Summary
Formazione immagine della vivere-cella fornisce una ricchezza di informazioni su singole cellule o di intere popolazioni che è irraggiungibile da cella fissa imaging da solo. Qui, i protocolli di imaging di cellule vive per valutare le decisioni di destino delle cellule dopo il trattamento con il paclitaxel della droga anti-mitotico sono descritti.
Abstract
Cellule vive imaging è una tecnica potente che può essere utilizzata per visualizzare direttamente i fenomeni biologici in singole cellule per lunghi periodi di tempo. Nell'ultimo decennio, nuove ed innovative tecnologie notevolmente hanno aumentato la praticità dell'imaging di cellule vive. Le cellule possono ora essere tenute a fuoco e continuamente immaginata durante diversi giorni mentre tenute sotto 37 °C e 5% CO2 condizioni di coltura delle cellule. Inoltre, molteplici campi di vista che rappresentano diverse condizioni sperimentali possono essere acquisite contemporaneamente, così fornendo dati sperimentali ad alta velocità. Formazione immagine della vivere-cella fornisce un vantaggio significativo rispetto formazione immagine fissa-cella, consentendo la visualizzazione diretta e la quantificazione temporale degli eventi cellulari dinamici. Formazione immagine della vivere-cella può anche identificare variazioni nel comportamento di singole cellule che sarebbe altrimenti stato perso utilizzando dosaggi basati sulla popolazione. Qui, descriviamo protocolli di imaging di cellule vive per valutare le decisioni di destino delle cellule dopo il trattamento con il paclitaxel della droga anti-mitotico. Dimostriamo di metodi per visualizzare se mitotically arrestato le cellule muoiono direttamente dalla mitosi o scivolare indietro in interfase. Inoltre descriviamo come il sistema di indicatori (FUCCI) fluorescente ubiquitinazione ciclo cellulare può essere utilizzato per valutare la frazione di cellule di interfase Nato da slittamento mitotic che sono in grado di immettere nuovamente il ciclo cellulare. Infine, descriviamo un metodo di imaging di cellule vive per identificare gli eventi di rottura involucro nucleare.
Introduction
Farmaci anti-mitotici lungamente sono stati usati nei regimi chemioterapeutici di vari tipi di tumori solidi e spesso mostrano grande efficacia1,2,3. Meccanicistico, queste droghe perturbare la normale progressione mitotica e promuovere arresto mitotico in rapidamente di proliferazione delle cellule tumorali. Tuttavia, il destino delle cellule in risposta all'arresto mitotico è altamente variabile: mentre una frazione delle cellule subisce la morte delle cellule direttamente dalla mitosi, altri uscire dalla mitosi e tornare a interfase come cellule tetraploidi (un processo definito slittamento mitotico)4, 5,6,7,8. Queste cellule di interfase possono eseguire apoptosi, subire l'arresto del ciclo cellulare permanente o anche immettere nuovamente il ciclo cellulare4,5,6,7,8,9 ,10,11. Cellule che eludere la morte delle cellule mitotiche scivolando nell'interfase, solo di inserire nuovamente il ciclo cellulare dopo la rimozione del farmaco, pertanto possono contribuire per il re-emergence di popolazioni di cellule di cancro. Inoltre, cellule che slittamento da mitosi sono tetraploide e tetraploidy è conosciuta per promuovere l'instabilità del cromosoma che spinge tumore ricadono12,13,14,15. Definire i fattori che controllano il destino delle cellule in risposta ai trattamenti farmacologici anti-mitotico è quindi fondamentale per ottimizzare terapeutica corrente.
In questo protocollo, descriviamo i metodi per direttamente osservare e studiare il destino delle cellule che subiscono prolungato arresto mitotico in risposta al paclitaxel della droga anti-mitotico. Paclitaxel è un consolidato terapeutico nella clinica e si è dimostrato altamente efficace in molti tipi di tumori, compresi quelli del seno, delle ovaie e polmoni16,17,18,19, 20. Paclitaxel, che è un alcaloide vegetale derivato dalla corteccia dell'albero del Yew, stabilizza i microtubuli e quindi impedisce la loro dinamicità21,22. Mentre la bagnatura della dinamica dei microtubuli da paclitaxel non influisce la progressione del ciclo cellulare da G1 e G2, la droga portano alla attivazione sostenuta del checkpoint montaggio mandrino durante la mitosi ostacolando allegato microtubulo-cinetocore (rivisto in profondità qui23,24)25. Di conseguenza, inizio anafase è impedito in cellule trattate con paclitaxel e risultati in un prolungato arresto mitotico.
Questo protocollo descriverà primi approcci per identificare cellule mitotiche in cellule vive imaging esperimenti. Mitosi possono essere visualizzati in cellule di coltura del tessuto aderente a causa di due cambiamenti biologici evidente delle cellule. In primo luogo, i cromosomi diventano altamente condensati immediatamente prima della ripartizione busta nucleare. Mentre spesso rilevabile da microscopia di contrasto di fase standard, condensazione del cromosoma può essere più chiaramente rilevato usando fluorescente Tag che cromosomi di etichetta (ad esempio alle proteine istoniche fluorescente etichettati). In secondo luogo, mitotiche cellule possono essere identificate anche dai drammatici cambiamenti morfologici risultanti dall'arrotondamento delle cellule.
Questo protocollo quindi dimostrerà come utilizzare approcci di imaging di cellule vive per tenere traccia i destini delle cellule vivendo prolungato arresto mitotico. Arrestato in mitosi le cellule subiscono una delle tre Parche distinti. In primo luogo, le cellule possono subire la morte delle cellule durante la mitosi. Questo fenomeno è visualizzato prontamente da microscopia chiara, come le cellule morte sono osservate per termoretraibile, vescichetta, e/o rottura. In secondo luogo, le cellule possono uscire dalla mitosi e ritorna alla interfase senza segregazione cromosomica o citochinesi, un processo definito slittamento mitotico. La decondensazione dei cromosomi e/o l'appiattimento della cella mitotica prontamente identifica questo processo. Le cellule che scivolare dalla mitosi spesso anche visualizzare i nuclei irregolari, multi-lobi e frequentemente harbor diversi micronuclei5. In terzo luogo, cellule arrestate nella mitosi possono avviare anafase e procedere attraverso mitosi dopo un lungo ritardo. Mentre raro alle più alte concentrazioni di farmaco, questo comportamento suggerisce che le cellule arrestate potrebbero hanno soddisfatto il checkpoint di montaggio del mandrino, o che il checkpoint di montaggio del mandrino è parzialmente indebolito o difettoso. Insorgenza di anafase possa essere visualizzata da segregazione del cromosoma e citochinesi successiva usando la formazione immagine di cellule vive.
Metodi di formazione immagine di cellule vive per tenere traccia il destino delle cellule che eludere la morte delle cellule mitotiche subendo lo slittamento mitotic inoltre saranno descritto. Cellule che subiscono lo slittamento mitotico muoiono nel interphase successivo, innescano un arresto del ciclo cellulare di1 G durevole o immettere nuovamente il ciclo cellulare per avviare un nuovo ciclo di divisione cellulare4. Verrà descritto un approccio utilizzando il sistema FUCCI (indicatore fluorescente ciclo cellulare basato su ubiquitinazione) a determinare la frazione di cellule che immettere nuovamente il ciclo cellulare seguendo lo slittamento mitotico. FUCCI consente la visualizzazione diretta della transizione G1/s e può essere utilizzato in combinazione con-vivere-cella a lungo termine sia in vitro che in vivo26,27di imaging. Il sistema FUCCI si avvale di due proteine fluorescente contrassegnati, troncate forme di hCdt1 (replicazione del DNA e della cromatina licenze factor 1) e hGeminin, i cui livelli oscillano basato sulla posizione del ciclo cellulare. hCdt1 (fuso a una proteina fluorescente rossa) è presente a livelli elevati durante la fase di1 G dove agisce per ottenere la licenza per la replica del DNA, ma viene ubiquitinata da E3 ubiquitina ligasi SCFSkp2 e degradati durante fasi / m2S/G per prevenire ri-replica del DNA26. Al contrario, hGeminin (fuso a una proteina fluorescente verde), è un inibitore della hCdt1 cui livella il picco durante S/G2/m, ma viene ubiquitinata da E3 ubiquitina ligasi APCCdh1 e degradato alla fine della mitosi e in tutto G1 26. di conseguenza, FUCCI offre una lettura semplice fluorescenza della fase del ciclo cellulare, come le cellule presentano fluorescenza rossa durante la fluorescenza di1 e verde di G durante S/G2/m. Il sistema FUCCI è un progresso significativo sopra altri approcci (come la bromodeossiuridina colorazione) per identificare cellule proliferative, perché non richiede fissazione delle cellule e permette per l'imaging di singola cellula senza la necessità di ulteriore farmacologico trattamenti per sincronizzare le popolazioni delle cellule. Anche se non discussi in questo protocollo, sensori aggiuntivi di cellule vive sono stati sviluppati anche per prevedere la progressione del ciclo cellulare, tra cui un sensore di helicase B per G128, DNA ligasi-RFP29 e PCDNA-GFP30 sensori per la fase S e il recente sensore di FUCCI-4, che rileva tutte le fasi del ciclo cellulare31.
Infine, sarà descritto un metodo di imaging di cellule vive di rilevare la rottura involucro nucleare. Recenti studi hanno rivelato che le buste di nucleare delle cellule di cancro sono instabile e soggetta a rottura, consentendo in tal modo il contenuto del nucleoplasma e citoplasma di combinare. Questo fenomeno, chiamato nucleare rottura, può promuovere il danno del DNA e la stimolazione della risposta immunitaria innata32,33,34,35,36,37, 38 , 39 , 40 , 41 , 42 , 43 , 44. mentre le cause di rottura nucleare rimangono in modo incompleto caratterizzate, è noto che le deformazioni nella struttura nucleare correlano con un'aumentata incidenza di rottura nucleare42. Un effetto ben noto di trattamento del paclitaxel è la generazione di strutture nucleari in maniera sconvolgente anormali seguendo la mitosi; come tale, sarà descritto un metodo che utilizza cellule vive di imaging nucleare rottura di quantificare, esplorando anche se il trattamento del paclitaxel aumenta la frequenza degli eventi di rottura nucleare. Nucleare rottura può essere rilevata tramite la perdita osservata di una proteina fluorescente nucleare-mirati nel citoplasma (ad es. un dimero di tandem ripetere di RFP fusa ad un segnale di localizzazione nucleare, TDRFP-NLS). Questa perdita è distintamente visibile dall'occhio, che consente la semplice quantificazione degli eventi di rottura.
Questo protocollo richiede un microscopio a epifluorescenza widefield che è dotato di un palco codificato e il software di messa a fuoco automatica. La fase di codificato permette per movimento preciso automatizzato a definite le coordinate X-Y, mentre il software di messa a fuoco automatica mantiene le cellule a fuoco per tutta la durata del periodo di formazione immagine. Inoltre, questo protocollo richiede attrezzature per mantenere le cellule a 37 ° C con umidificati 5% CO2 ambiente. Ciò può essere ottenuto racchiudendo l'intero microscopio all'interno una temperatura e atmosfera controllata recinzione, o mediante dispositivi di palcoscenico-top che localmente mantiene temperatura e ambiente. L'obiettivo di contrasto di fase utilizzato in questo protocollo è un piano fluor 10 x con un'apertura numerica di 0,30. Tuttavia, 20 X obiettivi sono anche sufficienti a identificare sia cellule arrotondate interfase mitotic e appiattita in un unico piano focale. Se eseguendo il contrasto di fase di imaging (come descritto in questo metodo), il coperchio può essere in vetro o in plastica. Se viene utilizzata la microscopia di contrasto (DIC) di differenziale di interferenza, è imperativo utilizzare un coperchio di vetro per impedire la depolarizzazione della luce.
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Protocol
Questo protocollo si concentra sull'utilizzo la non trasformate e cromosomicamente stabile retinico pigmentato epiteliale (RPE-1) linea cellulare per imaging esperimenti cellule vive. Tuttavia, questo protocollo può essere adattato a qualsiasi linea di cellulari aderenti, purché le condizioni di coltura delle cellule vengono regolati secondo necessità. Tutte le procedure devono rispettare istituzionale biosicurezza e orientamenti etici e regolamenti.
1. preparare le celle per Live cell Imaging
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Utilizzare il passaggio appena scongelati e primi RPE-1 cellule che esprimono umano istone che H2B fuso a una proteina fluorescente (per esempio H2B-GFP), o il sistema FUCCI (un protocollo dettagliato su come generare cellule che esprimono FUCCI può essere trovato in riferimento45) per valutare il destino delle cellule mitotiche.
- Per misurare la frequenza di rottura nucleare, utilizzare cellule RPE-1 che esprimono sia H2B-GFP e un dimero di tandem della proteina fluorescente rossa fusa ad un segnale di localizzazione nucleare singola (TDRFP-NLS).
Nota: Costrutti di tre proteine verdi fluorescenti fusa in tandem per un segnale di localizzazione nucleare singolo (GFP3- NLS) inoltre sono stati usati per dimostrare la rottura (come riferimento42). - Mantenere le cellule in piastre di coltura del tessuto di 10 cm nel terreno di crescita appropriata. Cellule RPE-1 sono mantenute fenolo rosso-libero, per volta Eagle Medium/nutriente miscela F-12 di Dulbecco (DMEM:F12) completati con 10% siero bovino fetale (FBS), 100 UI/mL di penicillina e 100 μg/mL di streptomicina.
- Per misurare la frequenza di rottura nucleare, utilizzare cellule RPE-1 che esprimono sia H2B-GFP e un dimero di tandem della proteina fluorescente rossa fusa ad un segnale di localizzazione nucleare singola (TDRFP-NLS).
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Media dalle celle di aspirare, lavare il piatto di coltura del tessuto con 10 mL di sterile, temperatura tampone fosfato salino (PBS) per rimuovere il mezzo di rimanente e quindi aspirare il PBS.
- Aggiungere 2 mL di 0,25% tripsina con acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) per le cellule e incubare a 37 ° C per 3 minuti o fino a quando la maggior parte delle cellule hanno staccato dalla piastra.
Nota: Non mantenere le cellule in tripsina più tempo del necessario.
- Aggiungere 2 mL di 0,25% tripsina con acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) per le cellule e incubare a 37 ° C per 3 minuti o fino a quando la maggior parte delle cellule hanno staccato dalla piastra.
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Aggiungere 10 mL di terreno completo per raccogliere le cellule trypsinized con un stripette sierologici 10ml e pipettare in una provetta conica da 15 mL.
- Agglomerare le cellule mediante centrifugazione a 180 x g per 3 min a temperatura ambiente.
- Aspirare il supernatante, facendo attenzione a non disturbare il pellet e poi accuratamente risospendere il pellet in 10 mL di terreno nuovo pipettando delicatamente il mezzo in su e giù nella stripette sierologici.
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Utilizzare un emocitometro o cella automatizzata conta la macchina per contare le cellule46.
- Diluire le cellule in una nuova provetta conica a 30.000 cellule/mL di terreno completo.
- Piastra di 30.000 cellule RPE-1 (volume di 1 mL) per pozzetto di un 12-pozzetti col fondo di vetro (spessore #1.5) imaging piatto per ottenere la densità cellulare richiesta il giorno successivo (30 – 50% confluenti).
Nota: Maneggiare la piastra con i guanti sempre e fare attenzione a non toccare il fondo di vetro.
- Consentire alle cellule di crescere in un incubatore a 37 ° C coltura tissutale fino a quando sono completamente allegare e appiattire sulla piastra imaging con fondo di vetro. Mentre le cellule possono allegare dentro così piccolo quanto 4 h, è consigliabile che le cellule non sono trattate con farmaci e ripreso fino al giorno seguente.
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Aggiungere paclitaxel (disciolto in dimetilsolfossido (DMSO)) alla concentrazione finale desiderata in terreno completo e mescolare accuratamente.
- Preparare il supporto completo con un volume uguale di DMSO da sola da utilizzare come controllo.
- Caldo il supporto contenente il farmaco o DMSO a 37 ° C prima dell'aggiunta alle cellule. Ciò impedirà focale deriva a causa di un mutamento di temperatura improvviso.
- Aggiungere 1 mL di medium contenente paclitaxel o DMSO da solo a singoli pozzetti del piatto imaging 12-pozzetti.
2. impostare il microscopio per l'Imaging di cellule vive
- Pulire il fondo di vetro del piatto imaging con ottica pulitore per rimuovere eventuali impronte digitali o la polvere che potrebbe interferire con la formazione immagine. Utilizzare pulitore ottico sufficiente per bagnare la superficie di vetro intero.
- Posizionare il piatto con fondo di vetro sul palco microscopio l'adattatore piatto imaging, rimuovere il coperchio di plastica dal piatto e coprire il piatto con un ripiano in vetro camera. Garantire che la camera ha una valvola per consentire un flusso costante di aria composta da 5% CO2.
Nota: Per umidificare il 5% di CO2, il gas viene propagato attraverso tubi inseriti in un alloggiamento di vasca di acqua sterile. Questo permette al gas di diventare equilibrato al 95% di umidità. - Avviare/calibrare la fase codificata utilizzando il programma software di controllo del microscopio. Questo garantisce precise coordinate X-Y ed impedisce focale deriva.
- Concentrarsi sulle cellule utilizzando ottiche di contrasto di fase ed eseguire illuminazione di Kohler (descritto in dettaglio in riferimento47) per focalizzare la luce e il contrasto ottimo.
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Utilizzare software di acquisizione per determinare i tempi di esposizione ottimale per tutti i canali fluorescenti utilizzati (esposizioni che danno 75% saturazione di pixel della fotocamera sono ideali, purché la quantità di luce non è tossica per le cellule) e luce bianca.
- Utilizzare software di acquisizione per selezionare diversi, non sovrapposte campi di vista da ogni pozzetto per l'imaging. Selezionare imaging regioni in cui le cellule hanno aderito bene il fondo di vetro e sono compresi tra 50% e 70% confluenti. Evitare zone delle cellule ragruppate, in quanto ciò renderà difficile l'analisi successiva.
Nota: È importante avere non sovrapposti campi di vista da ogni pozzetto per evitare il rilevamento delle stesse cellule due volte. Se le cellule sono altamente mobili, può essere necessario acquisire diverse immagini irradiano da un punto centrale e stitch che li di nuovo insieme per rendere un ampio campo visivo.
- Utilizzare software di acquisizione per selezionare diversi, non sovrapposte campi di vista da ogni pozzetto per l'imaging. Selezionare imaging regioni in cui le cellule hanno aderito bene il fondo di vetro e sono compresi tra 50% e 70% confluenti. Evitare zone delle cellule ragruppate, in quanto ciò renderà difficile l'analisi successiva.
- Attivare la funzionalità di messa a fuoco automatica del microscopio per assicurare che tutti i punti sono mantenuti a fuoco per tutta la durata dell'esperimento.
- Per valutare il destino delle cellule mitotiche, impostare il software di imaging per raccogliere le immagini da ogni campo di vista selezionato ogni 10 min fino a 96 h. imperturbabile mitosi dura 20 – 40 min, e così gli intervalli di 10 min fornirà sufficiente campionamento per identificare quando le cellule si dividono. Per identificare la rottura nucleare, che è un evento transitorio, acquisire immagini ogni 5 min.
Nota: Assicurarsi che il computer che guida il software di acquisizione di immagini ha auto-aggiornamento, screensaver e modalità di risparmio energetico disabilitate, come spesso questi possono interferire con acquisizione immagine sopra lunghi esperimenti. - Avviare l'esperimento di formazione immagine. Verificare periodicamente che acquisizione di immagini è senza intoppi nel corso del video.
3. video analisi per identificare il destino delle cellule in risposta a Paclitaxel
- Confermare che le cellule imaged sono sane durante tutto il corso dell'esperimento imaging. Cellule di controllo trattate con DMSO dovrebbero essere praticabile e attivamente proliferanti.
Nota: Se le cellule presentano segni di stress, non quantificare il video ed invece concentrarsi sull'ottimizzazione imaging condizioni48. Segni di stress di imaging comprendono blebbing/morire cellule, che non riescono a collegare/diffusione sulla piastra e quelle che mostrano un basso indice mitotico e/o prolungato mitosi. Possibili fonti di stress comprendono le fluttuazioni di temperatura o CO2 livelli all'interno l'imaging camera o fototossicità48. - Quando un intero campo di vista con un 10 X o 20 X obiettivo di imaging, centinaia di singole celle può essere presenti. Pertanto, per assistere con quantificazione, dividere il campo di vista in più piccoli quadranti utilizzando strumenti software disponibili. Punteggio di celle all'interno di ogni quadrante separatamente (come descritto nella procedura 3.3.1–3.6.2).
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Quando si analizza il video, tenere traccia di ogni cella in una visualizzazione unita con contrasto di fase e/o immagini fluorescenti. Utilizzare strumenti di analisi del software per creare la visualizzazione unita.
- A partire dall'inizio del video, identificare una cella singola interfase e monitorare lo stato di avanzamento durante il ciclo cellulare utilizzando ottiche di fase. Per tenere traccia di una singola cella, osservare la cellula da un fotogramma all'occhio. Identificare le cellule di interfase a causa della loro morfologia appiattita (come valutato da contrasto di fase) e la loro mancanza di condensazione del DNA (come valutato da H2B-GFP) (Figura 1A).
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Identificare le cellule che entrano mitosi tramite l'osservazione di cella arrotondamento (con ottica a contrasto di fase) e/o condensazione cromosomica (utilizzando H2B-GFP) (fig. 1A-C). Entrambi condensazione di arrotondamento e cromosoma di cella sono visualizzato prontamente dall'occhio.
- Annotare il tempo quando la cella viene attivata la mitosi. Continuare il tracciamento della cella finché raggiunge il suo destino (anafase come passo 3.5, morte delle cellule da mitosi come descritto al punto 3.6.1 o slittamento mitotico come descritto al punto 3.6.2).
- Cellule di controllo in modo efficiente dovrebbero allineare i loro cromosomi e immettere anafase entro 1 h (Figura 1). Visualizzare anafase dall'ottica a contrasto di fase, come la cellula comincia a pizzicare in due o mediante la visualizzazione di cromosomi movimento perturbato etichettati con H2B-GFP (Figura 1A). Annotare il tempo quando la cellula subisce anafase.
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Al contrario, le cellule trattate con paclitaxel rimarrà arrotondate con i cromosomi condensati per diverse ore (3-40 h) (Figura 1B-D).
- Identificare le cellule mitoticamente arrestato che subiscono la morte delle cellule.
Nota: Le cellule che muoiono durante la mitosi sono visualizzate da microscopia di contrasto di fase, come le cellule verranno vescichetta, strizzacervelli, e/o rottura (Figura 1B). Se imaging H2B-GFP, i cromosomi si frammentano anche durante la morte delle cellule. - Identificare le cellule mitoticamente arrestato che subiscono lo slittamento delle cellule.
Nota: Le cellule che subiscono lo slittamento mitotic sono osservate da microscopia di contrasto di fase, come si appiattiscono in interfase e decondense cromosomi senza subire anafase (Figura 1). Cellule che subiscono lo slittamento mitotico danno origine a grandi cellule tetraploidi che sono spesso multinucleated (Figura 1).
- Identificare le cellule mitoticamente arrestato che subiscono la morte delle cellule.
- Continuare il monitoraggio delle cellule dal campo di vista originale. Una volta che viene rilevato un intero campo di vista, spostare in un separato di campo acquisita dallo stesso bene e continuare il monitoraggio delle cellule.
4. video analisi per identificare il destino delle cellule dopo lo slittamento mitotico
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Valutare il destino delle cellule dopo lo slittamento mitotico (come descritto al punto 3.6.2) utilizzando cellule RPE-1 che esprimono il sistema FUCCI. Oltre a formazione immagine di contrasto di fase, è necessario acquisire sia fluorescenza rossa (indicativo della fase1 G) e le immagini di fluorescenza verde (indicativo di S/G2/m)).
- Tenere traccia di cellule RPE FUCCI-1 come descritto nel punto 3.3 al 3,7.
- Per verificare il corretto funzionamento del sistema FUCCI, convalidare tale controllo cellule alternativo espressione delle proteine fluorescenti rosse e verdi in modo appropriato da analisi di dati di imaging di cellule vive. Cellule di controllo dovrebbero passare da esporre interamente nucleare fluorescenza rossa ad esporre interamente nucleare fluorescenza verde durante l'interfase come progresso di cellule da G1 a fase S. Le cellule devono continuare esibendo fluorescenza verde durante il completamento della mitosi. Immediatamente dopo la mitosi, le cellule ancora una volta dovrebbero esibire fluorescenza interamente rossa durante l'interfase.
Nota: Mentre esistono metodi per quantificare l'intensità di fluorescenza sia RFP e GFP dal sistema FUCCI in singole cellule utilizzando tracce fluorescenti49, questo spesso non è necessario in quanto il cambiamento di colore di fluorescenza è robusto e visibili ad occhio.
- Per verificare il corretto funzionamento del sistema FUCCI, convalidare tale controllo cellule alternativo espressione delle proteine fluorescenti rosse e verdi in modo appropriato da analisi di dati di imaging di cellule vive. Cellule di controllo dovrebbero passare da esporre interamente nucleare fluorescenza rossa ad esporre interamente nucleare fluorescenza verde durante l'interfase come progresso di cellule da G1 a fase S. Le cellule devono continuare esibendo fluorescenza verde durante il completamento della mitosi. Immediatamente dopo la mitosi, le cellule ancora una volta dovrebbero esibire fluorescenza interamente rossa durante l'interfase.
- Tenere traccia di cellule RPE FUCCI-1 come descritto nel punto 3.3 al 3,7.
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Identificare le cellule arrestate nella mitosi usando la microscopia di contrasto di fase e tenerne traccia fino a quando non subiscono lo slittamento mitotico, come descritto in 3.4 e 3.6.2. Cellule che scivolare fuori mitosi e torna in interfase cambierà da esporre fluorescenza verde durante la mitosi per fluorescenza rossa durante fase di1 G (Figura 2A- C).
- Tenere traccia di queste celle utilizzando il contrasto di fase ed epifluorescente imaging Filò occhio per valutare il loro destino della cellula (Figura 2D).
- Identificare le cellule che immettere nuovamente il ciclo cellulare. Queste cellule sono identificate dal rosso al verde cambiamento nell'espressione di fluorescenza usando il sistema FUCCI che indica la transizione di G1/s (Figura 2A).
- Identificare le cellule che subiscono l'arresto del ciclo cellulare G1 . Queste cellule sono identificate dall'espressione di fluorescenza rossa che persiste per > 24 h (Figura 2B).
- Identificare le cellule che muoiono in interfase. Queste cellule sono identificate dalla cella rottura/blebbing/restringimento usando la formazione immagine di contrasto di fase (Figura 2).
- Tenere traccia di queste celle utilizzando il contrasto di fase ed epifluorescente imaging Filò occhio per valutare il loro destino della cellula (Figura 2D).
5. video analisi per identificare la frequenza di rottura involucro nucleare
- Utilizzare le cellule RPE-1 che esprimono H2B-GFP e TDRFP-NLS per valutare la rottura involucro nucleare. Oltre a formazione immagine di contrasto di fase, acquisire immagini di fluorescenza verde (FITC) sia di fluorescenza rossa (TRITC). Acquisire immagini ogni 5 min per prevedere la rottura.
Nota: È fondamentale per generare linee cellulari in cui la TDRFP-NLS viene importato in modo efficiente nel nucleo con minima fluorescenza citoplasmatica. - Celle di immagine come descritto al punto 3.3 al 3.4. Il segnale di fluorescenza TDRFP-NLS e H2B-GFP dovrebbe colocalizzano durante l'interfase. Al momento di mitosi (come visualizzati da cella arrotondamento utilizzando la condensazione di ottica e/o cromosoma di fase di H2B-GFP), la membrana nucleare si rompe e il segnale di TDRFP-NLS diventerà citoplasmatica (Figura 3A). A seguito di mitosi, busta nucleare riformerà in cellule della figlia e il segnale di TDRFP-NLS diventerà nucleare.
- Tenere traccia di cellule della figlia durante l'interfase successiva da formazione immagine di cellule vive. Identificare gli eventi nucleari rottura osservando una raffica transitoria di TDRFP-NLS nucleare localizzato nel citoplasma circostante. In pochi minuti, busta nucleare sarà riparata e il TDRFP-NLS sarà relocalized al nucleo (Figura 3A).
Nota: Spesso, il DNA nucleare, come visualizzato di H2B-GFP, sarà visibili a sporgere all'esterno del sito di rottura come una piccola vescichetta. - Punteggio ottenuto la frazione dei nuclei che subiscono un evento di rottura durante l'interfase. Per segnare questa frazione, contare il numero di cellule che subiscono un evento di rottura rispetto al numero totale delle cellule rilevate.
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Representative Results
Utilizzando il protocollo descritto in precedenza, cellule RPE-1 esprimendo H2B-GFP sono state trattate con un controllo anti-mitotico o veicolo (DMSO) e analizzate da formazione immagine di cellule vive. L'analisi ha rivelato che 100% di cellule RPE-1 mitotic controllo avviato anafase una media di 22 min dopo aver inserito la mitosi (Figura 1A, 1D). Al contrario, le cellule RPE-1 trattate con paclitaxel ha esibito un arresto mitotico profondo che dura parecchie ore (Figura 1). Formazione immagine ha rivelato che il 48% di queste cellule mitoticamente arrestate ha subito morte cellulare mitotica (Figura 1B, 1E), mentre il restante 52% ha subito lo slittamento mitotico (Figura 1, 1E).
Per valutare il destino delle cellule RPE-1 che ha subito lo slittamento mitotico, RPE-1 cellule che esprimono il sistema FUCCI sono state trattate con entrambi della basso-dose 50 nM paclitaxel, della alto-dose 5 µM paclitaxel, o veicolo controllare (DMSO) e analizzati da formazione immagine di cellule vive di lungo termine. I dati hanno rivelato che delle cellule RPE-1 che ha subito lo slittamento mitotico dopo il trattamento con 50 nM paclitaxel, 22% morì nel successivo ciclo cellulare (Figura 2, 2D), 72% ha indotto l'arresto del ciclo cellulare (Figura 2B, 2D), e solo il 5% re-entered la fase S (Figura 2A, 2D). Al contrario, delle cellule RPE-1 trattate con paclitaxel µM 5 della alto-dose che ha subito lo slittamento mitotico, il 35% è morto nel successivo ciclo cellulare, il 65% ha indotto l'arresto del ciclo cellulare e nessuno ri-entrata S-fase (Figura 2D).
È interessante notare che, paclitaxel-trattamento a basse dosi promuove la rottura involucro nucleare in cellule RPE-1 seguendo la mitosi. Dopo completamento mitotic cellule figlie sono state monitorate e segnate per tutti gli eventi di rottura nucleare, rivelando che solo ~ 4% di controllo (DMSO-trattati) RPE-1 cellule della figlia si è rotto, mentre ~ 23% della figlia cellule trattate con 10 nM paclitaxel hanno esibito la rottura ( Figura 3A, 3B).
Figura 1: destino delle cellule Mitotic in risposta al trattamento anti-mitotico. Le cellule RPE-1 che esprimono H2B-GFP sono state trattate con DMSO veicolo controllo (A) o 5 µM paclitaxel (B, C) e imaging utilizzando Time-lapse di contrasto di fase e widefield epifluorescenza per valutare il destino delle cellule mitotiche. Cellule di interfase (pannelli a sinistra) sono state monitorate come sono entrati mitosi (pannelli) e fino a quando sia iniziata anafase (A), ha subito la morte cellulare mitotica (B) o scivolato dalla mitosi torna a interfase (C). Frecce bianche indicano cellule rilevate. (D) la quantità di tempo che controllano le cellule (DMSO-trattati) e cellule trattate con anti-mitotic trascorso nella mitosi, come quantificato da formazione immagine di cellule vive (n = 100 celle per ogni condizione). (E), la frazione di cellule (n = 100) che ha subito anafase, morte cellulare mitotica o slittamento mitotico in cellule trattate con DMSO o cellule trattate con 5 µM paclitaxel. H:min. tempo, barra della scala = 50 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: il destino delle cellule che subiscono lo slittamento mitotico. Le cellule RPE-1 che esprimono il sistema FUCCI sono state trattate con 50 nM paclitaxel o 5 µM paclitaxel e imaging utilizzando Time-lapse di contrasto di fase e microscopia a fluorescenza widefield per quantificare il destino delle cellule dopo lo slittamento mitotico. Le cellule sono state segnate come uno dei due re-immettere il ciclo cellulare, come giudicato da un cambiamento di fluorescenza rosso--verde nel sistema FUCCI (A); arresto in fase di1 G, come giudicato dalla fluorescenza rossa persistente per > 24 h (B); o morti durante la mitosi successiva, come giudicato tramite cellulare blebbing/rottura (C). Frecce bianche indicano cellule rilevate. (D), la frazione di cellule (n = 100) che hanno subito ogni destino. Barre di errore rappresentano la deviazione standard dalla media da due esperimenti indipendenti. H:min. tempo, barra della scala = 50 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: frequenza di rottura involucro nucleare in cellule trattate con paclitaxel. RPE-1 le cellule che esprimono TDRFP-NLS e H2B-GFP sono state trattate con 10 nM paclitaxel o veicolo controllare (DMSO) e imaging utilizzando Time-lapse di contrasto di fase e widefield epifluorescenza (A). Durante la mitosi (metafase/anafase) busta nucleare è ripartita e TDRFP-NLS diventa citoplasmatica. A seguito di mitosi, il TDRFP-NLS relocalizes nel nucleo delle cellule di interfase (pre-rottura). Eventi di rottura nucleare sono identificati dalla delocalizzazione di TDRFP-NLS dal nucleo al citoplasma nelle cellule in interfase (rottura), seguita dalla rilocalizzazione di TDRFP-NLS nel nucleo che segue la riparazione involucro nucleare (post-rottura). Frecce bianche indicano cellule rilevate. (B), la frazione di cellule (n > 100 a condizione) che mostrano involucro nucleare rottura dopo la mitosi in presenza di controllo paclitaxel o veicolo. H:min. tempo, barra della scala = 50 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
L'aspetto più critico di formazione immagine di cellule vive a lungo termine è garantire la salute delle cellule essere imaged. È essenziale che le cellule esposte al minimo stress ambientali estranei, quali condizioni scadenti per quanto riguarda la temperatura, umidità e/o livelli di CO2 . È anche importante limitare photodamage da illuminazione fluorescente eccitazione, come lo stress di imaging è conosciuto per interessare cella comportamento50. Limitando photodamage può avvenire in diversi modi come dettagliate altrove48. In generale, si consiglia di utilizzare il tempo di esposizione più breve necessario per produrre un segnale di fluorescenza abbastanza sufficientemente luminosa per tenere traccia con efficacia le cellule, limitando così la fototossicità. Tuttavia, se le cellule sono stampate solo una volta ogni 10-20 min, esposizioni più lunghe (che si avvicinano al saturazione pixel) sono in genere ben tollerato (anche se questo deve essere determinato empiricamente per ogni tipo di fluoroforo e cellulare). Poiché le cellule imaged sono sensibili agli stress ambientali e di formazione immagine, è imperativo che le cellule di controllo sono sempre inclusi in cellule vive imaging esperimenti e monitorate per confermare normale proliferazione.
Una limitazione all'imaging di cellule vive a lungo termine è che richiede attrezzare un microscopio esistente con una camera climatica che mantiene la temperatura e il 5% umidificati atmosfera di CO2 , o una camera di palcoscenico-top che è anche in grado di sostenere la temperatura adatta e l'atmosfera. Mentre fluente CO2 è ottimale, le cellule possono essere imaged anche fino a 48 h usando CO2-mezzo indipendente se umidificata una camera climatica con 5% di CO2 non è disponibile. Tuttavia, molti tipi di cellule sono intolleranti di tale mezzo, e questo deve essere determinato empiricamente misurando la vitalità e la crescita delle cellule. Sovrapponendo le cellule con olio minerale utilizzabile anche per prevenire l'evaporazione media.
Una seconda limitazione importante di questo metodo è che tenere traccia manualmente dei destini delle cellule è molto laboriosa e richiede molto tempo. Tuttavia, programmi per il cellulare-monitoraggio sono disponibili e possono essere ottimizzati per automatizzare l'analisi di immagine51,52,53. Un'ulteriore limitazione con questo metodo è che cellule altamente mobili sono spesso difficili da rintracciare per lunghi periodi di tempo. Se questo costituisce un problema significativo, l'intero bene può essere imaged e le immagini cuciti insieme a formare un ampio campo visivo. Molti programmi supportano questo metodo.
Autofluorescenza è un altro vincolo che deve essere affrontato con questo protocollo. Rosso fenolo mezzo libero riduce sfondo autofluorescenza durante la formazione immagine di cellule vive. Inoltre è stato dimostrato che due vitamine che si trovano comunemente nel terreno di coltura, della riboflavina e piradossale, può ridurre la fotostabilità di proteine fluorescenti. Così, mezzo privo di queste vitamine utilizzabile anche durante la formazione immagine di fluorescenza per migliorare il segnale di rumore razioni. Mentre inferiore in plastica piatti è meno costosi e può fornire risultati di imaging adeguate, inoltre producono una maggiore quantità di autofluorescenza che influenza negativamente i rapporti segnale-rumore. Inoltre, fondo in plastica piatti hanno una maggiore variazione di spessore, che possa interferire con la funzione di autofocus di molti microscopi. Lo spessore del vetro a fondo piatto imaging in questo protocollo è 0,17 millimetri, che è il vetro ideale per l'utilizzo con microscopi moderni.
Infine, film a lungo termine che comprende molteplici campi di vista e l'acquisizione di diversi canali di fluorescenza produce file di dati massiccia (decine di Gigabyte anche ogni terabyte), che pongono un problema per l'archiviazione e backup. Per ovviare a questo problema, è consigliabile che tutte le immagini acquisite utilizzando 2x2 o 4x4 binning, fornito la risultante perdita di risoluzione è accettabile. Binning non solo limita i tempi di esposizione (cioè le cellule che esprimono H2B-GFP o il sistema FUCCI dovrebbero avere esposizioni meno di 500 ms), ma anche drasticamente riduce la dimensione dei file di dati (un'immagine binned 2x2 è un quarto le dimensioni di un non cestinate immagine).
Nonostante queste limitazioni, a lungo termine cellule vive imaging rappresenta il metodo migliore per tenere traccia di destini delle singole celle da intere popolazioni, soprattutto quando la cella destini sono altamente eterogenei. Come più cellule vive di marcatori fluorescenti e sensori diventano disponibili, cellule vive approcci di imaging sarà ampliato per visualizzare e quantificare ulteriori diversi aspetti della biologia delle cellule. Ad esempio, sensori di cellule vive attualmente esistano per quantificare i fuochi di danni del DNA, p53 livelli, posizione del ciclo cellulare e apoptosi26,54,55,56,57,58 . Così, imaging esperimenti hanno la capacità di rivelare le proprietà cellulari sottostanti che dettano come e perché le celluli variabilmente rispondono agli agenti chemioterapeutici.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
AFB, MAV e NJG vorrei ringraziare Ryan Quinton per commenti sul manoscritto e Adrian spera per il costrutto TDRFP-NLS. AFB e MAV sono finanziate con il 5T32GM008541 di NIGMS biomolecolari farmacologia Training Grant. NJG è un membro del Shamim e laboratori di ricerca di Ashraf davil seno cancro ed è supportato da sovvenzioni NIH GM117150 e CA-154531, la Karin Grunebaum Foundation, il programma di premi famiglia Smith, il programma di studiosi di Searle e la ricerca di Melanoma Alliance.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| phenol red-free, DMEM:F12 media | Hyclone | SH3027202 | |
| 10% fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10438026 | |
| 100 IU/ml penicillin, and 100 mg/ml streptomycin. | Gibco | 15070063 | |
| PBS | Gibco | 10010049 | |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gemini | 50-753-3104 | |
| 12-well glass bottomed imaging dish | Cellvis | P12-1.5H-N | |
| Paclitaxel | TSZ Chem | RS036 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | NC0215085 | |
| Environmental Chamber | In Vivo Scientific | ||
| 5% CO2 | Airgas | Z03NI7432000201 | |
| 15 mL Conical Tubes | Fisherbrand | 05-539-12 | |
| 10 cm polystyrene tissue culture plates | Falcon | 08772E | |
| 10 mL Disposable Serological Pipette | Fisherbrand | 4488 | |
| 5804R 15 amp Centrifuge | Eppendorf | 97007-370 | |
| 1000 microliters Pipette | Gilson | Pipetman Classic | |
| 20 microliters Pipette | Gilson | Pipetman Classic | |
| p1000 Pipette Tips | Sharp | p1126 | |
| p20 Pipette Tips | Sharp | P1121 | |
| RPE-1 Cells | ATCC | CRL-4000 | |
| Incubator Galaxy 170S | Eppendorf | CO17011005 | |
| Pipette Boy | Integra | 156401 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 0267110 | |
| Nikon Ti-E-PFS Inverted Microscope for Live Cell Imaging | Micro Video Instruments, Inc. | MEA53100 | |
| Prior X-Y Stage System and White Light LED Illuminator | Micro Video Instruments, Inc. | 500-H117P1N4 | |
| Prior Proscan 3 Controller XYZ with Encoders | Micro Video Instruments, Inc. | 500-H31XYZE | |
| Andor Digital Camera | Micro Video Instruments, Inc. | D10NLC | |
| Nikon NIS Elements AR Software | Micro Video Instruments, Inc. | MQS31000 | |
| SOLA LED Illuminator for Fluorescence | Micro Video Instruments, Inc. | SOLA-E | |
| InVivo Environmental Chamber with CO2 Flow Control | Micro Video Instruments, Inc. | Ti-IVS-100 | |
| Ti-ND6-PFS Perfect Focus Motorized Nosepiece | Micro Video Instruments, Inc. | MEP59391 | |
| Ti-C System Condenser Turret | Micro Video Instruments, Inc. | MEL51000 | |
| Ti-C LWD LWD Lens Unit for System Condenser Turret | Micro Video Instruments, Inc. | MEL56200 | |
| Te-C LWD Ph1 Module | Micro Video Instruments, Inc. | MEH41100 | |
| CFI Plan Fluor DLL 10X Objectivena 0.3 wd 16mm | Micro Video Instruments, Inc. | MRH10101 | |
| CFI Super Plan Fluor ELWD 20xc ADM Objective | Micro Video Instruments, Inc. | MRH48230 |
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