Cancer Research

לטווח ארוך לחיות תאים הדמיה כדי להעריך את גורל בתגובה פקליטקסל

Published: May 14, 2018 doi: 10.3791/57383

Amanda F. Bolgioni¹, Marc A. Vittoria¹, Neil J. Ganem^1,2

¹Department of Pharmacology & Experimental Therapeutics, Boston University School of Medicine, ²Department of Medicine, Section of Hematology and Oncology, Boston University School of Medicine

Summary

הדמיה לחיות תאים מספק שפע של מידע על תאים בודדים או באוכלוסיות שלמות כי הוא בלתי ניתן להשגה על-ידי תא קבוע הדמיה לבד. כאן, מתוארים פרוטוקולי הדמיה לחיות תאים כדי להעריך את החלטות גורל התא לאחר הטיפול עם פקליטקסל סמים אנטי mitotic.

Abstract

הדמיה לחיות תאים היא טכניקה רב עוצמה שיכול לשמש ישירות להמחיש תופעות ביולוגיות בתאים יחיד במשך פרקי זמן ארוכים. בעשור האחרון, טכנולוגיות חדשני יש שיפור משמעותי את המעשיות של הדמיה לחיות תאים. התאים עכשיו ניתן לשמור בפוקוס, באופן רציף עם תמונה על פני כמה ימים תוך מתוחזקים תחת 37 °C ו- 5% CO₂ תנאים התרבות תאים. יתר על כן, המבט של שדות מרובים, המייצג תנאים ניסויים שונים ניתן לרכוש בו זמנית, ובכך לספק נתוני הניסוי תפוקה גבוהה. הדמיה לחיות תאים מספק יתרון משמעותי על פני תאים קבוע הדמיה על-ידי מתן עבור פריט חזותי ישיר וכימות הטמפורלי של אירועים הסלולר דינמי. הדמיה לחיות תאים יכולים לזהות גם וריאציה בהתנהגות של תאים בודדים שאת אחרת הוחמצו באמצעות מבחני מבוסס-אוכלוסייה. כאן נתאר פרוטוקולים הדמיה לחיות תאים כדי להעריך את החלטות גורל התא לאחר הטיפול עם פקליטקסל סמים אנטי mitotic... נדגים שיטות לדמיין אם mitotically נעצר למות תאים ישירות מתוך מיטוזה או להחליק בחזרה לאטמוספרה. גם נתאר כיצד מערכת מחזור התא מבוסס ubiquitination פלורסנט מחוון (FUCCI) ניתן להשתמש כדי להעריך את השבר של תאים לאטמוספרה נולד מן החלקה mitotic מסוגלים להזין מחדש את מחזור התא. לבסוף, אנו מתארים שיטה הדמיה לחיות תאים לזיהוי אירועים קרע מעטפת הגרעין.

Introduction

תרופות אנטי-mitotic זמן רב השתמשו ב- משטרי כימותרפיות של סוגים שונים של גידולים מוצקים, לעתים קרובות להציג את היעילות הגדולה¹^,²^,³. Mechanistically, תרופות אלו לשבש את התקדמות mitotic נורמלית ולקדם mitotic למעצר מתרבים במהירות תאים סרטניים. עם זאת, גורל, בתגובה למעצר mitotic זה משתנה מאוד: בעוד שבריר של תאי עובר מוות של תאים ישירות מתוך מיטוזה, יציאה של מיטוזה ואחרים לחזור לאטמוספרה כתאים tetraploid (תהליך הנקרא גלישה mitotic)⁴^, ⁵^,-⁶^,-⁷^,-⁸. תאים אלה לאטמוספרה יכול לבצע אפופטוזיס, עוברים קבוע מחזור התא מעצר או אפילו להזין מחדש את מחזור התא⁴^,⁵^,⁶^,⁷^,⁸^,⁹¹⁰^, ^,¹¹. תאים להתחמק מוות תאי mitotic על ידי מחליקה לתוך לאטמוספרה, רק להזין מחדש את מחזור התא בעקבות הסרת סמים, עשויים לתרום לכן הופעתה של אוכלוסיות תאים סרטן. יתר על כן, תאים כי לחמוק מן מיטוזה הן tetraploid, tetraploidy ידוע לקדם יציבות כרומוזום שמניע הגידול נסיגה¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵. הגדרת הגורמים השולטים גורל בתגובה טיפולים תרופות אנטי mitotic לכן קריטי כדי למטב את הרפוי הנוכחי.

ב פרוטוקול זה, אנו מתארים שיטות ישירות להתבונן וללמוד את גורלו של תאים עוברים מעצר ממושך mitotic בתגובה פקליטקסל אנטי-mitotic סמים. פקליטקסל היא הוותיקה טיפולית במרפאה הוכיח תכופה בסוגי גידולים רבים, כולל אלה של השד, השחלות והריאות¹⁶^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹^, ²⁰-פקליטקסל, אשר אלקלואיד צמח נגזר מקליפת עץ הטקסוס, מייצבת microtubules, וכך מונע שלהם²¹^,dynamicity²². בעוד לשבור של דינמיקה microtubule מאת פקליטקסל אינה משפיעה על מחזור התא התקדמות של גרם₁ G_2, התרופה להוביל ההפעלה מתמשכת של המחסום מכלול ציר במהלך מיטוזה על ידי הפרעה קינטוכור-microtubule מצורף (נבדקה לעומק כאן²³^,²⁴)²⁵. כתוצאה מכך, "אנאפאזה" תחילת נמנעת ב תאים שטופלו פקליטקסל ותוצאות mitotic מעצר ממושך.

פרוטוקול זה יתאר תחילה גישות לזהות תאים mitotic בניסויים הדמיה לחיות תאים. מיטוזה, ניתן לאבחן בתאים תרביות רקמה חסיד בשל שני שינויים ביולוגיים תא מורגש. ראשית, כרומוזומים להיות מרוכז מאוד מייד לפני התמוטטות מעטפת הגרעין. אמנם, לעיתים קרובות ניתן לגילוי על ידי מיקרוסקופ שלב-ניגודיות סטנדרטי כרומוזום עיבוי יכול באופן ברור יותר יזוהו באמצעות פלורסנט מתייג את תווית כרומוזומים (למשל היסטון שכותרתו fluorescently חלבונים). השני, mitotic תאים גם יכול להיות מזוהה על ידי השינויים הדרמטיים מורפולוגי הנובעים תא עיגול.

פרוטוקול זה ואז תדגים כיצד להשתמש גישות הדמיה לחיות תאים כדי לאתר את גורלם של התאים חווים מעצר mitotic ממושך. תאים נעצרה מיטוזה עוברים אחד הגורל ברורים. ראשית, תאים יכול לעבור מות תאים במהלך מיטוזה. תופעה זו הוא מדמיין בקלות על ידי מיקרוסקופ אור, כמו תאים הגוסס שנצפו הפסיכיאטר, bleb, ו/או קרע. שנית, תאים יכולים לצאת מן מיטוזה, לחזור בחזרה לאטמוספרה ללא הפרדה בין כרומוזום או ציטוקינזה, תהליך הנקרא mitotic החלקה. את decondensation של כרומוזומים ו/או את שיטוח של התא mitotic ברצון מזהה תהליך זה. התאים לגלוש בין מיטוזה גם לעתים קרובות להציג גרעינים לא סדיר, מרובי אונות, לעתים קרובות הנמל micronuclei מספר⁵. שלישית, התאים נעצרה מיטוזה יכול ליזום את "אנאפאזה", להמשיך דרך מיטוזה לאחר עיכוב ארוך. בעוד נדיר בריכוזים גבוהים של סמים, התנהגות זו עולה כי התאים נעצר ייתכן ששיחת במחסום מכלול ציר, או כי המחסום מכלול ציר הוא נחלש חלקית או לקויה. תחילת "אנאפאזה", ניתן לאבחן על ידי כרומוזום סגרגציה ציטוקינזה עוקבות באמצעות הדמיה לחיות תאים.

שיטות הדמיה לחיות תאים כדי לעקוב אחר גורלם של תאים להתחמק מוות תאי mitotic מאת שעברו החלקה mitotic גם יתוארו. התאים עוברים החלקה mitotic למות. לאטמוספרה עוקבות, להפעיל מעצר עמיד של מחזור התא₁ G או הזן מחדש את מחזור התא ליזום סבב חדש של חלוקת התא⁴. גישה באמצעות המערכת (מחזור התא מבוסס ubiquitination פלורסנט מחוון) FUCCI כדי לקבוע את השבר של תאים הזן מחדש את מחזור התא בעקבות גלישה mitotic יתוארו. FUCCI מאפשר פריט חזותי ישיר של המעבר /S₁G, ניתן להשתמש בשילוב עם לטווח ארוך לחיות תאים הדמיה²⁶^,גם במבחנה וגם ויוו²⁷. מערכת FUCCI לוקח את היתרונות של שני חלבונים fluorescently שכותרתו, קטום צורות של hCdt1 (כרומטין הרישוי של שכפול ה-DNA גורם 1) ו- hGeminin, רמות אשר נעים בהתבסס על מיקום מחזור התא. hCdt1 (דבוקה חלבון פלואורסצנטי אדום) נוכח ברמה גבוהה במהלך שלב₁ G איפה שהוא פועל רשיון ה-DNA לצורך שכפול, אבל הוא ubiquitinated על ידי ליגאז אוביקוויטין E3 SCF^Skp2 והשפילו במהלך שלבי /M₂S/G כדי למנוע שכפול מחדש של ה-DNA²⁶. לעומת זאת, הוא מעכב של hCdt1 אשר רמות שיא במהלך S/G₂/M hGeminin (דבוקה של חלבון פלואורסצנטי ירוק), אבל היא ubiquitinated על-ידי E3 ליגאז אוביקוויטין APC^Cdh1 והשפילו בקצה של מיטוזה ולאורך ג'י₁ ²⁶. כתוצאה מכך, FUCCI מספק פלורסצנטיות פשוטה מפרט. של החלקים שלב מחזור התא, כמוצג תאים פלואורסצנטי אדום במהלך פלורסצנטיות_1,ו- green G במהלך S/G₂/M. מערכת FUCCI היא התקדמות משמעותית על גישות אחרות (כגון צביעת bromodeoxyuridine) כדי לזהות תאים המקדימות, כי היא לא דורשת קיבוע תא, מאפשר הדמיה תא בודד ללא הצורך נוספים תרופתי טיפולים כדי לסנכרן את אוכלוסיות תאים. אך לא נדון במסגרת פרוטוקול זה, חיישנים לחיות תאים נוספים גם פותחו כדי להמחיש התקדמות מחזור התא, כולל חיישן הליקאז B G₁²⁸, DNA ליגאז-RFP²⁹ , PCDNA-GFP³⁰ חיישנים S-פאזי, החיישן FUCCI-4 האחרונות, אשר מזהה בכל שלבי מחזור התא³¹.

לבסוף, שיטת הדמיה לחיות תאים כדי לזהות קרע מעטפת הגרעין יתוארו. מחקרים שנעשו לאחרונה חשפו כי המעטפות גרעיני של תאים סרטניים הם לא יציבה ונוטה להתפרץ, ובכך לאפשר את התוכן של נוקלאופלזמה, הציטופלסמה להתערבב. תופעה זו, כינה קרע גרעינית, יכול לקדם נזק לדנ א וגירוי של תגובה חיסונית מולדת³²^,³³^,³⁴^,³⁵^,³⁶^,³⁷^, ³⁸ ^, ³⁹ ^, ⁴⁰ ^, ⁴¹ ^, ⁴² ^, ⁴³ ^, ⁴⁴. בעוד הגורמים הבסיסיים של קרע גרעיני להישאר שהיישום מאופיין, ידוע כי דפורמציות במבנה הגרעין לתאם עם שכיחות מוגברת של קרע גרעיני⁴². אפקט ידוע אחד של טיפול פקליטקסל הוא הדור של מבנים גרעיני חריג בצורה בולטת בעקבות מיטוזה; ככזה, שיטה באמצעות הדמיה לחיות תאים לכמת קרע גרעיני יתוארו, בעת סיור גם אם פקליטקסל לטיפול מגדיל את תדירות האירועים קרע גרעינית. קרע גרעיני יכול יזוהו על-ידי דליפת חלבון פלואורסצנטי גרעיני במיקוד שנצפה לתוך הציטופלסמה (למשל דיימר טנדם חוזר של RFP דבוקה אות לוקליזציה גרעינית, TDRFP-NLS). דליפה זו מוצגת בפירוש לפי העין, אשר מאפשרת כימות פשוטה אירועי קרע.

פרוטוקול זה דורש מיקרוסקופ epifluorescence widefield, אשר מצויד עם הבמה מקודד, תוכנה autofocusing שותק. השלב מקודד מאפשר תנועה אוטומטי מדויק קואורדינטות X-Y מוגדר, בזמן פוקוס אוטומטי התוכנה שומרת על תאים בפוקוס למשך כל תקופת הדמיה. בנוסף, פרוטוקול זה דורש ציוד כדי לשמור על תאים ב 37 ° C עם humidified 5% CO₂ אווירה. זו יכולה להיות מושגת על-ידי תחימת המיקרוסקופ כולו בתוך חום, אווירה מבוקרת מארז, או באמצעות מכשירים הבמה-העליון כך מקומית שומר על הטמפרטורה והסביבה. המטרה בשלב ניגודיות בשימוש פרוטוקול זה היא עבור תוכנית חיל הים 10 x עם הפתח המספרי של 0.30. עם זאת, המטרות X 20 מספיקים גם לזהות שני תאים מעוגלים לאטמוספרה mitotic, שעברו שיטוח מוקד מטוס בודד. אם ביצוע שלב-ניגודיות הדמיה (כמתואר בשיטה זו), המכסה יכול להיות או זכוכית או פלסטיק. אם נעשה שימוש במיקרוסקופ ניגוד (DIC) התערבות דיפרנציאלית, זה הכרחי כדי להשתמש לכסות זכוכית כדי למנוע דפולריזציה של אור.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

פרוטוקול זה מתמקד בשימוש ללא טרנספורמציה ויציב chromosomally ברשתית פיגמנט אפיתל (RPE-1) תא הקו לניסויים הדמיה לחיות תאים. עם זאת, פרוטוקול זה ניתן להתאים כל קו תא חסיד כל עוד התא תרבות בתנאים מותאמים לפי הצורך. כל ההליכים חייבת לדבוק אבטחה מוסדיים, מנחים ותקנות.

1. הכנת התאים הדמיה לחיות תאים

להשתמש בתאים RPE-1 מעבר טרי המופשרים ותחילת ביטוי אנושי היסטון שויזת עבודה H2B דבוקה חלבון פלואורסצנטי (למשל ויזת עבודה H2B-GFP), או את מערכת FUCCI (פרוטוקול מפורט על איך ליצור תאים לבטא FUCCI ניתן למצוא התייחסות⁴⁵) כדי להעריך את גורל mitotic.
1. כדי למדוד את התדירות של קרע גרעינית, שימוש תאי RPE-1 לבטא ויזת עבודה H2B-GFP והן דיימר טנדם של חלבון פלואורסצנטי אדום דבוקה אות יחיד לוקליזציה הגרעין (TDRFP-NLS).
  הערה: בונה של שלושה חלבונים ניאון ירוק התמזגו במשולב לאות לוקליזציה גרעיני יחיד (GFP₃- NLS) היו בשימוש גם להפגין קרע (כמו התייחסות⁴²).
2. לשמור על תאים על 10 ס מ צלחות תרביות רקמה במצע הגידול המתאים. תאי RPE-1 נשמרים בפנול אדום חינם, F-12 ששינה נשר בינוני/מזין תערובת של Dulbecco (DMEM:F12) בתוספת 10% סרום שור עוברית (FBS) 100 IU/mL פניצילין, סטרפטומיצין μg/מ ל.
האחות בינוני את התאים, כדי לבשל תרביות רקמה עם 10 מ ל תמיסת מלח סטרילית, טמפרטורת החדר פוספט buffered (PBS) הסר בינוני הנותרים ולאחר מכן מחוק לגמרי מגניב.
1. להוסיף 2 מ של 0.25% טריפסין עם חומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA) לתאים דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות או עד רוב התאים יש מנותקת לצלחת.
  הערה: לא שומרים תאים בטריפסין יותר הדרושים.
להוסיף 10 מ של מדיום מלאה כדי לאסוף את התאים trypsinized עם stripette סרולוגית 10 מ ל לוותר על צינור חרוטי 15 מ"ל.
1. גלולה התאים על ידי צנטריפוגה ב x 180 גרם במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר.
וארוקן את תגובת שיקוע, נזהר שלא לשבש את צניפה, ואז ביסודיות resuspend בגדר ב 10 מ"ל של מדיום חדש על-ידי בעדינות pipetting למעלה ולמטה המדיום stripette סרולוגית.
השתמש hemocytometer או אוטומטיות תא ספירת מכונת לספור תאים⁴⁶.
1. לדלל בתאים צינור חרוטי ל 30,000 תאים למ"ל בינוני מלא.
2. צלחת 30,000 RPE-1 תאים (1 מ"ל נפח) לכל טוב של זכוכית 12-ובכן עם תחתית (עובי #1.5) הדמיה המנה כדי להשיג צפיפות הסלולר נדרש למחרת (30%-50% confluent).
  הערה: תמיד לטפל לצלחת עם כפפות, להיזהר לא לגעת בקרקעית הזכוכית.
מאפשרים לתאים לגדול בחממה תרביות רקמה 37 ° C עד שהם לחלוטין לצרף ולשטח על הצלחת הדמיה תת. בעוד תאים באפשרותך לצרף קצת כמו 4 שעות, מומלץ כי התאים הם לא לטפל בתרופות ולא עם תמונה עד למחרת היום.
הוסף פקליטקסל (מומס דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד)) לריכוז הסופי הרצוי שלם בינוני, מערבבים היטב.
1. להכין בינוני מלא עם אמצעי אחסון שווה של דימתיל סולפוקסיד לבד כדי להשתמש בפקד.
2. חמים המדיום המכיל סם או דימתיל סולפוקסיד עד 37 ° C לפני הוספת תאים. פעולה זו תמנע את הסחף מוקד עקב שינוי טמפרטורה פתאומי.
3. להוסיף 1 מ"ל של מדיום פקליטקסל או דימתיל סולפוקסיד לבד כדי בארות בודדים של המנה הדמיה 12-ובכן הכוללת.

2. הגדרת המיקרוסקופ עבור הדמיה לחיות תאים

ניקוי הזכוכית-התחתון של המנה הדמיה עם שואב האבק אופטי כדי להסיר את כל טביעות אצבעות או אבק שעשויים להפריע הדמיה. להשתמש מנקה אופטי מספיק כדי להרטיב את המשטח כולו זכוכית.
למקם את צלחת זכוכית-התחתון על השלב מיקרוסקופ מתאם מאכל הדמיה, הסר את מכסה פלסטיק מתוך קערה ולאחר מכסים את תא זכוכית. להבטיח שהחדר יש שסתום כדי לאפשר זרימה קבועה של אוויר בהיקף של 5% CO₂.
הערה: כדי ללחלוח 5% CO₂, הגז מוזרם דרך צינורות מוכנס לתוך אמבט מים סטריליים דיור. דבר זה מאפשר הגז להפוך equilibrated ל 95% לחות.
החניך/כיול הבמה המקודד באמצעות התוכנה לשליטה המיקרוסקופ. זה להבטיח קואורדינטות X-Y מדויקות ולמנוע להיסחף מוקד.
להתמקד התאים באמצעות אופטיקה חדות שלב ולבצע תאורה קולר (המתוארים בפירוט הפניה⁴⁷) כדי למקד את האור ולספק חדות אופטימלית.
השתמש רכישת תוכנה כדי לקבוע את זמני חשיפה אופטימלית עבור אור לבן וערוצי כל פלורסנט בשימוש (חשיפות כי לתת 75% רוויה פיקסל המצלמה הם אידיאלי, בתנאי זה כמות האור אינה רעילה לתאים).
1. השתמש רכישת תוכנה כדי לבחור מספר, שאינם חופפים שדות ראייה מכל קידוח עבור הדמיה. בחר אזורים הדמיה יש דבקה גם הזכוכית-התחתון ואיפה הם בין 50% ל- 70% confluent תאים. הימנע אזורים של תאים גושית, כמו פעולה זו תגרום לאחר מכן ניתוח קשה.
  הערה: חשוב לי המבט של שדות שאינם חופפים מכל קידוח כדי למנוע מעקב לאותם התאים פעמיים. אם התאים נמצאים תאי מאוד, ייתכן צורך לרכוש מספר תמונות מקרין החוצה הנקודה המרכזית, תפר שאותם בחזרה ביחד לעשות אחד גדול שדה ראייה.
להפעיל התכונה של המיקרוסקופ autofocusing שותק להבטיח שכל הנקודות נשמרות בפוקוס משך זמן הניסוי.
כדי להעריך את גורל mitotic, להגדיר את התוכנה הדמיה כדי לאסוף תמונות תצוגה של כל שדה שנבחר בכל 10 דקות עבור למעלה כדי ה 96 Unperturbed מיטוזה נמשך 20 – 40 דקות, ובכך 10 דקות מרווחי יספק מספיק דגימה לזהות בעת חלוקת התאים. כדי לזהות קרע הגרעיני, שהוא אירוע חולף, לרכוש תמונות כל 5 דקות.
הערה: ודא שהמחשב נהיגה התוכנה רכישת התמונה כולל עדכון אוטומטי, שומרי מסך ו מצבי חיסכון באנרגיה זמינה, כמו אלה יכולים לעיתים להפריע ייבוא תמונות על ניסויים זמן.
ליזום את הניסוי הדמיה. מעת לעת לאשר כי ייבוא תמונות פועל בצורה חלקה במהלך הסרטון.

3. וידאו ניתוח לזיהוי גורל בתגובה פקליטקסל

לאשר כי תאים שבעורך הם בריאים לאורך כל הקורס של הניסוי הדמיה. תאי בקרה שטופלו דימתיל סולפוקסיד צריך להיות פעיל מתרבים ובר קיימא.
הערה: אם תאים שהפגינו סימנים של מתח, לא quantitate הוידאו ולהתרכז מיטוב תנאים הדמיה⁴⁸. סימנים של הדמיה מתח כוללים תאים מתים/blebbing, תאים להיכשל לצרף/ממרח בצלחת ותאים להציג אינדקס mitotic נמוכה ו/או ממושך מיטוזה. מקורות אפשריים של מתח כוללים תנודות בטמפרטורה או רמות₂ CO בתוך הדמיה קאמרית או phototoxicity⁴⁸.
כאשר הדמיה תצוגה של שדה שלמה עם 10 X או המטרה X 20, מאות תאים בודדים עשוי להיות נוכח. לכן, כדי לסייע עם כימות, לחלק את שדה הראיה הגזרות קטנים באמצעות כלי תוכנה הזמינים. ציון תאים בתוך כל רביע בנפרד (כפי שמתואר צעדים 3.3.1–3.6.2).
בעת ניתוח הוידאו, מעקב אחר כל תא בתצוגה ממוזג באמצעות ניגוד שלב ו/או בתמונות פלורסנט. השתמש בכלי ניתוח תוכנה ליצירת התצוגה הממוזג.
1. החל בתחילת הסרטון, לזהות תא יחיד לאטמוספרה ולעקוב אחר ההתקדמות שלה דרך מחזור התא באמצעות אופטיקה שלב. כדי לעקוב אחר לתא בודד, להתבונן התא ממסגרת למסגרת לפי העין. לזהות תאים לאטמוספרה בשל מורפולוגיה שעברו שיטוח שלהם (כמו המוערך על ידי ניגודיות שלב) וחוסר עיבוי הדנ א שלהם (כפי לאומדן ויזת עבודה H2B-GFP) (איור 1 א').
לזהות תאים מזינים מיטוזה על ידי התבוננות תא עיגול (באמצעות שלב-ניגודיות אופטיקה) ו/או עיבוי כרומוזום (באמצעות ויזת עבודה H2B-GFP) (איור 1 א'-C). עיבוי עיגול, כרומוזום בשני תאים הם דמיינו בקלות לפי העין.
1. להוסיף את הזמן כאשר התא נכנס מיטוזה. המשך מעקב התא עד שהוא מגיע גורלה ("אנאפאזה" כמו שלב 3.5, מוות של תאים של מיטוזה כמו שלב 3.6.1 או גלישה mitotic כמו שלב 3.6.2).
תאים שליטה עליו ביעילות ליישר את הכרומוזומים שלהם, הזן "אנאפאזה" בתוך 1 h (איור 1D). לדמיין את "אנאפאזה" מאת אופטיקה חדות שלב כמו התא מתחיל לכאוב לתוך שני או באמצעות ויזואליזציה של כרומוזומים poleward-המעבר המסומנת ויזת עבודה H2B-GFP (איור 1 א'). להוסיף את הזמן כאשר התא עובר "אנאפאזה".
לעומת זאת, תאים שטופלו פקליטקסל יישאר מעוגל עם כרומוזומים מרוכז במשך מספר שעות (h 3-40) (איור 1B-D).
1. לזהות תאים נעצר mitotically שעוברים מוות של תאים.
  הערה: תאים מתים במהלך מיטוזה הם דמיינו ידי ניגודיות שלב מיקרוסקופ, כמו תאים bleb, לכווץ, ו/או קרע (איור 1B). אם הדמיה ויזת עבודה H2B-GFP, הכרומוזומים גם קטע במהלך מוות של תאים.
2. לזהות תאים נעצר mitotically עוברים תא החלקה.
  הערה: תאים עוברים החלקה mitotic הם נצפו על ידי מיקרוסקופ שלב-ניגודיות, כפי שהם לשטח בחזרה החוצה לתוך לאטמוספרה decondense הכרומוזומים מבלי שעברו "אנאפאזה" (איור 1C). התאים עוברים החלקה mitotic להצמיח תאי tetraploid גדולים כי הם לעיתים קרובות multinucleated (איור 1C).
המשך מעקב אחר תאים של שדה הראייה המקורית. לאחר מעקב אחר מנקודת מבט כל שדה, לעבור תצוגה של שדה נפרדת שנרכשה מן הדבר טוב והמשך מעקב אחר תאים.

4. וידאו ניתוח לזיהוי גורל בעקבות גלישה Mitotic

להעריך את גורל בעקבות גלישה mitotic (כפי שמתואר בשלב 3.6.2) באמצעות תאי RPE-1 לבטא את המערכת FUCCI. בנוסף הדמיה שלב-חדות, יש צורך לרכוש פלואורסצנטי אדום (מעיד על שלב₁ G) ותמונות (מרמז על S/G₂/M) ירוק זריחה).
1. מעקב אחר תאים FUCCI RPE-1 כפי שמתואר בשלב 3.3 דרך 3.7.
  1. כדי לוודא כי מערכת FUCCI פועל כראוי, לאמת את השליטה תאים חלופי לביטוי החלבונים ניאון אדום וירוק דרך ניתוח של הנתונים הדמיה לחיות תאים. תאים שליטה השינוי יתבצע להיתקל פלואורסצנטי אדום לגמרי גרעינית כדי מפגין פלורסצנטיות ירוק לחלוטין הגרעין במהלך לאטמוספרה כהתקדמות תאי G₁ לשלב S. תאים צריך להמשיך מפגין פלורסצנטיות ירוק לאורך כל ביצוע מיטוזה. מייד לאחר מיטוזה, תאים צריך להפגין שוב פלואורסצנטי אדום לחלוטין במהלך לאטמוספרה.
    הערה: בעוד שיטות קיימות לכמת עוצמות קרינה פלואורסצנטית RFP והן GFP מן המערכת FUCCI של תאים בודדים באמצעות עקבות פלורסנט⁴⁹, זה לעתים קרובות לא נחוץ שינוי הצבע פלורסצנטיות הוא גלוי על-ידי העין ועמיד.
לזהות תאים נעצרה מיטוזה באמצעות מיקרוסקופ שלב-ניגודיות, לאתר אותם עד שהם עוברים החלקה mitotic, כמתואר ב- 3.4 ו 3.6.2. תאים שישנה להחליק מחוץ מיטוזה ולתוך בחזרה לאטמוספרה להיתקל פלורסצנטיות ירוק במהלך מיטוזה כדי פלואורסצנטי אדום במהלך שלב₁ G (איור 2 א- ג).
1. מעקב אחר אלה החליקה תאים באמצעות ניגוד שלב והדמיה פלורסנטי לפי העין כדי להעריך את גורלם תא (איור דו-ממדי).
  1. לזהות תאים הזן מחדש את מחזור התא. תאים אלה מזוהים על ידי השינוי האדום-כדי-ירוק בביטוי פלורסצנטיות, באמצעות מערכת FUCCI המציין מעבר /S₁G (איור 2 א).
  2. לזהות תאים עוברים G₁ מחזור התא מעצר. תאים אלה מזוהים על ידי ביטוי של פלואורסצנטי אדום אשר נמשך > 24 שעות (איור 2B).
  3. לזהות תאים מתים לאטמוספרה. תאים אלה מזוהים על ידי תאי קרע/blebbing/כיווץ באמצעות הדמיה שלב-ניגודיות (איור 2C).

5. ניתוח וידאו לזהות את התדירות של מעטפת הגרעין קרע

השתמש תאי RPE-1 לבטא ויזת עבודה H2B-GFP, TDRFP-NLS כדי להעריך את מעטפת הגרעין קרע. בנוסף הדמיה ניגודיות שלב, רוכשים פלואורסצנטי אדום (TRITC) ותמונות פלורסצנטיות ירוק (FITC). לרכוש תמונות כל 5 דקות כדי להמחיש את הקרע.
הערה: חיוני ליצירת שורות תאים שבו TDRFP-NLS ביעילות מיובאים לתוך הגרעין עם פלורסצנטיות cytoplasmic מינימלי.
תאים תמונה כפי שמתואר בשלב 3.3 דרך 3.4. האות זריחה TDRFP-NLS של ויזת עבודה H2B-GFP צריך להתאים במשותף במהלך לאטמוספרה. על מיטוזה (כמו מטמיעים לתא עיגול באמצעות עיבוי אופטיקה ו/או כרומוזום שלב על ידי ויזת עבודה H2B-GFP), מעטפת הגרעין יהיה לשבור ויהפוך האות TDRFP-NLS cytoplasmic (איור 3 א). בעקבות מיטוזה, מעטפת הגרעין ישנה בתאי הבת ויהפוך האות TDRFP-NLS גרעינית.
מעקב אחר תאים הבת ברחבי לאטמוספרה עוקבות על-ידי הדמיה לחיות תאים. זיהוי אירועים קרע גרעינית על ידי התבוננות פרץ ארעית של גרעיני מותאם לשפות אחרות TDRFP-NLS לתוך הציטופלסמה שמסביב. תוך דקות, מעטפת הגרעין יתוקנו, TDRFP-המודיעין relocalized את הגרעין (איור 3 א).
הערה: לעתים קרובות, ה-DNA הגרעיני, כפי דמיינו ידי ויזת עבודה H2B-GFP, יראו לבלוט באתר קרע כמו bleb קטן.
ציון השבר של הגרעינים עוברים אירוע להיקרע במהלך לאטמוספרה. ניקוד זה שבר, לספור את מספר התאים עוברים אירוע להיקרע מעל המספר הכולל של תאים מסומנים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

באמצעות פרוטוקול המתואר לעיל, תאי RPE-1 לבטא ויזת עבודה H2B-GFP היו מטופלים עם פקד אנטי mitotic או רכב (דימתיל סולפוקסיד), נותחו על ידי הדמיה לחיות תאים. ניתוח גילה כי 100% תאי RPE-1 mitotic שליטה יזם "אנאפאזה" ממוצע של 22 דקות לאחר הזנת מיטוזה (איור 1 א', ד 1). לעומת זאת, תאי RPE-1 מטופלים עם פקליטקסל הציג מעצר mitotic מעמיק שנמשך כמה שעות (איור 1D). הדמיה חשפה כי 48% של תאים mitotically נעצר אלה עברו מוות תאי mitotic (איור 1B, 1E), בעוד הנותרים 52% עברו mitotic החלקה (איור 1C, 1E).

כדי להעריך את גורלו של תאי RPE-1 שעברו החלקה mitotic, תאי RPE-1 לבטא את מערכת FUCCI שטופלו גם במינון נמוך 50 ננומטר פקליטקסל, במינון גבוה 5 מיקרומטר פקליטקסל, או רכב לשלוט (דימתיל סולפוקסיד), נותחו על ידי הדמיה לחיות תאים לטווח ארוך. הנתונים חשף כי של תאי RPE-1 שעברו החלקה mitotic לאחר הטיפול עם פקליטקסל 50 ננומטר, 22% מתו במחזור התא עוקבות (איור 2C, 2D), 72% המושרה תא מחזור מעצר (איור 2B, 2D), ו רק 5% והתערבו S-פאזי (איור 2 א, 2D). לעומת זאת, של תאי RPE-1 שטופלו במינון גבוה 5 מיקרומטר פקליטקסל שעברו החלקה mitotic, 35% מתו במחזור התא עוקבות, 65% המושרה מחזור מעצר התא, אף אחד לא נכנס S-פאזי (איור דו-ממדי).

מעניין, במינון נמוך פקליטקסל לטיפול מקדם מעטפת הגרעין קרע תאי RPE-1 בעקבות מיטוזה. לאחר השלמת mitotic תאי הבת היו מסומנים, הבקיע עבור כל אירוע גרעיני קרע, חושף כי רק ~ 4% לשלוט תאי הבת (שטופלו דימתיל סולפוקסיד) RPE-1 נקרע, ואילו ~ 23% תאי הבת מטופלים עם פקליטקסל nM 10 הציג קרע ( איור 3 א, 3B).

איור 1: גורל Mitotic בתגובה לטיפול אנטי mitotic. תאי RPE-1 stably לבטא ויזת עבודה H2B-GFP טופלו עם בקרת הרכב דימתיל סולפוקסיד (A) או 5 פקליטקסל מיקרומטר (B, C), עם תמונה באמצעות שלב זמן לשגות-ניגודיות widefield epifluorescence מיקרוסקופ כדי להעריך את גורל mitotic. תאים לאטמוספרה (לוחות שמאלה) היו תחת מעקב כשנכנסו מיטוזה (לוחות האמצעי), ועד הם יזמו "אנאפאזה" (A), עברו מוות תאי mitotic (B), או החליקה מיטוזה לחזור לאטמוספרה (C). החצים הלבנים לציין תאים מסומנים. (ד) כמות הזמן פקד זה תאים (שטופלו דימתיל סולפוקסיד), תאים אנטי-mitotic שטופלו בילה מיטוזה, כפי quantitated על ידי הדמיה לחיות תאים (n = 100 תאים עבור כל תנאי). (E) השבר של תאים (n = 100) אשר עברה "אנאפאזה", מוות של תאים mitotic או גלישה mitotic תאים שטופלו דימתיל סולפוקסיד או תאים שטופלו פקליטקסל 5 מיקרומטר. H:min. הזמן, סולם בר = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 2: גורלו של תאים עוברים החלקה mitotic. תאי RPE-1 stably לבטא את מערכת FUCCI שטופלו 50 ננומטר פקליטקסל או 5 מיקרומטר פקליטקסל, עם תמונה באמצעות ניגוד שלב זמן לשגות widefield קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ כדי quantitate גורל בעקבות גלישה mitotic. תאים זכו כמו גם להזין מחדש את מחזור התא, כפי נשפטת על ידי שינוי אדום-כדי-ירוק פלורסצנטיות במערכת FUCCI (א); עוצר בשלב₁G, כפי שפטו פלואורסצנטי אדום מתמשך עבור > 24 שעות (B); . או למות במהלך מיטוזה עוקבות, כפי שפטו blebbing הסלולר/קרע (C) החצים הלבנים לציין תאים מסומנים. (ד) השבר של תאים (n = 100) אשר עברה כל הגורל. קווי שגיאה לייצג סטיית תקן מן הממוצע של שני ניסויים עצמאית. H:min. הזמן, סולם בר = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 3: תדירות של קרע מעטפת הגרעין בתאים שטופלו פקליטקסל. תאי RPE-1 stably לבטא TDRFP-NLS, ויזת עבודה H2B-GFP טופלו עם פקליטקסל nM 10 או הרכב לשלוט (דימתיל סולפוקסיד) עם תמונה באמצעות שלב זמן לשגות-ניגוד ומיקרוסקופ epifluorescence widefield (א). במהלך מיטוזה (מפה של/במחבת הכתומה) מעטפת הגרעין מתפרק והופך TDRFP-NLS cytoplasmic. בעקבות מיטוזה, NLS TDRFP relocalizes את הגרעין של תאים לאטמוספרה (קרע מראש). קרע גרעיני אירועים מזוהים על ידי delocalization של TDRFP-NLS מהגרעין אל הציטופלסמה בתאים לאטמוספרה (קרע), ואחריו את relocalization של TDRFP-NLS את הגרעין בעקבות תיקון מעטפת הגרעין (פוסט-קרע). החצים הלבנים לציין תאים מסומנים. (B) השבר של תאים (n > 100 לכל תנאי) זה מראה קרע מעטפת הגרעין בעקבות מיטוזה בנוכחות פקד פקליטקסל או רכב. H:min. הזמן, סולם בר = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ההיבט הקריטי ביותר של הדמיה לחיות תאים לטווח ארוך זה להבטיח את בריאותו של התאים להיות עם תמונה. זה חיוני כי תאים להיחשף מינימלי לחצים סביבתיים חיצוניים, כגון תנאים ירודים לגבי טמפרטורה, לחות, ו/או CO₂ רמות. חשוב גם להגביל את נזקי מ תאורה פלורסנט עירור, הדמיה מתח הידוע להשפיע על התנהגות תא⁵⁰. הגבלת נזקי יכול להיעשות בדרכים רבות כמו מפורט במקום⁴⁸. באופן כללי, מומלץ להשתמש בזמן חשיפה הקצר ביותר הדרושה להפקת אות פלורסצנטיות מספיק בהיר מספיק לעקוב ביעילות תאים, ובכך יגביל phototoxicity. עם זאת, אם התאים הם צילמו רק לאחר כל 10 – 20 דקות, חשיפות יותר (כי הגישה פיקסל רוויה) הם בדרך כלל ובכן נסבל (למרות זו צריכה להיקבע מדעית לכל סוג fluorophore של תאים). כי שבעורך תאים רגישים לחצים סביבתיים והן הדמיה, זה הכרחי כי תאים שליטה הם תמיד כלולים בניסויים הדמיה לחיות תאים, פיקוח כדי לאשר הפצת נורמלי.

מגבלה אחת כדי הדמיה לחיות תאים לטווח ארוך היא שזה דורש ציוד במיקרוסקופ הקיים עם חדר סביבתיים, השומר על טמפרטורה ו- 5% humidified CO₂אווירה או תא העליון בשלב זה הוא גם מסוגל תומך את הטמפרטורה המתאימה ואת האווירה. בעוד CO זורמים₂הוא אופטימלי, תאים גם יכול לדימות עבור עד 48 שעות באמצעות CO₂-בינוני עצמאית אם תא סביבתי עם 5% humidified CO₂אינה זמינה. עם זאת, סוגי תאים רבים הן לחלב של מדיום כזה, זה חייב להיקבע מדעית על ידי מדידת צמיחת תאים, הכדאיות. שכיסה את התאים עם שמן מינרלי יכול לשמש גם כדי למנוע אידוי בינוני.

מגבלה משמעותית נוספת לשיטה זו היא שתבצע מעקב ידני אחר תא הגורל הוא מאוד מייגעת וגוזלת זמן. עם זאת, אחרי תוכניות הינם זמינים, אולי ניתן למטב להפיכת תמונה ניתוח⁵¹^,⁵²^,⁵³. מגבלה נוספת בשיטה זו היא כי התאים מאוד תאי הם לעיתים קרובות קשה לעקוב במשך פרקי זמן ארוכים. אם זה מהווה בעיה משמעותית, כולו טוב יכול לדימות ותפרה התמונות כדי ליצור תצוגה של שדה גדול אחד. תוכניות רבות תומכות בשיטה זו.

Autofluorescence הוא אילוץ נוסף שמחייבות עם פרוטוקול זה. פנול אדום בינוני חינם מפחיתה את הרקע autofluorescence במהלך דימות תא חי. זה גם הוכח כי שני ויטמינים הנמצאים בדרך כלל מדיום הגידול, ריבופלבין, pyridoxal, יכול להקטין פוטוסטביליטי של חלבונים פלורסנט. לפיכך, מדיום חסר ויטמינים אלה יכולים לשמש גם במהלך הדימות קרינה פלואורסצנטית להגברת אות רעש הקצבה. בעוד התחתון פלסטיק מנות פחות יקרים עשוי לספק תוצאות הדמיה נאותה, הם גם מייצרים כמות גדולה יותר של autofluorescence המשפיעה לרעה על יחס אות לרעש. בנוסף, מנות התחתון פלסטיק יש וריאציה גדולה עובי, אשר יכול לשבש את תכונת פוקוס אוטומטי של מיקרוסקופים רבים. העובי של המנה bottomed זכוכית הדמיה ב פרוטוקול זה הוא 0.17 מ מ, אשר הוא זכוכית אידיאלי לשימוש עם מיקרוסקופים מודרני.

לבסוף, סרטים לטווח ארוך המקיף את המבט של שדות מרובים ורכישת מספר ערוצים פלורסצנטיות מייצרת קבצי נתונים מסיבי (עשרות ג'יגה-בתים אפילו טרה-בתים לכל), אשר מהווים בעיה עבור גיבוי ואחסון של נתונים. כדי להמתיק את הבעיה, מומלץ כי כל התמונות ניתן לרכוש באמצעות 2 x 2 או 4 x 4 binning, סיפקו את ההפסד שנוצר ברזולוציה מקובל. Binning לא רק מגבילה פעמים חשיפה (כלומר תאים stably לבטא ויזת עבודה H2B-GFP או מערכת FUCCI צריך חשיפות פחות מ 500 ms), אבל גם דרסטי מפחית את הגודל של קבצי נתונים (דימוי זה נשברתי 2 x 2 הוא רבע גודל הקובץ של מנופה ללא תמונה).

למרות מגבלות אלו, הדמיה לחיות תאים לטווח ארוך מייצג את השיטה הטובה ביותר כדי לעקוב אחר גורלם תא בודד מן באוכלוסיות שלמות, במיוחד כאשר התא הגורלות הם מאוד הטרוגנית. כמו יותר לחיות תאים סמני פלורסנט וחיישנים להיות זמין, לחיות תאים הדמיה גישות תורחב באופן חזותי, quantitate מספר היבטים נוספים של ביולוגיה של התא. לדוגמה, חיישנים לחיות תאים כיום קיימים כדי quantitate DNA נזק מוקדים, רמות p53, מיקום מחזור התא, אפופטוזיס²⁶^,⁵⁴^,⁵⁵^,⁵⁶^,⁵⁷^,⁵⁸ . לפיכך, ניסויים הדמיה יש יכולת לחשוף את המאפיינים הסלולר כבסיס להכתיב איך ולמה תאים בודדים מגיבים variably סוכנים כימותרפיות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

AFB, MAV, NJG רוצה להודות ריאן קווינטון להערות על כתב היד, אדריאן Salic עבור TDRFP-NLS הבונה. AFB ו MAV ממומנות על ידי 5T32GM008541 NIGMS למערכות ביולוגיות פרמקולוגיה הכשרה גרנט. NJG הוא חבר של בימוי ותסריט, מעבדות מחקר של סרטן השד Dahod אשרף, נתמכת על ידי NIH מענקים GM117150, CA-154531, קרן Grunebaum קארין, התוכנית פרסים משפחת סמית, התוכנית מלומדים סרל ומחקר של מלנומה ברית.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
phenol red-free, DMEM:F12 media	Hyclone	SH3027202
10% fetal bovine serum (FBS)	Gibco	10438026
100 IU/ml penicillin, and 100 mg/ml streptomycin.	Gibco	15070063
PBS	Gibco	10010049
0.25% Trypsin/EDTA	Gemini	50-753-3104
12-well glass bottomed imaging dish	Cellvis	P12-1.5H-N
Paclitaxel	TSZ Chem	RS036
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Sigma	NC0215085
Environmental Chamber	In Vivo Scientific
5% CO₂	Airgas	Z03NI7432000201
15 mL Conical Tubes	Fisherbrand	05-539-12
10 cm polystyrene tissue culture plates	Falcon	08772E
10 mL Disposable Serological Pipette	Fisherbrand	4488
5804R 15 amp Centrifuge	Eppendorf	97007-370
1000 microliters Pipette	Gilson	Pipetman Classic
20 microliters Pipette	Gilson	Pipetman Classic
p1000 Pipette Tips	Sharp	p1126
p20 Pipette Tips	Sharp	P1121
RPE-1 Cells	ATCC	CRL-4000
Incubator Galaxy 170S	Eppendorf	CO17011005
Pipette Boy	Integra	156401
Hemacytometer	Fisher Scientific	0267110
Nikon Ti-E-PFS Inverted Microscope for Live Cell Imaging	Micro Video Instruments, Inc.	MEA53100
Prior X-Y Stage System and White Light LED Illuminator	Micro Video Instruments, Inc.	500-H117P1N4
Prior Proscan 3 Controller XYZ with Encoders	Micro Video Instruments, Inc.	500-H31XYZE
Andor Digital Camera	Micro Video Instruments, Inc.	D10NLC
Nikon NIS Elements AR Software	Micro Video Instruments, Inc.	MQS31000
SOLA LED Illuminator for Fluorescence	Micro Video Instruments, Inc.	SOLA-E
InVivo Environmental Chamber with CO2 Flow Control	Micro Video Instruments, Inc.	Ti-IVS-100
Ti-ND6-PFS Perfect Focus Motorized Nosepiece	Micro Video Instruments, Inc.	MEP59391
Ti-C System Condenser Turret	Micro Video Instruments, Inc.	MEL51000
Ti-C LWD LWD Lens Unit for System Condenser Turret	Micro Video Instruments, Inc.	MEL56200
Te-C LWD Ph1 Module	Micro Video Instruments, Inc.	MEH41100
CFI Plan Fluor DLL 10X Objectivena 0.3 wd 16mm	Micro Video Instruments, Inc.	MRH10101
CFI Super Plan Fluor ELWD 20xc ADM Objective	Micro Video Instruments, Inc.	MRH48230

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

van Vuuren, R. J., Visagie, M. H., Theron, A. E., Joubert, A. M. Antimitotic drugs in the treatment of cancer. Cancer Chemother Pharmacol. 76 (6), 1101-1112 (2015).
Chan, K. S., Koh, C. G., Li, H. Y. Mitosis-targeted anti-cancer therapies: where they stand. Cell Death Dis. 3, e411 (2012).
Jackson, J. R., Patrick, D. R., Dar, M. M., Huang, P. S. Targeted anti-mitotic therapies: can we improve on tubulin agents? Nat Rev Cancer. 7 (2), 107-117 (2007).
Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. How do anti-mitotic drugs kill cancer cells? J Cell Sci. 122 (Pt 15), 2579-2585 (2009).
Rieder, C. L., Maiato, H. Stuck in division or passing through: what happens when cells cannot satisfy the spindle assembly checkpoint. Dev Cell. 7 (5), 637-651 (2004).
Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. Cancer cells display profound intra- and interline variation following prolonged exposure to antimitotic drugs. Cancer Cell. 14 (2), 111-122 (2008).
Huang, H. C., Mitchison, T. J., Shi, J. Stochastic competition between mechanistically independent slippage and death pathways determines cell fate during mitotic arrest. PLoS One. 5 (12), e15724 (2010).
Shi, J., Orth, J. D., Mitchison, T. Cell type variation in responses to antimitotic drugs that target microtubules and kinesin-5. Cancer Res. 68 (9), 3269-3276 (2008).
Ganem, N. J., Pellman, D. Limiting the proliferation of polyploid cells. Cell. 131 (3), 437-440 (2007).
Ganem, N. J., Storchova, Z., Pellman, D. Tetraploidy, aneuploidy and cancer. Curr Opin Genet Dev. 17 (2), 157-162 (2007).
Ganem, N. J., Pellman, D. Linking abnormal mitosis to the acquisition of DNA damage. J Cell Biol. 199 (6), 871-881 (2012).
Sotillo, R., Schvartzman, J. M., Socci, N. D., Benezra, R. Mad2-induced chromosome instability leads to lung tumour relapse after oncogene withdrawal. Nature. 464 (7287), 436-440 (2010).
Sotillo, R., et al. Mad2 overexpression promotes aneuploidy and tumorigenesis in mice. Cancer Cell. 11 (1), 9-23 (2007).
Ganem, N. J., Godinho, S. A., Pellman, D. A mechanism linking extra centrosomes to chromosomal instability. Nature. 460 (7252), 278-282 (2009).
Silkworth, W. T., Nardi, I. K., Scholl, L. M., Cimini, D. Multipolar spindle pole coalescence is a major source of kinetochore mis-attachment and chromosome mis-segregation in cancer cells. PLoS One. 4 (8), e6564 (2009).
McGuire, W. P., et al. Cyclophosphamide and Cisplatin Compared with Paclitaxel and Cisplatin in Patients with Stage III and Stage IV Ovarian Cancer. New England Journal of Medicine. 334 (1), 1-6 (1996).
McGuire, W. P., et al. Taxol: a unique antineoplastic agent with significant activity in advanced ovarian epithelial neoplasms. Ann Intern Med. 111 (4), 273-279 (1989).
Ettinger, D. S. Taxol in the treatment of lung cancer. J Natl Cancer Inst Monogr. (15), 177-179 (1993).
Weaver, B. A. How Taxol/paclitaxel kills cancer cells. Mol Biol Cell. 25 (18), 2677-2681 (2014).
Jordan, M. A., Wilson, L. Microtubules as a target for anticancer drugs. Nat Rev Cancer. 4 (4), 253-265 (2004).
Wall, M. E., Wani, M. C. Camptothecin and Taxol: Discovery to Clinic-Thirteenth Bruce F. Cain Memorial Award Lecture. Cancer Research. 55 (4), 753-760 (1995).
Schiff, P. B., Horwitz, S. B. Taxol stabilizes microtubules in mouse fibroblast cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (3), 1561-1565 (1980).
Lara-Gonzalez, P., Westhorpe, F. G., Taylor, S. S. The spindle assembly checkpoint. Curr Biol. 22 (22), R966-R980 (2012).
Musacchio, A. The Molecular Biology of Spindle Assembly Checkpoint Signaling Dynamics. Curr Biol. 25 (20), R1002-R1018 (2015).
Uetake, Y., et al. Cell cycle progression and de novo centriole assembly after centrosomal removal in untransformed human cells. J Cell Biol. 176 (2), 173-182 (2007).
Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132 (3), 487-498 (2008).
Chittajallu, D. R., et al. In vivo cell-cycle profiling in xenograft tumors by quantitative intravital microscopy. Nat Methods. 12 (6), 577-585 (2015).
Gu, J., et al. Cell cycle-dependent regulation of a human DNA helicase that localizes in DNA damage foci. Mol Biol Cell. 15 (7), 3320-3332 (2004).
Easwaran, H. P., Leonhardt, H., Cardoso, M. C. Cell cycle markers for live cell analyses. Cell Cycle. 4 (3), 453-455 (2005).
Hahn, A. T., Jones, J. T., Meyer, T. Quantitative analysis of cell cycle phase durations and PC12 differentiation using fluorescent biosensors. Cell Cycle. 8 (7), 1044-1052 (2009).
Bajar, B. T., et al. Fluorescent indicators for simultaneous reporting of all four cell cycle phases. Nat Methods. 13 (12), 993-996 (2016).
Gekara, N. O. DNA damage-induced immune response: Micronuclei provide key platform. J Cell Biol. 216 (10), 2999-3001 (2017).
Chow, K. H., Factor, R. E., Ullman, K. S. The nuclear envelope environment and its cancer connections. Nat Rev Cancer. 12 (3), 196-209 (2012).
Crasta, K., et al. DNA breaks and chromosome pulverization from errors in mitosis. Nature. 482 (7383), 53-58 (2012).
Hatch, E. M., Fischer, A. H., Deerinck, T. J., Hetzer, M. W. Catastrophic nuclear envelope collapse in cancer cell micronuclei. Cell. 154 (1), 47-60 (2013).
Maciejowski, J., Li, Y., Bosco, N., Campbell, P. J., de Lange, T. Chromothripsis and Kataegis Induced by Telomere Crisis. Cell. 163 (7), 1641-1654 (2015).
Zhang, C. Z., et al. Chromothripsis from DNA damage in micronuclei. Nature. 522 (7555), 179-184 (2015).
Denais, C. M., et al. Nuclear envelope rupture and repair during cancer cell migration. Science. 352 (6283), 353-358 (2016).
Raab, M., et al. ESCRT III repairs nuclear envelope ruptures during cell migration to limit DNA damage and cell death. Science. 352 (6283), 359-362 (2016).
Bernhard, W., Granboulan, N. THE FINE STRUCTURE OF THE CANCER CELL NUCLEUS. Exp Cell Res. 24 (Suppl 9), 19-53 (1963).
de Noronha, C. M., et al. Dynamic disruptions in nuclear envelope architecture and integrity induced by HIV-1 Vpr. Science. 294 (5544), 1105-1108 (2001).
Vargas, J. D., Hatch, E. M., Anderson, D. J., Hetzer, M. W. Transient nuclear envelope rupturing during interphase in human cancer cells. Nucleus. 3 (1), 88-100 (2012).
Sieprath, T., Darwiche, R., De Vos, W. H. Lamins as mediators of oxidative stress. Biochem Biophys Res Commun. 421 (4), 635-639 (2012).
Mitchison, T. J., Pineda, J., Shi, J., Florian, S. Is inflammatory micronucleation the key to a successful anti-mitotic cancer drug? Open Biol. 7 (11), (2017).
Shenk, E. M., Ganem, N. J. Generation and Purification of Tetraploid Cells. Methods Mol Biol. 1413, 393-401 (2016).
Morten, B. C., Scott, R. J., Avery-Kiejda, K. A. Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell Lines. J Vis Exp. (115), (2016).
Salmon, E. D., Canman, J. C. Proper alignment and adjustment of the light microscope. Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 4 Unit 4 1 (2001).
Cole, R. Live-cell imaging. Cell Adh Migr. 8 (5), 452-459 (2014).
Burke, R. T., Orth, J. D. Through the Looking Glass: Time-lapse Microscopy and Longitudinal Tracking of Single Cells to Study Anti-cancer Therapeutics. J Vis Exp. (111), (2016).
Douthwright, S., Sluder, G. Live Cell Imaging: Assessing the Phototoxicity of 488 and 546 nm Light and Methods to Alleviate it. J Cell Physiol. 232 (9), 2461-2468 (2017).
Hilsenbeck, O., et al. Software tools for single-cell tracking and quantification of cellular and molecular properties. Nat Biotechnol. 34 (7), 703-706 (2016).
Skylaki, S., Hilsenbeck, O., Schroeder, T. Challenges in long-term imaging and quantification of single-cell dynamics. Nat Biotechnol. 34 (11), 1137-1144 (2016).
Jones, T. R., et al. Scoring diverse cellular morphologies in image-based screens with iterative feedback and machine learning. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (6), 1826-1831 (2009).
Lukas, C., Falck, J., Bartkova, J., Bartek, J., Lukas, J. Distinct spatiotemporal dynamics of mammalian checkpoint regulators induced by DNA damage. Nat Cell Biol. 5 (3), 255-260 (2003).
Bekker-Jensen, S., Lukas, C., Melander, F., Bartek, J., Lukas, J. Dynamic assembly and sustained retention of 53BP1 at the sites of DNA damage are controlled by Mdc1/NFBD1. J Cell Biol. 170 (2), 201-211 (2005).
Loewer, A., Batchelor, E., Gaglia, G., Lahav, G. Basal dynamics of p53 reveal transcriptionally attenuated pulses in cycling cells. Cell. 142 (1), 89-100 (2010).
Lekshmi, A., et al. A quantitative real-time approach for discriminating apoptosis and necrosis. Cell Death Discovery. 3, 16101 (2017).
Jullien, D., Vagnarelli, P., Earnshaw, W. C., Adachi, Y. Kinetochore localisation of the DNA damage response component 53BP1 during mitosis. J Cell Sci. 115 (Pt 1), 71-79 (2002).

Cancer Research

לטווח ארוך לחיות תאים הדמיה כדי להעריך את גורל בתגובה פקליטקסל

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.