Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

الطويلة الأجل العيش-الخلية أن التصوير لتقييم مصير الخلية ردا على باكليتاكسيل

Published: May 14, 2018 doi: 10.3791/57383
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Pharmacology & Experimental Therapeutics, Boston University School of Medicine, 2Department of Medicine, Section of Hematology and Oncology, Boston University School of Medicine

Summary

تصوير خلية يعيش يقدم ثروة معلومات عن خلايا مفردة أو شعوب بأكملها التي غير قابلة للتحقيق بالتصوير ثابتة من خلية مفردة. ويرد هنا، خلية يعيش التصوير بروتوكولات لتقييم القرارات مصير الخلية بعد العلاج مع باكليتاكسيل الانقسامية لمكافحة المخدرات.

Abstract

تصوير خلية يعيش هو تقنية قوية يمكن استخدامها لتصور الظواهر البيولوجية في خلايا مفردة مباشرة على مدى فترات طويلة من الزمن. على مدى العقد الماضي، والتكنولوجيات الجديدة والمبتكرة عززت إلى حد كبير الطابع العملي لتصوير خلية يعيش. الخلايا يمكن أن يوضع الآن في التركيز وتصويرها بشكل مستمر على مدى عدة أيام في حين حافظت تحت 37 °C و 5% CO2 شروط ثقافة الخلية. وعلاوة على ذلك، نظر حقول متعددة تمثل ظروف تجريبية مختلفة يمكن الحصول عليها في وقت واحد، مما يوفر البيانات التجريبية الفائق. تصوير خلية يعيش يوفر ميزة كبيرة على تصوير ثابت الخلية عن طريق السماح للتصور المباشر وكوانتيتيشن الزمني للأحداث الخلوية الحيوية. يمكن تحديد تصوير خلية يعيش أيضا التباين في السلوك الخلايا المفردة التي خلاف ذلك قد ضاعت استخدام الاختبارات المستندة إلى السكان. وهنا يصف لنا خلية يعيش التصوير بروتوكولات لتقييم القرارات مصير الخلية بعد العلاج مع باكليتاكسيل الانقسامية لمكافحة المخدرات. علينا أن نظهر أساليب لتصور ما إذا كان ميتوتيكالي اعتقل تموت الخلايا مباشرة من الانقسام أو الانزلاق مرة أخرى إلى الطور البيني. كما يصف لنا كيف يمكن استخدام نظام المؤشر (فوكسي) دورة الخلية على أساس أوبيكويتينيشن الفلورية لتقييم جزء صغير خلايا الطور البيني ولد من انزلاق الانقسامية التي قادرة على إعادة إدخال دورة الخلية. وأخيراً، يصف لنا خلية يعيش أسلوب تصوير لتحديد الأحداث تمزق المغلف النووية.

Introduction

واستخدمت منذ وقت طويل في نظم العلاج الكيميائي لأنواع مختلفة من الأورام الصلبة الانقسامية لمكافحة المخدرات وغالباً ما تظهر فعالية كبيرة1،،من23. ميتشانيستيكالي، هذه الأدوية عرقلة التقدم الانقسامية العادي وتشجيع اعتقال الانقسامية في سرعة تكاثر الخلايا السرطانية. ومع ذلك، مصير الخلية ردا على اعتقال الانقسامية اختلافاً كبيرا: بينما يخضع جزء صغير من خلايا موت الخلية مباشرة من الانقسام، آخرون الخروج من الانقسام، والعودة إلى الطور البيني كخلايا تيترابلويد (عملية انزلاق الانقسامية التي يطلق عليها)4، 5،6،،من78. يمكن تنفيذ المبرمج هذه الخلايا الطور البيني أو الخضوع لتوقيف دورة الخلية الدائمة أو حتى إعادة إدخال دورة الخلية4،5،6،،من78،9 ،،من1011. الخلايا التي تهرب موت الخلية الانقسامية بالانزلاق في الطور البيني، فقط إعادة إدخال دورة الخلية بعد إزالة المخدرات، وبالتالي قد تسهم في ظهور سرطان الخلية السكان. وعلاوة على ذلك، الخلايا أن زلة من الانقسام تيترابلويد، والمعروف تيترابلويدي لتعزيز الاستقرار الكروموسوم الذي يدفع الورم الانتكاس12،13،،من1415. ولذلك تحديد العوامل التي تتحكم في مصير الخلية استجابة للعلاج بالعقاقير المضادة الانقسامية الحاسمة لتحسين العلاجات الحالية.

في هذا البروتوكول، يصف لنا أساليب مراقبة مباشرة ودراسة مصير الخلايا التي يخضع لها اعتقال الانقسامية طويلة ردا على باكليتاكسيل الانقسامية لمكافحة المخدرات. باكليتاكسيل تأسيس العلاجية في العيادة وقد ثبت أنها فعالة جداً في العديد من أنواع الأورام، بما في ذلك تلك التي الثدي والمبيض، والرئتين16،17،،من1819، 20-باكليتاكسيل، ونبات قلويد المستمدة من لحاء شجرة الطقسوس، تستقر microtubules وهكذا يمنع على21،dynamicity22. بينما الملطف لديناميات microtubule من باكليتاكسيل لا يؤثر على تطور دورة الخلية من غ1 إلى غ2، المخدرات تؤدي إلى التنشيط المستمر للحاجز الجمعية المغزل أثناء الانقسام بإعاقة مرفق كينيتوتشوري-ميكروتوبولي (استعراض متعمق هنا23،24)25. نتيجة لذلك، يتم منع بداية طور الصعود في الخلايا المعالجة باكليتاكسيل والنتائج في حملة اعتقال الانقسامية مطول.

وسيصف هذا البروتوكول أولاً النهج لتحديد الخلايا الانقسامية في خلية يعيش تجارب التصوير. يمكن تصور الانقسام في الخلايا استزراع الأنسجة ملتصقة بسبب تغيرات بيولوجية ملحوظة الخلية اثنين. أولاً، أصبحت شديدة مكثف الكروموسومات فورا قبل انهيار المغلف النووية. في حين غالباً ما يمكن كشفها بالفحص المجهري التباين المرحلة القياسية، التكثيف كروموسوم يمكن أكثر وضوح الكشف عن استخدام الفلورية علامات تلك التسمية الكروموسومات (مثل البروتينات هستون المسمى فلوريسسينتلي). يمكن أيضا تحديد الخلايا الانقسامية، والثانية أن التغيرات المورفولوجية الهائلة التي تنجم عن التقريب الخلية.

هذا البروتوكول ثم شرح كيفية استخدام النهج التصوير خلية يعيش لتعقب مصير الخلايا التي تعاني من فترات طويلة من اعتقال الانقسامية. الخلايا التي اعتقلت في الانقسام الخضوع لواحد من ثلاثة مصائر متميزة. أولاً، يمكن أن تخضع خلايا موت الخلية أثناء الانقسام. هذه الظاهرة هي سهولة تصور بالفحص المجهري الخفيفة، كما لوحظت خلايا الموت لتقليص وبليب تمزق. وثانيا، يمكن إنهاء الخلايا من الانقسام والعودة مرة أخرى إلى الطور البيني دون العزل الصبغي أو سيتوكينيسيس، ووصف عملية انزلاق الانقسامية. ويحدد ديكوندينسيشن الكروموسومات و/أو تسطيح الخلية الانقسامية يسهل هذه العملية. عرض أيضا في كثير من الأحيان غير النظامية، مفصصة متعدد الأنوية الخلايا التي تفلت من الانقسام وكثيراً ما تأوي عدة نويات5. ثالثا، يمكن الشروع في طور الصعود الخلايا التي اعتقلت في الانقسام والمضي قدما من خلال الانقسام بعد تأخير طويل. بينما غير شائع في تركيزات أعلى من المخدرات، هذا السلوك يوحي بأن الخلايا المقبوض عليهم قد استوفت الحاجز الجمعية المغزل، أو أن نقطة التفتيش الجمعية المغزل جزئيا ضعف أو عيب. يمكن تصور بداية طور الصعود بالعزل الصبغي و cytokinesis اللاحقة باستخدام التصوير بخلية يعيش.

وسيرد أيضا خلية يعيش من أساليب التصوير لتعقب مصير الخلايا التي تهرب موت الخلية الانقسامية التي تمر انزلاق الانقسامية. الخلايا التي يخضع لها انزلاق الانقسامية أما يموت في الطور البيني اللاحقة، وتؤدي إلى اعتقال دورة الخلية1 ز دائم، أو إعادة إدخال دورة الخلية الشروع في جولة جديدة من انقسام الخلية4. وسيجري وصف نهج استخدام النظام (مؤشر دورة الخلية على أساس أوبيكويتينيشن نيون) فوكسي لتحديد جزء صغير الخلايا التي تدخل في دورة الخلية بعد انزلاق الانقسامية. يسمح للتصور مباشرة من الانتقال/ق1ز فوكسي ويمكن استخدامها بالاقتران مع طويلة الأجل العيش-الخلية أن التصوير في المختبر و في فيفو26،27. يستفيد النظام فوكسي هما البروتينات المسماة فلوريسسينتلي، مبتوراً أشكال hCdt1 (ترخيص الكروماتين وتكرار الحمض النووي عامل. 1) وهجيمينين، تذبذبت مستويات الذي يستند إلى موقف دورة الخلية. hCdt1 (تنصهر فيها بروتين فلورسنت أحمر) هو تقديم مستويات عالية خلال المرحلة1 ز فيه الأعمال للترخيص الحمض النووي للنسخ المتماثل، ولكن هو أوبيكويتيناتيد من ليجاسى ubiquitin E3 SCFSkp2 وتدهورت خلال مراحل/M2S/G لمنع إعادة تكرار الحمض النووي26. على النقيض من ذلك، هجيمينين (تنصهر فيها بروتين فلوري أخضر)، هو مثبط من hCdt1 الذين مستويات الذروة خلال S/G2/M، ولكن أوبيكويتيناتيد من ليجاسى ubiquitin E3 APCCdh1 والمتدهورة في نهاية الانقسام وفي جميع أنحاء ز1 26-وبناء على ذلك، يسلم فوكسي قراءات الأسفار مباشرة من مرحلة دورة الخلية، كما يحمل الخلايا ومضان أحمر أثناء الأسفار ز1، والأخضر خلال S/G2/M. نظام فوكسي هو خطوة هامة إلى الأمام على نهج أخرى (مثل تلطيخ بروموديوكسيوريديني) لتحديد الخلايا التكاثري، نظراً لأنها لا تتطلب تثبيت الخلية ويسمح لتصوير خلية واحدة دون الحاجة إلى إضافية الدوائية علاجات لمزامنة السكان الخلية. لو لم تناقش في هذا البروتوكول، كما تم وضع أجهزة الاستشعار يعيش خلية إضافية لتصور تقدم دورة الخلية، بما في ذلك جهاز استشعار هيليكاز ب ز128والحمض النووي ليجاسى-طلب تقديم العروض29 ومجسات30 بكدنا-التجارة والنقل بالنسبة لمرحلة ثانية، واستشعار فوكسي-4 الأخيرة، التي تكشف جميع مراحل دورة الخلية31.

وأخيراً، سيتم وصف أسلوب تصوير خلية يعيش للكشف عن تمزق المغلف النووية. وأظهرت الدراسات الأخيرة أن المغلفات النووي من الخلايا السرطانية غير مستقرة ومعرضة للانفجار، مما يسمح لمحتويات نوكليوبلاسم والسيتوبلازم التمازج. يمكن تشجيع هذه الظاهرة، ووصف تمزق النووية، أضرار الحمض النووي وتحفيز الاستجابة المناعية الفطرية32،،من3334،35،36،37، 38 , 39 , 40 , 41 , 42 , 43 , 44-حين الأسباب الكامنة وراء تمزق النووية تظل تتسم غير كامل، فمن المعروف أن التشوهات في هيكل النووية ترتبط بزيادة في حدوث تمزق النووية42. واحد أثر العلاج باكليتاكسيل المعروف هو جيل الهياكل النووية لافت للنظر غير طبيعي بعد الانقسام؛ على هذا النحو، سيتم وصف أسلوب استخدام التصوير خلية يعيش بالتحديد الكمي لتمزق النووية، بينما تستكشف أيضا إذا كان العلاج باكليتاكسيل يزيد من تواتر الأحداث تمزق النووية. يمكن الكشف عن تمزق النووية التي لوحظ تسرب بروتين فلوري النووية الموجهة إلى السيتوبلازم (مثلاً ديمر جنبا إلى جنب تكرار لطلب تقديم العروض التي تنصهر فيها إشارة تعريب نووية، تدرفب-NLS). هذا التسرب واضح مرئية بالعين، والتي تمكن كوانتيتاتيون بسيطة لإحداث تمزق.

ويتطلب هذا البروتوكول مجهر ابيفلوريسسينسي ويديفيلد مجهزة مرحلة مرمز والبرمجيات autofocusing. المرحلة المرمزة التي يسمح بدقة الحركة التلقائية لمحددة بإحداثيات س ص، بينما تحتفظ برامج ضبط تلقائي الخلايا في التركيز لمدة فترة التصوير. وبالإضافة إلى ذلك، يتطلب هذا البروتوكول معدات للحفاظ على الخلايا عند 37 درجة مئوية مع هوميديفيد 5% CO2 الغلاف الجوي. ويمكن تحقيق ذلك بواسطة إحاطة المجهر كامل ضمن درجة حرارة والجو تسيطر الضميمة، أو باستخدام أجهزة التشفير المرحلة محلياً أن يحافظ على البيئة ودرجة الحرارة. هدف المرحلة التباين المستخدمة في هذا البروتوكول فلور خطة 10 x مع فتحه عددية من 0.30. ومع ذلك، أيضا 20 X أهداف كافية لتحديد كلا الخليتين الطور البيني الانقسامية ومسطح مستدير الزوايا في المستوى البؤري واحد. إذا كان أداء المرحلة التباين التصوير (كما هو موضح في هذا الأسلوب)، الغطاء يمكن أن يكون أما من الزجاج أو البلاستيك. إذا تم استخدام مجهر التباين (DIC) التدخل التفاضلية، من الضروري استخدام غطاء زجاج لمنع ديبولاريزيشن ضوء.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

هذا البروتوكول يركز على استخدام تشروموسومالي مستقرة وغير متحولة الشبكية المصطبغة طلائي (RPE-1) الخلية خط لخلية يعيش تجارب التصوير. ومع ذلك، يمكن تكييفها هذا البروتوكول لأي خط الخلية ملتصقة ما دامت ظروف ثقافة الخلية يتم تعديلها عند الضرورة. يجب أن تلتزم جميع إجراءات السلامة المؤسسية والمبادئ التوجيهية الأخلاقية واللوائح.

1. إعداد الخلايا لتصوير خلية يعيش

  1. استخدام خلايا RPE-1 مرور طازجة المذابة وأوائل الإعراب عن البشرية هيستون H2B تنصهر فيها بروتين فلوري (مثلاً H2B-التجارة والنقل)، أو نظام فوكسي (بروتوكول مفصلة بشأن كيفية توليد خلايا فوكسي-الإعراب عن يمكن الإشارة45) لتقييم مصير الخلية الانقسامية.
    1. لقياس تردد تمزق النووية، استخدام الخلايا RPE-1 الإعراب عن H2B-التجارة والنقل وديمر جنبا إلى جنب للبروتين الفلورسنت الأحمر تنصهر فيها إشارة واحد مسلم النووي (تدرفب-NLS).
      ملاحظة: بنيات ثلاث البروتينات الفلورية الخضراء تنصهر في جنبا إلى جنب لإشارة تعريب نووية واحدة (بروتينات فلورية خضراء3-NLS) قد استخدمت أيضا لإثبات تمزق (كما هو الحال في مرجع42).
    2. الحفاظ على الخلايا في لوحات زراعة الأنسجة 10 سم في المتوسط النمو المناسبة. الخلايا RPE-1 تمسك في الفينول الحمراء خالية، تستكمل تعديل النسر المتوسطة/المغذيات "خليط" F-12 دولبيكو (DMEM:F12) مع 10% مصل بقرى الجنين (FBS) و 100 وحدة دولية/مل البنسلين والستربتوميسين 100 ميكروغرام/مل.
  2. نضح المتوسطة من الخلايا، وتغسل طبق استنبات الأنسجة مع 10 مل من درجة حرارة الغرفة عقيمة، الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) لإزالة المتوسطة المتبقية، ثم نضح برنامج تلفزيوني.
    1. إضافة 2 مل من 0.25% التربسين مع حمض الإيثيلين (يدتا) إلى الخلايا واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 3 دقائق أو حتى معظم الخلايا وقد فصل من اللوحة.
      ملاحظة: لا تبقى الخلايا في التربسين وقتاً أطول من اللازم.
  3. أضف 10 مل متوسطة كاملة لجمع الخلايا تريبسينيزيد مع 10 مل ستريبيتي مصلية والاستغناء عن في أنبوب مخروطي 15 مل.
    1. بيليه الخلايا باستخدام الطرد المركزي في 180 x ز لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  4. نضح المادة طافية، مع الحرص على عدم عرقلة بيليه، ودقة ثم ريسوسبيند بيليه في 10 مل متوسطة جديدة بلطف بيبيتينج المتوسط صعودا وهبوطاً في ستريبيتي المصلية.
  5. استخدام هيموسيتوميتير أو خلية الآلي عد آلة لعد الخلايا46.
    1. تمييع الخلايا في أنبوب مخروطية الشكل جديد لخلايا/مل 30,000 متوسطة كاملة.
    2. لوحة 30,000 RPE-1 الخلايا (حجم 1 مل) كل بئر زجاج 12-بئر القاع (سمك #1.5) التصوير طبق لتحقيق الكثافة الخلوية المطلوبة في اليوم التالي (روافد 30 – 50%).
      ملاحظة: دائماً التعامل مع اللوحة مع القفازات، ويجب الحرص على عدم لمس الزجاج-الأسفل.
  6. السماح للخلايا لتنمو في حاضنة زراعة الأنسجة 37 درجة مئوية حتى إرفاق تماما وتتسطح على لوحة التصوير زجاجية. بينما يمكنك إرفاق الخلايا في أقل من 4 ح، من المستحسن أن الخلايا لا تعامل مع المخدرات وتصويرها حتى اليوم التالي.
  7. إضافة باكليتاكسيل (حله في ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس])) إلى التركيز النهائي المطلوب في متوسطة كاملة ومزيج دقيق.
    1. إعداد متوسطة كاملة مع حجم متساوية من [دمس] وحدها لاستخدامها كعنصر تحكم.
    2. الحارة المتوسطة التي تحتوي على المخدرات أو [دمس] إلى 37 درجة مئوية قبل إضافة إلى الخلايا. سيمنع هذا التنسيق الانجراف بسبب تغيير مفاجئ في درجة حرارة.
    3. أضف 1 مل متوسطة التي تحتوي على باكليتاكسيل أو [دمس] وحدها إلى الآبار الفردية للطبق التصوير 12-جيدا.

2-إعداد المجهر لتصوير خلية يعيش

  1. تنظيف الزجاج-أسفل الطبق التصوير مع نظافة الضوئية لإزالة أي بصمات الأصابع أو الغبار التي قد تتداخل مع التصوير. استخدام منظف الضوئية كافية الرطب سطح الزجاج كامل.
  2. ضع الطبق أسفل الزجاج في مرحلة مجهر في محول طبق التصوير وإزالة الغطاء من البلاستيك من الطبق وتغطي الطبق مع دائرة وتصدرت الزجاج. تكفل الدائرة صمام للسماح بتدفق مستمر للهواء تتكون من 5% CO2.
    ملاحظة: يرطب CO 5%2، يتم تدفق الغاز عبر الأنابيب إدراج إسكان حمام الماء معقم. وهذا يسمح للغاز تصبح اكويليبراتيد لرطوبة 95%.
  3. بدء/معايرة مرحلة المشفرة باستخدام برنامج التحكم بالمجهر. وهذا ضمان دقة إحداثيات س ص ومنع الانجراف المحورية.
  4. التركيز على الخلايا باستخدام البصريات المرحلة-التباين وتؤدي الإضاءة كولر (وصف بالتفصيل في المرجع47) تركيز الضوء، وتوفر على النقيض الأمثل.
  5. استخدام اقتناء البرمجيات لتحديد أوقات الأمثل التعرض للضوء الأبيض وجميع القنوات الفلورسنت المستخدمة (التعرض أن تعطي 75% التشبع بكسل في الكاميرا مثالية، شريطة هذا المبلغ للضوء غير سامة للخلايا).
    1. استخدم اقتناء البرمجيات لتحديد عدة، غير متداخلة في عرض للحقول من كل بئر للتصوير. تحديد مناطق التصوير حيث انضمت أيضا إلى الزجاج-الأسفل الخلايا وما بين 50% و 70% روافد. تجنب مناطق الخلايا تحبب خفيف، كهذا من شأنه أن يجعل التحليل اللاحق الصعب.
      ملاحظة: من المهم أن يكون عرض للحقول غير متداخلة من كل بئر لتجنب تتبع نفس الخلايا مرتين. إذا كانت الخلايا متحركة عالية، قد يكون ضروريا للحصول على عدة صور يشع خارجاً من نقطة مركزية والإبرة مرة أخرى معا لجعل مجال الرؤية كبيرة واحدة.
  6. تنشيط ميزة autofocusing في المجهر ضمان الحفاظ على جميع النقاط في التركيز طوال فترة التجربة.
  7. لتقييم مصير الخلية الانقسامية، قم بتعيين برامج التصوير جمع الصور من كل مجال الرؤية المحددة كل 10 دقيقة ليصل إلى 96 حاء مجهوداتهم يستمر الانقسام 20 – 40 دقيقة، وهكذا فترات 10 دقيقة سوف توفر ما يكفي أخذ العينات لتحديد عند انقسام الخلايا. تحديد تمزق النووية، وحدث عابر، الحصول على صور كل 5 دقائق.
    ملاحظة: تأكد من أن الكمبيوتر يقود البرنامج اقتناء الصورة لديه التحديث التلقائي وعلى الشاشة، وتحقيق وفورات في الطاقة أوضاع المعوقين، كهذه يمكن أن تتداخل غالباً مع الحصول على الصور عبر تجارب طويلة.
  8. الشروع في تجربة التصوير. دوري تأكد من تشغيل الحصول على الصور بشكل سلس على مدى الفيديو.

3-فيديو التحليل لتحديد مصير الخلية ردا على باكليتاكسيل

  1. تأكد من أن الخلايا المصورة صحية طوال فترة التجربة التصوير. مراقبة الخلايا تعامل مع [دمس] ينبغي أن تكون قابلة للحياة وتكاثر بنشاط.
    ملاحظة: إذا كان يحمل الخلايا علامات الإجهاد، لا كوانتيتاتي الفيديو والتركيز بدلاً من ذلك على تحسين ظروف التصوير48. وتشمل علامات الإجهاد التصوير بلبينغ/موت الخلايا والخلايا التي أخفقت في إرفاق/انتشار على اللوحة والخلايا التي تظهر انخفاض مؤشر الانقسامية و/أو فترات طويلة من الانقسام. وتشمل المصادر المحتملة للإجهاد التقلبات في درجات الحرارة أو CO2 المستويات داخل الدائرة أو الضيائية التصوير48.
  2. عند التصوير أكمله مجال الرؤية مع 10 X أو 20 X الهدف، قد تتواجد مئات خلايا الفردية. ولذلك، للمساعدة في كوانتيتاتيون، تقسيم مجال الرؤية إلى أجزاء أصغر باستخدام أدوات البرمجيات المتاحة. نقاط الخلايا ضمن رباعي، كل على حدة (كما هو موضح في الخطوات 3.3.1–3.6.2).
  3. عند تحليل الفيديو، تتبع كل خلية في طريقة عرض مدمجة باستخدام التباين المرحلة و/أو الصور الفلورسنت. استخدام أدوات تحليل البرمجيات لإنشاء طريقة عرض مدمجة.
    1. اعتبارا من بداية الفيديو، تحديد خلية مفردة الطور البيني وتتبع التقدم المحرز خلال دورة الخلية استخدام البصريات المرحلة. لتعقب خلية مفردة، مراقبة الخلية من إطار إلى إطار بالعين المجردة. تحديد خلايا الطور البيني بسبب بهم مورفولوجيا الأرض (المقررة قبل مرحلة التباين) وافتقارها إلى التكثيف الحمض النووي (حسب تقييم H2B-التجارة والنقل) (الشكل 1A).
  4. تحديد الخلايا التي أدخل الانقسام بالملاحظة الخلية التقريب (باستخدام التباين المرحلة البصريات) و/أو التكثيف كروموسوم (باستخدام H2B-التجارة والنقل) (الشكل 1A-ج). هي سهولة تصور كلا التكثيف التقريب وكروموسوم الخلية بالعين المجردة.
    1. إضافة تعليق توضيحي الوقت عندما يدخل الخلية الانقسام. مواصلة تتبع الخلية حتى تصل إلى مصيره (طور الصعود كما في الخطوة 3، 5 أو موت الخلية من الانقسام كما هو الحال في الخطوة 3.6.1 أو انزلاق الانقسامية كما في الخطوة 3.6.2).
  5. ينبغي مراقبة الخلايا كفاءة محاذاة الكروموسومات وأدخل طور الصعود ضمن ح 1 (الشكل 1). تصور طور الصعود من بصريات التباين مرحلة الخلية يبدأ قرصه إلى قسمين، أو من خلال التصور من الكروموزومات تتحرك الأدفأ المسمى بواسطة H2B-التجارة والنقل (الشكل 1A). إضافة تعليق توضيحي الوقت عندما يخضع الخلية طور الصعود.
  6. على النقيض من ذلك، سوف تظل الخلايا تعامل مع باكليتاكسيل مدورة بالكروموسومات مكثف لعدة ساعات (3-40 ح) (الشكل 1B--د).
    1. تحديد خلايا القبض على ميتوتيكالي أن الخضوع لموت الخلايا.
      ملاحظة: الخلايا التي تموت أثناء الانقسام هي تصور بالمقابل مرحلة الفحص المجهري، وكذلك خلايا بليب، يتقلص، و/أو تمزق (الشكل 1B). إذا كان التصوير H2B-التجارة والنقل، وسيتم أيضا تفتيت الكروموزومات أثناء موت الخلية.
    2. تحديد خلايا القبض على ميتوتيكالي التي يخضع لها انزلاق الخلية.
      ملاحظة: الخلايا التي يخضع لها انزلاق الانقسامية يتم مراقبتها من قبل الفحص المجهري المرحلة-على النقيض، أنها تتسطح العودة بها إلى الطور البيني وديكوندينسي الكروموسومات دون تمر بطور الصعود (الشكل 1). الخلايا التي يخضع لها انزلاق الانقسامية أن تؤدي إلى خلايا تيترابلويد الكبيرة التي هي غالباً ما مولتينوكليتيد (الشكل 1).
  7. مواصلة تتبع الخلايا من مجال الرؤية الأصلية. حالما يتم تعقب كل مجال رؤية، الانتقال إلى مجال رؤية منفصلة المكتسبة من نفسه جيدا ومواصلة تعقب الخلايا.

4-فيديو التحليل لتحديد مصير الخلية بعد انزلاق الانقسامية

  1. تقييم مصير الخلية بعد انزلاق الانقسامية (كما هو موضح في الخطوة 3.6.2) باستخدام خلايا RPE-1 الإعراب عن النظام فوكسي. بالإضافة إلى تصوير المرحلة-على النقيض، من الضروري الحصول على ومضان أحمر (الإرشادية للمرحلة1 ز) والصور الفلورية الخضراء (يدل على S/G2/M)).
    1. تعقب الخلايا RPE فوكسي-1 كما هو موضح في الخطوة 3، 3 من خلال 3.7.
      1. للتأكد من أن النظام فوكسي يعمل بشكل صحيح، والتحقق من صحة عنصر التحكم هذا الخلايا تعبير بديل من البروتينات الفلورية الحمراء والخضراء على نحو مناسب من تحليل البيانات خلية يعيش التصوير. خلايا المراقبة ينبغي الانتقال من العارضة ومضان أحمر النووية تماما لنستعرض الفلورية الخضراء النووية تماما خلال الطور البيني كما تقدم الخلايا من ز1 إلى مرحلة ثانية. ينبغي أن تستمر الخلايا العارضة الفلورية الخضراء في جميع أنحاء انتهاء الانقسام. فور انتهاء الانقسام، ينبغي مرة أخرى يحمل الخلايا ومضان أحمر تماما خلال الطور البيني.
        ملاحظة: بينما توجد أساليب لقياس كثافة الأسفار طلبات تقديم العروض والتجارة والنقل من نظام فوكسي في الخلايا المفردة باستخدام آثار الفلورسنت49، هذا ليس غالباً ضروريا كما تغيير اللون fluorescence قوية ومرئية بالعين المجردة.
  2. تحديد الخلايا التي اعتقلت في الانقسام باستخدام مجهر تباين المرحلة وتعقبهم حتى أنها تمر بانزلاق الانقسامية، كما هو موضح في 3.4 و 3.6.2. الخلايا التي سيتم تغيير قسيمة الخروج من الانقسام، والعودة إلى الطور البيني من العارضة الفلورية الخضراء خلال الانقسام إلى الأسفار الأحمر المرحلة1 ز (الشكل 2 أ-ج).
    1. تتبع هذه تراجع الخلايا باستخدام التصوير ابيفلوريسسينت والمرحلة-على النقيض من العين لتقييم مصيرهم الخلية (الشكل 2D).
      1. تحديد الخلايا التي تدخل في دورة الخلية. يتم تعريف هذه الخلايا بواسطة تغيير الأحمر إلى الأخضر في الأسفار التعبير باستخدام نظام فوكسي التي تشير إلى انتقال/ق1ز (الشكل 2A).
      2. تحديد الخلايا التي يخضع لها ز1 دورة الخلية اعتقال. يتم تعريف هذه الخلايا بالتعبير عن الأسفار الحمراء التي استمرت > ح 24 (الشكل 2).
      3. تحديد الخلايا التي تموت في الطور البيني. يتم تعريف هذه الخلايا بواسطة الخلية تمزق/بلبينغ/تقلص استخدام تصوير المرحلة-التباين (الشكل 2).

5-فيديو التحليل لتحديد تواتر تمزق المغلف النووية

  1. استخدام خلايا RPE-1 الإعراب عن H2B-التجارة والنقل و NLS تدرفب لتقييم تمزق المغلف النووية. بالإضافة إلى تصوير المرحلة-على النقيض، اكتساب ومضان أحمر (تريتك) والصور الفلورية الخضراء (فيتك). الحصول على الصور كل 5 دقائق لتصور تمزق.
    ملاحظة: من المهم لإنشاء خطوط الخلايا التي تدرفب-NLS هو كفاءة المستوردة إلى النواة مع الحد الأدنى من الأسفار هيولى.
  2. صورة الخلايا كما هو موضح في الخطوة 3، 3 من خلال 3.4. ينبغي أن يشترك تعريب NLS تدرفب fluorescence إشارة و H2B-التجارة والنقل أثناء الطور البيني. عند الانقسام (كتصور بخلية التقريب باستخدام التكثيف البصريات و/أو كروموسوم المرحلة قبل H2B-التجارة والنقل)، المغلف النووية سوف تنهار وسوف تصبح إشارة تدرفب-NLS هيولى (الشكل 3A). في أعقاب الانقسام، سيتم إصلاح المغلف النووي في الخلايا ابنه وسوف تصبح إشارة NLS تدرفب النووية.
  3. تعقب الخلايا ابنه طوال الطور البيني اللاحقة بتصوير خلية يعيش. تحديد الأحداث تمزق النووية عن طريق مراقبة انفجار عابر ل NLS تدرفب النووية مترجمة إلى السيتوبلازم المحيطة بها. في غضون دقائق، سيتم إصلاحه المغلف النووية وسوف ريلوكاليزيد تدرفب-NLS بالنواة (الشكل 3A).
    ملاحظة: في كثير من الأحيان، الحمض النووي، تصور قبل H2B-التجارة والنقل، سوف أن ينظر إليه نتا خارج الموقع تمزق بليب صغيرة.
  4. نقاط كسر الأنوية التي يخضع لها حدثاً تمزق أثناء الطور البيني. نقاط هذا الكسر، وحساب عدد الخلايا التي يخضع لها حدثاً تمزق على العدد الكلي للخلايا تعقبها.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

استخدام البروتوكول، المذكورة أعلاه، تعامل مع عنصر تحكم لمكافحة الانقسامية أو مركبة ([دمس]) خلايا RPE-1 الإعراب عن H2B-التجارة والنقل وتحليلها بواسطة التصوير خلية يعيش. وكشف التحليل أن 100% من عنصر التحكم الانقسامية RPE-1 الخلايا بدأ طور الصعود في متوسط 22 دقيقة بعد دخول الانقسام (الشكل 1A، 1 د). وفي المقابل، أظهرت RPE-1 الخلايا تعامل مع باكليتاكسيل حملة اعتقال الانقسامية عميقة استمرت عدة ساعات (الشكل 1). تصوير كشف عن أن 48% من هذه الخلايا المقبوض عليهم ميتوتيكالي خضع لموت الخلية الانقسامية (الشكل 1B، 1E)، بينما تبقى نسبة 52% وخضع انزلاق الانقسامية (الشكل 1، 1E).

لتقييم مصير الخلايا RPE-1 التي خضعت لانزلاق الانقسامية، تعامل الخلايا RPE-1 الإعراب عن النظام فوكسي مع أما الجرعات المنخفضة 50 نانومتر باكليتاكسيل، جرعة عالية 5 ميكرومتر باكليتاكسيل، أو مركبة التحكم ([دمس]) وتحليلها بواسطة التصوير خلية يعيش طويل الأجل. وكشفت البيانات أن 22% من الخلايا RPE-1 التي خضعت لانزلاق الانقسامية بعد العلاج مع 50 نانومتر باكليتاكسيل، توفي في دورة الخلية اللاحقة (الشكل 2، 2D)، 72% الناجم عن توقيف دورة الخلية (الشكل 2B، 2D)، و إعادة إدخالها فقط 5% S-المرحلة (الشكل 2A، 2D). على النقيض من ذلك، RPE-1 الخلايا تعامل مع جرعة عالية 5 ميكرومتر باكليتاكسيل التي شهدت عثرات الانقسامية، 35% وتوفي في دورة الخلية اللاحقة، 65% الناجم عن اعتقال خلية دورة، وبلا إعادة دخلت المرحلة S (الشكل 2D).

من المثير للاهتمام، تشجع جرعة منخفضة باكليتاكسيل-علاج تمزق المغلف النووية في RPE-1 الخلايا بعد الانقسام. بعد إكمال الانقسامية تعقب الخلايا الوليدة وسجل لأي أحداث تمزق النووي، كشف عن أن ~ 4% فقط من التحكم في الخلايا الوليدة (يعامل [دمس]) RPE-1 تمزق، بينما أظهرت ~ 23% خلايا تعامل مع 10 نانومتر باكليتاكسيل تمزق ( الشكل 3A، 3B).

Figure 1
رقم 1: مصير الخلية الانقسامية في الاستجابة للعلاج المضادة الانقسامية. تعامل مع [دمس] مراقبة المركبات (A) أو 5 ميكرومتر باكليتاكسيل (ب، ج) RPE-1 الخلايا ستابلي معربا عن H2B-التجارة والنقل وتصويرها باستخدام الوقت الفاصل بين مرحلة التباين والفحص المجهري ابيفلوريسسينسي ويديفيلد لتقييم مصير الخلية الانقسامية. تم تعقب خلايا الطور البيني (لوحات الأيسر) كما أنها دخلت الانقسام (لوحات الأوسط) وحتى أنها بدأت طور الصعود (A)، خضع لموت الخلية الانقسامية (ب)، أو انزلق من الانقسام إلى الطور البيني (ج). تشير الأسهم البيضاء إلى خلايا تم تعقبها. (د) مقدار الوقت التي تتحكم الخلايا (يعامل [دمس]) وقضى مكافحة ميتوتيك تعامل الخلايا في الانقسام، كما كوانتيتاتيد بتصوير خلية يعيش (n = 100 خلية لكل حالة). (ﻫ) جزء صغير خلايا (n = 100) التي خضعت لطور الصعود، وموت الخلية الانقسامية، أو انزلاق الانقسامية في [دمس] تعامل الخلايا أو الخلايا تعامل مع 5 ميكرومتر باكليتاكسيل. H:min. الوقت، شريط المقياس = 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: مصير الخلايا التي يخضع لها انزلاق الانقسامية. RPE-1 الخلايا ستابلي معربا عن النظام فوكسي تعامل مع 50 نانومتر باكليتاكسيل أو 5 ميكرومتر باكليتاكسيل وتصويرها استخدام الوقت الفاصل بين مرحلة التباين ومجهر الأسفار ويديفيلد إلى كوانتيتاتي مصير الخلية بعد انزلاق الانقسامية. كانت الخلايا وسجل أما إعادة إدخال دورة الخلية، كما يحكم بتغيير fluorescence الأحمر إلى الأخضر في النظام فوكسي (A)؛ إلقاء القبض في المرحلة1 ز، كما يحكم بالأسفار الحمراء المستمرة > ح 24 (ب)؛ أو يموتون أثناء الانقسام اللاحقة، كما يحكم بالهاتف الخلوي بلبينغ/تمزق (ج). تشير الأسهم البيضاء إلى خلايا تم تعقبها. (د) جزء صغير خلايا (n = 100) التي خضعت لكل مصير. أشرطة الخطأ تمثل الانحراف المعياري من الوسط من تجربتين مستقلة. H:min. الوقت، شريط المقياس = 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: الترددات تمزق المغلف النووي في الخلايا المعالجة باكليتاكسيل. تعامل الخلايا RPE-1 ستابلي معربا عن تدرفب-NLS و H2B-التجارة والنقل مع 10 نانومتر باكليتاكسيل أو مركبة التحكم ([دمس]) وتصويرها باستخدام الوقت الفاصل بين مرحلة التباين والفحص المجهري ابيفلوريسسينسي ويديفيلد (A). أثناء الانقسام (الطورية/طور الصعود) موزعة المغلف النووي ويصبح تدرفب-NLS هيولى. وفي أعقاب الانقسام، ريلوكاليزيس تدرفب-NLS إلى نواة لخلايا الطور البيني (قبل تمزق). يتم تعريف الأحداث النووية تمزق بالتوطن من تدرفب-NLS من النواة إلى السيتوبلازم في الخلايا الطور البيني (تمزق)، تليها ريلوكاليزيشن من تدرفب-NLS بنواة بعد إصلاح المغلف النووية (بعد تمزق). تشير الأسهم البيضاء إلى خلايا تم تعقبها. (ب) جزء صغير خلايا (ن > 100 كل حالة) التي تظهر تمزق المغلف النووية عقب الانقسام حضور مراقبة باكليتاكسيل أو مركبة. H:min. الوقت، شريط المقياس = 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الجانب الأكثر أهمية لتصوير خلية يعيش طويل الأجل هو ضمان صحة الخلايا يجري تصويرها. فمن الضروري أن الخلايا تتعرض لعوامل الإجهاد البيئي دخيلة الحد الأدنى، مثل ظروف دون المستوى المطلوب فيما يتعلق بدرجة الحرارة والرطوبة، و/أو مستويات2 CO. من المهم أيضا أن تحد د من إضاءة الفلورسنت الإثارة، كالتصوير الإجهاد ومن المعروف أن تؤثر على سلوك الخلية50. ويمكن تحقيق الحد د بطرق متعددة كما مفصلة في مكان آخر من48. وبصفة عامة، فمن الأفضل استخدام أقصر وقت التعرض اللازمة لإنتاج إشارة fluorescence مشرق بما فيه الكفاية بما يكفي لتتبع كفاءة الخلايا، مما يحد من الضيائية. ومع ذلك، إذا يتم تصويرها الخلايا فقط مرة واحدة كل 10-20 دقيقة، يعد التعرض (أن نهج التشبع بكسل) وعادة ما تكون أيضا التسامح (على الرغم من أن هذا يجب أن تحدد تجريبيا لكل نوع من أنواع فلوروفوري والخلية). لأن الخلايا المصورة تكون حساسة للضغوط البيئية والتصوير على حد سواء، من المحتم أن الخلايا التحكم دائماً ترد في خلية يعيش تجارب التصوير ورصد لتأكيد الانتشار العادي.

حد واحد لتصوير خلية يعيش طويل الأجل هو أنه يتطلب تجهيز مجهر موجود مع دائرة للبيئة التي تحافظ على درجة الحرارة ونسبة 5% هوميديفيد CO2 الغلاف الجوي، أو دائرة المرحلة الأعلى التي أيضا قادرة على الداعمة لدرجة الحرارة المناسبة والغلاف الجوي. بينما تتدفق CO2 الأمثل، يمكن أيضا تصويرها الخلايا لتصل إلى 48 ساعة باستخدام CO2-المتوسطة مستقلة إذا كانت دائرة للبيئة مع 5% هوميديفيد CO2 غير متوفر. ومع ذلك، العديد من أنواع الخلايا التعصب هذه المتوسطة، وهذا يجب أن تتقرر تجريبيا بقياس نمو الخلايا وقدرتها على البقاء. يمكن أيضا استخدام تتراكب الخلايا مع الزيوت المعدنية لمنع تبخر المتوسطة.

حد رئيسية ثانية إلى هذا الأسلوب أن يدوياً تتبع مصائر خلية شاقة للغاية والوقت كثيفة. ومع ذلك، برامج تتبع الخلية المتوفرة وقد يكون الأمثل لأتمتة صورة التحليل51،،من5253. حد آخر مع هذا الأسلوب أن خلايا متحركة عالية غالباً ما تكون صعبة لتعقب على مدى فترات طويلة من الزمن. إذا كان هذا يشكل مشكلة كبيرة، يمكن تصويرها أكمله جيدا والصور مخيط معا لتشكيل واحد مجال الرؤية الكبيرة. العديد من برامج دعم هذا الأسلوب.

أوتوفلوريسسينسي هو عائق آخر يجب التصدي لها مع هذا البروتوكول. يقلل الفينول الحمراء المتوسطة الحرة أوتوفلوريسسينسي الخلفية أثناء تصوير الخلايا الحية. وقد ثبت أيضا أن اثنين من الفيتامينات التي توجد عادة في متوسط النمو وفيتامين بي وبيريدكسال، يمكن إنقاص فوتوستابيليتي بروتينات الفلورية. وهكذا، يمكن أيضا استخدام المتوسطة التي تفتقر إلى هذه الفيتامينات أثناء التصوير الأسفار لتعزيز الإشارات إلى الضجيج حصص الإعاشة. بينما الأطباق أسفل البلاستيك هي أقل تكلفة، وقد توفر نتائج التصوير كافية، كما أنها تنتج كمية أكبر من أوتوفلوريسسينسي التي تؤثر تأثيراً سلبيا على نسبة إشارة إلى الضجيج. وبالإضافة إلى ذلك، قد الأطباق البلاستيك أسفل تباين أكبر في السمك، مما يمكن أن يؤدي إلى تعطيل ميزة ضبط تلقائي للعديد من المجاهر. سمك الزجاج الطبق التصوير أدنى في هذا البروتوكول هو 0.17 ملم، وهو الزجاج مثالية للاستخدام مع المجاهر الحديثة.

وأخيراً، أفلام طويلة الأجل تشمل مجالات متعددة لعرض والحصول على العديد من القنوات الأسفار تنتج ملفات البيانات الضخمة (عشرات غيغابايت حتى تيرا بايت كل)، التي تشكل مشكلة بالنسبة لتخزين البيانات والنسخ الاحتياطي. للتخفيف من حدة هذه المشكلة، من المستحسن أن يكون الحصول على جميع الصور باستخدام 2 × 2 أو 4 × 4 binning، قدم الخسارة الناتجة في القرار مقبول. Binning يحد التعرض مرات (أي الخلايا ستابلي معربا عن H2B-التجارة والنقل أو نظام فوكسي يجب أن يكون التعرض أقل من 500 مللي) ليس فقط، ولكن أيضا كبير يقلل من حجم ملفات البيانات (صورة هو إهمال 2 × 2 هو ربع حجم الملف من صورة عدم إهمال).

وعلى الرغم من هذه القيود، يمثل طويلة الأجل خلية يعيش تصوير أفضل طريقة لتعقب مصير الخلية الفردية من شعوب بأكملها، خاصة عندما تكون الخلية مصائر متغايرة جداً. كما أصبحت أكثر علامات خلية يعيش الفلورسنت وأجهزة الاستشعار المتاحة، خلية يعيش سيوسع التصوير النهج لتصور وكوانتيتاتي عدة جوانب إضافية لبيولوجيا الخلايا. على سبيل المثال، أجهزة الاستشعار يعيش خلية موجودة حاليا كوانتيتاتي البؤر ضرر الحمض النووي، ومستويات p53، موقف دورة الخلية، والمبرمج26،54،،من5556،،من5758 . وهكذا، تجارب التصوير لديها القدرة على الكشف عن الخصائص الخلوية الكامنة التي تملي كيف ولماذا تستجيب خلايا مفردة مغايرة لوكلاء العلاج الكيميائي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

AFB و MAV ونجج يود أن يشكر كوينتون ريان للتعليق على المخطوط وأدريان سالك لبناء تدرفب-NLS. AFB و MAV ممولة من 5T32GM008541 "منحة التدريب الصيدلة الجزيئية البيولوجية نيجمس". نجج عضو شميم و "مختبرات أبحاث سرطان الثدي داهود أشرف" ومعتمد من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح GM117150 وكاليفورنيا 154531 ومؤسسة جرونيباوم كارين وبرنامج جوائز الأسرة سميث، البرنامج علماء سيرل وأبحاث سرطان الجلد تحالف.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
phenol red-free, DMEM:F12 media Hyclone SH3027202
10% fetal bovine serum (FBS) Gibco 10438026
100 IU/ml penicillin, and 100 mg/ml streptomycin. Gibco 15070063
PBS Gibco 10010049
0.25% Trypsin/EDTA Gemini 50-753-3104
12-well glass bottomed imaging dish Cellvis P12-1.5H-N
Paclitaxel TSZ Chem RS036
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma NC0215085
Environmental Chamber In Vivo Scientific
5% CO2 Airgas Z03NI7432000201
15 mL Conical Tubes Fisherbrand 05-539-12
10 cm polystyrene tissue culture plates Falcon 08772E
10 mL Disposable Serological Pipette Fisherbrand 4488
5804R 15 amp Centrifuge Eppendorf 97007-370
1000 microliters Pipette Gilson Pipetman Classic
20 microliters Pipette Gilson Pipetman Classic
p1000 Pipette Tips Sharp p1126
p20 Pipette Tips Sharp P1121
RPE-1 Cells ATCC CRL-4000
Incubator Galaxy 170S Eppendorf CO17011005
Pipette Boy Integra 156401
Hemacytometer Fisher Scientific 0267110
Nikon Ti-E-PFS Inverted Microscope for Live Cell Imaging Micro Video Instruments, Inc. MEA53100
Prior X-Y Stage System and White Light LED Illuminator Micro Video Instruments, Inc. 500-H117P1N4
Prior Proscan 3 Controller XYZ with Encoders Micro Video Instruments, Inc. 500-H31XYZE
Andor Digital Camera Micro Video Instruments, Inc. D10NLC
Nikon NIS Elements AR Software Micro Video Instruments, Inc. MQS31000
SOLA LED Illuminator for Fluorescence Micro Video Instruments, Inc. SOLA-E
InVivo Environmental Chamber with CO2 Flow Control Micro Video Instruments, Inc. Ti-IVS-100
Ti-ND6-PFS Perfect Focus Motorized Nosepiece Micro Video Instruments, Inc. MEP59391
Ti-C System Condenser Turret Micro Video Instruments, Inc. MEL51000
Ti-C LWD LWD Lens Unit for System Condenser Turret Micro Video Instruments, Inc. MEL56200
Te-C LWD Ph1 Module Micro Video Instruments, Inc. MEH41100
CFI Plan Fluor DLL 10X Objectivena 0.3 wd 16mm Micro Video Instruments, Inc. MRH10101
CFI Super Plan Fluor ELWD 20xc ADM Objective Micro Video Instruments, Inc. MRH48230

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. van Vuuren, R. J., Visagie, M. H., Theron, A. E., Joubert, A. M. Antimitotic drugs in the treatment of cancer. Cancer Chemother Pharmacol. 76 (6), 1101-1112 (2015).
  2. Chan, K. S., Koh, C. G., Li, H. Y. Mitosis-targeted anti-cancer therapies: where they stand. Cell Death Dis. 3, e411 (2012).
  3. Jackson, J. R., Patrick, D. R., Dar, M. M., Huang, P. S. Targeted anti-mitotic therapies: can we improve on tubulin agents? Nat Rev Cancer. 7 (2), 107-117 (2007).
  4. Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. How do anti-mitotic drugs kill cancer cells? J Cell Sci. 122 (Pt 15), 2579-2585 (2009).
  5. Rieder, C. L., Maiato, H. Stuck in division or passing through: what happens when cells cannot satisfy the spindle assembly checkpoint. Dev Cell. 7 (5), 637-651 (2004).
  6. Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. Cancer cells display profound intra- and interline variation following prolonged exposure to antimitotic drugs. Cancer Cell. 14 (2), 111-122 (2008).
  7. Huang, H. C., Mitchison, T. J., Shi, J. Stochastic competition between mechanistically independent slippage and death pathways determines cell fate during mitotic arrest. PLoS One. 5 (12), e15724 (2010).
  8. Shi, J., Orth, J. D., Mitchison, T. Cell type variation in responses to antimitotic drugs that target microtubules and kinesin-5. Cancer Res. 68 (9), 3269-3276 (2008).
  9. Ganem, N. J., Pellman, D. Limiting the proliferation of polyploid cells. Cell. 131 (3), 437-440 (2007).
  10. Ganem, N. J., Storchova, Z., Pellman, D. Tetraploidy, aneuploidy and cancer. Curr Opin Genet Dev. 17 (2), 157-162 (2007).
  11. Ganem, N. J., Pellman, D. Linking abnormal mitosis to the acquisition of DNA damage. J Cell Biol. 199 (6), 871-881 (2012).
  12. Sotillo, R., Schvartzman, J. M., Socci, N. D., Benezra, R. Mad2-induced chromosome instability leads to lung tumour relapse after oncogene withdrawal. Nature. 464 (7287), 436-440 (2010).
  13. Sotillo, R., et al. Mad2 overexpression promotes aneuploidy and tumorigenesis in mice. Cancer Cell. 11 (1), 9-23 (2007).
  14. Ganem, N. J., Godinho, S. A., Pellman, D. A mechanism linking extra centrosomes to chromosomal instability. Nature. 460 (7252), 278-282 (2009).
  15. Silkworth, W. T., Nardi, I. K., Scholl, L. M., Cimini, D. Multipolar spindle pole coalescence is a major source of kinetochore mis-attachment and chromosome mis-segregation in cancer cells. PLoS One. 4 (8), e6564 (2009).
  16. McGuire, W. P., et al. Cyclophosphamide and Cisplatin Compared with Paclitaxel and Cisplatin in Patients with Stage III and Stage IV Ovarian Cancer. New England Journal of Medicine. 334 (1), 1-6 (1996).
  17. McGuire, W. P., et al. Taxol: a unique antineoplastic agent with significant activity in advanced ovarian epithelial neoplasms. Ann Intern Med. 111 (4), 273-279 (1989).
  18. Ettinger, D. S. Taxol in the treatment of lung cancer. J Natl Cancer Inst Monogr. (15), 177-179 (1993).
  19. Weaver, B. A. How Taxol/paclitaxel kills cancer cells. Mol Biol Cell. 25 (18), 2677-2681 (2014).
  20. Jordan, M. A., Wilson, L. Microtubules as a target for anticancer drugs. Nat Rev Cancer. 4 (4), 253-265 (2004).
  21. Wall, M. E., Wani, M. C. Camptothecin and Taxol: Discovery to Clinic-Thirteenth Bruce F. Cain Memorial Award Lecture. Cancer Research. 55 (4), 753-760 (1995).
  22. Schiff, P. B., Horwitz, S. B. Taxol stabilizes microtubules in mouse fibroblast cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (3), 1561-1565 (1980).
  23. Lara-Gonzalez, P., Westhorpe, F. G., Taylor, S. S. The spindle assembly checkpoint. Curr Biol. 22 (22), R966-R980 (2012).
  24. Musacchio, A. The Molecular Biology of Spindle Assembly Checkpoint Signaling Dynamics. Curr Biol. 25 (20), R1002-R1018 (2015).
  25. Uetake, Y., et al. Cell cycle progression and de novo centriole assembly after centrosomal removal in untransformed human cells. J Cell Biol. 176 (2), 173-182 (2007).
  26. Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132 (3), 487-498 (2008).
  27. Chittajallu, D. R., et al. In vivo cell-cycle profiling in xenograft tumors by quantitative intravital microscopy. Nat Methods. 12 (6), 577-585 (2015).
  28. Gu, J., et al. Cell cycle-dependent regulation of a human DNA helicase that localizes in DNA damage foci. Mol Biol Cell. 15 (7), 3320-3332 (2004).
  29. Easwaran, H. P., Leonhardt, H., Cardoso, M. C. Cell cycle markers for live cell analyses. Cell Cycle. 4 (3), 453-455 (2005).
  30. Hahn, A. T., Jones, J. T., Meyer, T. Quantitative analysis of cell cycle phase durations and PC12 differentiation using fluorescent biosensors. Cell Cycle. 8 (7), 1044-1052 (2009).
  31. Bajar, B. T., et al. Fluorescent indicators for simultaneous reporting of all four cell cycle phases. Nat Methods. 13 (12), 993-996 (2016).
  32. Gekara, N. O. DNA damage-induced immune response: Micronuclei provide key platform. J Cell Biol. 216 (10), 2999-3001 (2017).
  33. Chow, K. H., Factor, R. E., Ullman, K. S. The nuclear envelope environment and its cancer connections. Nat Rev Cancer. 12 (3), 196-209 (2012).
  34. Crasta, K., et al. DNA breaks and chromosome pulverization from errors in mitosis. Nature. 482 (7383), 53-58 (2012).
  35. Hatch, E. M., Fischer, A. H., Deerinck, T. J., Hetzer, M. W. Catastrophic nuclear envelope collapse in cancer cell micronuclei. Cell. 154 (1), 47-60 (2013).
  36. Maciejowski, J., Li, Y., Bosco, N., Campbell, P. J., de Lange, T. Chromothripsis and Kataegis Induced by Telomere Crisis. Cell. 163 (7), 1641-1654 (2015).
  37. Zhang, C. Z., et al. Chromothripsis from DNA damage in micronuclei. Nature. 522 (7555), 179-184 (2015).
  38. Denais, C. M., et al. Nuclear envelope rupture and repair during cancer cell migration. Science. 352 (6283), 353-358 (2016).
  39. Raab, M., et al. ESCRT III repairs nuclear envelope ruptures during cell migration to limit DNA damage and cell death. Science. 352 (6283), 359-362 (2016).
  40. Bernhard, W., Granboulan, N. THE FINE STRUCTURE OF THE CANCER CELL NUCLEUS. Exp Cell Res. 24 (Suppl 9), 19-53 (1963).
  41. de Noronha, C. M., et al. Dynamic disruptions in nuclear envelope architecture and integrity induced by HIV-1 Vpr. Science. 294 (5544), 1105-1108 (2001).
  42. Vargas, J. D., Hatch, E. M., Anderson, D. J., Hetzer, M. W. Transient nuclear envelope rupturing during interphase in human cancer cells. Nucleus. 3 (1), 88-100 (2012).
  43. Sieprath, T., Darwiche, R., De Vos, W. H. Lamins as mediators of oxidative stress. Biochem Biophys Res Commun. 421 (4), 635-639 (2012).
  44. Mitchison, T. J., Pineda, J., Shi, J., Florian, S. Is inflammatory micronucleation the key to a successful anti-mitotic cancer drug? Open Biol. 7 (11), (2017).
  45. Shenk, E. M., Ganem, N. J. Generation and Purification of Tetraploid Cells. Methods Mol Biol. 1413, 393-401 (2016).
  46. Morten, B. C., Scott, R. J., Avery-Kiejda, K. A. Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell Lines. J Vis Exp. (115), (2016).
  47. Salmon, E. D., Canman, J. C. Proper alignment and adjustment of the light microscope. Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 4 Unit 4 1 (2001).
  48. Cole, R. Live-cell imaging. Cell Adh Migr. 8 (5), 452-459 (2014).
  49. Burke, R. T., Orth, J. D. Through the Looking Glass: Time-lapse Microscopy and Longitudinal Tracking of Single Cells to Study Anti-cancer Therapeutics. J Vis Exp. (111), (2016).
  50. Douthwright, S., Sluder, G. Live Cell Imaging: Assessing the Phototoxicity of 488 and 546 nm Light and Methods to Alleviate it. J Cell Physiol. 232 (9), 2461-2468 (2017).
  51. Hilsenbeck, O., et al. Software tools for single-cell tracking and quantification of cellular and molecular properties. Nat Biotechnol. 34 (7), 703-706 (2016).
  52. Skylaki, S., Hilsenbeck, O., Schroeder, T. Challenges in long-term imaging and quantification of single-cell dynamics. Nat Biotechnol. 34 (11), 1137-1144 (2016).
  53. Jones, T. R., et al. Scoring diverse cellular morphologies in image-based screens with iterative feedback and machine learning. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (6), 1826-1831 (2009).
  54. Lukas, C., Falck, J., Bartkova, J., Bartek, J., Lukas, J. Distinct spatiotemporal dynamics of mammalian checkpoint regulators induced by DNA damage. Nat Cell Biol. 5 (3), 255-260 (2003).
  55. Bekker-Jensen, S., Lukas, C., Melander, F., Bartek, J., Lukas, J. Dynamic assembly and sustained retention of 53BP1 at the sites of DNA damage are controlled by Mdc1/NFBD1. J Cell Biol. 170 (2), 201-211 (2005).
  56. Loewer, A., Batchelor, E., Gaglia, G., Lahav, G. Basal dynamics of p53 reveal transcriptionally attenuated pulses in cycling cells. Cell. 142 (1), 89-100 (2010).
  57. Lekshmi, A., et al. A quantitative real-time approach for discriminating apoptosis and necrosis. Cell Death Discovery. 3, 16101 (2017).
  58. Jullien, D., Vagnarelli, P., Earnshaw, W. C., Adachi, Y. Kinetochore localisation of the DNA damage response component 53BP1 during mitosis. J Cell Sci. 115 (Pt 1), 71-79 (2002).

Tags

أبحاث السرطان، 135 قضية، فوكسي، ز1/ق، انزلاق الانقسامية، والتباين مرحلة الفحص المجهري، كارثة الانقسامية، تيترابلويدي، خلية دورة اعتقال، تاكسول، تمزق النووية
الطويلة الأجل العيش-الخلية أن التصوير لتقييم مصير الخلية ردا على باكليتاكسيل
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bolgioni, A. F., Vittoria, M. A.,… More

Bolgioni, A. F., Vittoria, M. A., Ganem, N. J. Long-term Live-cell Imaging to Assess Cell Fate in Response to Paclitaxel. J. Vis. Exp. (135), e57383, doi:10.3791/57383 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter