinasjon av molekylære, genetisk og kirurgiske teknikker som tillater presis manipulering av genetisk identifiserte spinal Nevron subpopulasjoner, begynner forskere nå å forstå underliggende spinal kretser ansvarlig for behandling av ulike sensoriske modaliteter.

Intraspinal injeksjon av rAAV i vill-type eller transgene mus har sterkt bidratt til manipulasjon, analyse og forståelse av den spesifikke delsett av spinal neurons5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11. denne teknikken kan levering av markør proteiner (for eksempel GFP / GFP fusion proteiner), reporter proteiner (for eksempel GCaMP) eller effektor proteiner (som bakteriell giftstoffer, channelrhodopsin eller farmakogenetiske reseptorer) i en romlig begrenset måte spinal neurons. Lokale injeksjon av grobunn-avhengige rAAVs i transgene mus uttrykke grobunn recombinase i et bestemt delsett av spinal neurons kan bestemt analyse av respektive neuronal befolkningen. Vi har brukt denne teknikken til å merke, ablate, hemme eller aktivere spinal glycinergic neurons viser at de er en viktig del av spinal gate kontrollere smerte og kløe overføring7. Disse eksperimentene aktivert intraspinal injeksjon av grobunn-avhengige rAAV i GlyT2::Cre mus selektiv manipulering av glycinergic nerveceller i ryggmargen lumbale. Dermed kan samtidige manipulering av supraspinal kretser som inneholder glycinergic neurons avgjørende for overlevelse av dyret unngås.

Mens en intraspinal injeksjon av rAAVs begrenser smitte til området av injeksjon, kan viral signaltransduksjon oppstå ikke bare i lokal nerveceller, men også i nerveceller som kobler til injeksjonsstedet via axonal anslag. Sistnevnte brukes ofte til å spore CNS områder gir neuronal innspill til en bestemt kjerne i hjernen. Infeksjon av axonal anslag kan imidlertid også være en forvirrende faktor når en definert befolkning av neurons skal bli utdannet ved et bestemt område. For å løse disse problemene, har vi nylig gjennomført en omfattende analyse av AAV serotyper og uttrykk kassetter å identifisere serotyper og arrangører som kan brukes til å minimere eller maksimere retrograd signaltransduksjon. I forbindelse med denne bestemte forskning i spinal kretser analyserte vi evne til annen serotyper og arrangører å retrogradely transduce nerveceller i dorsal root Ganglion (DRG), rostral ventromedial medulla (Benytterrvm) og somatosensory cortex 12. teknikken beskrevet i denne protokollen kan derfor brukes å analysere spinal neurons på injeksjonsstedet eller analysere projeksjon neurons som gir inngang til området injisert i ryggmargen. Protokoll beskrevet her, utføres tre injeksjoner av rAAV i venstre side av lumbale ryggmargen for å aktivere signaltransduksjon neurons i tre lumbale segmenter (L3-L5). L3-L5 segmentene få mesteparten av sanseinntrykk fra hindlimb ipsilateral til injeksjonsstedet. Vi viser at funksjonelle manipulasjon av genetisk merket nerveceller i L3-L5 er tilstrekkelig til å fremkalle robust atferdsendringer, altså funksjonelle bevis for funksjonen krets i slike en genetisk merket Nevron undertype.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreforsøk ble godkjent av sveitsiske cantonal veterinær kontor (Zürich) og er i samsvar og overholdelse av alle relevante regulatoriske og institusjonelle retningslinjer.

Merk: Alle materialer med respektive produsenter og/eller leverandører er oppført i Tabellen for materiale.

1. generasjon grobunn-avhengige AAV vektorer

Merk: En rekke grobunn-avhengige vektorer med ulike arrangører kan kjøpes (se Tabell for materiale) eller, hvis den ønskede uttrykk konstruere ikke er tilgjengelig, det kan genereres ved å endre eksisterende AAV konstruksjoner. Merk selskapet samt serotype kan ha innvirkning på spredningen av viral signaltransduksjon (se 12). Den første delen av denne protokollen beskriver kort generasjonen av to forskjellige grobunn-avhengige AAV vektorer egnet for gevinst og tap funksjonen eksperimenter, henholdsvis.

  1. Farmakogenetiske Aktivisering (gevinst funksjonen)
    1. Bestill pAAV.hSyn.flex.hM3D (Gq)-mCherry (se Tabell for materiale) for designer reseptorer utelukkende aktivert av syntetiske medikamenter (DREADD)-mediert aktivisering.
    2. Ved mottak av bakteriell stikk kulturen, strek ut bakterier på LB plater (bakteriologiske-grade agar oppløst i Luria-Bertani flytende medium) supplert med det passende antibiotikumet. Ruge over natten på 37 ° C og plukke en enkelt koloni på neste dag.
      Merk: Plasmider inneholder AAV vektor genomer kan være ustabilt og rekombinasjon i viral genomet, spesielt innen viral invertert terminalen gjentar (ITR), kan oppstå under forsterkning i E. coli. Vi foreslår bruker recA dårlig/undertrykt påkjenningen slik som MDS42 eller Stbl3 for å unngå rekombinasjon i plasmider inneholder AAV genomet.
    3. Forsterke bakterier følge instruksjonene gitt av leverandøren av valgt DNA-Maxi-Kit og forberede høykvalitets plasmider DNA med en kommersielt tilgjengelig DNA-Maxi-Kit (f.eksse Tabellen for materiale). Utføre en kvalitetskontroll av plasmider DNA forberedelse ved å kontrollere integritet og identiteten til plasmider DNA gjennom begrensning Sammendrag av en aliquot av plasmider DNA.
      Merk: Det er anerkjennelse nettsteder for begrensning endonuclease SmaI innen ITRs. Ta et SmaI Sammendrag i kvalitetskontroll å kontrollere integriteten til ITRs.
    4. Sende DNA til et viral vektor kjernen for å produsere høykvalitets rAAV.
      Merk: Høy titer, høykvalitets viral forutbetalt er avgjørende for å unngå confounding fenotyper forårsaket av forurensing i det viral prep. Vi anbefaler derfor å ha rAAV valgfrihet produsert i et etablert vektor kjernen anlegg, med mindre AAV produksjonen er godt etablert i laboratoriet.
  2. Ablasjon (tap av funksjon)
    Merk: Bakteriell giftstoffer eller gift reseptorer kan brukes å megle celle ablasjon eller neuronal stanse. Vi har generert pAAV.EF1α.flex.DTA til express difteri gift fragment A (DTA) på en måte som grobunn-avhengige.
    1. Vil generere en grobunn-avhengige viral vektor, velge en grobunn-avhengige vektor med en egnet promoter (f.eks, pAAV.EF1α.flex.hChR2(H134R)-eYFP). Forsterke koding sekvensen av valg (f.eksDTA) av polymerasekjedereaksjons med primer som omfatter AscI og NheI eller kompatibel begrensning endonuclease anerkjennelse områder i deres overheng (se Foster et al. 7)
    2. Bruke standard molekylærbiologi teknikker, utføre begrensning oppsummeringer av vektoren DNA (pAAV.EF1α.FLEX.hChR2(H134R)-eYFP) og av PCR-forsterket setter (NheI-DTA-ASCII) med begrensning endonucleases AscI og NheI. Ligate renset fragmenter.
    3. Transformere ligation reaksjonen til egnet bakterier, i henhold til protokollen gitt av leverandøren av kompetente bakterier valgfrihet og plate bakterier på LB plater. Bruke recA dårlig/undertrykt stammer, som MDS42 eller Stbl3, for kloning og påfølgende forsterkning av plasmider DNA.
    4. På dagen etter transformasjon plukke kloner og vaksinere dem i LB medium med passende antibiotikumet overnatting på 37 ° C. På den neste dagen, ekstra plasmider DNA fra kulturperler bakterier. Kontroller vellykket kloning av begrensning fordøyer og sekvensering av den utpakkede plasmider DNA.
    5. Forsterke høy kvalitet, bakteriell plasmider DNA (se trinn 1.1.3). Sende forsterket DNA til et viral vektor kjernen for virus produksjon.

2. signaltransduksjon Spinal celler

  1. Utarbeidelse av Virus løsning
    Forsiktig: Virus er smittsomme reagenser og skal håndteres i henhold til relevante retningslinjer. I de fleste tilfeller kan rAAVs håndteres på biosikkerhet nivå 1 (BSL1).
    1. Ved injeksjon, defrost en lager aliquot av ønsket renset virus på is og holde det på is inntil rett før injeksjon. Unngå gjentatte fryse-Tin-sykluser, da dette vil redusere den effektive titer av viruset.
      Merk: Om nødvendig defrosted virus aliquot kan holdes på 4 ° C i opptil 3 dager.
    2. Fortynne viruspartikler i sterilt 0,9% NaCl eller fosfat bufret saltvann (PBS).
      Merk: Den aktuelle titer avhenger eksperimentelle målene og bør fastsettes eksperimentelt. En god totale viral belastning er å starte med 3 x 109 genomet kopier (3.33x1012 GC/mL, 3 x 300 nL injisert). Tar overflødig og tap under lasting av kapillær i kontoen, ca 2,5 µL av virus løsning vil være behov for hver musen.
  2. Utarbeidelse av Mikropipetter for Intraspinal injeksjoner
    1. "Pull" tynne vegger glass kapillærene (ytre diameter 1 mm) på en brønnene avtrekker å lage en ~5.5 mm lange, grunne skaft. Bruk en 3.0 mm varmeapparatet filament og innstillingene for programmet 00 med P(A) tilpasset i tabell 1.
      Merk: Trekke kan gjøres på forhånd. Trakk kapillærene skal lagres i en lukket beholder på modell-leire for å unngå støv, som senere kan tette av brønnene. Autoklavering av Mikropipetter er ikke nødvendig.
    2. Klipp skaft av trakk capillary med laminectomy tang til en lengde på ca 4,5 til 5 mm opprette et tips åpning med en diameter på 25-35 μm. Bruker et mikroskop med en mikrometer skala, mål den indre diameteren på flere Mikropipetter å få en følelse for hvor store åpningen bør, eller mål for alle brønnene.
      Merk: En mindre tips kan føre til tilstopping; en større tips kan forårsake skade på vev og vanskeligheter å trenge ryggmargen.
  3. Utarbeidelse av kirurgiske oppsett og verktøy
    1. Sikre utstyret er ren og klar til bruk. Desinfiser arbeidsområdet ved å tørke med 70% etanol og sterilisere verktøy autoklavering eller desinfeksjon dem. Ikke la noen desinfiserende på mikroliter sprøyten som ville skade viral vektoren skal brukes.
  4. Anestesi og utarbeidelse av dyret for kirurgi
    Merk: Den totale varigheten til operasjonen er 60-90 min.
    1. Velg 6 - til 10 - uke gamle mus å lette den kirurgiske prosedyren.
      Merk: Hvis eksperimentell design krever det, injeksjon av yngre eller eldre dyr er mulig. Belastning og begge kjønn kan brukes i prinsippet, men bruke den samme bakgrunn stammen (f.eks C57BL/6J) for sammenligning av mellom forskjellige transgene musen linjer. Hvis kjønnsforskjeller forventes eller undersøkes, analysere menn og kvinner i separate grupper.
    2. Indusere anestesi bruker ~ 5% isoflurane. Plassere dyret i stereotaxic rammen på varme mat og vedlikeholde anestesi på 1-2.5% isoflurane (air flow rate 900 mL/min). Overvåke pustefrekvens hele operasjonen.
    3. Bruke smøremiddel øye ointment å forhindre hornhinnen tørking under operasjonen.
    4. Barbere dyrets tilbake og fjerne hår med våt vev. Desinfiser barbert huden med joden løsning og la huden til tørk.
    5. Gi smertestillende behandling (f.eks0.1-0.2 mg/kg buprenorfin subcutaneously).
  5. Eksponering av virvelsøylen på lumbale ryggmargen nivå
    Merk: Differensiell utbygging av ryggmargen og virvelsøylen, de respektive nivåene er ikke justert, men lumbale ryggmargen segmentet L4 er på samme nivå som thorax vertebra T13.
    1. Finne mest caudal vrbord paret ved palpating langs virvelsøylen. Bruke en skalpell, lage en 1.5-2.5 cm langsgående kutt i huden fra bare rostral til mest caudal vrbord paret.
    2. Løft huden med tang og koble det fra underliggende muskler med saks. Hele operasjonen, holde eksponert vev fuktig med sterilt 0,9% NaCl.
    3. Bruke fine tang og liten saks, gjør et snitt i neste, tynne membranous laget ved midtlinjen og avskåret fra spinous prosesser. Det er atskilt fra den underliggende paraspinous muskelen, men knyttet til spinous prosesser.
  6. Identifikasjon av ryggsøylen på lumbale ryggmargen nivå
    Merk: Når virvelsøylen er utsatt, intertransverse leddbånd og dorsal spinous prosesser skal vises. Flere anatomiske landemerker kan hjelpe identifisere riktig vertebra til målet (figur 1B).
    1. Rykk huden tilbake mot halen å avsløre iliaca bølgetopp. På samme nivå blir den mest caudal par synlig intertransverse leddbånd L6 spinous prosessen. Telle bakover i en caudal rostral retning å identifisere vertebra rundt.
    2. Palpate langs virvelsøylen. Mest caudal vrbord paret ligger bare rostral å T13 vertebra bekkenbenet på hip-nivå er på nivå med L6 vertebra.
    3. Finn et sted hvor senen langs siden av virvelsøylen er hviteste og mest mediale. T13 vertebra ligger bare rostral. Lumbale ryggmargen segmentet L4 ligger dette vertebra.
  7. Fiksering av virvelsøylen og eksponering av lumbale ryggmargen
    1. Plass dyr på en pute av fremhevet vev å heve det til spinal klyper stereotaxic rammen.
    2. Fastsette mål vertebra for å unngå bevegelser av virvelsøylen på grunn av pusting. For dette målet, justere klemmer ved målet vertebra, fastsette en klemme i posisjon og hold virvelsøylen med Adson tang mens den andre Monteringsklemme.
      Merk: Kolonnen skal vinkelrett injeksjon flyet og bestemt fast slik at det ikke flytte på press ovenfra. Om nødvendig kan et par klemmer fast å virvelsøylen. I dette tilfellet er det nyttig å fikse på to par klemmer til to tilstøtende målet vertebra ryggsøylen.
    3. Fjern paraspinous muskelen over ryggvirvlene rundt. Bruke skalpell, lage en parallelt innsnitt bare mediale til sener som er parallelle med virvelsøylen, samt vinkelrett incisions rostral og caudal til målet vertebra. Pass på at du ikke kutte for dypt. Rive/klippe bort muskelen ved hjelp av rongeurs. Bruk tang behov for å fjerne vev igjen på vertebra eller over dura i intervertebral plass.
    4. I intervertebral plass skal dorsal blodkaret vises merking midtlinjen i ryggmargen. Ensidig injeksjoner, utføre en delvis laminectomy ved å bore et hull i midten av siden målet på vertebra. Bruk en fin odontologi boring apparater med 0,5 mm sfærisk kniv og bore spesielt nøye når du nærmer ryggmargen. Fjern alle gjenværende beinfragmenter med en 26G skrå nål å avsløre ryggmargen.
    5. Bruker en 26G skrå nål, autoperforering dura boret hullet og intervertebral plass rostral og caudal til målet vertebra, alle ca 200 µm lateral til dorsal blodkaret. Cerebrospinalvæske bør være rømmer fra hullene og ryggmargen bør være litt svulmende.
  8. Forberedelse av injeksjon
    Merk: Injeksjon sprøyten bør være forberedt umiddelbart før starten av injeksjon for å redusere risikoen av støvpartikler tilstopping av brønnene.
    1. Montere av glass kapillær på mikroliter sprøyte flyttbare p-komprimering monteringssett. Fest mutteren tett for å sikre en fast og sikker passform.
    2. Fyll sprøyten mikroliter med sterilt destillert vann og begynne å trykke den ut med stempelet.
      Merk: Hvis det er for mye motstand slik at vannet ikke lett komme ut av spissen, på brønnene er sannsynlig blokkert og bør byttes.
    3. Monter sprøyten til en micromanipulator som er koblet til en elektronisk styrte microinjector. Pass på at du ikke ta på noe med brønnene.
    4. Bruker microinjector, trekke opp ca 1 µL av air å lage en boble mellom vannet og virus.
    5. Plasser en 2,5 µL dråpe virus løsning på et stykke av parafin film, nøye flytte tuppen av av brønnene i slippverktøyet med stereotaxic rammen og utarbeide det. Deretter forsiktig trykk dispensere til litt virus løsning kommer på spissen.
    6. Trekke sprøyten og bruke penn, merke brønnene med skala og Merk nivået av det virus løsningen; Dette vil lette overvåking av om infusjonen går som programmert.
  9. Intraspinal injeksjoner
    1. Flytte tuppen av brønnene over en av hullene i dura og deretter ned til en liten bulk er nevnt i dura. Målrettingsland injeksjon til spinal dorsal horn, Flytt ned 500 µm i 100 µm sammenhengende trinn (fart 1 mm/s) og deretter 200 µm opp å tillate mekanisk stabilisering av vev.
      Merk: Siste dybden tips er 300 µm i dette tilfellet, men kan tilpasses avhengig av målet.
      1. Hvis vevet er motstandsdyktig mot gjennomtrengning, kan i brønnene være fanger på dura. I dette tilfellet trekke og flytte litt til skal ligge over hullet, eller bruk nålen igjen for å autoperforering dura riktig før du gjentar forsøket på penetrasjon.
    2. Programmet pumpen til en injeksjon målvolumet 300 nL en hastigheten injeksjon av 50 nL/min og trykk på start-knappen for å starte infusjonen.
    3. Når injeksjon er fullført, kan du kontrollere omfanget for å se om viruset nivået har falt og la brønnene i stedet for en ytterligere 3 minutter at trykket for equilibrate før sakte trekke sprøyten.
    4. Gjenta trinn 2.9.1.-2.9.3. for de andre to injeksjon nettstedene.
  10. Suturing og gjenoppretting
    1. Fjern de spinal klemmer og pute under musen.
    2. Lukke såret i lag med avbrutt masker, suturing overfladisk vev lag med absorberbare suturer og huden med ikke-absorberbare suturer. Bruk jod desinfeksjonsmiddel sutured såret.
    3. Avslutte av bedøvelsen og la dyret på varme mat til gjenoppretter før tilbake til buret sitt hjem.
  11. Postoperative bekymring
    1. Overvåke tilstanden til dyret på dagen og neste dag, deretter hver 2-3 dager. Sikre at dyret har en normal gange, et sunt utseende (vekt, øyne, pels og atferd), og at såret er healing.
    2. Fortsette smertestillende behandling (f.eks0.1-0.2 mg/kg buprenorfin subcutaneously) som nødvendig, tre ganger per dag.

3. atferd og morfologiske analyser

  1. Atferdsanalyse
    Merk: Tillat dyr til plass respektive oppsettet for minst 30 min før målene for å la dem å tilpasse seg nye eksperimentelle miljøet.
    1. von Frey Test
      1. Plasser dyr individuelt i enkelte avdelinger på ca 10 cm x 10 cm på et metall rutenett gulvet.
      2. Stimulere plantar overflaten av hindpaw ipsilateral til injeksjonsstedet med en dynamisk von Frey filament. Merk kraften som trekker dyret labben fra stimulans.
      3. Gjenta fem ganger og beregne gjennomsnittlig tilbaketrekning grensen fra seks målene for hvert dyr.
    2. PIN stikk Test
      1. Plasser dyr i enkelte avdelinger på ca 10 cm x 10 cm på et metall rutenett gulvet.
      2. Stimulere plantar overflaten av hindpaw ipsilateral til injeksjonsstedet med en avstumpet 26-G nål uten gjennomtrengning av huden. Score atferd som null (ingen reaksjon) eller en (reaksjon).
      3. Gjenta 9 ganger med intervaller på 3 minutter mellom stimulations og beregne prosentandelen svar fra 10 målene for hvert dyr.
    3. Injeksjon av DREADD-ligand clozapine-N-oxide (CNO)
      1. Løses CNO i dimethyl sulfoxide (DMSO) opprette en lagerløsning av 0,2 mg/µL, som kan lagres ved romtemperatur.
      2. På dagen for eksperimentet, fortynne lagerløsning i sterilt 0,9% NaCl til 0,2 µg/µL og injisere 10 µL/g kroppsvekt intraperitoneally. Sett inn kontrollen dyr med kjøretøy (0,2% DMSO 0,9% NaCl).
        Merk: Ifølge erfaring, topp effekter på atferd kan være forventet 1-3 h etter injeksjon, og effekter skal helt avta etter 24 timer. Ved aktivering av glycinergic neurons, observert atferd inkluderer redusert smerte og kløe svar. Atferd fremkalt av DREADD-mediert aktivisering av neurons avhenger av målrettet delsettet av spinal neurons.
    4. Injeksjon av Pruritogens å indusere kløe
      1. Oppløse pruritogens i 0,9% NaCl løsninger 8 mg/mL (chloroquine) eller 10 mg/mL (histamin). 2t etter CNO administrasjon, injisere 10 µL av pruritogen eller kjøretøy løsningen subcutaneously i plantar overflaten av hindpaw ipsilateral til spinal innsprøytingen sted. Alternativt, injisere pruritogen intradermally i leggen, som har blitt barbert dagen før for å redusere aversive atferd skyldes barbere seg.
    5. Videotaping å analysere spontan Nocifensive eller Pruritogen-indusert kløe atferd
      1. Plasser dyr individuelt i gjennomsiktig rom (ca 10 cm diameter) med litt sengetøy fra sine respektive hjem-bur på gulvet.
      2. Videobånd dyrene for 5 min post spontan og 30 min for å registrere pruritogen-indusert atferd. Analysere videoer frakoblet i hyller av 5 minutter.
    6. Smerte Versus kløe atferd
      1. Observere og Merk flinching slikker og bite atferd.
        Merk: Flinching og slikker av det aktuelle webområdet er vurdert Svar å smerte, mens bite er forbundet med kløe.
      2. Analysere videoer på normal hastighet, måle tiden at musen licking eller bite det aktuelle webområdet eller måle i slow motion for et mer presis skille mellom licking og bite reflekser. Du kan også telle antall licking/biter/flinching utbrudd.
  2. Morfologisk analyse
    1. Utføre morfologiske analyser fra ett til tre uker etter injeksjon av viruset eller på slutten av en opptreden eksperiment.
      Merk: Vi har oppdaget eGFP uttrykk så snart 48 timer etter injeksjon, men fant også at uttrykket øker betraktelig innen neste dager og uker. For celler med sterk reporter uttrykk, en uke med inkubering (fra intraspinal injeksjon til perfusjon) være nok. For celler med svak transgene uttrykk, virus med svak arrangører eller svakere fluorophores, kan et lengre uttrykk være nødvendig å sikre Detektbart nivåer.
    2. Vev fiksering
      1. Perfuse hver musen transcardially, først med 20 ml av iskalde kunstig cerebrospinalvæske (ACSF) løsning (NaCl 125 mM, NaHCO3 25 mM, NaH2PO4 1,25 mM, D-glukose 20 mM, KCl 2.5 mM og CaCl2 2 mM MgSO4 1 mM), med 100 mL på 4% iskalde paraformaldehyde (inne 0.1 M natrium fosfatbuffer, pH 7.4).
        Forsiktig: Paraformaldehyde er giftig og må håndteres med forsiktighet.
      2. Umiddelbart dissekere lumbale ryggmargen og ordne etter vev 2 h med 4% paraformaldehyde på is. Kort vask post-fixes vevet med 0.1 M natrium fosfatbuffer (pH 7.4) og deretter ruge det i 25% sukrose løsning (inne 0.1 M natrium fosfatbuffer, pH 7.4) overnatting på 4 ° C.
      3. Skjær cryoprotected vev på 30 μm på en kryostaten og montere delene på objektglass.
    3. Immunofluorescence flekker
      1. Etter kort vasker i PBS, bruke 300 μL blokkerer løsning (10% Normal esel serum 0,3% Triton-PBS) på delene 1t ved romtemperatur.
      2. Inkuber lysbildene med 300 μL respektive kombinasjoner av primære antistoffer i blokkering løsning (se Tabell for materiale) over natten på 4 ° C. Vask delene 3 ganger i 5 min hver i PBS.
      3. Inkuber lysbildene med respektive kombinasjoner av sekundær antistoffer i blokkering løsning for 1t ved romtemperatur. Vask delene 3 ganger i 5 min hver i PBS.
      4. Kort skyll lysbildene i ddH2O, så montere coverslips med fluorescerende montering medium.
      5. Erverve fluorescerende bilder ved hjelp av en AC confocal mikroskop utstyrt med en 20 x og en 40 x målsetting.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For å illustrere uttrykk nivåene som kan fås ved intraspinal injeksjon av rAAV koding en markør protein, injisert vi først AAV1. CAG.eGFP i lumbal ryggmargen av vill-type mus. Tre injeksjoner linjeavstand ca 1 mm fra hverandre produsert en nesten sammenhengende infeksjon lumbale spinal segmenter L3 til L5 (figur 1A-C). Virus injeksjon i en dybde av 300 µm fra spinal overflaten fører til dominerende infeksjon av celler i ryggmargen dorsal horn. Imidlertid kan infiserte celler også finnes i ventral horn (figur 1 d). Deretter var målet å illustrere forskjellen i rAAV-mediert uttrykk når injisere en grobunn-avhengige rAAV i en grobunn transgene mus. Vi har derfor injisert grobunn-avhengige AAV1. CAG.flex.eGFP vector i ryggmargen GlyT2::Cre transgene mus. Som ble før, eGFP uttrykk observert i rygg- og ventral horn. Imidlertid, som forventet, uttrykk for eGFP ble mer begrenset, reflekterer distribusjon av GlyT2 + neurons, dvs relativt sparsom uttrykket i overfladisk dorsal horn og tett uttrykk i dypt dorsal horn (figur 1E).

Neste, for å demonstrere muligheten for adressering krets funksjon av spinal neuronal subpopulasjoner, to forskjellige grobunn-avhengige AAVs koding for ulike effektor proteiner (DTA og hM3Dq) ble injisert i GlyT2::Cre transgene mus. Analoge til viral uttrykket observert etter tre injeksjoner av AAV1. CAG.eGFP inn i vill-type mus, det var robust ablasjon hemmende neurons (Pax2 +) i lumbal segmenter L3-L5 etter injeksjon av AAV1. EF1a.Flex.DTA i Glyt2::Cre mus (figur 2AC). Tap av glycinergic hemmende nerveceller i disse segmentene utløste en markert mekanisk overfølsomhet (figur 2D) og spontan aversive opptreden rettet mot de ipsilateral hindlimb (figur 2E). Aversive virkemåten førte til selvforskyldt lesjoner, som kunne observeres på paws, kalv og lår (for data, se Foster et al. 7) overfor effekter ble observert når aktivere glycinergic neurons gjennom injeksjon av AAV1.hSyn.flex.hM3Dq og senere intraperitoneal injeksjon av CNO (figur 2B). Mus ble ufølsomme for skadelige mekanisk stimulering (figur 2F) og andre skadelige stimuli (se Foster et al. 7) i tillegg når behandlet med pruritogens histamin eller chloroquine, hM3Dq-mediert aktivisering glycinergic neurons effektivt undertrykket prurifensive svar (figur 2 g). Disse resultatene viser at tre injeksjoner av rAAV i lumbal ryggmargen kunne transduce et område på lumbale ryggmargen tilstrekkelig å observere robust atferdsendringer fremkalt av stimulering av det tilsvarende hindlimb.

I et siste forsøk ønsket vi å demonstrere de potensielle forskjellene i bruke grobunn reporter mus sammenlignet grobunn reporter virus. Derfor ble en grobunn driveren genet valgt som har tidligere blitt beskrevet som viser et begrenset uttrykksmønster i ryggmargen musen. Genet RORβ har blitt foreslått å være hovedsakelig hemmende interneurons dypt dorsal horn13,14. Denne studien brukte RORβgrobunn banke i mus og krysset dem til Rosa26lox-stopp-lox-tdTomato (R26Tom) grobunn reporter mus, som fører til uttrykk for tdTomato i alle celler vise grobunn uttrykk til enhver tid før analyse ( Figur 3A). Karakterisering av tdTomato + celler i RORβgrobunn; R26Tom mus avslørt uttrykk i neurons og astrocyttene av dorsal horn (figur 3BC). Faktisk foreslo kvantifisering av tdTomato + cellene at fleste cellene gjennomgår grobunn-mediert rekombinasjon (58%) var ikke-neuronal. Vi deretter injisert en grobunn-avhengige tdTomato reporter rAAV (AAV1. CAG.flex.tdTomato) til ryggmargen P40 RORβgrobunn mus (figur 3D). I motsetning til R26Tom-mediert reporter uttrykk, vi fant alle tdTomato + celler merket av reporteren viruset skal neurons (figur 3EF). Til slutt, identiteten til tdTomato + neurons ble analysert i begge settene med mus (RORβgrobunn; R26Tom og RORβgrobunn injisert med AAV1. CAG.flex.tdTomato). I begge tilfeller, fleste av neurons var hemmende (> 85%) og mindretallet av neurons eksitatoriske (< 20%) (Figur 3 G-jeg), som er i samsvar med tidligere vurderinger av identiteten til RORβ + neurons13,14.

Figure 1
Figur 1: Intraspinal injeksjon av AAV1-eGFP/AAV1-flex-eGFP
(A) skjematisk illustrasjon av en intraspinal injeksjon av en AAV1. CAG.eGFP (AAV1-eGFP) i lumbal ryggmargen, som er innerveres fra hindlimb. (B) anatomiske plasseringen av lumbale ryggmargen segmentene L3-L4 kan sees i en topp ned-visning av baksiden av en mus. Huden ble åpnet for å avsløre virvelsøylen. Spinal prosesser av vertebrae T13-L6 farges som omtale og en pil angir iliaca bølgetopp. (C) representativt bilde av en hel mount lumbale ryggmargen. Grønne fluorescens angir virus-transduced områder i ryggmargen. (D) representativt bilde av et tverrsnitt gjennom en AAV1-eGFP-transduced, lumbale ryggmargen fra vill-type mus. (E) representativt bilde av et tverrsnitt av en AAV1. CAG.flex.eGFP-transduced ryggmargen GlyT2::Cre museklikk. Stiplede linjer representerer omrisset av grå materie og overfladiske dorsal horn i ryggmargen. Skalere barer C = 1 mm, D = 100 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Funksjonell manipulering av Spinal grobunn-uttrykke Glycinergic nerveceller
(A + B) Skjematisk illustrasjon av en intraspinal injeksjon av en AAV1. EF1a.Flex.DTA (A) eller en AAV1. EF1a.Flex.hM3Dq (B) i lumbal ryggmargen. Grobunn-avhengige uttrykk av difteri gift fragment A (DTA) vil føre til ablasjon av glycinergic neurons (GlyT2 +) (A), mens grobunn-avhengige uttrykk for farmakogenetiske designer reseptor-hM3Dq vil gjengi GlyT2 neurons activatable av Clozapine-N-oxide (CNO) (B). (C) tre injeksjoner av AAV1. EF1a.Flex.DTA i L3-L5 segmenter av GlyT2::Cre mus førte til merket tap av hemmende nevroner i de respektive delene av den ipsilateral men ikke siden kontralateral. (D) tap av GlyT2 neurons utløste en langvarig overfølsomhet for mekanisk von Frey stimulering i ipsilateral bakben labben GlyT2::Cre mus injisert med AAV1. EF1a.Flex.DTA, men ingen endringer ble observert hvis grobunn-negativ musene ble injisert. (E) tap av GlyT2 neurons utløste spontan aversive opptreden minner om kronisk kløe. (F) hM3Dq-mediert aktivisering GlyT2 neurons lindres skadelige mekanisk smerte fremkalt av pinprick stimulering. (G) hM3Dq-mediert aktivisering GlyT2 neurons redusert pruritogen (chloroquine eller histamin)-utløste aversive atferd. Dataene er representert som gjennomsnittlig ± SEM. *** p < 0,001; p < 0,01. Skalere bar C = 1 mm. g = gram. Bildene er brukt på nytt og endret fra Foster et al. 7 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: genetiske og Virus-mediert merking av RORβ-uttrykke celler. (A) Diagram som viser strategien for grobunn-avhengige uttrykk for fluorescerende tdTomato reporter i RORβgrobunn; Rosa26lox-stopp-lox-tdTomato (R26Tom) mus. (B) Immunostaining på ryggmargen deler av RORβgrobunn; R26Tom mus avslørte at NeuN + RORβ-Tom neurons kan finnes i laminae I-IV. (C) grobunn-avhengige uttrykk for tdTomato ble også observert i GFAP + celler i RORβgrobunn; R26Tom mus, antyder at RORβ er uttrykt i astrocyttene under utvikling. Pilspisser angi dobbel-merket astrocyttene i lamina III. (D) -Diagram som viser intraspinal injeksjon av AAV-flex-Tom (rAAV1.CAG.flex.tdTomato) virus i RORβgrobunn mus til stasjonen, lokale uttrykk grobunn-avhengig av tdTomato. (E) Immunostaining på ryggmargen deler av RORβgrobunn mus injisert med AAV-flex-Tom virus. RORβ-Tom neurons var lokalisert til de overfladiske laminae av spinal dorsal horn og uttrykk for tdTomato var fraværende fra astrocyttene. (F) prosent av RORβ-Tom celler uttrykke neuronal markøren NeuN spinal deler av RORβgrobunn; R26Tom mus og RORβgrobunn mus injisert med AAV-flex-Tom virus. (G-H) Immunostaining på ryggmargen deler av (G) RORβgrobunn; R26Tom mus og (H) RORβgrobunn mus injisert med AAV-flex-Tom virus viser colocalization mellom RORβ-Tom nevroner og hemmende markøren Pax2 eller den eksitatoriske markør Lmx1b. (I) prosent av RORβ-Tom neurons uttrykke Lmx1b og Pax2 i RORβgrobunn; R26Tom mus og RORβgrobunn mus injisert med AAV-Tom virus. Dataene er representert som gjennomsnittlig ± SEM. Data er fra 2-3 mus og 1-3 deler per musen. Skala barer representerer 100 µm (B, E) og 20 µm (C, E forstørring bilder, G og H). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Variabel Angitt verdi Enhet
varme (H) 450 -(verdi proporsjonal med makt av utstrålt varme)
tvinge foreløpige trekk (F(TH)) 20 -(verdi proporsjonal med spenning brukes til å tvinge coil)
avstand terskelen (s(TH)) 25 0,12 mm
forsinkelsen heatstop (t(H)) 30 0,5 ms
avstand heatstop (s(H)) 0 0,12 mm
forsinkelse trekk 1 (t(F1)) 200 0,5 ms
tvinge trekk 1 (F1) 300 -(verdi proporsjonal med spenning brukes til å tvinge coil)
avstand trekk 2 (s(F2)) 30 0,12 mm
tvinge trekk 2 (F2) 600 -(verdi proporsjonal med spenning brukes til å tvinge coil)
justere (AD) 0 -

Tabell 1: Avtrekker innstillinger

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Intraspinal injeksjon av AAVs kan bli et kraftig teknikk i et forskningslaboratorium, slik at analyse av spinal celler med en høy timelige og romlig løsning. Denne protokollen kan signaltransduksjon av de tre viktigste spinal segmentene innerveres av sensoriske neurons utvide deres eksterne axons å hindlimb. Transducing tre segmenter gir robust og reproduserbar atferdsdata. Det gjør også testing av et større sensorisk område enn mulig etter en enkelt intraspinal injeksjon. For eksempel samme injeksjon regimet tillater testing paw (von Frey, Hargreaves, etc.) og lår (intradermal injeksjoner, mechano-reseptor stimulering), således utvide de sensoriske modalitetene som kan løses.

Avgjørende skritt:

Det er flere trinn avgjørende for å få robust morfologiske og atferdsmessige data og for å unngå gjenstander. Utformingen av viral vektoren og valg av selskapet samt serotype kan ha en sterk innvirkning på signaltransduksjon effektivitet og omfanget av transduced området, og derfor på atferdsdata resultater (om viral spredning og signaltransduksjon effektivitet, se 12). høy kvalitet viral forberedelser er nødvendig for å redusere bivirkninger av virus injeksjon, som kan oppstå hvis miljøgifter eller celle rusk finnes i det virus løsningen. Operasjonen som er nødvendig for å injisere ryggmargen må utføres med stor forsiktighet for å unngå morfologiske og atferdsmessige gjenstander introdusert av operasjonen. Spesiell oppmerksomhet er nødvendig håndtering ryggmargen, spesielt under laminectomy og under perforering av dura med nålen. Skade på ryggmargen kan svekke somatiske opplevelser og koordinasjon av musen, slik at planlagte atferdsmessige eksperimenter. I tillegg er det viktig å montere sprøyten forsiktig. Feil montering eller tilstopping av brønnene kan hemme eksperimentet. Spinal vev på injeksjonsstedet har undersøkes på slutten av eksperimentet for å bekrefte vellykket injeksjon og signaltransduksjon av området injisert og utelate overdreven vevsskade som følge av konsultasjonen. Denne protokollen har brukt viral titers til en konsentrasjon av 1 x 1013 GC/mL uten tilsynelatende toksisitet, men høyere titers av viruset kan bli giftig på noen tidspunkt. I tillegg vil toksisitet sannsynligvis også avhenge protein kodet av den injiserte AAV.

Modifikasjoner:

Flere parametere i protokollen kan tilpasses for neuronal befolkningen og problemstilling studier. Injeksjon av 300 nL virus løsning på dyp 300 µm fører til signaltransduksjon neurons gjennom, og hovedsakelig i dorsal horn. Hvis målet er å mål neurons ytterligere ventral, justeres dybden. Injeksjon av større mengder virus (vi har brukt opp til 500 nL per injeksjon) vil føre til en større spredning i dorsoventral og rostrocaudal retninger. Dette kan være fordelaktig å oppnå målretting av andre celler i grad det rostrocaudal, men kan øke ringvirkninger til kontralateral side, som kan hemme bruk av den kontralateral siden som en intern kontroll. I tillegg vil dorsoventral omfanget av transduced celler øke, som kan være ønsket effekt eller bør unngås. Injeksjon av 300 nL i en dybde på 300 µm unngås siden effekter på motorstyring i GlyT2::Cre mus, mens injeksjon av 500 nL eller injeksjon på en større dybde av og produsert motor fenotyper, som spastisk utvidelse av hindlimb (data ikke vist). Injeksjon av mindre volumer kan brukes til å begrense målretting til enda mer trange områder5. Viral titer er en parameter som kan endres og bør faktisk fastsettes for hver virus. For bakteriell giftstoffer, som den svært effektive DTA, kan lav uttrykk nivåer være tilstrekkelig til å indusere ønsket effekt, mens fluorescerende journalister og DREADDs, høyere titers kan være nødvendig for synlig eller effektiv.

Betydningen av metoden med hensyn til eksisterende/Alternative metoder:

Hittil har hovedsakelig to teknikker blitt brukt funksjonelt avhøre nevrale kretser kreves for overføring av sensoriske signaler. Mange forskere har brukt intraspinal injeksjoner av rAAV koding for reporter og effektor proteiner i recombinase-uttrykke mus for å merke og manipulere spinal neuronal subpopulasjoner. Intraspinal injeksjon som en teknikk for å manipulere spinal celler har tidligere blitt beskrevet15,16. Protokollen skissert her var spesielt beregnet på transduce genetisk merket nerveceller i tre sammenhengende segmenter i lumbal ryggmargen samtidig minimere kirurgisk manipulasjon. Dette oppnås ved å plassere to av tre injeksjoner i intervertebral plass rostral og caudal T13 ryggvirvlene og andre, ved å bore et hull i T13 for tredje injeksjon istedet for fjerner ryggvirvlene. Målrettet L3-L5 segmentene er viktigste oppsigelse området sensoriske neurons innervating hindlimb. Viser vi at denne typen signaltransduksjon er tilstrekkelig til å produsere robust atferdsendringer etter manipulering av glycinergic nevroner og antyde at det er egnet for analyse av en rekke ulike genetisk merket spinal neurons.

Den andre metoden som ble brukt for å manipulere funksjonen av spinal Nevron delsett er basert på krysset transgene dyr. Her, må mus uttrykke en recombinase i et bestemt delsett av spinal neurons være krysset til reporter mus for å oppnå uttrykk for ønsket markøren eller effektor protein i de respektive neuronal delsett17,18, 19. for å illustrere noen av forskjellene som kan oppstå når sammenligne resultatene innhentet ved hjelp av reporteren mus eller intraspinal virus injeksjoner vi krysset RORβgrobunn banke i dyr til grobunn-avhengige reporter mus eller injisert RORβ Grobunn mus med en grobunn-avhengige reporter rAAV. Vi sammenlignet reporter genuttrykk Hentet fra rAAV til reporter genuttrykk innhentet i RORβgrobunn; R26Tom mus. Reporter genuttrykk fra intraspinal injeksjon av en grobunn-avhengige rAAV var begrenset til nerveceller i ryggmargen, mens R26Tom reporter mus utløste tdTomato uttrykk er også funnet i astrocyttene. Dette tyder på at RORβ er transiently uttrykt i astrocyttene. Tilsvarende Gutierrez-Mecinas et al. funnet et mer begrenset reporter uttrykk (romlig og celle type-spesifikk) etter viral injeksjon sammenlignet med mus-utløste reporter uttrykk i Tac1grobunn mus20. Ved å bruke intraspinal injeksjoner av rAAV reporter i ryggmargen voksen mus, kan reporter og/eller effektor genuttrykk effektivt begrenset til befolkningen i celler som uttrykker genet i voksen og dermed unngå rekombinasjon/uttrykk i disse populasjoner med tidligere forbigående genet aktivitet.

En andre største fordelen av intraspinal rAAV injeksjoner er muligheten til å begrense uttrykk for rAAV-kodet genene til injeksjonsstedet. I transgene mus, er grobunn driver-mediert uttrykk ofte ikke bare finnes i neuronal subpopulasjon rundt, men også andre bestander i nervesystemet. Dymecki og kolleger, samt gruppene med Ma og Goulding, har utviklet elegante måter å bruke interseksjonell reporter musen tilnærminger som unngå rekombinasjon i deler av nervesystemet som skal forbli uendret17, 18,19,21,22,23. Bruke banke i mus for å oppnå uttrykk for markør eller effektor proteiner kan også antas for å være mindre variabel, som det er bare én genomisk kopi av respektive uttrykk kassetten per celle og uttrykk kassetten er tilstede i alle celler i området rundt . Derimot kassetteninn respektive uttrykk og også kopien antall uttrykk kassetten etter viral signaltransduksjon er avhengig av signaltransduksjon effektiviteten, som kan variere fra celle til celle, fra injeksjon til injeksjon, og avhenger av virus mye. Endelig, den største ulempen av virus-mediert genuttrykk over tradisjonelle genetiske metoder er nødvendigheten av kirurgi. Kirurgi-mediert skade/betennelse kan påvirke neurons og kretser direkte. Inkludering av kontroll mus som har gjennomgått den samme operasjonen er derfor obligatorisk.

Fremtidige programmer:

Intraspinal injeksjon kan brukes til å analysere og manipulere enhver genetisk identifiserte spinal subpopulasjon gjennom overuttrykte markør og effektor proteiner. Det er derfor sannsynlig i fremtiden at mange vil vedta denne teknikken for å studere neuronal populasjoner i deres spesifikke fokus. Videre tillegg til å bruke intraspinal injeksjon av rAAVs for å oppnå overuttrykte eksogene effektor proteiner, denne teknikken kan også brukes til taushet eller overexpress endogene proteiner og derfor å studere funksjonen av alle gitt genet med høy romlig og midlertidig løsning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Vi takker Hanns Ulrich Zeilhofer for sjenerøst å støtte dette arbeidet. Hendrik Wildner ble støttet av Olga Mayenfisch foundation. Vi takker Carmen Birchmeier Lmx1b antistoffer.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
micropipette puller: DMZ-Universal-Electrode-Puller Zeitz NA
anesthesia unit: Oxymat3 oxygen concentrator Weinmann NA
anesthesia unit: VIP 3000 Veterinary Vaporizer Midmark NA
Heat mat: Mio Star Thermocare 100 Migros 717614700000
Electric shaver Philips BT9290
surgical microscope (OPMI pico) Zeiss NA
Small animal stereotaxic apparatus Kopf NA
Neurostar StereoDrive (optional) Neurostar NA
Model 51690 Cunningham mouse spinal adaptor Harvard Apparatus 72-4811
PHD Ultra syringe pump with nanomite Harvard Apparatus 70-3601
Hamilton 701 RN 10 μl glass microliter syringe Hamilton 7635-01
Hamilton Removable needle (RN) compression fitting 1 mm Hamilton 55750-01
fine dentistry drilling apparatus: Osada success 40 Osada OS-40
spherical cutter, 0.5mm Busch 12001005B
electronic von Frey anesthesiometer IITC 23905
flexible von Frey hairs IITC #7
LSM710 Pascal confocal microscope Zeiss NA
0.8 NA × 20 Plan-apochromat objective Zeiss NA
1.3 NA × 40 EC Plan-Neofluar oil-immersion objective Zeiss NA
Name Company Catalog Number Comments
Surgical Tools
Scalpel Handle #4, 13cm Fine Science Tools 10004-13
Extra Fine Bonn Scissors Fine Science Tools 14084-08
Adson forceps, 1 x 2 teeth, 12 cm Fine Science Tools 11027-12
Friedman-Pearson rongeurs, curved, 0.7 mm cup Fine Science Tools 16121-14
Dumont #2 laminectomy forceps Fine Science Tools 11223-20
Olsen-Hegar needle holders, serrated, 8.5 mm clamp length Fine Science Tools 12002-12
Fine forceps #5 Fine Science Tools 11254-20
Name Company Catalog Number Comments
Consumables and Chemicals
Thin-wall glass capillary, 1mm outside diameter World Precision Instruments TW 100-3
Syringes (1, 5 and 20 ml) B. Braun (9166917V, 4606051V, 4606205V)
26G beveled needle B. Braun 4665457
Sterile scalpel blades B. Braun BB523
Surgical sutures Safil Quick+ 4/0, absorbable B. Braun C1046220
Surgical sutures Premilene 5/0, non-absorbable B. Braun C0932191
Sterile PBS or saline (0.9%) NA
Ethanol, 70% (disinfectant) NA
Iodine solution (e.g. Braunol) B. Braun 18380
Anaesthetics (e.g. Attane isoflurane) Provet 2222
Aldasorber Provet 333526
analgesics (e.g. buprenorphine: temgesic) Indivior GTIN: 7680419310018
Ophthalmic ointment (e.g. vita-pos) Pharma medica GTIN: 4031626710635
Cotton swabs (e.g. from) IVF Hartmann 1628100
Facial tissues (e.g. from) Uehlinger AG 2015.10018
Superfrost plus microscope slides ThermoScientific J1800AMNZ
Name Company Catalog Number Comments
Mice
C57BL/6J mice (wildtype) The Jackson Laboratory RRID:IMSR_JAX:000664
Rorbtm1.1(cre)Hze/J mice (RORβCre) The Jackson Laboratory RRID:IMSR_JAX:023526
Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J mice (R26Tom) The Jackson Laboratory RRID: IMSR_JAX:007914
Name Company Catalog Number Comments
Viral vectors
AAV1.CB7.CI.eGFP.WPRE.rBG (AAV1.CAG.eGFP) Penn Vector Core AV-1-PV1963
AAV1.CAG.flex.eGFP.WPRE.bGH (AAV1.CAG.flex.eGFP) Penn Vector Core AV-1-ALL854
AAV1.CAG.flex.tdTomato.WPRE
.bGH (AAV1.CAG.flex.tdTomato)		 Penn Vector Core AV-1-ALL864
AAV1.EF1a.flex.DTA.hGH (AAV1.EF1a.flex.DTA) Penn Vector Core Custom production
AAV1.hSyn.DIO.hM3D(Gq)-mCherry.hGH (AAV.flex.hM3D(Gi)) Penn Vector Core Custom production
Name Company Catalog Number Comments
Plasmids
pAAV.hSyn.flex.hM3D(Gq)-mCherry Addgene 44361
pAAV.EF1α.flex.hChR2(H134R)-eYFP Addgene 20298
Name Company Catalog Number Comments
Bacteria
MDS42 ScarabGenomics
Stbl3 ThermoScientific C737303
Name Company Catalog Number Comments
Reagents
EndoFree Plasmid Maxi Kit Quiagen 12362
NucleoBond PC 500 Machery & Nagel 740574
clozapine-N-oxide (CNO) Enzo Life Sciences BBL-NS105-0025
chloroquine diphosphate salt Sigma C6628
histamine Sigma H7125
Dapi Invitrogen D3571
Name Company Catalog Number Comments
Antibodies (dilution)
Rabbit anti-GFP (1:1000) Molecular Probes RRID:AB_221570
Rabbit anti-NeuN (1:3000) Abcam RRID:AB_10711153
Goat anti-Pax2 (1 : 200) R & D Systems RRID:AB_10889828
Guinea pig anti-Lmx1b (1 : 10 000) Dr Carmen Birchmeier Muller et al. 2002
Rabbit anti-GFAP (1 : 1000) DakoCytomation RRID:AB_10013382
Secondary antibodies raised in donkey (1:800) Jackson ImmunoResearch Laboratories NA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goulding, M., Bourane, S., Garcia-Campmany, L., Dalet, A., Koch, S. Inhibition downunder: an update from the spinal cord. Curr Opin Neurobiol. 26, 161-166 (2014).
  2. Todd, A. J. Neuronal circuitry for pain processing in the dorsal horn. Nat Rev Neurosci. 11 (12), 823-836 (2010).
  3. Sandkuhler, J. Models and mechanisms of hyperalgesia and allodynia. Physiol Rev. 89 (2), 707-758 (2009).
  4. Zeilhofer, H. U., Wildner, H., Yevenes, G. E. Fast synaptic inhibition in spinal sensory processing and pain control. Physiol Rev. 92 (1), 193-235 (2012).
  5. Azim, E., Jiang, J., Alstermark, B., Jessell, T. M. Skilled reaching relies on a V2a propriospinal internal copy circuit. Nature. 508 (7496), 357-363 (2014).
  6. Cui, L., et al. Identification of Early RET+ Deep Dorsal Spinal Cord Interneurons in Gating Pain. Neuron. 91 (6), 1413 (2016).
  7. Foster, E., et al. Targeted ablation, silencing, and activation establish glycinergic dorsal horn neurons as key components of a spinal gate for pain and itch. Neuron. 85 (6), 1289-1304 (2015).
  8. Francois, A., et al. A Brainstem-Spinal Cord Inhibitory Circuit for Mechanical Pain Modulation by GABA and Enkephalins. Neuron. 93 (4), 822-839 (2017).
  9. Peirs, C., et al. Dorsal Horn Circuits for Persistent Mechanical Pain. Neuron. 87 (4), 797-812 (2015).
  10. Petitjean, H., et al. Dorsal Horn Parvalbumin Neurons Are Gate-Keepers of Touch-Evoked Pain after Nerve Injury. Cell Rep. 13 (6), 1246-1257 (2015).
  11. Zhang, Y., et al. Identifying local and descending inputs for primary sensory neurons. J Clin Invest. 125 (10), 3782-3794 (2015).
  12. Haenraets, K., et al. Spinal nociceptive circuit analysis with recombinant adeno-associated viruses: the impact of serotypes and promoters. J Neurochem. , (2017).
  13. Abraira, V. E., et al. The Cellular and Synaptic Architecture of the Mechanosensory Dorsal Horn. Cell. 168 (1-2), 295-310 (2017).
  14. Wildner, H., et al. Genome-wide expression analysis of Ptf1a- and Ascl1-deficient mice reveals new markers for distinct dorsal horn interneuron populations contributing to nociceptive reflex plasticity. J Neurosci. 33 (17), 7299-7307 (2013).
  15. Inquimbert, P., Moll, M., Kohno, T., Scholz, J. Stereotaxic injection of a viral vector for conditional gene manipulation in the mouse spinal cord. J Vis Exp. (73), e50313 (2013).
  16. Kohro, Y., et al. A new minimally-invasive method for microinjection into the mouse spinal dorsal horn. Sci Rep. 5, 14306 (2015).
  17. Bourane, S., et al. Gate control of mechanical itch by a subpopulation of spinal cord interneurons. Science. 350 (6260), 550-554 (2015).
  18. Bourane, S., et al. Identification of a spinal circuit for light touch and fine motor control. Cell. 160 (3), 503-515 (2015).
  19. Duan, B., et al. Identification of spinal circuits transmitting and gating mechanical pain. Cell. 159 (6), 1417-1432 (2014).
  20. Gutierrez-Mecinas, M., et al. Preprotachykinin A is expressed by a distinct population of excitatory neurons in the mouse superficial spinal dorsal horn including cells that respond to noxious and pruritic stimuli. Pain. 158 (3), 440-456 (2017).
  21. Awatramani, R., Soriano, P., Rodriguez, C., Mai, J. J., Dymecki, S. M. Cryptic boundaries in roof plate and choroid plexus identified by intersectional gene activation. Nat Genet. 35 (1), 70-75 (2003).
  22. Kim, J. C., et al. Linking genetically defined neurons to behavior through a broadly applicable silencing allele. Neuron. 63 (3), 305-315 (2009).
  23. Kim, J. C., Dymecki, S. M. Genetic fate-mapping approaches: new means to explore the embryonic origins of the cochlear nucleus. Methods Mol Biol. 493, 65-85 (2009).

Tags

Nevrovitenskap problemet 135 Spinal Neurons ryggmarg Dorsal Horn rekombinant Adeno-assosiert Virus AAV sensoriske System Intraspinal injeksjon grobunn-LoxP System
Adeno-assosiert Virus-mediert Transgene uttrykk i genetisk definerte nerveceller i ryggmargen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Haenraets, K., Albisetti, G. W.,… More

Haenraets, K., Albisetti, G. W., Foster, E., Wildner, H. Adeno-associated Virus-mediated Transgene Expression in Genetically Defined Neurons of the Spinal Cord. J. Vis. Exp. (135), e57382, doi:10.3791/57382 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter