Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Adeno-associerade Virus-medierad transgenens uttryck i genetiskt definierade nervceller i ryggmärgen

Published: May 12, 2018 doi: 10.3791/57382
Automatic Translation
*1,2, *1, 1, 1
1Institute of Pharmacology and Toxicology, University of Zurich, 2Institute of Pharmaceutical Sciences, Swiss Federal Institute (ETH) Zurich
* These authors contributed equally

Summary

Intraspinala injektion av recombinase beroende av rekombinant adeno-associerade virus (rAAV) kan användas för att manipulera någon genetiskt märkta celltyp i ryggmärgen. Här beskriver vi hur man transduce nervceller i den dorsala hornen av ländryggen ryggmärgen. Denna teknik möjliggör funktionella förhör av undertypen manipulerade neuron.

Abstract

Selektiv manipulation av spinal neuronala subpopulations har främst uppnåtts genom två olika metoder: 1) intersektionella genetik, whereby dubbla eller tredubbla transgena möss genereras för att uppnå selektiv uttryck för en reporter eller effektor gen (t.ex., från det Rosa26 locus) i önskad spinal befolkningen. (2) intraspinala injektion av Cre-beroende rekombinant adeno-associerade virus (rAAV); här injiceras Cre-beroende AAV vektorer kodning för reporter eller effektor genen val i ryggmärgen hos möss som uttrycker Cre recombinase i önskad neuronala subpopulationen. Det här protokollet beskriver hur du genererar Cre-beroende rAAV vektorer och hur man transduce nervceller i den dorsala hornen av ländryggen ryggmärgen segmenten L3-L5 med rAAVs. Som de lumbal spinal segment L3-L5 är innerveras av de perifera sensoriska nervceller som skickar sensorisk information från bakbenen, kan spontana beteende och Svaren till sensoriska tester tillämpas på bakbenet ipsilaterala sida injektion vara analyserats för att förhöra funktionen av manipulerade nervceller i sensorisk bearbetning. Vi ger exempel på hur denna teknik kan användas för att analysera genetiskt definierade undergrupper av spinal nervceller. De främsta fördelarna med virus-medierad transgenens uttryck i Cre transgena möss jämfört med klassisk reporter mus-inducerad transgenens uttryck är följande: 1) olika Cre-beroende rAAVs kodning olika reporter eller effektor proteiner kan vara injiceras i en enda Cre transgena rad, således övervinna behovet av att skapa flera flera transgena möss linjer. (2) intraspinala injektion begränsar manipulation av Cre-uttryckande celler på injektionsstället och tiden efter injektion. De främsta nackdelarna är: 1) Reporter genuttryck från rAAVs är mer variabel. (2) kirurgi krävs att transduce spinal nervceller av intresse. Vilken av de två metoderna är lämpligare beror på neuron befolkningen och forskning frågan tas upp.

Introduction

Dorsala ryggmärgen är viktigt för informationsutbyte mellan peripheryen av kroppen och hjärnan. Sensoriska stimuli såsom värme, kyla, tryck eller skadliga stimuli upptäcks av specialiserade perifera nervceller, som förmedlar informationen till nervceller i ryggmärgen dorsala hornen. Här, ett komplext nätverk av retande och hämmande interneuroner modulerar och så småningom reläer sensorisk information via spinal projektion nervceller till supraspinal webbplatser1,2. De beräkningar som utförts av spinal inter- och projektion nervceller gate sensorisk information, således bestämma vilken är undertryckta eller återutläggas på vilken intensitet. Integrering av sensoriska stimuli, till exempel en förändrad balans mellan hämning och magnetisering, kan orsaka sensorisk dysfunktioner såsom överkänslighet eller allodyni (smärtsamma förnimmelser efter normalt icke-smärtsam stimulering). Dessa förändringar tros vara den bakomliggande orsaken till olika kronisk smärta anges3,4. Spinal kretsar är således av stor betydelse i sensorisk bearbetning och följaktligen i uppfattningen av en organisms miljö och själv. Med den senaste tillkomsten kombination av molekylär, genetisk och kirurgiska tekniker som tillåter exakta manipulering av genetiskt identifierade spinal neuron subpopulations, börjar forskare nu förstå de underliggande spinal kretsarna ansvarig för bearbetning av olika sensoriska modaliteter.

Intraspinala injektion av rAAV i vildtyp eller transgena möss har bidragit mycket till manipulation, analys och förståelse för funktionen i enskilda undergrupper av spinal nervceller5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11. denna teknik tillåter leverans av markör proteiner (till exempel GFP / GFP fusionsproteinerna), reporter proteiner (t.ex. GCaMP) eller effektor proteiner (t.ex. bakteriella toxiner, channelrhodopsin eller farmakogenetiska receptorer) i ett rumsligt restriktivt till spinal nervceller. Lokal injektion av Cre-beroende rAAVs i transgena möss uttrycker Cre recombinase i en specifik delmängd av spinal nervceller tillåter specifika analysen av respektive neuronala befolkningen. Vi har anställt denna teknik att etikettera, ablatera, hämma eller aktivera spinal glycinergic nervceller som visar att de är en viktig del av spinal grinden kontrollera smärta och kliar överföring7. I dessa experiment aktiverat intraspinala injektion av Cre-beroende rAAV i GlyT2::Cre möss selektiv manipulering av glycinergic nervceller i ländryggen ryggmärgen. Samtidiga manipulation av supraspinal kretsar som innehåller glycinergic nervceller kritiska för djurets överlevnad kan därmed undvikas.

Medan en intraspinala injektion av rAAVs begränsar infektion till platsen för injektionen, kan viral transduktion uppstå inte bara i lokala nervceller, men också i nervceller som ansluter till injektionsstället via axonal prognoser. Den sistnämnda används ofta till trace CNS områden ger neuronala bidrag till en viss kärna i hjärnan. Infektion av axonal projektioner kan dock också vara en störande faktor när en definierad population av nervceller ska undersökas på en viss webbplats. För att lösa dessa frågor, har vi nyligen genomfört en omfattande analys av AAV serotyper och uttryck kassetter att identifiera serotyper och initiativtagare som kan användas för att antingen minimera eller maximera retrograd transduktion. I samband med denna specifika forskning i spinal kretsar analyserade vi olika serotyper och initiativtagare förmåga att retrogradely transduce nervceller i de dorsala rotganglier (DRG), rostralt ventromediala medulla (RVM) och somatosensoriska cortex 12. den teknik som beskrivs i detta protokoll kan därför användas antingen analysera spinal nervceller vid injektionsstället eller analysera projektion nervceller som ger input till webbplatsen injiceras i ryggmärgen. I protokollet som beskrivs här, utförs tre injektioner av rAAV i vänster sida av ländryggen ryggmärgen för att aktivera transduktion av nervceller i de tre lumbala segmenten (L3-L5). Segmenten L3-L5 få majoriteten av sinnesintryck från den ipsilaterala bakbenet på injektionsstället. Vi visar att funktionella manipulation av genetiskt märkt nervceller i L3-L5 är tillräcklig för att framkalla robust beteendeförändringar, vilket ger funktionella bevis för funktionen krets av sådan en genetiskt märkt neuron subtyp.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla djurförsök godkändes av den schweiziska kantonala veterinärfrågor (Zurich) och är i enlighet och alla relevanta rättsliga och institutionella riktlinjer följs.

Obs: Alla material tillsammans med respektive tillverkare eller leverantörer är listade i Tabell för material.

1. generering av Cre-beroende AAV vektorer

Obs: En mängd Cre-beroende vektorer med olika initiativtagare kan köpas (se Tabell för material) eller, om den önska uttrycket konstruktionen inte är tillgänglig, så kan skapas genom att modifiera befintliga AAV konstruktioner. Observera att den arrangören och serotyp kan ha en inverkan på spridningen av viral transduktion (se 12). Den första delen av detta protokoll beskrivs kort generering av två olika Cre-beroende AAV vektorer lämplig för vinst och förlust av funktion experiment, respektive.

  1. Farmakogenetiska aktivering (förstärkning av funktion)
    1. Beställa pAAV.hSyn.flex.hM3D (Gq)-mCherry (se Tabell för material) för designer receptorer uteslutande aktiveras av designer droger (DREADD)-medierad aktivering.
    2. Vid mottagandet av den bakteriella knivhugg kulturen, strimma ut bakterier på LB tallrikar (bakteriologisk-grade agar upplöst i Luria-Bertani flytande medium) kompletteras med anslåantibiotikummen. Inkubera över natten vid 37 ° C och plocka en enda koloni på nästa dag.
      Obs: Plasmider som innehåller AAV vektor genomen kan vara instabil och rekombination av det virala genomet, särskilt inom viral inverterad terminalen upprepar (ITR), kan inträffa under amplifiering i E. coli. Vi föreslår att använda recA-brist/undertryckta stammar sådan som MDS42 eller Stbl3 för att undvika rekombination inom plasmiden som innehåller AAV genomet.
    3. Förstärka bakterier efter de instruktioner som ges av leverantören av valda DNA-Maxi-Kit och förbereda hög kvalitet plasmid DNA med en kommersiellt tillgänglig DNA-Maxi-Kit (t.ex., se Tabell för material). Utföra en kvalitetskontroll av plasmid DNA preparatet genom att verifiera integritet och identitet av Plasmiden DNA genom begränsning sammanfattad i en alikvot av Plasmiden DNA.
      Obs: Det finns erkännande platser för den begränsning Amiiiiin SmaI inom ITRs. Inkludera en SmaI sammanfattad i kvalitetskontrollen för att verifiera integriteten hos ITRs.
    4. Skicka DNA till en viral vektor core facilitet för att producera högkvalitativa rAAV.
      Obs: Hög titer, hög kvalitet viral preps är avgörande för att undvika confounding fenotyper som orsakas av föroreningar i det virala prep. Vi rekommenderar därför att rAAV val som produceras i en etablerad vektor core facilitet, såvida AAV produktionen är väl etablerad i laboratoriet.
  2. Ablation (förlust av funktion)
    Obs: Bakteriella toxiner eller toxin receptorer kan användas att medla cell ablation eller neuronala ljuddämpning. Vi har genererat pAAV.EF1α.flex.DTA till express difteri toxin fragment A (DTA) på ett sätt som Cre-beroende.
    1. Generera en Cre-beroende viral vektor, välja en Cre-beroende vektor med en lämplig promotor (t.ex., pAAV.EF1α.flex.hChR2(H134R)-eYFP). Förstärka den kodande sekvensen av val (t.ex., DTA) av polymeras-kedjereaktion med primers som inkluderar AscI och NheI eller kompatibel begränsning Amiiiiin erkännande platser i deras överhäng (se Foster m.fl. 7)
    2. Använda standarden molekylärbiologiska tekniker, utföra begränsning smälter vektorns DNA (pAAV.EF1α.FLEX.hChR2(H134R)-eYFP) och av den PCR-förstärkta Infoga (NheI-DTA-AscI) med de begränsning endonucleases AscI och NheI. Ligera renat fragment.
    3. Förvandla ligering reaktionen till lämplig bakterier, enligt protokollet ges av leverantören av den behöriga bakterien av val, och plattan bakterierna på LB plattor. Använda recA-brist/undertryckta stammar, såsom MDS42 eller Stbl3, för kloning och efterföljande förstärkning av Plasmiden DNA.
    4. Dagen efter omvandling, plocka kloner och Inokulera dem i LB medium kompletteras med lämpliga antibiotika övernattnings vid 37 ° C. Nästa dag, extrahera plasmid DNA från odlade bakterier. Verifiera lyckad kloning av begränsning smälter och sekvensering av den extraherade plasmiden DNA.
    5. Förstärka bakterieplasmid DNA av hög kvalitet (se steg 1.1.3). Skicka amplifierade DNA till en viral vektor core facilitet för virus produktion.

2. transduktion Spinal celler

  1. Beredning av lösning för Virus
    Försiktighet: Virus är smittsamma reagenser och ska hanteras enligt tillämpliga riktlinjer. I de flesta fall kan rAAVs hanteras på biosäkerhet nivå 1 (BSL1).
    1. Samma dag som injektion, avfrostning en lager alikvot av önskad renat viruset på is och hålla det på is tills direkt före injektion. Undvik upprepad frysning-tining-cykler, eftersom dessa kommer att minska den effektiva titern av viruset.
      Obs: Om nödvändigt, avfrostade viruset alikvotens kan förvaras vid 4 ° C i upp till 3 dagar.
    2. Späd viruspartiklarna i steril 0,9% NaCl eller fosfat buffrad saltlösning (PBS).
      Observera: Lämplig titern beror på experimentella syften och bör bestämmas experimentellt. En bra totala virusbelastning är att börja med 3 x 109 genomet kopior (3.33x1012 GC/mL, 3 x 300 nL injiceras). Med överskott och några förlust medan lastning kapillären in i konto, ca 2,5 µL virus lösning kommer att behövas för varje mus.
  2. Beredning av Mikropipetter för intraspinala injektioner
    1. 'Dra' tunnväggiga glas kapillärer (yttre diameter 1 mm) på en mikropipett avdragare att skapa en ~5.5 mm långa, grunda skaft. Använda en 3,0 mm värmare glödtråd och inställningarna för programmet 00 med P(A) anpassas som i tabell 1.
      Anmärkning: Dra kan göras i förväg. Drog kapillärerna ska förvaras i sluten behållare på modellera för att undvika damm, som senare kunde täppa mikropipett. Autoklavering av Mikropipetter är inte nödvändigt.
    2. Klipp i shanken av den drog kapillären med laminektomi pincett till en längd av ca 4,5 till 5 mm att skapa ett tips som öppning med en inre diameter av 25-35 μm. Med ett Mikroskop med en mikrometer skala, mäta den inre diametern av flera Mikropipetter för att få en känsla för hur stor öppningen bör vara eller mäta för varje mikropipett.
      Observera: Ett mindre tips kan leda till igensättning; en större spets kan orsaka vävnadsskada och svårigheter att tränga in i ryggmärgen.
  3. Beredning av kirurgiska Setup och verktyg
    1. Kontrollera utrustningen är ren och redo att användas. Desinficera arbetsområdet genom att torka med 70% etanol och sterilisera verktyg genom autoklavering eller desinficera dem. Lämna inte någon desinfektionsmedel på mikroliter sprutan som skulle skada den virala vektorn ska användas.
  4. Anestesi och beredning av djuret för kirurgi
    Obs: Den totala varaktigheten av kirurgi är 60-90 min.
    1. Välj 6 - 10 vecka gamla möss att underlätta ingreppet.
      Obs: Om experimentell design kräver det, injektion av yngre eller äldre djur är möjligt. Någon stam och båda könen kan användas i princip, men använda samma bakgrund stam (t.ex. C57BL/6J) för jämförelse av beteenden mellan olika transgena möss linjer. Om könsskillnader förväntas eller undersökas, analysera hanar och honor i separata grupper.
    2. Inducera anestesi med ~ 5% isofluran. Placera djuret i stereotaxic ramen på en värme matta och underhålla anestesi på 1-2,5% isofluran (air flödeshastighet 900 mL/min). Övervaka de respiration klassar under hela operationen.
    3. Applicera smörjmedel ögonsalva för att förebygga korneal torkning under operationen.
    4. Raka djurets rygg och ta bort hår noggrant med våtservetter. Desinficera rakade huden med jodlösning och låt huden torka.
    5. Ge smärtstillande behandling (t.ex., 0,1-0,2 mg/kg buprenorfin subkutant).
  5. Exponering av ryggraden på ländryggen ryggmärgen nivå
    Obs: På grund av differentiell utvecklingen av ryggmärgen och kotpelaren, respektive nivåer inte är justerade, men ländryggen ryggmärgen segmentet L4 är på samma nivå som bröstkorg kotan T13.
    1. Leta upp mest kaudala rib paret av palperas längs ryggraden. Med en skalpell, göra ett 1,5-2,5 cm längsgående snitt i huden börjar från bara rostralt mest kaudala rib paret.
    2. Lyfta huden med pincett och lossa det från den underliggande muskeln med sax. Under hela operationen, hålla utsatta vävnader fuktig med steril 0,9% NaCl.
    3. Använda fin pincett och liten sax, gör ett snitt i den nästa, tunna membranös lagret intill mittlinjen och avskurna det från spindelkrabba processerna. Det är separat från den underliggande paraspinous muskeln, men bifogas spindelkrabba processerna.
  6. Identifiering av kotorna på ländryggen ryggmärgen nivå
    Obs: När ryggraden utsätts, intertransverse ligament och dorsal spindelkrabba processerna ska vara synliga. Flera anatomiska landmärken kan stöd i att identifiera rätt kotan till mål (figur 1B).
    1. Dra ut huden tillbaka mot svansen att exponera höftbenskammen. På samma nivå går den mest kaudala par synliga intertransverse ligament den L6 spindelkrabba processen. Räkna baklänges i en stjärtfena rostralt riktning att identifiera kotan sevärdheter.
    2. Palpera längs ryggraden. Mest kaudala rib paret ligger bara rostralt om T13 kotan och bäckenben på höft nivå är i nivå med L6 kotan.
    3. Leta upp platsen där senan längs sidan av ryggraden är vitaste och mest mediala. T13 kotan ligger bara rostralt. Segmentet ländryggen ryggmärgen L4 ligger inom denna kotan.
  7. Fixering av kotpelaren och exponering av ländryggen ryggmärgen
    1. Placera djuret på en kudde av rullade upp vävnader att upphöja det till spinal klämmorna på stereotaxic ramen.
    2. Fixa målet kotan för att undvika rörelser av ryggraden på grund av andning. För detta mål, justera klämmorna intill målet kotan, fixa en klämma i position och håll ryggraden med Adson pincett fördriva tiden fästande den andra klämman.
      Obs: Kolumnen bör vara vinkelrätt mot planet som injektion och fast ordentligt så att det inte rör sig vid trycket från ovan. Om det behövs kan ett par klämmor fästas i kotpelaren. I det här fallet, är det användbart att fixa de två par av klämmor till två kotorna intill målet kotan.
    3. Ta bort paraspinous muskeln ovanför kotorna av intresse. Med en skalpell, göra en parallella snitt bara mediala till senor som är parallellt med ryggraden, samt vinkelräta snitt rostralt och stjärtfenan till målet kotan. Var noga med att inte klippa för djupt. Tår/klippa bort muskeln med hjälp av rongeurs. Använd tången som behövs för att avlägsna vävnad kvar på kotan eller ovanför dura i intervertebral utrymme.
    4. I intervertebral utrymme, bör den dorsala blodkärlen vara synlig märkning med mittlinjen av ryggmärgen. För ensidiga injektioner, utföra en partiell laminektomi genom att borra ett hål i mitten av målet sida av kotan. Använd en bra tandvård borrning apparater med en 0,5 mm sfärisk fräs och borra särskilt noggrant när du närmar dig ryggmärgen. Ta bort alla återstående benfragment med 26G avfasade nål att exponera ryggmärgen.
    5. Använder 26G avfasade nål, perforera dura i det borrade hålet och intervertebral utrymme rostralt och stjärtfenan till målet kotan, cirka 200 µm i sidled till den dorsala blodkärlen. Cerebrospinalvätskan bör fly från hålen och ryggmärgen bör vara något utbuktande.
  8. Beredning av injektionssprutan
    Obs: Injektionssprutan bör beredas omedelbart före injektionen att minska risken för dammpartiklar täpper mikropipett.
    1. Montera glas kapillären på en mikroliter sprutan med den flyttbara nål klämringskoppling kit. Dra fast muttern ordentligt för att säkerställa en tät och säker passform.
    2. Fyll mikroliter sprutan med sterilt destillerat vatten och börja trycka ut med kolven.
      Obs: Om det finns för mycket motstånd så att vattnet inte kommer lätt ur spetsen, mikropipett blockeras sannolikt och bör bytas.
    3. Montera sprutan på en micromanipulator ansluten till en elektroniskt styrd microinjector. Var noga med att inte röra någonting med en mikropipett.
    4. Med microinjector, rita upp ca 1 µL av luft för att skapa en bubbla mellan vatten och viruset.
    5. Placera en 2,5 µL droplet virus lösning på en bit paraffin filma, försiktigt flytta spetsen av en mikropipett till droplet-programmet med stereotaxic ram och utarbeta det. Sedan noggrant fördela tryck tills lite av virus lösning framträder på spetsen.
    6. Dra tillbaka sprutan och med en penna, markera mikropipett med en skala och notera nivån på virus lösningen; Detta kommer att underlätta övervakningen av huruvida infusionen fortskrider som programmeras.
  9. Intraspinala injektioner
    1. Flytta spetsen av en mikropipett ovanför en av hålen i dura och sedan ner tills en liten buckla noteras i dura. För att rikta injektionen för spinal dorsala hornen, flytta ner 500 µm i 100 på varandra följande steg om µm (hastighet 1 mm/s) och sedan 200 µm upp för mekaniska stabiliseringen av vävnad.
      Obs: Sista djupet i spetsen är 300 µm i detta fall, men kan anpassas beroende på målområdet.
      1. Om vävnaden är resistenta mot penetration, kan vara att fånga mikropipett på dura. I detta fall tillbaka och flytta något till överträffar hålet, eller använda nålen igen för att perforera dura ordentligt innan du upprepar penetration försöket.
    2. Programmera pumpen till en target injektionsvolym av 300 nL injektion hastighet av 50 nL/min och tryck på Start att börja infusionen.
    3. Efter injektionen är klar, kontrollera skalan för att se om viruset nivån har sjunkit och lämnar mikropipett på plats för en ytterligare 3 min så att trycket temperera innan långsamt Upprullningskraften sprutan.
    4. Upprepa steg 2.9.1.-2.9.3. för de andra två injektionsställen.
  10. Suturering och återhämtning
    1. Ta bort spinal klämmorna och dynan under musen.
    2. Nära såret i lager med avbrutna Hundmotiv, suturering de ytliga vävnaden lagrarna med resorberbara suturer och huden med icke-resorberbara suturer. Applicera jod desinfektionsmedel på sys såret.
    3. Avsluta anestesi och lämna djuret på värme mattan tills det återvinner innan du återvänder det till dess buren.
  11. Postoperativ vård
    1. Övervaka hälsan hos djuret på operationsdagen, nästa dag och sedan varje 2-3 dagar. Se till att djuret har en normal gång, ett friskt utseende (vikt, ögon, päls och beteende), och att såret är helande.
    2. Fortsätt smärtstillande behandling (t.ex., 0,1-0,2 mg/kg buprenorfin subkutant) vid behov, tre gånger per dag.

3. beteendemässiga och morfologiska analyser

  1. Beteendeanalys
    Obs: Tillåt djur att rymma till respektive setup för minst 30 min innan mätningar för att låta dem anpassa sig till den nya experimentella miljön.
    1. von Frey testa
      1. Placera djur individuellt i enskilda delområden av ca 10 x 10 cm på ett metallgaller golv.
      2. Stimulera den ipsilaterala hindpaw plantar yta på injektionsstället med en dynamisk von Frey glödtråd. Observera den kraft som djuret återtar dess tass från stimulans.
      3. Upprepa fem gånger och beräkna genomsnittliga tillbakadragande tröskelvärdet från de sex mätningarna för varje djur.
    2. PIN-pricktest
      1. Placera djuren i enskilda delområden av ca 10 x 10 cm på ett metallgaller golv.
      2. Stimulera den ipsilaterala hindpaw plantar yta på injektionsstället med en avtrubbad 26-G nål utan penetration av huden. Poäng beteende som noll (ingen reaktion) eller en (reaktion).
      3. 9 gånger med intervaller på 3 min mellan stimuli och beräkna procentuella svar från 10 mätningarna för varje djur.
    3. Injektion av DREADD-ligand klozapin-N-oxid (CNO)
      1. Lös CNO i dimetyl sulfoxid (DMSO) att skapa en stamlösning av 0,2 mg/µL, som kan förvaras i rumstemperatur.
      2. På dagen för experimentet, späd stamlösningen i steril 0,9% NaCl till 0.2 µg/µL och injicera 10 µL/g kroppsvikt intraperitonealt. Injicera kontrolldjur med fordon (0,2% DMSO i 0,9% NaCl).
        Obs: Enligt erfarenhet, peak effekter på beteenden kan vara förväntade 1-3 h efter injektion, och effekter bör helt avtar efter 24 h. När det gäller aktivering av glycinergic nervceller, observerade beteenden inkluderar minskad smärta och klådan svaren. Beteenden som frammanade av DREADD-medierad aktivering av nervceller kommer att bero på den rikta delmängden av spinal nervceller.
    4. Injektion av Pruritogens att framkalla klåda
      1. Lös upp pruritogens i 0,9% NaCl till lösningar av 8 mg/mL (klorokin) eller 10 mg/mL (histamin). 2 h efter CNO administration, injicera 10 µL pruritogen eller fordon lösningen subkutant i plantar ytan av den ipsilaterala hindpaw på spinal injektionsstället. Alternativt, injicera pruritogen injiceras intrakutant i kalven, som har rakat en dag innan för att minska aversivt beteende orsakas av rakningen själv.
    5. Videofilmning för att analysera spontana Nocifensive eller Pruritogen-inducerad klådan beteenden
      1. Placera djur individuellt i genomskinliga fack (ca 10 cm diameter) med lite sängkläder från sina respektive hem-buren på golvet.
      2. Videoband djuren för 5 min till post spontana och 30 min för att spela in pruritogen-inducerad beteenden. Analysera videor offline på lagerplatser av 5 min.
    6. Smärta jämfört med klådan beteenden
      1. Observera och notera blinka, slicka och bita beteenden.
        Obs: Blinka och slickande på webbplatsen påverkas är betraktade Svaren till smärta, medan bita är associerade med klådan.
      2. Analysera videor i normal hastighet, mäta tidåtgång att musen slicka eller bita på webbplatsen påverkas eller mäta i slow motion för en tydligare åtskillnad mellan Slickande och bitande reflexer. Alternativt kan du räkna antalet slicka/bita/blinka anfall.
  2. Morfologisk analys
    1. Utföra morfologiska analyser från en till tre veckor efter injektion av viruset eller slutet av ett beteende experiment.
      Obs: Vi har upptäckt andra uttryck så snart 48 h efter injektion, men fann också att uttrycket ökar betydligt inom närmaste dagar och veckor. För celler med stark reporter uttryck, en vecka efter inkubation (från intraspinala injektionen tills perfusion) vara tillräckligt. För celler med svag transgenens uttryck, virus med svag initiativtagare eller svagare fluorophores, kan ett längre uttryck krävas att säkerställa detekterbara halter.
    2. Vävnaden fixering
      1. BEGJUTA varje mus transcardially, först med 20 ml iskallt konstgjorda cerebrospinalvätska (ACSF) lösning (NaCl 125 mM, NaHCO3 25 mM, NaH2PO4 1,25 mM, D-glukos 20 mM, KCl 2,5 mM och CaCl2 2 mM MgSO4 1 mM), sedan med 100 mL av 4% iskall PARAFORMALDEHYD (i 0,1 M natrium fosfatbuffert, pH 7,4).
        Försiktighet: PARAFORMALDEHYD är giftigt och måste hanteras med försiktighet.
      2. Omedelbart dissekera ländryggen ryggmärgen och efter fixa vävnaden för 2 h med 4% PARAFORMALDEHYD på is. Kort tvätta efter fasta vävnaden med 0,1 M natrium fosfatbuffert (pH 7,4) och sedan Inkubera det i 25% sackaroslösning (i 0,1 M natrium fosfatbuffert, pH 7,4) över natten vid 4 ° C.
      3. Skär cryoprotected vävnaden på 30 μm på en kryostat och montera avsnitten på objektglas.
    3. Immunofluorescens färgning
      1. Efter korta tvättar i PBS, applicera 300 μL av blockering lösning (10% normala åsna serum i 0,3% Triton-PBS) på avsnitten för 1 h i rumstemperatur.
      2. Inkubera i bilderna med 300 μL av respektive kombinationer av primära antikroppar blockera lösning (se Tabell för material) över en natt vid 4 ° C. Tvätta i avsnitt 3 gånger för 5 min varje i PBS.
      3. Inkubera i bilderna med respektive kombinationer av sekundära antikroppar i blockerande lösning för 1 h i rumstemperatur. Tvätta i avsnitt 3 gånger för 5 min varje i PBS.
      4. Kort skölj glasen i ddH2O, montera sedan den coverslips använder fluorescerande monteringsmedium.
      5. Förvärva fluorescerande bilder med confocal Mikroskop utrustad med en 20 x och ett 40 x-objektiv.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

För att illustrera de nivåer som kan erhållas genom intraspinala injektion av rAAV kodning en markör protein, injiceras vi först AAV1. CAG.eGFP i ländryggen ryggmärgen av vildtyp möss. Tre injektioner fördelade ungefär 1 mm isär produceras en nästan fortlöpande infektion av lumbal spinal segment L3 till L5 (figur 1A-C). Virus injektion på ett djup av 300 µm från spinal ytan leder till dominerande infektion av celler i ryggmärgen dorsala horn. Infekterade celler kunde dock också hittas i ventrala horn (figur 1 d). Nästa, målet var att illustrera skillnaden i rAAV-medierade uttryck när injicera en Cre-beroende rAAV i en transgen mus som Cre. Vi injiceras därför den Cre-beroende AAV1. CAG.flex.eGFP vector i ryggmärgen hos GlyT2::Cre transgena möss. Som observerades innan, andra uttryck i rygg- och ventrala horn. Som väntat blev dock ett uttryck för andra mer begränsad, vilket speglar fördelningen av GlyT2 + nervceller, dvs relativt glesa uttrycket i den ytliga dorsala hornen och tät uttryck i den djupa dorsala hornen (figur 1E).

Nästa, för att demonstrera genomförbarheten av adressering krets funktion av spinal neuronala subpopulations, två olika Cre-beroende AAVs som kodar för olika effektor proteiner (DTA och hM3Dq) skulle injiceras i GlyT2::Cre transgena möss. Liknande viral uttryck observerades efter tre injektioner av AAV1. CAG.eGFP in vildtyp möss, det var robust ablation av hämmande nervceller (Pax2 +) i lumbala segmenten L3-L5 efter injektion av AAV1. EF1a.Flex.dta i Glyt2::Cre möss (figur 2AC). Förlust av glycinergic hämmande nervceller i dessa segment frammanas en markant mekaniska överkänslighet (figur 2D) och spontana aversivt beteende riktad mot den ipsilaterala bakbenet (figur 2E). Aversivt beteende ledde till självförvållade skador, vilket kan observeras på tassar, vaden och låret (för data, se Foster m.fl. 7) mittemot effekter observerades vid aktivering glycinergic nervceller genom injektion av AAV1.hSyn.flex.hM3Dq och efterföljande intraperitoneal injektion av CNO (figur 2B). Möss blev okänsliggjorda till skadliga mekanisk stimulering (figur 2F) och andra skadliga stimuli (se Foster m.fl. 7) Dessutom, när de behandlades med pruritogens histamin eller klorokin, hM3Dq-medierad aktivering av glycinergic nervceller effektivt undertryckt prurifensive svaren (figur 2 g). Dessa resultat visar att tre injektioner av rAAV i ländryggen ryggmärgen ska kunna transduce ett område av ländryggen ryggmärgen tillräckligt att konstatera robust beteendeförändringar som frammanade genom stimulering av det motsvarande bakbenet.

I en slutgiltig uppsättning experiment ville vi visa potentiella skillnader i använder Cre reporter möss jämfört med Cre reporter virus. Därför valdes en Cre driver gen som har tidigare beskrivits som visar ett begränsat uttryck mönster i mus ryggmärgen. Genen RORβ har föreslagits uttrycks huvudsakligen i hämmande interneuroner av djupa dorsala horn13,14. Denna studie använde RORβCre inpressning möss och korsade dem till Rosa26lox-STOP-lox-tdTomato (R26Tom) Cre reporter möss, som leder till uttrycket av tdTomato i alla celler visar Cre uttryck vid någon tidpunkt före analys) Figur 3A). Karakterisering av tdTomato + celler i RORβCre; R26Tom möss visade uttryck i nervceller och astrocyter av dorsala horn (figur 3BC). I själva verket föreslog kvantifiering av celler tdTomato + att flertalet celler som genomgår Cre-medierad rekombination (58%) var icke-neuronala. Vi sedan injiceras en Cre-beroende tdTomato reporter rAAV (AAV1. CAG.flex.tdTomato) in i ryggmärgen P40 RORβCre möss (figur 3D). I motsats till R26Tom-medierad reporter uttryck, Vi hittade alla tdTomato +-celler som märkt av reporter virus vara nervceller (figur 3EF). Slutligen, identiteten för den tdTomato + nervceller analyserades i båda uppsättningar av möss (RORβCre; R26Tom och RORβCre injiceras med AAV1. CAG.flex.tdTomato). I båda fallen majoriteten av nervceller var hämmande (> 85%) och minoriteten av nervceller excitatoriska (< 20%) (Figur 3 G-jag), som är överens med tidigare bedömningar av RORβ + nervceller13,14identitet.

Figure 1
Figur 1: Intraspinala injektion av AAV1-andra/AAV1-flex-andra
(A) Schematisk illustration av intraspinala injektion av ett AAV1. CAG.eGFP (AAV1-andra) i ländryggen ryggmärgen, som innerveras från bakbenet. (B) anatomiska läge av ländryggen ryggmärgen segmenten L3-L4 kan ses i en top-down syn på baksidan av en mus. Huden öppnades för att exponera ryggraden. Spinal tvärutskott T13-L6 är färgad som anatomiska referenser och en pil indikerar höftbenskammen. (C) representativ bild av en hela mount ländryggen ryggmärgen. Grön fluorescens anger virus-sensorik områden i ryggmärgen. (D) representativ bild av ett tvärsnitt genom en AAV1-andra-sensorik ländryggen ryggmärgen från en vildtyp mus. (E) representativ bild av ett tvärsnitt av en AAV1. CAG.flex.eGFP-sensorik ryggmärgen av en GlyT2::Cre mus. Streckade linjer representerar disposition av den grå substans och ytliga dorsala hornen av ryggmärgen. Skala barer C = 1 mm, D = 100 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Funktionella Manipulation av Spinal Cre-uttryckande Glycinergic nervceller
(A + B) Schematisk illustration av intraspinala injektion av ett AAV1. EF1a.Flex.dta (A) eller en AAV1. EF1a.Flex.hM3Dq (B) i ländryggen ryggmärgen. CRE-beroende uttryck för difteri toxin fragment A (DTA) kommer att leda till ablation av glycinergic nervceller (GlyT2 +) (A), medan Cre-beroende uttryck för det farmakogenetiska designer receptor hM3Dq kommer att göra GlyT2 nervceller activatable av klozapin-N-oxid (CNO) (B). (C) tre injektioner av AAV1. EF1a.Flex.dta i L3-L5 segment av GlyT2::Cre möss ledde till en markant förlust av hämmande nervceller i respektive segment av den ipsilaterala men inte av den kontralaterala sidan. (D) förlust av GlyT2 nervceller framkallat en långvarig överkänslighet mot mekaniska von Frey stimulering i ipsilaterala hind tass av GlyT2::Cre möss som injicerats med AAV1. EF1a.Flex.dta, men ingen förändring observerades om Cre-negativ möss injicerades. (E) förlust av GlyT2 nervceller frammanas spontant aversivt beteende påminner om kronisk klåda. (F) hM3Dq-medierad aktivering av GlyT2 nervceller lindras skadliga mekanisk smärta frammanade genom nålstick stimulering. (G) hM3Dq-medierad aktivering av nervceller som GlyT2 reducerade pruritogen (klorokin eller histamin)-framkallat aversivt beteende. Data representeras som medelvärde ± SEM. *** p < 0,001; p < 0,01. Skala bar C = 1 mm. g = gram. Bilderna är återanvändas och modifierad från Foster m.fl. 7 Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: genetiska och Virus-medierad märkning av RORβ-uttryckande celler. (A) diagrammet visar strategin för Cre-beroende uttryck för fluorescerande tdTomato reporter i RORβCre; Rosa26lox-STOP-lox-tdTomato (R26Tom) möss. (B) immunfärgning på ryggmärgen delar av RORβCre; R26Tom möss visade att NeuN + RORβ-Tom nervceller kan hittas i bladskivan I-IV. (C) Cre-beroende uttryck av tdTomato observerades också i Fredsgenomförande + celler i RORβCre; R26Tom möss, vilket tyder på att RORβ uttrycks i astrocyterna under utveckling. Pilspetsar visar dubbel-märkt astrocyter i lamina III. (D) Diagram visar intraspinala injektion av AAV-flex-Tom (rAAV1.CAG.flex.tdTomato)-virus i RORβCre möss att driva lokala Cre-beroende uttryck för tdTomato. (E) immunfärgning på ryggmärgen delar av RORβCre möss injicerade med AAV-flex-Tom virus. RORβ-Tom nervceller var lokaliserade till de ytliga bladskivan av spinal dorsala horn och uttryck för tdTomato var frånvarande från astrocyter. (F) procent av RORβ-Tom celler som uttrycker den neuronala markören NeuN i spinal delar av RORβCre; R26Tom möss och RORβCre möss injicerade med AAV-flex-Tom virus. (G-H) Immunfärgning på ryggmärgen delar av (G) RORβCre; R26Tom möss och (H) RORβCre möss injicerade med AAV-flex-Tom virus visar colocalization mellan RORβ-Tom nervceller och hämmande markören Pax2 eller den excitatoriska markör Lmx1b. (I) procent av RORβ-Tom nervceller som uttrycker Lmx1b och Pax2 i RORβCre; R26Tom möss och RORβCre möss injicerade med AAV-Tom virus. Data representeras som medelvärde ± SEM. uppgifterna är från 2-3 möss och 1-3 sektioner per mus. Skala staplarna representerar 100 µm (B, E) och 20 µm (C, E i hög förstoring bilder, G och H). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Variabel Inställt värde Enhet
värme (H) 450 -(värde proportionell mot kraften i den utstrålade värmen)
tvinga preliminära pull (F(TH)) 20 -(värde proportionell mot spänning för att tvinga spole)
avstånd tröskel (s(TH)) 25 0,12 mm
dröjsmål heatstop (t(H)) 30 0.5 ms
avstånd heatstop (s(H)) 0 0,12 mm
fördröja pull 1 (t(F1)) 200 0.5 ms
tvinga pull 1 (F1) 300 -(värde proportionell mot spänning för att tvinga spole)
avstånd pull 2 (s(F2)) 30 0,12 mm
tvinga pull 2 (F2) 600 -(värde proportionell mot spänning för att tvinga spole)
Justera (AD) 0 -

Tabell 1: Avdragare inställningar

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Intraspinala injektion av AAVs kan bli en kraftfull teknik i ett forskningslaboratorium, möjliggör analys av spinal celler med en hög tids- och rumsupplösning lösning. Detta protokoll kan transduktion tre huvudsakliga spinal segment innerveras av sensoriska nervceller att utvidga sin perifera axoner till bakbenet. Transducing tre segment producerar tillförlitliga och reproducerbara beteendemässiga data. Det gör också tester av ett större sensoriska område än möjligt efter en enda intraspinala injektion. Exempelvis samma injektion regimen medger provning tass (von Frey, Hargreaves, etc.) och låret (intradermala injektioner, mechano-receptorn stimulering), utvidgas de sensoriska modaliteter som kan åtgärdas.

Kritiska steg:

Det finns flera steg som är kritiska för att erhålla robust morfologiska och beteendemässiga data och för att undvika artefakter. Utformningen av virala vektorn och valet av promotorn och serotyp kan ha en stark inverkan på transduktion effektivitet och omfattningen av det transduced området, och därför på beteendemässiga resultat (för information om viral spridning och transduktion effektivitetsvinster, se 12). högkvalitativa viral förberedelser krävs för att minimera biverkningar av virus injektionen, som kan uppstå om föroreningar eller cell skräp är närvarande i virus lösningen. Operationen som krävs för att injicera ryggmärgen måste göras med stor omsorg för att undvika morfologiska och beteendemässiga artefakter som infördes genom operationen. Särskild uppmärksamhet krävs vid hantering av ryggmärgen, särskilt under laminektomi och vid perforeringen av dura med nålen. Skador på ryggmärgen kan försämra kroppsliga förnimmelser och finmotorik samordning av musen, vilket äventyrar några planerade beteende experiment. Det är dessutom viktigt att montera sprutan noggrant. Felaktig montering eller igensättning av en mikropipett kan hämma experimentet. Spinal vävnad vid injektionsstället har behandlas vid slutet av experimentet för att verifiera framgångsrik injektion och transduktion av det injicerade området och att utesluta alltför stora vävnadsskador till följd av operationen. Detta protokoll har använt viral titrar upp till en koncentration av 1 x 1013 GC/mL utan uppenbar toxicitet, ännu högre titrar av virus kan bli giftigt vid viss tidpunkt. Toxicitet beror dessutom troligen också på det protein som kodas av den injicerade AAV.

Ändringar:

Flera parametrar i protokollet kan anpassas till den neuronala befolkningen och forskningsfrågan studeras. Injektion av 300 nL virus lösning på ett djup av 300 µm leder till transduktion av nervceller i hela, och främst i den dorsala hornen. Om syftet är att ytterligare mål nervceller ventrala, kan djupet justeras. Injektion av större volymer av virus (vi har använt upp till 500 nL per injektion) kommer att leda till en större spridning i dorsoventral och rostrocaudal riktningar. Detta kan vara fördelaktigt att uppnå inriktning av ytterligare celler i utsträckning som rostrocaudal, men kan öka spridningseffekter till kontralaterala sidan, som kan hindra användningen av den kontralaterala sidan som intern kontroll. Dessutom kommer att dorsoventral omfattningen av sensorik celler öka, vilket kan vara önskad effekt eller bör undvikas. Injektion av 300 nL på ett djup av 300 µm undvikas sida effekter på motorisk kontroll i GlyT2::Cre möss, medan injektion av 500 nL eller injektion vid ett större djup ibland producerade motor fenotyper, såsom spastisk förlängning av bakbenet (inga data anges). Injektion av mindre volymer kan användas för att begränsa inriktning till ännu mer slutna utrymmen5. Viral titern är en annan parameter som kan ändras och i själva verket bör bestämmas för varje virus. För bakteriella toxiner, såsom högeffektiva DTA, kan låga nivåer räcka för att framkalla önskad effekt, för fluorescerande reportrar och DREADDs, högre titrar kan bli nödvändigt för detekterbar eller effektiv uttryck.

Betydelsen av metoden avseende befintliga/alternativa metoder:

Hittills har främst två tekniker använts till funktionellt förhöra de neuronala kretsar som krävs för överföring av sensoriska signaler. Många forskare har använt intraspinala injektioner av rAAV kodning för reporter och effektor proteiner i recombinase-uttryckande möss för att märka och manipulera spinal neuronala subpopulations. Intraspinala injektion som en teknik att manipulera spinal celler har tidigare varit beskrivs15,16. Protokollet beskrivs här var särskilt utformade för att transduce genetiskt märkt nervceller i tre på varandra följande segment av ländryggen ryggmärgen samtidigt minimera kirurgisk manipulation. Detta uppnås genom att placera två av de tre injektionerna i intervertebral utrymme rostralt och stjärtfenan T13 Kotor och andra, genom att borra ett hål i T13 för den tredje injektionen i stället för att ta bort Kotor. De rikta L3-L5-segmenten är området viktigaste uppsägning av sensoriska neuron innervating bakbenet. Vi visar att denna typ av signaltransduktion är tillräcklig för att producera robusta beteendeförändringar efter manipulation av glycinergic nervceller och tyder på att det är lämpligt för analys av en mängd olika genetiskt märkt spinal neuroner.

Den andra tekniken som använts för att manipulera funktionen av spinal neuron undergrupper är baserat på korsningen transgena djur. Här har möss uttrycker en recombinase i en specifik delmängd av spinal nervceller korsas reporter möss för att uppnå uttryck av önskad markör eller effektor protein i respektive neuronala delmängd17,18, 19. för att illustrera några av de skillnader som kan uppstå när jämföra resultat erhålls med hjälp av reporter möss eller intraspinala virus injektioner vi antingen korsade RORβCre inpressning djur till en Cre-beroende reporter mus eller injiceras RORβ CRE möss med en Cre-beroende reporter rAAV. Vi jämförde reporter genuttryck som erhållits från rAAV reporter genuttryck erhållits i RORβCre; R26Tom möss. Reporter genuttryck från intraspinala injektion av en Cre-beroende rAAV begränsades till nervceller i ryggmärgen, medan R26Tom reporter mus-framkallat tdTomato uttryck finns även i astrocyterna. Detta tyder på att RORβ övergående uttrycks i astrocyterna. Likaså Gutierrez-Mecinas et al. fann ett mer begränsat reporter uttryck (rumsligt och celltyp specifika) efter viral injektion jämfört med mus-framkallat reporter uttryck i Tac1Cre möss20. Genom att använda intraspinala injektioner av rAAV reporter i ryggmärgen hos vuxna möss, kan reporter eller effektor genuttryck effektivt begränsas till befolkningen av celler som uttrycker genen i vuxen och därmed undvika rekombination/uttryck i dessa populationer med tidigare övergående gen aktivitet.

En andra största fördelen med intraspinala rAAV injektioner är förmågan att begränsa uttrycket av rAAV-kodade gener till injektionsstället. Transgena möss, är Cre drivrutin-medierade uttryck ofta återfinns inte bara i neuronala subpopulationen av intresse, men också i andra populationer inom nervsystemet. Dymecki och kollegor, samt grupperna av Ma och Goulding, har utvecklat eleganta sätt att använda intersektionella reporter mus-baserade metoder att undvika rekombination i delar av nervsystemet som skall förbli oförändrat17, 18,19,21,22,23. Med inpressning möss för att få uttryck för markör eller effektor proteiner kan också antas vara mindre variabel, eftersom det finns bara en genomisk kopia av respektive uttryck kassetten per cell och uttryck kassetten finns i alla celler i området av intresse . I kontrast, förekomsten av en respektive uttryck kassett och också kopia antalet uttryck kassetten efter viral transduktion är beroende av transduktion effektivitet, som kan variera från cell till cell, från injektion till injektion, och beror på den virus mycket. Slutligen, den största nackdelen med virus-medierad genuttryck över traditionella genetiska metoder är behovet av kirurgi. Kirurgi-medierad skada/inflammation kan påverka nervceller och kretsar direkt. Införandet av kontroll möss som genomgått samma operation är därför obligatoriska.

Framtida tillämpningar:

Intraspinala injektion kan användas för att analysera och manipulera någon genetiskt identifierade spinal subpopulation genom överuttryck av markör och effektor proteiner. Det är därför sannolikt i framtiden att många kommer att anta denna teknik för att studera neuronala populationer i deras specifika fokus. Dessutom, förutom att använda intraspinala injektion av rAAVs för att uppnå överuttryck av exogena effektor proteiner, denna teknik kan också användas till tystnad eller overexpress endogena proteiner och därför att studera funktionen av någon enskild gen med hög rumslig och temporal upplösning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Vi tackar Hanns Ulrich Zeilhofer för generöst stödja detta arbete. Hendrik Wildner stöddes av stiftelsen Olga Mayenfisch. Vi tackar Carmen Birchmeier för Lmx1b antikroppen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
micropipette puller: DMZ-Universal-Electrode-Puller Zeitz NA
anesthesia unit: Oxymat3 oxygen concentrator Weinmann NA
anesthesia unit: VIP 3000 Veterinary Vaporizer Midmark NA
Heat mat: Mio Star Thermocare 100 Migros 717614700000
Electric shaver Philips BT9290
surgical microscope (OPMI pico) Zeiss NA
Small animal stereotaxic apparatus Kopf NA
Neurostar StereoDrive (optional) Neurostar NA
Model 51690 Cunningham mouse spinal adaptor Harvard Apparatus 72-4811
PHD Ultra syringe pump with nanomite Harvard Apparatus 70-3601
Hamilton 701 RN 10 μl glass microliter syringe Hamilton 7635-01
Hamilton Removable needle (RN) compression fitting 1 mm Hamilton 55750-01
fine dentistry drilling apparatus: Osada success 40 Osada OS-40
spherical cutter, 0.5mm Busch 12001005B
electronic von Frey anesthesiometer IITC 23905
flexible von Frey hairs IITC #7
LSM710 Pascal confocal microscope Zeiss NA
0.8 NA × 20 Plan-apochromat objective Zeiss NA
1.3 NA × 40 EC Plan-Neofluar oil-immersion objective Zeiss NA
Name Company Catalog Number Comments
Surgical Tools
Scalpel Handle #4, 13cm Fine Science Tools 10004-13
Extra Fine Bonn Scissors Fine Science Tools 14084-08
Adson forceps, 1 x 2 teeth, 12 cm Fine Science Tools 11027-12
Friedman-Pearson rongeurs, curved, 0.7 mm cup Fine Science Tools 16121-14
Dumont #2 laminectomy forceps Fine Science Tools 11223-20
Olsen-Hegar needle holders, serrated, 8.5 mm clamp length Fine Science Tools 12002-12
Fine forceps #5 Fine Science Tools 11254-20
Name Company Catalog Number Comments
Consumables and Chemicals
Thin-wall glass capillary, 1mm outside diameter World Precision Instruments TW 100-3
Syringes (1, 5 and 20 ml) B. Braun (9166917V, 4606051V, 4606205V)
26G beveled needle B. Braun 4665457
Sterile scalpel blades B. Braun BB523
Surgical sutures Safil Quick+ 4/0, absorbable B. Braun C1046220
Surgical sutures Premilene 5/0, non-absorbable B. Braun C0932191
Sterile PBS or saline (0.9%) NA
Ethanol, 70% (disinfectant) NA
Iodine solution (e.g. Braunol) B. Braun 18380
Anaesthetics (e.g. Attane isoflurane) Provet 2222
Aldasorber Provet 333526
analgesics (e.g. buprenorphine: temgesic) Indivior GTIN: 7680419310018
Ophthalmic ointment (e.g. vita-pos) Pharma medica GTIN: 4031626710635
Cotton swabs (e.g. from) IVF Hartmann 1628100
Facial tissues (e.g. from) Uehlinger AG 2015.10018
Superfrost plus microscope slides ThermoScientific J1800AMNZ
Name Company Catalog Number Comments
Mice
C57BL/6J mice (wildtype) The Jackson Laboratory RRID:IMSR_JAX:000664
Rorbtm1.1(cre)Hze/J mice (RORβCre) The Jackson Laboratory RRID:IMSR_JAX:023526
Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J mice (R26Tom) The Jackson Laboratory RRID: IMSR_JAX:007914
Name Company Catalog Number Comments
Viral vectors
AAV1.CB7.CI.eGFP.WPRE.rBG (AAV1.CAG.eGFP) Penn Vector Core AV-1-PV1963
AAV1.CAG.flex.eGFP.WPRE.bGH (AAV1.CAG.flex.eGFP) Penn Vector Core AV-1-ALL854
AAV1.CAG.flex.tdTomato.WPRE
.bGH (AAV1.CAG.flex.tdTomato)		 Penn Vector Core AV-1-ALL864
AAV1.EF1a.flex.DTA.hGH (AAV1.EF1a.flex.DTA) Penn Vector Core Custom production
AAV1.hSyn.DIO.hM3D(Gq)-mCherry.hGH (AAV.flex.hM3D(Gi)) Penn Vector Core Custom production
Name Company Catalog Number Comments
Plasmids
pAAV.hSyn.flex.hM3D(Gq)-mCherry Addgene 44361
pAAV.EF1α.flex.hChR2(H134R)-eYFP Addgene 20298
Name Company Catalog Number Comments
Bacteria
MDS42 ScarabGenomics
Stbl3 ThermoScientific C737303
Name Company Catalog Number Comments
Reagents
EndoFree Plasmid Maxi Kit Quiagen 12362
NucleoBond PC 500 Machery & Nagel 740574
clozapine-N-oxide (CNO) Enzo Life Sciences BBL-NS105-0025
chloroquine diphosphate salt Sigma C6628
histamine Sigma H7125
Dapi Invitrogen D3571
Name Company Catalog Number Comments
Antibodies (dilution)
Rabbit anti-GFP (1:1000) Molecular Probes RRID:AB_221570
Rabbit anti-NeuN (1:3000) Abcam RRID:AB_10711153
Goat anti-Pax2 (1 : 200) R & D Systems RRID:AB_10889828
Guinea pig anti-Lmx1b (1 : 10 000) Dr Carmen Birchmeier Muller et al. 2002
Rabbit anti-GFAP (1 : 1000) DakoCytomation RRID:AB_10013382
Secondary antibodies raised in donkey (1:800) Jackson ImmunoResearch Laboratories NA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goulding, M., Bourane, S., Garcia-Campmany, L., Dalet, A., Koch, S. Inhibition downunder: an update from the spinal cord. Curr Opin Neurobiol. 26, 161-166 (2014).
  2. Todd, A. J. Neuronal circuitry for pain processing in the dorsal horn. Nat Rev Neurosci. 11 (12), 823-836 (2010).
  3. Sandkuhler, J. Models and mechanisms of hyperalgesia and allodynia. Physiol Rev. 89 (2), 707-758 (2009).
  4. Zeilhofer, H. U., Wildner, H., Yevenes, G. E. Fast synaptic inhibition in spinal sensory processing and pain control. Physiol Rev. 92 (1), 193-235 (2012).
  5. Azim, E., Jiang, J., Alstermark, B., Jessell, T. M. Skilled reaching relies on a V2a propriospinal internal copy circuit. Nature. 508 (7496), 357-363 (2014).
  6. Cui, L., et al. Identification of Early RET+ Deep Dorsal Spinal Cord Interneurons in Gating Pain. Neuron. 91 (6), 1413 (2016).
  7. Foster, E., et al. Targeted ablation, silencing, and activation establish glycinergic dorsal horn neurons as key components of a spinal gate for pain and itch. Neuron. 85 (6), 1289-1304 (2015).
  8. Francois, A., et al. A Brainstem-Spinal Cord Inhibitory Circuit for Mechanical Pain Modulation by GABA and Enkephalins. Neuron. 93 (4), 822-839 (2017).
  9. Peirs, C., et al. Dorsal Horn Circuits for Persistent Mechanical Pain. Neuron. 87 (4), 797-812 (2015).
  10. Petitjean, H., et al. Dorsal Horn Parvalbumin Neurons Are Gate-Keepers of Touch-Evoked Pain after Nerve Injury. Cell Rep. 13 (6), 1246-1257 (2015).
  11. Zhang, Y., et al. Identifying local and descending inputs for primary sensory neurons. J Clin Invest. 125 (10), 3782-3794 (2015).
  12. Haenraets, K., et al. Spinal nociceptive circuit analysis with recombinant adeno-associated viruses: the impact of serotypes and promoters. J Neurochem. , (2017).
  13. Abraira, V. E., et al. The Cellular and Synaptic Architecture of the Mechanosensory Dorsal Horn. Cell. 168 (1-2), 295-310 (2017).
  14. Wildner, H., et al. Genome-wide expression analysis of Ptf1a- and Ascl1-deficient mice reveals new markers for distinct dorsal horn interneuron populations contributing to nociceptive reflex plasticity. J Neurosci. 33 (17), 7299-7307 (2013).
  15. Inquimbert, P., Moll, M., Kohno, T., Scholz, J. Stereotaxic injection of a viral vector for conditional gene manipulation in the mouse spinal cord. J Vis Exp. (73), e50313 (2013).
  16. Kohro, Y., et al. A new minimally-invasive method for microinjection into the mouse spinal dorsal horn. Sci Rep. 5, 14306 (2015).
  17. Bourane, S., et al. Gate control of mechanical itch by a subpopulation of spinal cord interneurons. Science. 350 (6260), 550-554 (2015).
  18. Bourane, S., et al. Identification of a spinal circuit for light touch and fine motor control. Cell. 160 (3), 503-515 (2015).
  19. Duan, B., et al. Identification of spinal circuits transmitting and gating mechanical pain. Cell. 159 (6), 1417-1432 (2014).
  20. Gutierrez-Mecinas, M., et al. Preprotachykinin A is expressed by a distinct population of excitatory neurons in the mouse superficial spinal dorsal horn including cells that respond to noxious and pruritic stimuli. Pain. 158 (3), 440-456 (2017).
  21. Awatramani, R., Soriano, P., Rodriguez, C., Mai, J. J., Dymecki, S. M. Cryptic boundaries in roof plate and choroid plexus identified by intersectional gene activation. Nat Genet. 35 (1), 70-75 (2003).
  22. Kim, J. C., et al. Linking genetically defined neurons to behavior through a broadly applicable silencing allele. Neuron. 63 (3), 305-315 (2009).
  23. Kim, J. C., Dymecki, S. M. Genetic fate-mapping approaches: new means to explore the embryonic origins of the cochlear nucleus. Methods Mol Biol. 493, 65-85 (2009).

Tags

Neurovetenskap fråga 135 Spinal nervceller ryggmärgen dorsala Horn rekombinant Adeno-associerade Virus AAV sensoriska System intraspinala injektion Cre-LoxP System
Adeno-associerade Virus-medierad transgenens uttryck i genetiskt definierade nervceller i ryggmärgen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Haenraets, K., Albisetti, G. W.,… More

Haenraets, K., Albisetti, G. W., Foster, E., Wildner, H. Adeno-associated Virus-mediated Transgene Expression in Genetically Defined Neurons of the Spinal Cord. J. Vis. Exp. (135), e57382, doi:10.3791/57382 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter