Summary
Inyección intraspinal del recombinase dependiente recombinante virus adeno-asociado (rAAV) puede utilizarse para manipular cualquier tipo de célula genéticamente marcadas en la médula espinal. Aquí describimos cómo transduce las neuronas en el asta dorsal de la médula espinal lumbar. Esta técnica permite interrogatorio funcional del subtipo neurona manipulada.
Abstract
Manipulación selectiva de subpoblaciones neuronales espinales se ha logrado principalmente mediante dos métodos diferentes: 1) concurrencia genética, por el que se generan ratones transgénicos dobles o triples con el fin de lograr la expresión selectiva de un reportero o un efector gen (por ejemplo, desde el locus Rosa26) en la población de columna deseada. 2) inyección intraspinal de las virus Cre-dependiente de adeno-asociado recombinante (rAAV); Aquí vectores AAV Cre-dependiente que codifica para el gen reportero o efectora de elección se inyectan en la médula espinal de los ratones que expresaban recombinase de Cre en la subpoblación neuronal deseada. Este protocolo describe cómo generar vectores rAAV de Cre-dependiente y que transduce las neuronas en el asta dorsal de la médula espinal lumbar segmentos L3-L5 con rAAVs. Como los segmentos de columna vertebral lumbares L3-L5 están inervados por las neuronas sensoriales periféricas que transmiten información sensorial de los miembros posteriores, pueden ser espontáneo comportamiento y respuestas a las pruebas sensoriales aplicadas en el miembro posterior ipsolateral al lado de inyección analizados con el fin de interrogar a la función de las neuronas manipuladas en el procesamiento sensorial. Ofrecemos ejemplos de cómo puede utilizarse esta técnica para analizar genéticamente definición subconjuntos de neuronas espinales. Las principales ventajas de la expresión del transgén mediada por virus en Cre ratones transgénicos en comparación con la expresión inducida de ratón transgénico de reportero clásica son los siguientes: 1) diferentes Cre-dependiente rAAVs codificación de varias proteínas de reportero o efector puede ser inyectado en una sola línea transgénica Cre, superando así la necesidad de crear varios Ratón transgénico múltiples líneas. 2) inyección intraspinal limita la manipulación de células expresan Cre para el sitio de inyección y el tiempo después de la inyección. Las principales desventajas son: 1) expresión del gen reportero de rAAVs es más variable. 2) la cirugía es necesaria para transducir las neuronas espinales de interés. Cual de los dos métodos es más apropiado depende de la pregunta de investigación y población neurona a abordarse.
Introduction
La médula espinal dorsal es esencial para el intercambio de información entre la periferia del cuerpo y el cerebro. Estímulos sensoriales como calor, frío, tacto, o estímulos nocivos son detectados por las neuronas periféricas especializadas, que transmitan esta información a las neuronas del cuerno dorsal de la médula espinal. Aquí, una compleja red de interneuronas inhibitorias y excitatorias modula y eventualmente relés de información sensorial a través de las neuronas de proyección espinal a supraspinal sitios1,2. Los cálculos realizados por espinal inter- y las neuronas de proyección de información sensorial, determinando así que la información es suprimida o reenviada a que intensidad la puerta. Cambios en la integración de estímulos sensoriales, como un balance alterado entre inhibición y excitación, pueden causar disfunciones sensoriales tales como hipersensibilidad o alodinia (sensaciones dolorosas después del estímulo normalmente no doloroso). Estos cambios se cree que la causa subyacente del dolor crónico de diferentes Estados de3,4. Así, los circuitos espinales son de gran importancia en el procesamiento sensorial y por lo tanto en la percepción del ambiente de un organismo y el yo. Con el advenimiento reciente combinación de molecular, genética y técnicas quirúrgicas que permiten la manipulación precisa de subpoblaciones genéticamente identificado neurona espinal, los científicos están empezando a entender los circuitos espinales subyacentes responsable de la elaboración de distintas modalidades sensoriales.
Inyección intraspinal de rAAV en ratones de tipo salvaje o transgénicas ha contribuido enormemente a la manipulación, análisis y comprensión de la función de subconjuntos específicos de neuronas espinales5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11. esta técnica permite la entrega de proteínas marcadoras (como GFP / proteínas de la fusión de GFP), proteínas de reportero (como GCaMP), o proteínas efectoras (como toxinas bacterianas, channelrhodopsin o receptores Farmacogenético) en un espacial manera restringida a las neuronas espinales. Inyección local de Cre-dependiente rAAVs en ratones transgénicos que expresaban recombinase de Cre en un subconjunto específico de neuronas espinales permite el análisis específico de la población neuronal respectiva. Hemos empleado esta técnica para etiqueta, ablar, inhibir o activar glycinergic espinal neuronas demostrando que son una parte esencial de la columna puerta de control del dolor y picor de transmisión7. En estos experimentos, inyección intraspinal de rAAV Cre-dependiente en ratones GlyT2::Cre permitió la manipulación selectiva de las neuronas glycinergic en la médula espinal lumbar. De tal modo, puede evitarse la manipulación simultánea del supraspinal circuitos que contienen neuronas de glycinergic fundamentales para la supervivencia del animal.
Mientras que una inyección intraspinal de rAAVs limita la infección en el sitio de la inyección, transducción viral puede ocurrir no sólo en las neuronas locales, sino también en las neuronas que conectan con el sitio de la inyección mediante proyecciones axonales. El último es a menudo utilizado para áreas de CNS de seguimiento proporciona entrada neuronal a un núcleo particular en el cerebro. La infección de proyecciones axonales, sin embargo, también puede ser un factor de confusión cuando una población definida de neuronas debe estudiarse en un sitio en particular. Para tratar estos temas, recientemente hemos realizado un análisis exhaustivo de serotipos AAV y cassettes de expresión para identificar los serotipos y los promotores que pueden utilizarse para minimizar o maximizar la transducción retrógrada. En el contexto de esta investigación específica en circuitos espinales, se analizó la capacidad de diferentes serotipos y promotores retrogradely transduce las neuronas en los ganglios de raíz dorsal (GRD), la médula rostral ventromedial (RVM) y la corteza somáticosensorial 12. la técnica se describe en este protocolo, por tanto, puede utilizarse para analizar las neuronas espinales en el sitio de inyección o analizar las neuronas de proyección que aportar en el sitio inyectado de la médula espinal. En el protocolo descrito aquí, tres inyecciones de rAAV en el lado izquierdo de la médula espinal lumbar se realizan para habilitar la transducción de señales de las neuronas en los tres segmentos lumbares (L3-L5). Los segmentos L3-L5 reciben la mayor parte de la entrada sensorial de la trasera ipsolateral en el sitio de inyección. Demostramos que la manipulación funcional de las neuronas genéticamente marcadas en L3-L5 es suficiente para evocar cambios en el comportamiento robustos, proporcionando pruebas funcionales para la función de circuito de un subtipo de neurona marcada genéticamente.
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Protocol
Todos los experimentos con animales fueron aprobados por la Oficina veterinaria cantonal suizo (Zurich) y están de acuerdo y conformidad con todas las directrices pertinentes del reguladoras e institucionales.
Nota: Todos los materiales junto con los respectivos fabricantes o proveedores están listados en la Tabla de materiales.
1. generación de vectores AAV Cre-dependiente
Nota: Puede adquirirse una gran variedad de vectores de Cre-dependiente con diferentes promotores (véase Tabla de materiales) o, si la construcción de la expresión deseada no está disponible, puede generarse mediante la modificación de construcciones existentes de AAV. Tenga en cuenta, el promotor y el serotipo pueden tener un impacto en la propagación de la transducción viral (ver 12). La primera parte de este protocolo describe brevemente la generación de dos diferentes vectores AAV Cre-dependiente adecuados para ganancia y pérdida de los experimentos de la función, respectivamente.
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Activación farmacogenética (ganancia de función)
- Orden pAAV.hSyn.flex.hM3D (Gq)-mCherry (véase Tabla de materiales) para receptores diseño activados exclusivamente por drogas de diseño (DREADD)-mediada por la activación.
- Al recibir la cultura bacteriana stab, raya a las bacterias en placas de LB (grado bacteriológico agar disuelto en medio líquido Luria-Bertani) complementado con el antibiótico apropiado. Incubar durante la noche a 37 ° C y escoger una sola Colonia en el día siguiente.
Nota: Plásmidos que contienen AAV vector genomas pueden ser inestables y recombinación del genoma viral, especialmente dentro de la terminal invertida viral repite (ITR), puede ocurrir durante la amplificación en e. coli. Se sugiere uso de recA-deficiente/suprimido cepas tales como MDS42 o Stbl3 para evitar recombinación dentro del plásmido que contiene el genoma AAV. - Amplificar las bacterias siguiendo las instrucciones dadas por el proveedor elegido Maxi-Kit de ADN y preparación de DNA plasmídico de alta calidad con un ADN-Maxi-Kit disponible comercialmente (por ejemplo, véase Tabla de materiales). Realizar un control de calidad de la preparación de DNA plasmídico mediante la verificación de la integridad y la identidad del plásmido ADN a través de la recopilación de la restricción de una alícuota de ADN del plásmido.
Nota: Existen sitios de reconocimiento para el endonuclease de la restricción SmaI dentro el RTI. Incluir un resumen de SmaI en el control de calidad para verificar la integridad de la RTI. - Enviar el ADN a una instalación de base de vectores virales para producir alta calidad rAAV.
Nota: Alto título, preparaciones virales de alta calidad son cruciales para evitar confundir fenotipos causados por contaminación de la preparación viral. Por lo tanto recomendamos el rAAV de elección producida en una instalación de base de vector establecido, a menos que la producción de AAV está bien establecida en el laboratorio.
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Ablación (pérdida de la función)
Nota: Toxinas bacterianas o receptores de la toxina se pueden utilizar para mediar la ablación celular o neuronal de silenciamiento. Hemos generado pAAV.EF1α.flex.DTA al fragmento de la toxina de difteria expresa A (DTA) en una forma dependiente de la Cre.- Para generar un vector viral dependiente de la Cre, elegir un vector dependiente de la Cre con un promotor adecuado (p. ej., pAAV.EF1α.flex.hChR2(H134R)-eYFP). Amplificar la secuencia de codificación de elección (p. ej., DTA) por reacción en cadena de polimerasa con las cartillas que incluyen AscI y NheI o sitios de reconocimiento compatible endonuclease de la restricción en sus voladizos (véase Foster et al. 7)
- Mediante técnicas de biología molecular estándar, realizar resúmenes de la restricción del vector de la DNA (pAAV.EF1α.FLEX.hChR2(H134R)-eYFP) y de la polimerización en cadena-amplificado (NheI-DTA-AscI) con las endonucleasas de restricción AscI y NheI. Ligar los fragmentos purificados.
- Transformar la reacción de la ligadura en las bacterias adecuadas, según el protocolo dado por el proveedor de las bacterias competentes de elección y las bacterias en placas de LB de la placa. Uso de recA-deficiente/suprimida las cepas, como MDS42 o Stbl3, para la clonación y posterior amplificación del plásmido ADN.
- El día después de la transformación, selección de clones e inocular en medio LB suplementado con el antibiótica apropiada durante la noche a 37 ° C. Al día siguiente, extraer ADN de plásmido de las bacterias cultivadas. Verificar la exitosa clonación de resúmenes de la restricción y la secuencia del ADN plásmido extraído.
- Amplificación de alta calidad, DNA plasmídico bacteriano (ver paso 1.1.3). Enviar el ADN amplificado a un centro de base de vectores virales para la producción de virus.
2. transducción de las células espinales
- Preparación de la solución antivirus
PRECAUCIÓN: Los virus son reactivos infecciosos y deben ser manejados según las directrices pertinentes. En la mayoría de los casos, rAAVs pueden ser manejados en el nivel de bioseguridad 1 (BSL1).- En el día de la inyección, descongele una alícuota stock del virus purificado deseada en el hielo y mantenerlo en hielo hasta directamente antes de la inyección. Evite ciclos repetidos de congelación descongelación, ya que éstos reducirá la concentración eficaz del virus.
Nota: Si es necesario, el descongelado virus alícuota puede conservarse a 4 ° C hasta 3 días. - Diluir las partículas de virus en estéril 0,9% NaCl o fosfato tampón salino (PBS).
Nota: El título apropiado depende de los objetivos experimentales y debe determinarse experimentalmente. Una buena carga viral total para empezar es 3 x 109 copias de genoma (3.33x1012 GC/mL, 3 x 300 nL inyectado). Exceso de tomar y algo de pérdida al cargar el capilar en cuenta, se necesitarán cerca de 2.5 μl de la solución antivirus para cada ratón.
- En el día de la inyección, descongele una alícuota stock del virus purificado deseada en el hielo y mantenerlo en hielo hasta directamente antes de la inyección. Evite ciclos repetidos de congelación descongelación, ya que éstos reducirá la concentración eficaz del virus.
- Preparación de Micropipetas para inyecciones intraspinales
- 'Tirar' de Capillares de vidrio de paredes finas (diámetro exterior 1 mm) en un tirador de la micropipeta para crear un ~5.5 mm., bajo la caña. Utilice ajustes de programa 00 y un filamento calentador de 3.0m m con p (a) adaptada como en la tabla 1.
Nota: Tirar puede hacerse por adelantado. Los capilares se deben guardarse en un envase cerrado en modelado en arcilla para evitar el polvo, que más adelante pueda obstruir la micropipeta. Autoclave de Micropipetas no es necesario. - Clip de la caña del tubo capilar tirado con pinza laminectomía a una longitud de aproximadamente 4.5 a 5 mm para crear una punta con un diámetro interno de 25-35 μm. Utilizando un microscopio con una escala del micrómetro, mida el diámetro interior de varios Micropipetas para obtener una sensación de cómo es grande la apertura debe ser o medir para cada micropipeta.
Nota: Un Consejo más pequeño puede conducir a la obstrucción; una punta más grande puede causar daño a los tejidos y las dificultades para penetrar en la médula espinal.
- 'Tirar' de Capillares de vidrio de paredes finas (diámetro exterior 1 mm) en un tirador de la micropipeta para crear un ~5.5 mm., bajo la caña. Utilice ajustes de programa 00 y un filamento calentador de 3.0m m con p (a) adaptada como en la tabla 1.
- Preparación de la instalación quirúrgica y herramientas
- Asegúrese de que el equipo está limpio y listo para ser utilizado. Desinfectar el área de trabajo limpia con etanol al 70% y esterilizar las herramientas por autoclave o les desinfección de. No deje ningún desinfectante en la jeringa microliter que dañen el vector viral para ser utilizado.
- Anestesia y preparación del Animal para la cirugía
Nota: La duración total de la cirugía es de 60-90 min.- Elegir ratones de 6 a 10 semanas de edad para facilitar el procedimiento quirúrgico.
Nota: Si lo requiere el diseño experimental, es posible la inyección de los animales más jóvenes o más viejos. Cualquier tensión y ambos sexos se pueden utilizar en principio, pero utilizan la misma tensión de fondo (por ejemplo C57BL/6J) para la comparación de comportamientos entre líneas de ratón transgénico diferente. Si las diferencias de sexo se espera o para investigar, analizar los machos y las hembras en grupos separados. - Inducir la anestesia con isoflurano ~ 5%. Coloque el animal en el marco estereotáxicas sobre una estera de calor y mantener la anestesia en 1-2.5% isoflurano (900 mL/min de velocidad de flujo de aire). Monitorear la tasa de respiración a lo largo de la cirugía.
- Aplique ungüento lubricante ocular para evitar la desecación corneal durante la cirugía.
- Afeita la parte posterior del animal y limpiarlas con cuidado con los tejidos húmedos. Desinfectar la piel depilada con solución de iodo y permitir que la piel se seque.
- Dar tratamiento analgésico (por ejemplo, 0.1-0.2 mg/kg de buprenorfina por vía subcutánea).
- Elegir ratones de 6 a 10 semanas de edad para facilitar el procedimiento quirúrgico.
- Exposición de la Columna Vertebral a nivel Lumbar de la médula espinal
Nota: Debido al desarrollo diferencial de la médula espinal y la columna vertebral, los respectivos niveles no están alineados, pero el segmento lumbar de la médula espinal L4 está en el mismo nivel que la vértebra torácica T13.- Localice el par de costillas más caudal palpando a lo largo de la columna vertebral. Con un bisturí, hacer un corte longitudinal de 1.5-2.5 cm en la piel a partir de justo rostral al par más caudal de la costilla.
- Levante la piel con pinzas y sepárela del músculo subyacente con las tijeras. A lo largo de la cirugía, mantener los tejidos expuestos húmedos con estéril 0,9% NaCl.
- Con pinzas finas y pequeñas tijeras, hacer una incisión en la capa membranosa siguiente, delgada justo al lado de la línea media y cortado de las apófisis espinosas. Está separado del músculo subyacente paraspinous, pero unido a los procesos espinosos.
- Identificación de las vértebras a nivel Lumbar de la médula espinal
Nota: Una vez que está expuesta la columna vertebral, los ligamentos intertransversales y las apófisis espinosas dorsales debe ser visibles. Varios puntos anatómicos pueden ayudar en la identificación de la vértebra correcta a blanco (figura 1B).- Tire de la piel hacia la cola para exponer la cresta ilíaca. En el mismo nivel, el par más caudal de ligamentos intertransversales visibles se une a la apófisis Espinosa L6. Contar hacia atrás en un caudal a rostral hacia identificar la vértebra de interés.
- Palpe a lo largo de la columna vertebral. El par más caudal de la costilla se encuentra justo rostral a la vértebra de T13 y hueso pélvico a nivel de la cadera es a nivel de la vértebra L6.
- Localizar el punto donde el tendón a lo largo de la columna vertebral es más blanco y más medial. La vértebra T13 encuentra justo rostral. El segmento de la médula espinal lumbar L4 se encuentra dentro de esta vértebra.
- Fijación de la Columna Vertebral y la exposición de la médula espinal Lumbar
- Colocar el animal sobre un colchón de tejidos enrollados para elevar a las abrazaderas espinales del marco estereotáxicas.
- Fijar la vértebra de destino para evitar movimientos de la columna vertebral debido a la respiración. Para ello, alinee las abrazaderas adyacentes a la vértebra de objetivo, fijar una abrazadera en la posición y mantenga la columna vertebral con pinza Adson mientras la segunda abrazadera de fijación.
Nota: La columna debe ser perpendicular al plano de inyección y fijado firmemente para que no se mueve a presión desde arriba. Si es necesario, un segundo par de abrazaderas puede fijarse en la columna vertebral. En este caso, es útil fijar los dos pares de pinzas a las dos vértebras adyacentes a la vértebra de destino. - Quitar los músculos paraspinous sobre las vértebras de interés. Con bisturí, realizar una incisión paralela justo medial a los tendones que son paralelos a la columna vertebral, así como incisiones perpendiculares rostral y caudal en la vértebra de destino. Tenga cuidado de no cortar demasiado profundo. Desgarro/corte lejos el músculo utilizando gubias. Usar pinzas si es necesario para remover el tejido restante sobre la vértebra o por encima de la duramadre en el espacio intervertebral.
- En el espacio intervertebral, el vaso sanguíneo dorsal debe ser visible el midline de la médula espinal de la marca. Para inyecciones unilaterales, realizar una laminectomía parcial por taladrar un agujero en el centro del lado de destino de la vértebra. Utilice una odontología fina aparato con una fresa esférica de 0.5 mm de perforación y taladro especial cuidado al acercarse a la médula espinal. Quite cualquier restantes fragmentos de hueso con una aguja biselada de 26G para exponer la médula espinal.
- Utilizando una aguja biselada de 26G, perforar la duramadre en el agujero y en el espacio intervertebral rostral y caudal a la vértebra del destino, aproximadamente 200 μm lateral a los vasos sanguíneos dorsal. Líquido cefalorraquídeo deben escapar de los agujeros y la médula espinal se deben bombear ligeramente hacia fuera.
- Preparación de la jeringa de inyección
Nota: La jeringa de inyección debe ser preparada inmediatamente antes del comienzo de la inyección para reducir el riesgo de partículas de polvo que la micropipeta.- Monte el tubo capilar de vidrio en un microlitro la jeringa con la aguja desmontable de compresión en el paquete. Fije la tuerca firmemente para asegurar un ajuste apretado y seguro.
- Llene la jeringa microliter con agua destilada estéril y empezar a presionarlo con el émbolo.
Nota: Si hay demasiada resistencia para que el agua no se sale fácilmente de la punta, la micropipeta es probable que se bloquea y debe cambiarse. - Montar la jeringa en un micromanipulador conectado a un microinyector controlado electrónicamente. Tenga cuidado de no tocar nada con la micropipeta.
- Usando el microinyector, elaboración de alrededor de 1 μl de aire para crear una burbuja entre el agua y el virus.
- Coloque una gota 2,5 μl de solución de antivirus en un pedazo de la película de parafina, mueva con cuidado la punta de la micropipeta a la gota usando el marco estereotáxicas y redactarla. Luego con cuidado Presione dispensar hasta que salga un poco de solución de antivirus en la punta.
- Retraiga la jeringa y, utilizando un lápiz, marque la micropipeta con una escala y tenga en cuenta el nivel de la solución de virus; Esto facilitará el seguimiento de si la infusión es progresando conforme a lo programado.
- Inyecciones intraspinales
- Mover la punta de la micropipeta sobre uno de los agujeros en la dura y luego hacia abajo hasta una abolladura leve se observa en la duramadre. Para la inyección en el cuerno dorsal espinal, bajar 500 μm en incrementos consecutivos de 100 μm (1 mm/s de velocidad) y luego 200 para arriba permitir la estabilización mecánica del tejido.
Nota: La profundidad final de la punta es el μm 300 en este caso, pero puede ser adaptada según la zona de destino.- Si el tejido es resistente a la penetración, la micropipeta puede coger en la duramadre. En este caso, repliegue y mueva ligeramente cubren el orificio, o usar la aguja otra vez perforar la duramadre correctamente antes de repetir el intento de penetración.
- Programar la bomba a un volumen de inyección blanco de 300 nL a una velocidad de inyección de 50 nL/min y presione el botón start para comenzar la infusión.
- Una vez finalizada la inyección, Compruebe la escala para ver si ha bajado el nivel de virus y deje la micropipeta en lugar de un 3 minutos adicionales equilibrar antes de retraer lentamente la jeringa la presión.
- Repita el paso 2.9.1.-2.9.3. para los inyección de dos sitios.
- Mover la punta de la micropipeta sobre uno de los agujeros en la dura y luego hacia abajo hasta una abolladura leve se observa en la duramadre. Para la inyección en el cuerno dorsal espinal, bajar 500 μm en incrementos consecutivos de 100 μm (1 mm/s de velocidad) y luego 200 para arriba permitir la estabilización mecánica del tejido.
- Sutura y la recuperación
- Quite las abrazaderas del espinales y el cojín debajo del ratón.
- Cerrar la herida en capas con suturas interrumpidas, suturar las capas de tejido superficial con suturas absorbibles y la piel con suturas no absorbibles. Aplicar desinfectante de yodo en la herida suturada.
- Terminar la anestesia y deja el animal en la estera de calor hasta que recupera antes de regresar a su jaula casera.
- Cuidados postoperatorios
- Supervisar la salud de los animales en el día de la cirugía, al día siguiente y luego cada 2-3 días. Asegúrese de que el animal tiene un paso normal, un aspecto saludable (peso, ojos, pelaje y comportamiento), y que la herida está cicatrizando.
- Continuar el tratamiento con analgésicos (por ejemplo, 0.1-0.2 mg/kg de buprenorfina por vía subcutánea) según sea necesario, tres veces al día.
3. análisis del conductuales y morfológicos
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Análisis del comportamiento
Nota: Deje que los animales para adaptarse a la configuración respectiva por lo menos 30 minutos antes de comenzar las mediciones para hacerles adaptarse al nuevo entorno experimental.-
Prueba de von Frey
- Coloque animales individualmente en compartimientos individuales de unos 10 cm x 10 cm en un suelo de rejilla metálica.
- Estimular la superficie plantar de la hindpaw ipsilateral al sitio de inyección con un filamento de von Frey dinámico. Tenga en cuenta la fuerza que el animal se retira su pata desde el estímulo.
- Repetir cinco veces y calcular el umbral de retiro promedio de las seis medidas para cada animal.
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Prueba del pinchazo de alfiler
- Colocar animales en compartimentos individuales de unos 10 cm x 10 cm en un suelo de rejilla metálica.
- Estimular la superficie plantar de la hindpaw ipsilateral al sitio de la inyección con una aguja 26-G blunted sin penetración de la piel. Puntuación de comportamiento como cero (sin reacción) o uno (reacción).
- Repetir 9 veces con intervalos de 3 min entre estímulos y calcular el porcentaje de respuesta de 10 mediciones de cada animal.
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Inyección de ligando DREADD clozapina-N-óxido (CNO)
- CNO se disuelven en dimetil sulfóxido (DMSO) para crear una solución de 0,2 mg/μl, que puede ser almacenado a temperatura ambiente.
- En el día del experimento, diluir la solución madre en estéril 0,9% NaCl a 0,2 μg/μl y se inyectan 10 μl/g de peso corporal por vía intraperitoneal. Inyectar animales de control con vehículo (0.2% de DMSO en 0.9% NaCl).
Nota: Según la experiencia, efectos pico de comportamientos pueden ser esperado 1-3 h después de la inyección, y efectos deben desaparecen totalmente después de 24 h. En el caso de activación de las neuronas glycinergic, observa comportamientos incluyen respuestas reducción de dolor y picor. Comportamientos por DREADD mediada por activación de las neuronas depende de los subconjuntos específicos de neuronas espinales.
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Inyección de Pruritogens para inducir prurito
- Disolver pruritogens en 0.9% NaCl a soluciones de 8 mg/mL (cloroquina) o 10 mg/mL (histamina). 2 h después de la administración de la CNO, inyectan 10 μl de solución vehículo o pruritogen por vía subcutánea en la superficie plantar de la hindpaw ipsilateral al sitio de la inyección espinal. Por otra parte, inyectar por vía intradérmica el pruritogen en la pantorrilla, que ha sido afeitada un día antes para reducir la conducta aversiva causada por el afeitado sí mismo.
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Video para analizar Nocifensive espontánea o picor inducido por Pruritogen comportamientos
- Coloque animales individualmente en compartimientos transparentes (unos 10 cm de diámetro) con un poco de ropa de cama de su respectivo hogar-jaula en el piso.
- Grabar en video los animales durante 5 min a registro espontáneo y 30 min para registrar comportamientos inducidos por pruritogen. Analizar los videos off-line en contenedores de 5 minutos.
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Dolor Versus comportamientos de picor
- Vea y recuerde pestañear, lamer y morder los comportamientos.
Nota: Vacilar y lamiendo de sitio afectado son considera las respuestas al dolor, mientras que pican se asocia con prurito. - Analizar videos a velocidad normal, medir el tiempo que el ratón pasó lamiendo o mordiendo el sitio afectado o medir en camara lenta para una distinción más precisa entre lamer y morder los reflejos. Como alternativa, contar el número de combates, lamer, morder/vacilar.
- Vea y recuerde pestañear, lamer y morder los comportamientos.
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Prueba de von Frey
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Análisis morfológico
- Realizar análisis morfológicos de una a tres semanas después de la inyección del virus o al final de un experimento conductual.
Nota: Hemos detectado la expresión de eGFP en cuanto a 48 h después de la inyección, pero también encontró que expresión aumenta significativamente en los próximos días y hasta semanas. Para las células con expresión fuerte reportero, una semana de incubación (de inyección intraspinal hasta perfusión) puede ser suficiente. Para células con expresión débil transgenes, virus con promotores débiles o fluoróforos más débil, se requiera una expresión más larga para asegurar niveles detectables. -
Fijación del tejido
- Perfusión cada transcardially de ratón, primero con de 20 mL de solución de helado líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF) (NaCl 125 mM, NaHCO3 25 mM, NaH2PO4 1,25 mM, D-glucosa 20 mM, 2.5mm de KCl y CaCl2 2 mM MgSO4 1 m m), luego a 100 mL de paraformaldehído helada al 4% (en buffer de fosfato de sodio de 0,1 M, pH 7.4).
PRECAUCIÓN: Paraformaldehido es tóxica y debe manipularse con cuidado. - Diseccionar la médula espinal lumbar y después fijar el tejido por 2 h con paraformaldehído al 4% en el hielo. Lavar brevemente el tejido posterior fijo con tampón de fosfato sódico de 0,1 M (pH 7,4) y luego la incubar en la solución de sacarosa al 25% (en tampón de fosfato de sodio de 0,1 M, pH 7.4) durante la noche a 4 ° C.
- Cortar el tejido de cryoprotected a 30 μm en un criostato y Monte las secciones en portaobjetos de microscopio.
- Perfusión cada transcardially de ratón, primero con de 20 mL de solución de helado líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF) (NaCl 125 mM, NaHCO3 25 mM, NaH2PO4 1,25 mM, D-glucosa 20 mM, 2.5mm de KCl y CaCl2 2 mM MgSO4 1 m m), luego a 100 mL de paraformaldehído helada al 4% (en buffer de fosfato de sodio de 0,1 M, pH 7.4).
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Tinción de inmunofluorescencia
- Después de lavado breve en PBS, aplicar 300 μL de solución de bloqueo (10% de suero Normal de burro en 0.3% Triton-PBS) en las secciones por 1 h a temperatura ambiente.
- Incube los portaobjetos con 300 μL de las respectivas combinaciones de anticuerpos primarios en solución de bloqueo (véase Tabla de materiales) durante la noche a 4 ° C. Lávese las secciones 3 veces por 5 minutos cada uno en PBS.
- Incube los portaobjetos con las respectivas combinaciones de anticuerpos secundarios en solución de bloqueo durante 1 hora a temperatura ambiente. Lávese las secciones 3 veces por 5 minutos cada uno en PBS.
- Brevemente enjuague los portaobjetos en ddH2O y luego montar el cubreobjetos con medio de montaje fluorescente.
- Adquisición de imágenes fluorescentes utilizando un microscopio confocal equipado con 20 x y un objetivo de 40 x.
- Realizar análisis morfológicos de una a tres semanas después de la inyección del virus o al final de un experimento conductual.
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Representative Results
Con el fin de ilustrar los niveles de expresión que pueden ser obtenidos por la inyección intraspinal de rAAV codificando una proteína del marcador, primero inyectamos AAV1. CAG.eGFP en la médula espinal lumbar de los ratones de tipo salvaje. Tres inyecciones espaciadas aproximadamente 1 mm de separación producción una infección casi continua de segmentos espinales lumbares L3 a L5 (figura 1A-C). Inyección de virus a una profundidad de 300 μm de la superficie vertebral conduce a infección predominante de las células en el asta dorsal de la médula espinal. Sin embargo, las células infectadas podrían encontrarse también en el cuerno ventral (figura 1). A continuación, el objetivo era ilustrar la diferencia en la expresión rAAV-mediada al inyectar un rAAV Cre-dependiente en un ratón transgénico de Cre. Por lo tanto, inyectamos el AAV1 Cre-dependiente. Vector de CAG.flex.eGFP en la médula espinal de ratones transgénicos GlyT2::Cre. Como antes, la expresión de eGFP fue observada en el cuerno dorsal y ventral. Sin embargo, como se esperaba, la expresión de eGFP se convirtió más restringida, lo que refleja la distribución de GlyT2 + neuronas, es decir, la expresión relativamente escasa en el cuerno dorsal superficial y expresión densa en el cuerno dorsal profunda (Figura 1E).
A continuación, para demostrar la viabilidad de abordar la función circuito de subpoblaciones neuronales espinales, dos diferentes Cre-dependiente AAVs codifica para proteínas efectoras diferentes (DTA y hM3Dq) fueron inyectadas en ratones transgénicos GlyT2::Cre. Análoga a la expresión viral observada después de tres inyecciones de AAV1. CAG.eGFP en ratones de tipo salvaje, era robusta ablación de las neuronas inhibitorias (Pax2 +) en segmentos lumbares L3-L5 después de la inyección de AAV1. EF1a.Flex.DTA en ratones Glyt2::Cre (figura 2AC). Pérdida de neuronas inhibidoras glycinergic en estos segmentos evoca una marcada hipersensibilidad mecánica (Figura 2D) y comportamiento aversivo espontáneo dirigido hacia el miembro posterior ipsilateral (Figura 2E). El comportamiento aversivo condujo a las lesiones infligidas a sí mismo, que pudieran observarse en las patas, pantorrilla y muslo (para datos, vea Foster et al. 7) enfrente de efectos se observaron cuando la activación de las neuronas glycinergic a través de la inyección de AAV1.hSyn.flex.hM3Dq y posterior inyección intraperitoneal de CNO (figura 2B). Ratones se convirtió en insensible a la estimulación mecánica nociva (figura 2F) y otros estímulos nocivos (véase Foster et al. 7) además, cuando tratadas con pruritogens histamina o cloroquina, hM3Dq mediada por activación de las neuronas glycinergic eficientemente reprimida prurifensive respuestas (figura 2). Estos resultados demuestran que tres inyecciones de rAAV en la médula espinal lumbar son capaces de transducir una zona de la médula espinal lumbar suficiente para observar cambios de comportamiento robustos evocados por el estímulo de la trasera correspondiente.
En un conjunto final de experimentos, hemos querido demostrar las diferencias de potencial en el uso de ratones de reportero de Cre en comparación con el virus de la reportera de Cre. Por lo tanto, un gen controlador de Cre fue elegido que se ha descrito previamente como mostrando un patrón de expresión restringido en la médula espinal de ratón. El gen RORβ se ha sugerido para ser expresado principalmente en interneuronas inhibitorias del cuerno dorsal profunda13,14. Este estudio utilizó RORβCre knock-en ratones y cruzado Rosa26lox-parada-lox-tdTomato (R26Tom) Cre reportero ratones que conducen a la expresión de tdTomato en todas las células mostrando expresión Cre en cualquier momento antes de () análisis Figura 3A). Caracterización de células tdTomato + en RORβCre; R26Tom ratones revelaron la expresión en neuronas y astrocitos del cuerno dorsal (figura 3BC). De hecho, la cuantificación de las células tdTomato + sugiere que la mayoría de las células que experimentan recombinación mediada por la Cre (58%) fueron no neuronales. Luego se inyecta un Cre-dependiente tdTomato reportero rAAV (AAV1. CAG.flex.tdTomato) en la médula espinal de ratones P40 RORβCre (figura 3D). En contraste con R26Tom-mediada por la expresión del reportero, encontramos todas tdTomato + las células por el virus de la reportera que las neuronas (figura 3EF). Por último, se analizó la identidad de las tdTomato + neuronas en ambos grupos de ratones (RORβCre; R26Tom y RORβCre inyectada AAV1. CAG.flex.tdTomato). en ambos casos, la mayoría de las neuronas es inhibitoria (> 85%) y la minoría de neuronas excitatorias (< 20%) (Figura 3 G-I), que está de acuerdo con las evaluaciones previas de la identidad de RORβ +1413,de las neuronas.
Figura 1: Inyección Intraspinal de AAV1-eGFP/AAV1-flex-eGFP
(A) ilustración esquemática de una inyección intraspinal de un AAV1. CAG.eGFP (AAV1-eGFP) en la médula espinal lumbar, que es inervada de la trasera. (B) se aprecia la localización anatómica de los segmentos de la médula espinal lumbar L3-L4 en una tapa abajo vista de la parte posterior de un ratón. La piel se abrió para dejar al descubierto la columna vertebral. Procesos espinales de las vértebras T13-L6 se colorean como referencias anatómicas y una flecha indica la cresta ilíaca. (C) imagen representativa de una médula espinal lumbar de Monte todo. Fluorescencia verde indica áreas transduced por el virus de la médula espinal. (D) imagen representativa de una sección transversal a través de un AAV1-eGFP-transduced lumbar medular de un ratón de tipo salvaje. (E) imagen representativa de una sección transversal de un AAV1. CAG.flex.eGFP-transduced la médula espinal de un ratón GlyT2::Cre. Las líneas punteadas representan el contorno de la materia gris y superficial cuerno dorsal de la médula espinal. Escala de barras C = 1 mm, D = 100 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Manipulación funcional de Cre-expresar espinal las neuronas Glycinergic
(A + B) Ilustración esquemática de una inyección intraspinal de un AAV1. EF1a.Flex.DTA (A) o un AAV1. EF1a.Flex.hM3Dq (B) en la médula espinal lumbar. CRE-dependiente de la expresión del fragmento de la toxina de difteria A (DTA) conducirá a la ablación de las neuronas (GlyT2 +) glycinergic (A), mientras que expresión Cre-dependiente de la hM3Dq de la farmacogenética del receptor diseñador hará que GlyT2 neuronas activables por clozapina-N-óxido (CNO) (B). (C) tres inyecciones de AAV1. EF1a.Flex.DTA en los segmentos L3-L5 GlyT2::Cre ratones condujo a una pérdida marcada de neuronas inhibitorias en los segmentos respectivos de la ipsolateral pero no del lado contralateral. (D) pérdida de GlyT2 neuronas evocan una hipersensibilidad de larga duración al estímulo mecánico de von Frey en la pata trasera ipsolateral de GlyT2::Cre ratones inyectados con AAV1. EF1a.Flex.DTA, pero el cambio no se observó si se inyectaron ratones Cre-negativo. (E) pérdida de GlyT2 neuronas evocan comportamiento aversivo espontáneo de prurito crónico. (F) hM3Dq mediada por activación de las neuronas GlyT2 aliviados nociva mecánica dolor evocado por el estímulo del pinchazo. (G) hM3Dq mediada por activación de las neuronas GlyT2 reducido pruritogen (cloroquina o histamina)-evocado comportamiento aversivo. Los datos se representan como media ± SEM. *** p < 0.001; p < 0.01. Escala de la barra C = 1 m. g = gramos. Las imágenes son reutilizadas y modificadas de Foster et al. 7 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: genética y mediada por Virus etiquetado de células RORβ-expresión. (A) diagrama que muestra la estrategia para la expresión de Cre-dependiente del reportero fluorescente tdTomato en RORβCre; Rosa26lox-parada-lox-tdTomato (R26Tom) ratones. (B) inmunotinción sobre las secciones de la médula espinal de RORβCre; R26Tom ratones revelaron que las neuronas NeuN + RORβ-Tom se pueden encontrar en láminas I-IV. (C) expresión de Cre-dependiente de tdTomato también fue observada en células GFAP + de RORβCre; R26Tom ratones, sugiriendo que la RORβ se expresa en los astrocitos durante el desarrollo. Puntas de flecha indican los astrocitos marcados con doble en la lámina III. (D) diagrama que muestra la inyección intraspinal de virus AAV-flex-Tom (rAAV1.CAG.flex.tdTomato) en ratones RORβCre a unidad local Cre-dependiente de la expresión de tdTomato. (E) inmunotinción sobre las secciones de la médula espinal de RORβCre ratones inyectados con virus AAV-flex-Tom. Las neuronas RORβ-Tom fueron localizadas a las láminas superficiales del cuerno dorsal espinal y expresión de tdTomato estuvo ausente de los astrocitos. (F) porcentaje de RORβ-Tom las células con el marcador neuronal NeuN en secciones de espinales de RORβCre; R26Tom ratones y ratones RORβCre inyectados con virus AAV-flex-Tom. (G-H) Inmunotinción sobre las secciones de la médula espinal de (G) RORβCre; (H) RORβCre ratones inyectados con virus AAV-flex-Tom mostrando colocalización entre las neuronas RORβ-Tom y el marcador inhibitorio Pax2 o el marcador excitatorios Lmx1b. (I) porcentaje de RORβ-Tom y R26Tom ratones neuronas que expresan Lmx1b y Pax2 en RORβCre; R26Tom ratones y ratones RORβCre inyectados con virus AAV-Tom. Los datos se representan como media ± SEM. los datos son de 1 a 3 secciones por ratón y ratones de 2-3. Barras de escala representan 100 μm (B, E) y 20 (C, E imágenes de gran aumento, G y H). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Variable | Valor ajustado | Unidad |
| calor (H) | 450 | -(valor proporcional a la energía del calor irradiado) |
| fuerza preliminar pull (F(TH)) | 20 | -(valor proporcional al voltaje aplicado a la fuerza de la bobina) |
| umbral de distancia (s(TH)) | 25 | 0.12 mm |
| retraso heatstop (t(H)) | 30 | 0,5 ms |
| distancia heatstop (s(H)) | 0 | 0.12 mm |
| tirón de retardo 1 (t(F1)) | 200 | 0,5 ms |
| fuerza de tracción 1 (F1) | 300 | -(valor proporcional al voltaje aplicado a la fuerza de la bobina) |
| tiro de distancia 2 (s(F2)) | 30 | 0.12 mm |
| fuerza de tirón 2 (F2) | 600 | -(valor proporcional al voltaje aplicado a la fuerza de la bobina) |
| ajuste (AD) | 0 | - |
Tabla 1: Configuración de tirador
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Discussion
Inyección intraspinal de aireación puede convertirse en una poderosa técnica en un laboratorio de investigación, lo que permite el análisis de células espinales con solución temporal y espacial de alta. Este protocolo permite la transducción de los tres principales segmentos espinales inervados por neuronas sensoriales ampliando sus axones periféricos a la trasera. Transducción de tres segmentos produce datos conductuales robustos y reproducibles. También permite la prueba de un área sensorial más grande que posible después de una sola inyección intraspinal. Por ejemplo, el mismo régimen de inyección permite probar la pata (von Frey, Hargreaves, etc.) y el muslo (inyecciones intradérmicas, estimulación de mechano-receptor), ampliando las modalidades sensoriales que pueden abordarse.
Pasos críticos:
Hay varios pasos fundamentales para la obtención de datos morfológicos y de comportamiento robustos y para evitar artefactos. El diseño de vectores virales y la elección de la promotora y el serotipo pueden tener un fuerte impacto en la eficiencia de la transducción y la superficie transduced y por lo tanto en los resultados conductuales (para más detalles sobre la propagación viral y la eficiencia de la transducción de señales, ver 12). preparaciones virales de alta calidad son necesarios para minimizar los efectos secundarios de la inyección del virus, que puede ocurrir si contaminantes o celda de desechos están presentes en la solución de virus. La cirugía que es necesaria para inyectar la médula espinal tiene que realizarse con mucho cuidado para evitar artefactos morfológicos y de comportamiento introducidos por la cirugía. Especial atención se requiere en el manejo de la médula espinal, especialmente durante la laminectomía y la perforación de la duramadre con la aguja. Daño a la médula espinal podría disminuir sensaciones somáticas y coordinación motora del ratón, comprometiendo cualquier experimentos conductuales previstos. Además, es importante montar la jeringa cuidadosamente. Montaje incorrecto u obstrucción de la micropipeta puede obstaculizar el experimento. Tejido espinal en el sitio de inyección debe examinarse al final del experimento para verificar la inyección acertada y transducción de la zona inyectada y para excluir daño el exceso de tejido como resultado de la cirugía. Este protocolo utiliza títulos virales hasta una concentración de 1 x 1013 GC/mL sin toxicidad aparente, pero más altos títulos de virus pueden llegar a ser tóxicos en algún momento del tiempo. Además, la toxicidad probablemente también dependerá de la proteína codificada por el AAV inyectado.
Modificaciones:
Varios parámetros en el protocolo pueden ser adaptados a la población neuronal y pregunta de investigación a estudiar. Inyección de solución de antivirus de nL 300 a 300 μm de profundidad conduce a la transducción de las neuronas a lo largo y predominante en el cuerno dorsal. Si el objetivo es objetivo las neuronas más ventrales, la profundidad puede ajustarse. La inyección de volúmenes grandes de virus (que hemos usado hasta 500 nL por inyección) conducirá a una mayor propagación en dorsoventral y rostrocaudal. Esto puede ser beneficioso para lograr la orientación de células adicionales de la extensión rostrocaudal, pero puede aumentar el derrame hacia el lado contralateral, que puede dificultar el uso del lado contralateral como control interno. Además, la medida dorsoventral de células transduced aumentará, que debe evitarse o puede ser el efecto deseado. Inyección de 300 nL a una profundidad de 300 μm evitar lado efectos sobre el control del motor en ratones GlyT2::Cre, mientras que la inyección de 500 nL o inyección a una profundidad mayor de vez en cuando produce fenotipos motor, tales como extensión espástica de la trasera (datos no mostrados). Inyección de volúmenes más pequeños se puede utilizar para restringir la focalización de áreas confinadas aún más5. El título viral es otro parámetro que puede ser modificado y de hecho debe ser determinado para cada virus. Para las toxinas bacterianas, como la DTA altamente eficiente, niveles bajos de expresión pueden ser suficientes para inducir el efecto deseado, mientras que reporteros fluorescentes y DREADDs, títulos más altos pueden ser necesarios para la expresión perceptible o eficaz.
Importancia del método con respecto a los métodos existentes y alternativas:
Hasta la fecha, se han utilizado principalmente dos técnicas para interrogar funcionalmente los circuitos neuronales necesarios para la transmisión de las señales sensoriales. Muchos investigadores han utilizado inyecciones intraspinales de rAAV codificación para reportero y efectoras proteínas en ratones recombinase-expresión con el fin de etiquetar y manipular subpoblaciones neuronales espinales. Intraspinal inyección como una técnica para manipular células espinales ha sido previamente descrito15,16. El protocolo descrito aquí fue diseñado específicamente para transducir las neuronas genéticamente marcadas en tres segmentos consecutivos de la médula espinal lumbar y reducir al mínimo la manipulación quirúrgica. Esto se logra colocando dos de las tres inyecciones en el espacio intervertebral rostral y caudal de las vértebras de T13 y segundo, por taladrar un agujero en T13 para la tercera inyección en vez de quitar las vértebras. Los segmentos L3-L5 específicos son el área principal de terminación de las neuronas sensoriales que inervan el miembro posterior. Demostramos que este tipo de transducción de señales es suficiente para producir cambios de comportamiento sólidos después de la manipulación de las neuronas glycinergic y sugieren que es conveniente para el análisis de una variedad de diferentes neuronas espinales genéticamente marcadas.
La segunda técnica que se ha utilizado para manipular la función de subconjuntos de neuronas espinales se basa en el cruce de animales transgénicos. Aquí, los ratones que expresaban un recombinase en un subconjunto específico de neuronas espinales tienen que ser cruzado a los ratones de reportero para lograr la expresión del marcador deseado o proteínas efectoras en el respectivo subgrupo neuronal17,18, 19. para ilustrar algunas de las diferencias que se pueden presentar al comparar resultados obtenidos mediante el uso de ratones de reportero o inyecciones intraspinales virus nos cruzó RORβCre knock-en animales a un ratón de reportero de Cre-dependiente o inyectado RORβ CRE ratones con un Cre-dependiente reportero rAAV. Comparamos la expresión del gen reportero obtenida de la rAAV a expresión del gen reportero en RORβCre; R26Tom ratones. Expresión del gen reportero de la inyección intraspinal de un rAAV Cre-dependiente se limita a las neuronas de la médula espinal, mientras la reportera R26Tom ratón-evocado tdTomato expresión también se encuentra en astrocitos. Esto sugiere que la RORβ se expresa transitoriamente en los astrocitos. Asimismo, Gutiérrez Mecinas et al encontró una expresión más restringida de reportero (espacial y tipo de células específicas) después de la inyección viral en comparación con la expresión del reportero ratón-evocado en TCA1Cre ratones20. Mediante el uso de inyecciones intraspinales de rAAV reportero en la médula espinal de ratones adultos, expresión del gen reportero o efectoras eficientemente puede ser restringido a la población de células que expresan el gen en el adulto y así evitar recombinación/expresión en las poblaciones con actividad genética transitoria anterior.
Una segunda ventaja principal de las inyecciones intraspinales rAAV es la capacidad para restringir la expresión de los genes codificados de rAAV al sitio de inyección. En ratones transgénicos, Cre mediada por controlador expresión a menudo no sólo se encuentra en la subpoblación neuronal de interés, sino también en otras poblaciones dentro del sistema nervioso. Dymecki y colegas, así como los grupos de Ma y Goulding, han desarrollado formas elegantes de utilizar enfoques ratón reportero intersectorial que evita la recombinación de partes del sistema nervioso que permanecerá inalterado17, 1819,de,21,22,23. Utilizando ratones knock-in para obtener la expresión de las proteínas efectoras o plumón marcador también puede ser asumido para ser menos variable, ya que hay solamente una copia genomic de la cassette de expresión respectivos por la célula y el casete de expresión está presente en todas las células en la región de interés . Por el contrario, la presencia de un cassette de expresión respectivos y también el número de copias del cassette de expresión después de transducción viral depende de la eficiencia de la transducción de señales, que puede variar de célula a célula, de inyección a inyección y depende de la gran cantidad de virus. Por último, la principal desventaja de la expresión génica mediada por virus sobre los métodos genéticos tradicionales es la necesidad de cirugía. Lesiones, inflamación mediada por la cirugía puede afectar a las neuronas y los circuitos directamente. Inclusión de los ratones de control que han sido sometidos a la misma cirugía, por tanto, es obligatorio.
Futuras aplicaciones:
Intraspinal inyectable puede utilizarse para analizar y manipular cualquier subpoblación genéticamente identificado espinal a través de la sobreexpresión de proteínas marcador y efectoras. En el futuro, por tanto, es probable que muchos adopten esta técnica para estudiar poblaciones neuronales en su foco específico. Por otra parte, además de utilizar inyección intraspinal de rAAVs para conseguir la sobreexpresión de proteínas efectoras exógena, esta técnica puede usarse a silencio o sobrexpresan proteínas endógenas y por lo tanto, estudiar la función de cualquier gen dado con alta espacial y resolución temporal.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos Hanns Ulrich Zeilhofer generosamente apoyando este trabajo. Hendrik Wildner fue apoyado por la Fundación Olga Mayenfisch. Agradecemos a Carmen Birchmeier para el anticuerpo de Lmx1b.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| micropipette puller: DMZ-Universal-Electrode-Puller | Zeitz | NA | |
| anesthesia unit: Oxymat3 oxygen concentrator | Weinmann | NA | |
| anesthesia unit: VIP 3000 Veterinary Vaporizer | Midmark | NA | |
| Heat mat: Mio Star Thermocare 100 | Migros | 717614700000 | |
| Electric shaver | Philips | BT9290 | |
| surgical microscope (OPMI pico) | Zeiss | NA | |
| Small animal stereotaxic apparatus | Kopf | NA | |
| Neurostar StereoDrive (optional) | Neurostar | NA | |
| Model 51690 Cunningham mouse spinal adaptor | Harvard Apparatus | 72-4811 | |
| PHD Ultra syringe pump with nanomite | Harvard Apparatus | 70-3601 | |
| Hamilton 701 RN 10 μl glass microliter syringe | Hamilton | 7635-01 | |
| Hamilton Removable needle (RN) compression fitting 1 mm | Hamilton | 55750-01 | |
| fine dentistry drilling apparatus: Osada success 40 | Osada | OS-40 | |
| spherical cutter, 0.5mm | Busch | 12001005B | |
| electronic von Frey anesthesiometer | IITC | 23905 | |
| flexible von Frey hairs | IITC | #7 | |
| LSM710 Pascal confocal microscope | Zeiss | NA | |
| 0.8 NA × 20 Plan-apochromat objective | Zeiss | NA | |
| 1.3 NA × 40 EC Plan-Neofluar oil-immersion objective | Zeiss | NA | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Tools | |||
| Scalpel Handle #4, 13cm | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Adson forceps, 1 x 2 teeth, 12 cm | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Friedman-Pearson rongeurs, curved, 0.7 mm cup | Fine Science Tools | 16121-14 | |
| Dumont #2 laminectomy forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
| Olsen-Hegar needle holders, serrated, 8.5 mm clamp length | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| Fine forceps #5 | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables and Chemicals | |||
| Thin-wall glass capillary, 1mm outside diameter | World Precision Instruments | TW 100-3 | |
| Syringes (1, 5 and 20 ml) | B. Braun | (9166917V, 4606051V, 4606205V) | |
| 26G beveled needle | B. Braun | 4665457 | |
| Sterile scalpel blades | B. Braun | BB523 | |
| Surgical sutures Safil Quick+ 4/0, absorbable | B. Braun | C1046220 | |
| Surgical sutures Premilene 5/0, non-absorbable | B. Braun | C0932191 | |
| Sterile PBS or saline (0.9%) | NA | ||
| Ethanol, 70% (disinfectant) | NA | ||
| Iodine solution (e.g. Braunol) | B. Braun | 18380 | |
| Anaesthetics (e.g. Attane isoflurane) | Provet | 2222 | |
| Aldasorber | Provet | 333526 | |
| analgesics (e.g. buprenorphine: temgesic) | Indivior | GTIN: 7680419310018 | |
| Ophthalmic ointment (e.g. vita-pos) | Pharma medica | GTIN: 4031626710635 | |
| Cotton swabs (e.g. from) | IVF Hartmann | 1628100 | |
| Facial tissues (e.g. from) | Uehlinger AG | 2015.10018 | |
| Superfrost plus microscope slides | ThermoScientific | J1800AMNZ | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| C57BL/6J mice (wildtype) | The Jackson Laboratory | RRID:IMSR_JAX:000664 | |
| Rorbtm1.1(cre)Hze/J mice (RORβCre) | The Jackson Laboratory | RRID:IMSR_JAX:023526 | |
| Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J mice (R26Tom) | The Jackson Laboratory | RRID: IMSR_JAX:007914 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Viral vectors | |||
| AAV1.CB7.CI.eGFP.WPRE.rBG (AAV1.CAG.eGFP) | Penn Vector Core | AV-1-PV1963 | |
| AAV1.CAG.flex.eGFP.WPRE.bGH (AAV1.CAG.flex.eGFP) | Penn Vector Core | AV-1-ALL854 | |
| AAV1.CAG.flex.tdTomato.WPRE .bGH (AAV1.CAG.flex.tdTomato) |
Penn Vector Core | AV-1-ALL864 | |
| AAV1.EF1a.flex.DTA.hGH (AAV1.EF1a.flex.DTA) | Penn Vector Core | Custom production | |
| AAV1.hSyn.DIO.hM3D(Gq)-mCherry.hGH (AAV.flex.hM3D(Gi)) | Penn Vector Core | Custom production | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmids | |||
| pAAV.hSyn.flex.hM3D(Gq)-mCherry | Addgene | 44361 | |
| pAAV.EF1α.flex.hChR2(H134R)-eYFP | Addgene | 20298 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacteria | |||
| MDS42 | ScarabGenomics | ||
| Stbl3 | ThermoScientific | C737303 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Quiagen | 12362 | |
| NucleoBond PC 500 | Machery & Nagel | 740574 | |
| clozapine-N-oxide (CNO) | Enzo Life Sciences | BBL-NS105-0025 | |
| chloroquine diphosphate salt | Sigma | C6628 | |
| histamine | Sigma | H7125 | |
| Dapi | Invitrogen | D3571 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies (dilution) | |||
| Rabbit anti-GFP (1:1000) | Molecular Probes | RRID:AB_221570 | |
| Rabbit anti-NeuN (1:3000) | Abcam | RRID:AB_10711153 | |
| Goat anti-Pax2 (1 : 200) | R & D Systems | RRID:AB_10889828 | |
| Guinea pig anti-Lmx1b (1 : 10 000) | Dr Carmen Birchmeier | Muller et al. 2002 | |
| Rabbit anti-GFAP (1 : 1000) | DakoCytomation | RRID:AB_10013382 | |
| Secondary antibodies raised in donkey (1:800) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | NA |
References
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