Summary
Live-celle imaging giver et væld af oplysninger om enkelt celler eller hele befolkninger der er uopnåelig af faste celle imaging alene. Her, er live-celle imaging protokoller at vurdere celle skæbne beslutninger efter behandling med anti-mitotiske drug paclitaxel beskrevet.
Abstract
Live-celle imaging er en kraftfuld teknik, der kan bruges til direkte visualisere biologiske fænomener i enkelt celler over længere perioder. I det sidste årti, har nye og innovative teknologier stærkt forbedret den praktiske gennemførlighed af live-celle billeddannelse. Celler kan nu holdes i fokus og løbende afbildet over flere dage, mens vedligeholdt under 37 °C og 5% CO2 celle kultur betingelser. Desuden kan flere felter i visningen repræsenterer forskellige eksperimentelle betingelser erhverves samtidig, hvilket giver høj overførselshastighed eksperimentelle data. Live-celle imaging giver en betydelig fordel over fast-celle billeddannelse ved at tillade direkte visualisering og tidsmæssige kvantitering af dynamiske cellulære begivenheder. Live-celle imaging kan også identificere variation i adfærden af enkelt celler, der ville ellers have været savnet ved hjælp af befolkningen-baserede assays. Her beskriver vi live-celle imaging protokoller for at vurdere celle skæbne afgørelser efter behandling med anti-mitotiske drug paclitaxel. Vi demonstrere, metoder til at visualisere om mitotically arresteret celler dør direkte fra mitose eller glide tilbage ind i interfasen. Vi beskriver også, hvordan fluorescerende ubiquitination-baserede cellecyklus indikator (FUCCI) systemet kan bruges til at vurdere brøkdel af interphase celler født fra mitotiske skred, der er i stand til at re-indtastning af cellecyklus. Endelig, vi beskriver en live-celle tænkelig metode til at identificere nukleare kuvert brud begivenheder.
Introduction
Anti-mitotiske narkotika har længe været anvendt i de kemoterapeutiske regimer af forskellige typer af solide tumorer og viser ofte stor effekt1,2,3. Mekanisk, disse stoffer forstyrrer normal mitotiske progression og fremme mitotiske anholdelse i hurtigt prolifererende kræftceller. Celle skæbne som svar på mitotiske anholdelse er dog meget varierende: mens en brøkdel af celler gennemgår celledød direkte fra mitose, andre afslutte mitosen og vende tilbage til interphase som tetraploide celler (en proces, der kaldes mitotiske skred)4, 5,6,7,8. Disse interphase celler kan udføre apoptose, gennemgå permanent celle-cyklus anholdelse eller endda genindtræde den celle cyklus4,5,6,7,8,9 ,10,11. Celler, der unddrager sig mitotiske celledød ved at glide over i interfase, kun til at genindtaste den celle cyklus efter narkotika fjernelse, kan derfor bidrage til re-fremkomsten af kræft cellepopulationer. Derudover tilbagefald celler at glide fra mitosen tetraploide, og tetraploidy er kendt for at fremme kromosom ustabilitet, der driver tumor12,13,14,15. Definere de faktorer, der styrer celle skæbne i svar til anti-mitotiske lægemiddelsbehandlinger er derfor kritisk at optimere nuværende therapeutics.
I denne protokol beskriver vi metoder til direkte observere og undersøge skæbnen af celler, der gennemgår langvarig mitotiske anholdelse i svar på den anti-mitotiske drug paclitaxel. Paclitaxel er en etableret terapeutiske i klinikken og har vist sig meget effektiv i mange typer af tumorer, herunder dem i bryst, æggestokke og lunger16,17,18,19, 20. Paclitaxel, som er en plante alkaloid stammer fra bark af Yew tree, stabiliserer mikrotubuli og dermed forhindrer deres dynamik21,22. Mens dæmpning af mikrotubulus dynamics af paclitaxel ikke påvirker cellecyklus progression fra G1 til G2, fører stoffet til vedvarende aktivering af spindel forsamling checkpoint under mitosen af hindrer kinetochore-mikrotubulus vedhæftet fil (gennemgået i dybden her23,24)25. Som følge heraf hindres anaphase debut med paclitaxel-behandlede celler og resulterer i en langvarig mitotiske anholdelse.
Denne protokol vil først beskrive tilgange for at identificere mitotiske celler i live-celle imaging eksperimenter. Mitose kan visualiseres i vedhængende væv kultur celler på grund af to mærkbar celle biologiske ændringer. Først, kromosomer blive meget kondenseret umiddelbart før nuklear kuvert opdeling. Mens ofte påvises ved standard fasekontrast mikroskopi, kan kromosom kondens mere tydeligt påvises ved hjælp af fluorescerende tags at etiketten kromosomer (f.eks. fluorescently mærket Histon proteiner). Andet, mitotiske celler kan også identificeres ved de dramatiske morfologiske ændringer, der skyldes celle afrunding.
Denne protokol vil så vise, hvordan live-celle Billeddannende metoder til at spore skæbner af celler oplever langvarig mitotiske anholdelse. Celler anholdt i mitosen undergår en af tre forskellige skæbner. Første kan celler gennemgå celledød under mitosen. Dette fænomen er let visualiseres ved lysmikroskopi, som døende celler er observeret at skrumpe, bleb, og/eller brud. For det andet celler kan forlade mitosen og vende tilbage tilbage til interphase uden kromosom segregation eller cytokinesis, en proces, der kaldes mitotiske skred. Decondensation af kromosomer og/eller udfladning af cellen mitotiske let identificerer denne proces. Celler, der glider fra mitose også ofte vise uregelmæssig, multi fliget kerner og ofte harbor adskillige mikronukleus5. For det tredje kan celler anholdt i mitosen indlede anaphase og fortsætte gennem mitosen efter en lang forsinkelse. Mens ualmindeligt i højere koncentrationer, stof, antyder denne adfærd at de anholdte celler kan have opfyldt spindel forsamling checkpoint, eller at spindel forsamling checkpoint er delvist svækket eller defekt. Anaphase debut kan visualiseres ved kromosom adskillelse og efterfølgende cytokinesis ved hjælp af live-celle billeddannelse.
Live-celle Billeddannende metoder til at spore skæbnen af celler, der unddrager sig mitotiske celledød af gennemgår mitotiske skred vil også blive beskrevet. Celler, der undergår mitotiske skred enten dø i den efterfølgende interfase, udløse et holdbart G1 celle cyklus anholdelse, eller genindtræde den celle cyklus for at igangsætte en ny runde af celledeling4. Fremgangsmåde ved hjælp af FUCCI (fluorescerende ubiquitination-baserede cellecyklus indikator) system til at bestemme brøkdel af celler, der igen indtaste celle cyklus efter mitotiske skred vil blive beskrevet. FUCCI giver mulighed for direkte visualisering af G1/S overgang og kan bruges sammen med langsigtede live-celle imaging både in vitro- og i vivo26,27. FUCCI-systemet tager fordel af to fluorescently mærket proteiner, afkortet former for hCdt1 (kromatin licenser og DNA-replikation faktor 1) og hGeminin, hvis niveauet svinger baseret på celle cyklus holdning. hCdt1 (smeltet til en rød fluorescerende proteiner) er til stede i høje niveauer i G1 fase hvor det virker til at licensere DNA til replikering, men er ubiquitinated ved E3 ubiquitin ligase SCFSkp2 og forringet under S/G2/M faser at forhindre re replikation af DNA26. Derimod hGeminin (smeltet til en grøn fluorescerende proteiner), er en hæmmer af hCdt1 hvis niveauer peak under S/G2/m, men er ubiquitinated ved E3 ubiquitin ligase APCCdh1 og nedbrudt i slutningen af mitosen og hele G1 26. Følgelig FUCCI leverer en ligetil fluorescens udlæsning af cellecyklus fase, som cellerne udviser rød fluorescens under G1, og grøn fluorescens under S/G2/m. FUCCI systemet er et betydeligt fremskridt over andre metoder (f.eks. bromodeoxyuridine farvning) at identificere proliferativ celler, fordi det ikke kræver celle fiksering og giver mulighed for enkelt celle tænkelig uden behov for yderligere farmakologiske behandlinger til at synkronisere cellepopulationer. Selvom ikke drøftet i denne protokol, er yderligere live-celle sensorer også blevet udviklet for at visualisere cellecyklus progression, herunder en helicase B sensor for G128, DNA ligase-RFP29 og PCDNA-NGL30 sensorer for S-fase, og den seneste FUCCI-4 sensor, som registrerer alle faser i cellecyklus31.
Endelig, en live-celle billedmetoden til at opdage nukleare kuvert brud vil blive beskrevet. Nylige undersøgelser har afsløret, at de nukleare konvolutter af kræftceller er ustabil og udsat for brister, hvorved indholdet af nukleoplasmaet og cytoplasma at intermix. Dette fænomen, såkaldte nukleare brud, kan fremme DNA-skader og stimulation af det medfødte immunforsvar32,33,34,35,36,37, 38 , 39 , 40 , 41 , 42 , 43 , 44. mens de underliggende årsager til nukleare brud forblive ufuldstændigt karakteriseret, er det kendt at deformationer i nukleare struktur korrelerer med en øget forekomst af nukleare brud42. En velkendt effekt af paclitaxel behandling er generation af påfaldende unormal nukleare strukturer efter mitosen; som sådan er vil en metode, ved hjælp af live-celle imaging til at opgøre nukleare brud blive beskrevet, samtidig med at udforske hvis paclitaxel behandling øger hyppigheden af nukleare brud begivenheder. Nukleare brud kan påvises ved den observerede lækage af en nuklear-målrettet fluorescerende proteiner i cytoplasma (f.eks. en tandem dimer gentage af RFP smeltet til en nuklear lokalisering signal, TDRFP-NLS). Denne lækage er tydeligt synlige med det blotte øje, som giver mulighed for enkel kvantitering af brud begivenheder.
Denne protokol kræver en widefield epifluorescensmikroskop, der er udstyret med et kodet Stadium og autofokus software. Den indkodede tidspunkt giver mulighed for præcis automatiserede bevægelse defineret X-Y koordinaterne, mens autofokus software fastholder celler i fokus for varigheden af perioden billeddannelse. Derudover denne protokol kræver udstyr at opretholde celler ved 37 ° C med fugtet 5% CO2 atmosfære. Dette kan opnås ved omslutter hele mikroskop i en temperatur og atmosfære kontrolleret kabinet, eller ved hjælp af fase-top enheder der lokalt fastholder temperatur og miljø. Fasekontrast målet anvendes i denne protokol er en plan fluor 10 x med en numerisk blænde på 0,30. 20 X mål er imidlertid også tilstrækkelige til at identificere både afrundede mitotiske og fladtrykte interphase celler i en enkelt fokalplan. Hvis udfører fasekontrast kan imaging (som beskrevet i denne metode), dækslet være enten glas eller plastik. Differential interferens kontrast (DIC) mikroskopi anvendes, er det bydende nødvendigt at bruge et glas dækning til at forhindre depolarisering af lys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokol fokuserer på brug af ikke-transformeret og chromosomally stabile retinal pigmenteret epitel (ÅV-1) celle linjen til live-celle imaging eksperimenter. Denne protokol kan tilpasses til enhver vedhængende cellelinie, så længe celle dyrkningsbetingelserne er tilpasset efter behov. Alle procedurer skal overholde institutionelle biosikkerhed og etiske retningslinjer og forordninger.
1. forberede celler til Live-celle Imaging
-
Brug frisk optøede og tidlige passage ÅV-1 celler udtrykker menneskelige Histon H2B smeltet til en fluorescerende proteiner (fx H2B-normal god landbrugspraksis), eller det FUCCI system (en detaljeret protokol om hvordan man kan generere FUCCI-udtrykker celler kan findes i reference45) at vurdere mitotiske celle skæbne.
- For at måle frekvensen af nukleare brud, bruge ÅV-1 celler udtrykker både H2B-normal god landbrugspraksis og en tandem dimer af rødt fluorescerende proteiner smeltet til en enkelt nukleare lokalisering signal (TDRFP-NLS).
Bemærk: Konstruktioner af tre grønne fluorescerende proteiner smeltet sammen til en enkelt nukleare lokalisering signal (normal god landbrugspraksis3- NLS) har også været brugt til at demonstrere brud (som reference42). - Vedligeholde celler på 10 cm vævskultur plader i passende vækstmediet. ÅV-1 celler er fastholdt i phenol rød-fri, Dulbeccos modificerede Eagle Medium/næringsstof blanding F-12 (DMEM:F12) suppleret med 10% føtal bovint serum (FBS), 100 IE/mL penicillin og 100 μg/mL streptomycin.
- For at måle frekvensen af nukleare brud, bruge ÅV-1 celler udtrykker både H2B-normal god landbrugspraksis og en tandem dimer af rødt fluorescerende proteiner smeltet til en enkelt nukleare lokalisering signal (TDRFP-NLS).
-
Opsug medium fra cellerne, vaske vævskultur fadet med 10 mL sterilt, stuetemperatur fosfatbufferet saltopløsning (PBS) at fjerne resterende medium, og derefter Aspirér PBS.
- Der tilsættes 2 mL 0,25% Trypsin med ethylendiamintetra syre (EDTA) til cellerne og inkuberes ved 37 ° C i 3 min, eller indtil fleste celler har løsrevet fra pladen.
Bemærk: Opbevar ikke celler i trypsin længere end nødvendigt.
- Der tilsættes 2 mL 0,25% Trypsin med ethylendiamintetra syre (EDTA) til cellerne og inkuberes ved 37 ° C i 3 min, eller indtil fleste celler har løsrevet fra pladen.
-
Der tilsættes 10 mL af komplet medium til at indsamle de trypsinized celler med en 10 mL serologiske stripette og dispensere i en 15 mL konisk slange.
- Sammenpresse cellerne ved centrifugering ved 180 x g i 3 min ved stuetemperatur.
- Opsug supernatanten, være omhyggelig med ikke at forstyrre pelleten, og derefter grundigt resuspenderes i 10 mL frisk medium af forsigtigt pipettering medium op og ned i den serologiske stripette.
-
Bruge en hemocytometer eller automatiseret celle optælling maskine til at tælle celler46.
- Fortynd celler i en ny koniske rør til 30.000 celler/mL af komplet medium.
- Plade 30.000 ÅV-1 celler (1 mL volumen) pr. brønd af et 12-godt glas bund (#1.5 tykkelse) imaging parabol for at opnå den krævede cellulære tæthed den næste dag (30-50% sammenflydende).
Bemærk: Altid håndtere pladen med handsker og vær forsigtig ikke at røre glas-bund.
- Tillad celler til at vokse i et 37 ° C vævskultur inkubator, indtil de fuldt vedhæfte og flade på glas-bund imaging pladen. Mens celler kan vedhæfte i så lidt som 4 h, anbefales det, at cellerne ikke er i behandling med medicin og afbildet indtil den følgende dag.
-
Tilføje paclitaxel (opløst i dimethylsulfoxid (DMSO)) til den ønskede slutkoncentration i komplet medium og bland grundigt.
- Udarbejde komplette medium med et lige saa stort volumen af DMSO alene at anvende som kontrol.
- Varm det medium, der indeholder stof eller DMSO til 37 ° C før du tilføjer til celler. Dette vil forhindre fokale drift på grund af en pludselige temperaturskift.
- Der tilsættes 1 mL af medium indeholdende enten paclitaxel eller DMSO alene individuelle brønde af 12-godt imaging parabol.
2. opsætning af mikroskopet for Live-celle Imaging
- Rene glas-bund af imaging fadet med optisk renere at fjerne fingeraftryk eller støv, der kan forstyrre billeddannelse. Brug tilstrækkelig optisk renere for at befugte hele glasoverfladen.
- Placer glas-bund fad på stadiet mikroskop i Overgangsstikket imaging parabol, fjerne plastik cover fra skålen og Dæk fadet med en glas-topped kammer. Sikre, at Parlamentet har en ventil til at tillade en lind strøm af luft består af 5% CO2.
Bemærk: For at fugte 5% CO2, gas flød gennem rør indsat i et sterilt vand bad boliger. Dette giver gas til blive ekvilibreres til 95% fugtighed. - Indled/kalibrere den kodede fase hjælp i programmet kontrollere mikroskop. Dette vil sikre nøjagtige X-Y koordinaterne og forhindre fokale drift.
- Fokusere på celler ved hjælp af fasekontrast optik og udføre Kohler belysning (beskrevet i detaljer i reference47) for at fokusere lyset og give optimal kontrast.
-
Bruge erhvervelse software til at bestemme de optimale eksponering gange for hvidt lys og alle fluorescerende kanaler bliver brugt (engagementer at give 75% pixel mætning på kameraet er ideelle, forudsat dette beløb af lys ikke er giftigt for celler).
- Brug erhvervelse software til at vælge flere, ikke-overlappende områder i lyset fra hver brønd for billeddannelse. Vælg imaging regioner hvor celler har overholdt godt glas-bund og er mellem 50% og 70% sammenflydende. Undgå klumpet celleområder, da dette vil gøre efterfølgende analyse vanskeligt.
Bemærk: Det er vigtigt at have ikke-overlappende områder i lyset fra hver grundigt for at undgå sporing de samme celler to gange. Hvis celler er stærkt motile, kan det være nødvendigt at erhverve flere billeder udstrålende ud fra et centralt punkt og søm dem sammen igen for at gøre et stort synsfelt.
- Brug erhvervelse software til at vælge flere, ikke-overlappende områder i lyset fra hver brønd for billeddannelse. Vælg imaging regioner hvor celler har overholdt godt glas-bund og er mellem 50% og 70% sammenflydende. Undgå klumpet celleområder, da dette vil gøre efterfølgende analyse vanskeligt.
- Aktivér den mikroskop autofokus funktion for at sikre alle punkter bevares i fokus for varigheden af forsøget.
- For at vurdere mitotiske celle skæbne, indstille billedbehandlingsprogrammer at indsamle billeder fra hver valgte synsfelt hver 10 min for op til 96 h. Unperturbed mitosen varer 20 – 40 min, og dermed 10 min mellemrum vil give nok prøvetagning til at identificere, når celler deler. For at identificere nukleare brud, som er en forbigående hændelse, erhverve billeder hvert 5 min.
Bemærk: Sørg for, at computeren kører billede erhvervelse software har auto-opdatering, screensavers og energibesparelser transportformer handicappede, som disse kan ofte forstyrrer billede erhvervelse over lange eksperimenter. - Indlede den billeddiagnostiske eksperiment. Bekræfte med jævne mellemrum at billede erhvervelse kørende i løbet af videoen.
3. video analyse til at identificere celle skæbne i svar til Paclitaxel
- Bekræfte, at afbildede celler er raske i løbet af de billeddiagnostiske eksperiment. Kontrol celler behandles med DMSO bør være levedygtige og aktivt prolifererende.
Bemærk: Hvis cellerne udviser tegn på stress, ikke kvantificere videoen og i stedet fokusere på at optimere imaging betingelser48. Tegn på imaging stress omfatter blebbing/døende celler, celler, der undlader at vedhæfte/spredning på pladen og celler, der viser en lav mitotiske indeks og/eller langvarig mitosen. Mulige kilder til stress omfatter udsving i temperatur eller CO2 niveauer inde den billeddiagnostiske afdeling eller fototoksicitet48. - Når imaging en hele synsfelt med en 10 X eller 20 X mål, kan hundredvis af individuelle celler være til stede. Derfor, for at hjælpe med kvantitering, opdele synsfelt i mindre kvadranter ved hjælp af tilgængelige software-værktøjer. Score celler inden for hver kvadrant separat (som beskrevet i trin 3.3.1–3.6.2).
-
Når du analyserer video, spore hver celle i en flettet visning ved hjælp af fase-kontrast og/eller fluorescerende billeder. Brug software analyseværktøjer til at oprette de flettede visning.
- Fra begyndelsen af videoen, identificere en enkelt interphase celle og følge op på sine fremdriften gennem cellecyklus hjælp fase optik. For at spore en enkelt celle, observere cellen fra ramme til ramme af øjet. Identificere interphase celler på grund af deres fladtrykte morfologi (som vurderet af fase-kontrast) og deres manglende DNA kondens (som vurderet af H2B-normal god landbrugspraksis) (figur 1A).
-
Identificere celler, der indtaste mitosen ved observation af celle afrunding (hjælp fasekontrast optik) og/eller kromosom kondens (ved hjælp af H2B-normal god landbrugspraksis) (figur 1A-C). Begge celle afrunding og kromosom kondens er let visualiseres med det blotte øje.
- Anmærke når cellen træder mitosen. Fortsætte med sporing af celle, indtil den når sin skæbne (anaphase som i trin 3.5, celledød fra mitosen som i trin 3.6.1, eller mitotiske skred i trin 3.6.2).
- Kontrol celler bør effektivt justere deres kromosomer og Indtast anaphase inden for 1 h (figur 1 d). Visualiser anaphase ved fasekontrast optik, som cellen begynder at hugge i to eller gennem visualisering af poleward-flytte kromosomer mærket med H2B-normal god landbrugspraksis (figur 1A). Anmærke det tidspunkt når cellen undergår anaphase.
-
Derimod forbliver celler behandles med paclitaxel afrundede med kondenseret kromosomer i flere timer (3-40 h) (figur 1B-D).
- Identificere mitotically arresteret celler, der undergår celledød.
Bemærk: Celler, der dør under mitosen er visualiseret ved fasekonstrastmikroskopi, som celler vil bleb, skrumpe, og/eller brud (figur 1B). Hvis imaging H2B-normal god landbrugspraksis, fragment kromosomerne også under celledød. - Identificere mitotically arresteret celler, der undergår celle skred.
Bemærk: Celler, der undergår mitotiske skred er observeret af fasekonstrastmikroskopi, som de flade tilbage ud i interfase og decondense kromosomer uden at undergå anaphase (figur 1 c). Celler, der undergår mitotiske skred giver anledning til store tetraploide celler der er ofte multinucleated (figur 1 c).
- Identificere mitotically arresteret celler, der undergår celledød.
- Fortsætte tracking celler fra den oprindelige synsfelt. Når en hel synsfelt er sporet, flytte til en særskilt synsfelt, der er erhvervet fra samme godt og fortsætte tracking celler.
4. video analyse til at identificere celle skæbne efter mitotiske skred
-
Vurdere celle skæbne efter mitotiske skred (som beskrevet i trin 3.6.2) ved hjælp af ÅV-1 celler udtrykker FUCCI systemet. Ud over fasekontrast imaging, er det nødvendigt at erhverve både røde fluorescens (vejledende G1 fase) og grønne fluorescens (vejledende af S/G2/m) billeder).
- Spore FUCCI ÅV-1 celler som beskrevet i trin 3.3 gennem 3.7.
- For at bekræfte, at FUCCI systemet fungerer korrekt, validere at kontrol celler alternative udtryk for de røde og grønne fluorescerende proteiner korrekt fra analyse af live-celle billeddiagnostiske data. Kontrol celler bør overgangen fra udstiller helt nukleare røde fluorescens at udstille helt nukleare grønne fluorescens under interphase som celler fremskridt fra G1 S-fasen. Celler fortsat udviser grønne fluorescens i hele gennemførelsen af mitosen. Umiddelbart efter mitose, bør celler igen udviser helt rød fluorescens under interfasen.
Bemærk: Mens der findes metoder til at kvantificere både RFP og normal god landbrugspraksis fluorescens intensiteter fra FUCCI systemet i enkelte celler ved hjælp af fluorescerende spor49, dette er ofte ikke nødvendigt som fluorescens farveændring er robust og synlige med det blotte øje.
- For at bekræfte, at FUCCI systemet fungerer korrekt, validere at kontrol celler alternative udtryk for de røde og grønne fluorescerende proteiner korrekt fra analyse af live-celle billeddiagnostiske data. Kontrol celler bør overgangen fra udstiller helt nukleare røde fluorescens at udstille helt nukleare grønne fluorescens under interphase som celler fremskridt fra G1 S-fasen. Celler fortsat udviser grønne fluorescens i hele gennemførelsen af mitosen. Umiddelbart efter mitose, bør celler igen udviser helt rød fluorescens under interfasen.
- Spore FUCCI ÅV-1 celler som beskrevet i trin 3.3 gennem 3.7.
-
Identificere celler anholdt i mitosen bruger fasekonstrastmikroskopi og spore dem indtil de undergår mitotiske skred, som beskrevet i 3,4 og 3.6.2. Celler, slip ud af mitosen og tilbage i interfase ændres fra udstiller grønne fluorescens under mitosen til røde fluorescens i G1 fase (figur 2A- C).
- Spore disse gled celler ved hjælp af fase-kontrast og epifluorescerende billeddannelse af øjet til at vurdere deres celle skæbne (figur 2D).
- Identificere celler, genindtræde celle cyklus. Disse celler er identificeret ved den rød til grøn ændring i fluorescens udtryk ved hjælp af det FUCCI system, der angiver G1/S overgang (figur 2A).
- Identificere celler, der undergår G1 celle cyklus anholdelse. Disse celler er identificeret ved ekspression af røde fluorescens, der fortsætter i > 24 timer (figur 2B).
- Identificere celler, der dør i interfasen. Disse celler er identificeret af celle brud/blebbing/krympning bruger fasekontrast imaging (figur 2 c).
- Spore disse gled celler ved hjælp af fase-kontrast og epifluorescerende billeddannelse af øjet til at vurdere deres celle skæbne (figur 2D).
5. video analyse til at identificere hyppigheden af nukleare kuvert brud
- Bruge ÅV-1 celler udtrykker H2B-normal god landbrugspraksis og TDRFP-NLS for at vurdere nukleare kuvert brud. Ud over fasekontrast imaging, får både rød fluorescens (TRITC) og grønne fluorescens (FITC) billeder. Erhverve billeder hvert 5 min til at visualisere brud.
Bemærk: Det er afgørende at generere cellelinjer som TDRFP-NLS er effektivt importeres til kernen med minimal cytoplasmatisk fluorescens. - Billede celler trin som beskrevet i 3.3 gennem 3.4. TDRFP-NLS fluorescens signal og H2B-normal god landbrugspraksis bør Co lokalisere under interfasen. Ved mitosen (som visualiseret ved celle afrunding ved hjælp af fase optik og/eller kromosom kondensering af H2B-normal god landbrugspraksis), den nukleare kuvert vil nedbryde og TDRFP-NLS signal bliver cytoplasmatisk (figur 3A). Efter mitose, nukleare kuvert vil reformere i datter celler og TDRFP-NLS signal bliver nukleare.
- Spore datter celler i hele den efterfølgende interphase ved live-celle billeddannelse. Identificere nukleare brud begivenheder ved at observere et forbigående burst af nukleare lokaliseret TDRFP-NLS ind i de omkringliggende cytoplasma. Inden for få minutter, den nukleare kuvert vil blive repareret og TDRFP-NLS vil være relocalized til kernen (figur 3A).
Bemærk: Ofte, den nukleare DNA, som visualiseret ved H2B-normal god landbrugspraksis, vil ses at rager uden for webstedet brud som en lille bleb. - Score brøkdel af kerner, der undergår en Bristning begivenhed under interfasen. At score denne fraktion, tælle antallet af celler, der undergår en Bristning begivenhed over det samlede antal celler spores.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjælp af protokollen, der er beskrevet ovenfor, var RPE-1 celler udtrykker H2B-normal god landbrugspraksis behandlet med en anti-mitotiske eller køretøjet kontrol (DMSO) og analyseres af live-celle billeddannelse. Analysen viste, at 100% af kontrol mitotiske ÅV-1 celler indledt anaphase gennemsnitligt 22 min. efter indtastning mitosen (figur 1A, 1 D). Derimod udstillet ÅV-1 celler behandles med paclitaxel en dyb mitotiske arrestordre varede flere timer (fig. 1 d). Imaging afslørede at 48% af disse mitotically arresteret celler undergik mitotiske celledød (figur 1B, 1E), mens de resterende 52% undergik mitotiske skred (figur 1 c, 1E).
For at vurdere skæbnen af ÅV-1 celler, der undergik mitotiske skred, RPE-1 celler udtrykker FUCCI systemet blev behandlet med enten lav-dosis 50 nM paclitaxel, høj-dosis 5 µM paclitaxel, eller køretøjet kontrol (DMSO) og analyseres af langsigtede live-celle billeddannelse. Data viste, at 22% af ÅV-1 celler, der undergik mitotiske skred efter behandling med 50 nM paclitaxel, døde i de efterfølgende celle cyklus (figur 2 c, 2D), 72% induceret celle cyklus anholdelse (figur 2B, 2D), og kun 5% genindtastet S-fase (figur 2A, 2D). Derimod af ÅV-1 celler behandlet med højdosis 5 µM paclitaxel, der undergik mitotiske skred, 35% døde i de efterfølgende cellecyklus, 65% induceret celle cyklus anholdelse, og genindtastet ingen S-fase (figur 2D).
Interessant, fremmer lav-dosis paclitaxel-behandling nukleare kuvert brud i ÅV-1 celler efter mitosen. Efter mitotiske afslutning blev datterceller sporet og scorede for enhver nukleare brud begivenheder, afsløre at kun ~ 4% af kontrol (DMSO-behandlet) ÅV-1 datterceller bristede, hvorimod ~ 23% af datterceller behandlet med 10 nM paclitaxel udstillet brud ( Figur 3A, 3B).
Figur 1: mitotiske celle skæbne i svar til anti-mitotiske behandling. ÅV-1 celler stabilt udtrykker H2B-normal god landbrugspraksis var behandlet med DMSO køretøj kontrol (A) eller 5 µM paclitaxel (B, C) og afbildet bruge time-lapse fase-kontrast og widefield epifluorescensmikroskop mikroskopi til at vurdere mitotiske celle skæbne. Interphase celler (venstre paneler) blev sporet som de angivet mitosen (midterste paneler), og indtil de enten indledt anaphase (A), undergik mitotiske celledød (B), eller gled fra mitosen tilbage til interphase (C). Hvide pile angiver sporede celler. (D) mængden af tid, der styrer celler (DMSO-behandlet) og mitotic-behandlede celler tilbragte i mitosen, som quantitated af live-celle imaging (n = 100 celler for hver betingelse). (E) brøkdel af celler (n = 100) der undergik anaphase, mitotiske celledød, eller mitotiske skred i DMSO-behandlede celler eller celler behandles med 5 µM paclitaxel. Tid, h:min. skalalinjen = 50 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: skæbne af celler, der undergår mitotiske skred. ÅV-1 celler stabilt udtrykker FUCCI systemet blev behandlet med 50 nM paclitaxel eller 5 µM paclitaxel og afbildet bruge time-lapse fase-kontrast og widefield Fluorescens mikroskopi til at kvantificere celle skæbne efter mitotiske skred. Celler blev scoret som enten igen at indtaste cellecyklus, som bedømt af en rød til grøn fluorescens ændring i FUCCI systemet (A); arrestere i G1 fase, som bedømt af vedvarende røde fluorescens for > 24 timer (B); eller dør i den efterfølgende mitose, som bedømt af cellulære blebbing/brud (C). Hvide pile angiver sporede celler. (D) brøkdel af celler (n = 100), gennemgik hver skæbne. Fejllinjer udgør standardafvigelse fra middelværdien fra to uafhængige forsøg. Tid, h:min. skalalinjen = 50 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: hyppighed af nukleare kuvert brud i paclitaxel-behandlede celler. ÅV-1 celler stabilt udtrykker TDRFP-NLS og H2B-normal god landbrugspraksis var behandlet med 10 nM paclitaxel eller køretøjet kontrol (DMSO) og afbildet bruge time-lapse fase-kontrast og widefield epifluorescensmikroskop mikroskopi (A). Under mitosen (metafase/Anaphase) nukleare konvolut er brudt og TDRFP-NLS bliver cytoplasmatisk. Efter mitose relocalizes TDRFP-NLS til kernen i interfase celler (pre brud). Nukleare brud begivenheder er identificeret ved flytning af TDRFP-NLS fra kernen til cytoplasmaet i interfase celler (brud), efterfulgt af relocalization af TDRFP-NLS til kernen efter nukleare kuvert reparation (efter brud). Hvide pile angiver sporede celler. (B) brøkdel af celler (n > 100 pr. betingelse) der viser nukleare kuvert brud efter mitosen i overværelse af paclitaxel eller køretøjet kontrol. Tid, h:min. skalalinjen = 50 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det mest kritiske aspekt af langsigtede live-celle imaging er at sikre sundheden for cellerne at blive afbildet. Det er vigtigt, at celler blive udsat for minimal uvedkommende miljømæssige stressfaktorer, såsom substandard betingelser med hensyn til temperatur, fugtighed, og/eller CO2 niveauer. Det er også vigtigt at begrænse solskader fra fluorescerende excitation belysning, som imaging stress er kendt for at påvirke celle adfærd50. Begrænse solskader kan opnås på flere måder som beskrevet andetsteds48. Generelt er det bedst at bruge de korteste eksponeringstid nødvendig for at producere en tilstrækkelig lys nok fluorescens signal at effektiv spore celler, hvilket begrænser fototoksicitet. Men hvis celler er afbildet kun en gang hver 10-20 min, længere eksponeringer, (der henvender sig til pixel mætning) er typisk godt tolereret (selvom dette skal bestemmes empirisk for hver fluorophore og celle). Fordi afbildet celler er følsomme over for både miljøet og billedbehandling understreger, er det bydende nødvendigt, at kontrol celler er altid inkluderet i live-celle imaging eksperimenter og overvåges for at bekræfte normale spredning.
Én begrænsning for langsigtet live-celle billeddannelse er, at det kræver udstyre en eksisterende mikroskop med enten en miljømæssig kammer, der vedligeholder både temperatur og 5% fugtet CO2 atmosfære, eller en fase-toppen kammer, som også er i stand til at støtte passende temperatur og atmosfære. Mens strømmende CO2 er optimale, celler også kan være afbildet i op til 48 timer ved hjælp af CO2-uafhængige medium hvis en miljømæssig kammer med 5% fugtet CO2 er ikke tilgængelig. Men mange celletyper ikke tåler sådan medium, og dette skal fastlægges empirisk ved måling af cellevækst og levedygtighed. Overliggende cellerne med mineralsk olie kan også bruges til at forhindre medium fordampning.
En anden stor begrænsning til denne metode er, at manuelt spore celle skæbner er meget besværlige og tidskrævende. Men celle-tracking programmer er tilgængelige og kan være optimeret til at automatisere billede analyse51,52,53. En yderligere begrænsning med denne metode er, at meget motile celler ofte er vanskeligt at spore over længere perioder. Hvis dette udgør et væsentligt problem, hele godt kan være afbildet og billeder syet sammen til at danne et stort synsfelt. Mange softwareprogrammer understøtter denne metode.
Autofluorescence er en anden betingelse, der skal behandles med denne protokol. Phenol rød gratis medium reducerer baggrund autofluorescence under levende celle billeddannelse. Det er også blevet påvist, at to vitaminer almindeligt forekommende i vækstmediet, riboflavin og pyridoxal, kan mindske fotostabilitet af fluorescerende proteiner. Medium mangler disse vitaminer kan således også bruges under fluorescens imaging til at forbedre signal til støj rationer. Mens plast bunden retter er billigere og kan give tilstrækkelig imaging resultater, producerer de også et større antal autofluorescence, der påvirker negativt signal-støj-forhold. Derudover har plastik bund retter større variation i tykkelse, der kan forstyrre funktionen autofokus i mange mikroskoper. Tykkelsen af glas bund imaging parabol i denne protokol er 0,17 mm, hvilket er den ideelle glas til brug med moderne mikroskoper.
Endelig, langsigtede film omfatter flere felter af Se og erhverve flere fluorescens kanaler producerer massive datafiler (snese gigabytes til selv terabytes hver), som udgør et problem for datalagring og sikkerhedskopiering. For at afhjælpe dette problem, anbefales det, at alle billeder erhverves ved hjælp af 2 x 2 eller 4 x 4 binning, forudsat den resulterende tab i opløsning er acceptabel. Binning ikke kun begrænser eksponeringstider (dvs. celler stabilt udtrykker H2B-normal god landbrugspraksis eller FUCCI systemet skulle have engagementer mindre end 500 ms), men også drastisk reducerer størrelsen af datafiler (et billede, der er arkiveret lodret 2 x 2 er en fjerdedel filstørrelsen af et ikke arkiveret lodret billede).
På trods af disse begrænsninger repræsenterer langsigtede live-celle imaging den bedste metode til at spore individuelle celle skæbner fra hele befolkninger, især når celle skæbner er meget heterogen. Som mere live-celle fluorescerende markører og sensorer bliver tilgængelige, live-celle vil imaging tilgange blive udvidet for at visualisere og kvantificere flere yderligere aspekter for cellebiologi. For eksempel, eksisterer live-celle sensorer i øjeblikket for at kvantificere DNA skader foci, p53 niveauer, celle cyklus holdning og apoptose26,54,55,56,57,58 . Således har tænkelig eksperimenter kapacitet til at afsløre de underliggende cellulære egenskaber, der dikterer, hvordan og hvorfor enkelt celler reagerer trinløst at kemoterapeutika.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
AFB, MAV og NJG gerne takke Ryan Quinton for kommentarer til manuskriptet og Adrian områder for TDRFP-NLS konstruktion. AFB og MAV er finansieret af NIGMS Biomolekylær farmakologi uddannelse Grant 5T32GM008541. NJG er medlem af Shamim og Ashraf Dahod bryst kræft forskningslaboratorier og understøttes af NIH tilskud GM117150 og CA-154531, Karin Grunebaum Foundation, Smith familie Awards Program, programmet Searle lærde og melanom forskning Alliance.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| phenol red-free, DMEM:F12 media | Hyclone | SH3027202 | |
| 10% fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10438026 | |
| 100 IU/ml penicillin, and 100 mg/ml streptomycin. | Gibco | 15070063 | |
| PBS | Gibco | 10010049 | |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gemini | 50-753-3104 | |
| 12-well glass bottomed imaging dish | Cellvis | P12-1.5H-N | |
| Paclitaxel | TSZ Chem | RS036 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | NC0215085 | |
| Environmental Chamber | In Vivo Scientific | ||
| 5% CO2 | Airgas | Z03NI7432000201 | |
| 15 mL Conical Tubes | Fisherbrand | 05-539-12 | |
| 10 cm polystyrene tissue culture plates | Falcon | 08772E | |
| 10 mL Disposable Serological Pipette | Fisherbrand | 4488 | |
| 5804R 15 amp Centrifuge | Eppendorf | 97007-370 | |
| 1000 microliters Pipette | Gilson | Pipetman Classic | |
| 20 microliters Pipette | Gilson | Pipetman Classic | |
| p1000 Pipette Tips | Sharp | p1126 | |
| p20 Pipette Tips | Sharp | P1121 | |
| RPE-1 Cells | ATCC | CRL-4000 | |
| Incubator Galaxy 170S | Eppendorf | CO17011005 | |
| Pipette Boy | Integra | 156401 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 0267110 | |
| Nikon Ti-E-PFS Inverted Microscope for Live Cell Imaging | Micro Video Instruments, Inc. | MEA53100 | |
| Prior X-Y Stage System and White Light LED Illuminator | Micro Video Instruments, Inc. | 500-H117P1N4 | |
| Prior Proscan 3 Controller XYZ with Encoders | Micro Video Instruments, Inc. | 500-H31XYZE | |
| Andor Digital Camera | Micro Video Instruments, Inc. | D10NLC | |
| Nikon NIS Elements AR Software | Micro Video Instruments, Inc. | MQS31000 | |
| SOLA LED Illuminator for Fluorescence | Micro Video Instruments, Inc. | SOLA-E | |
| InVivo Environmental Chamber with CO2 Flow Control | Micro Video Instruments, Inc. | Ti-IVS-100 | |
| Ti-ND6-PFS Perfect Focus Motorized Nosepiece | Micro Video Instruments, Inc. | MEP59391 | |
| Ti-C System Condenser Turret | Micro Video Instruments, Inc. | MEL51000 | |
| Ti-C LWD LWD Lens Unit for System Condenser Turret | Micro Video Instruments, Inc. | MEL56200 | |
| Te-C LWD Ph1 Module | Micro Video Instruments, Inc. | MEH41100 | |
| CFI Plan Fluor DLL 10X Objectivena 0.3 wd 16mm | Micro Video Instruments, Inc. | MRH10101 | |
| CFI Super Plan Fluor ELWD 20xc ADM Objective | Micro Video Instruments, Inc. | MRH48230 |
References
- van Vuuren, R. J., Visagie, M. H., Theron, A. E., Joubert, A. M. Antimitotic drugs in the treatment of cancer. Cancer Chemother Pharmacol. 76 (6), 1101-1112 (2015).
- Chan, K. S., Koh, C. G., Li, H. Y. Mitosis-targeted anti-cancer therapies: where they stand. Cell Death Dis. 3, e411 (2012).
- Jackson, J. R., Patrick, D. R., Dar, M. M., Huang, P. S. Targeted anti-mitotic therapies: can we improve on tubulin agents? Nat Rev Cancer. 7 (2), 107-117 (2007).
- Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. How do anti-mitotic drugs kill cancer cells? J Cell Sci. 122 (Pt 15), 2579-2585 (2009).
- Rieder, C. L., Maiato, H. Stuck in division or passing through: what happens when cells cannot satisfy the spindle assembly checkpoint. Dev Cell. 7 (5), 637-651 (2004).
- Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. Cancer cells display profound intra- and interline variation following prolonged exposure to antimitotic drugs. Cancer Cell. 14 (2), 111-122 (2008).
- Huang, H. C., Mitchison, T. J., Shi, J. Stochastic competition between mechanistically independent slippage and death pathways determines cell fate during mitotic arrest. PLoS One. 5 (12), e15724 (2010).
- Shi, J., Orth, J. D., Mitchison, T. Cell type variation in responses to antimitotic drugs that target microtubules and kinesin-5. Cancer Res. 68 (9), 3269-3276 (2008).
- Ganem, N. J., Pellman, D. Limiting the proliferation of polyploid cells. Cell. 131 (3), 437-440 (2007).
- Ganem, N. J., Storchova, Z., Pellman, D. Tetraploidy, aneuploidy and cancer. Curr Opin Genet Dev. 17 (2), 157-162 (2007).
- Ganem, N. J., Pellman, D. Linking abnormal mitosis to the acquisition of DNA damage. J Cell Biol. 199 (6), 871-881 (2012).
- Sotillo, R., Schvartzman, J. M., Socci, N. D., Benezra, R. Mad2-induced chromosome instability leads to lung tumour relapse after oncogene withdrawal. Nature. 464 (7287), 436-440 (2010).
- Sotillo, R., et al. Mad2 overexpression promotes aneuploidy and tumorigenesis in mice. Cancer Cell. 11 (1), 9-23 (2007).
- Ganem, N. J., Godinho, S. A., Pellman, D. A mechanism linking extra centrosomes to chromosomal instability. Nature. 460 (7252), 278-282 (2009).
- Silkworth, W. T., Nardi, I. K., Scholl, L. M., Cimini, D. Multipolar spindle pole coalescence is a major source of kinetochore mis-attachment and chromosome mis-segregation in cancer cells. PLoS One. 4 (8), e6564 (2009).
- McGuire, W. P., et al. Cyclophosphamide and Cisplatin Compared with Paclitaxel and Cisplatin in Patients with Stage III and Stage IV Ovarian Cancer. New England Journal of Medicine. 334 (1), 1-6 (1996).
- McGuire, W. P., et al. Taxol: a unique antineoplastic agent with significant activity in advanced ovarian epithelial neoplasms. Ann Intern Med. 111 (4), 273-279 (1989).
- Ettinger, D. S. Taxol in the treatment of lung cancer. J Natl Cancer Inst Monogr. (15), 177-179 (1993).
- Weaver, B. A. How Taxol/paclitaxel kills cancer cells. Mol Biol Cell. 25 (18), 2677-2681 (2014).
- Jordan, M. A., Wilson, L. Microtubules as a target for anticancer drugs. Nat Rev Cancer. 4 (4), 253-265 (2004).
- Wall, M. E., Wani, M. C. Camptothecin and Taxol: Discovery to Clinic-Thirteenth Bruce F. Cain Memorial Award Lecture. Cancer Research. 55 (4), 753-760 (1995).
- Schiff, P. B., Horwitz, S. B. Taxol stabilizes microtubules in mouse fibroblast cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (3), 1561-1565 (1980).
- Lara-Gonzalez, P., Westhorpe, F. G., Taylor, S. S. The spindle assembly checkpoint. Curr Biol. 22 (22), R966-R980 (2012).
- Musacchio, A. The Molecular Biology of Spindle Assembly Checkpoint Signaling Dynamics. Curr Biol. 25 (20), R1002-R1018 (2015).
- Uetake, Y., et al. Cell cycle progression and de novo centriole assembly after centrosomal removal in untransformed human cells. J Cell Biol. 176 (2), 173-182 (2007).
- Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132 (3), 487-498 (2008).
- Chittajallu, D. R., et al. In vivo cell-cycle profiling in xenograft tumors by quantitative intravital microscopy. Nat Methods. 12 (6), 577-585 (2015).
- Gu, J., et al. Cell cycle-dependent regulation of a human DNA helicase that localizes in DNA damage foci. Mol Biol Cell. 15 (7), 3320-3332 (2004).
- Easwaran, H. P., Leonhardt, H., Cardoso, M. C. Cell cycle markers for live cell analyses. Cell Cycle. 4 (3), 453-455 (2005).
- Hahn, A. T., Jones, J. T., Meyer, T. Quantitative analysis of cell cycle phase durations and PC12 differentiation using fluorescent biosensors. Cell Cycle. 8 (7), 1044-1052 (2009).
- Bajar, B. T., et al. Fluorescent indicators for simultaneous reporting of all four cell cycle phases. Nat Methods. 13 (12), 993-996 (2016).
- Gekara, N. O. DNA damage-induced immune response: Micronuclei provide key platform. J Cell Biol. 216 (10), 2999-3001 (2017).
- Chow, K. H., Factor, R. E., Ullman, K. S. The nuclear envelope environment and its cancer connections. Nat Rev Cancer. 12 (3), 196-209 (2012).
- Crasta, K., et al. DNA breaks and chromosome pulverization from errors in mitosis. Nature. 482 (7383), 53-58 (2012).
- Hatch, E. M., Fischer, A. H., Deerinck, T. J., Hetzer, M. W. Catastrophic nuclear envelope collapse in cancer cell micronuclei. Cell. 154 (1), 47-60 (2013).
- Maciejowski, J., Li, Y., Bosco, N., Campbell, P. J., de Lange, T. Chromothripsis and Kataegis Induced by Telomere Crisis. Cell. 163 (7), 1641-1654 (2015).
- Zhang, C. Z., et al. Chromothripsis from DNA damage in micronuclei. Nature. 522 (7555), 179-184 (2015).
- Denais, C. M., et al. Nuclear envelope rupture and repair during cancer cell migration. Science. 352 (6283), 353-358 (2016).
- Raab, M., et al. ESCRT III repairs nuclear envelope ruptures during cell migration to limit DNA damage and cell death. Science. 352 (6283), 359-362 (2016).
- Bernhard, W., Granboulan, N. THE FINE STRUCTURE OF THE CANCER CELL NUCLEUS. Exp Cell Res. 24 (Suppl 9), 19-53 (1963).
- de Noronha, C. M., et al. Dynamic disruptions in nuclear envelope architecture and integrity induced by HIV-1 Vpr. Science. 294 (5544), 1105-1108 (2001).
- Vargas, J. D., Hatch, E. M., Anderson, D. J., Hetzer, M. W. Transient nuclear envelope rupturing during interphase in human cancer cells. Nucleus. 3 (1), 88-100 (2012).
- Sieprath, T., Darwiche, R., De Vos, W. H. Lamins as mediators of oxidative stress. Biochem Biophys Res Commun. 421 (4), 635-639 (2012).
- Mitchison, T. J., Pineda, J., Shi, J., Florian, S. Is inflammatory micronucleation the key to a successful anti-mitotic cancer drug? Open Biol. 7 (11), (2017).
- Shenk, E. M., Ganem, N. J. Generation and Purification of Tetraploid Cells. Methods Mol Biol. 1413, 393-401 (2016).
- Morten, B. C., Scott, R. J., Avery-Kiejda, K. A. Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell Lines. J Vis Exp. (115), (2016).
- Salmon, E. D., Canman, J. C. Proper alignment and adjustment of the light microscope. Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 4 Unit 4 1 (2001).
- Cole, R. Live-cell imaging. Cell Adh Migr. 8 (5), 452-459 (2014).
- Burke, R. T., Orth, J. D. Through the Looking Glass: Time-lapse Microscopy and Longitudinal Tracking of Single Cells to Study Anti-cancer Therapeutics. J Vis Exp. (111), (2016).
- Douthwright, S., Sluder, G. Live Cell Imaging: Assessing the Phototoxicity of 488 and 546 nm Light and Methods to Alleviate it. J Cell Physiol. 232 (9), 2461-2468 (2017).
- Hilsenbeck, O., et al. Software tools for single-cell tracking and quantification of cellular and molecular properties. Nat Biotechnol. 34 (7), 703-706 (2016).
- Skylaki, S., Hilsenbeck, O., Schroeder, T. Challenges in long-term imaging and quantification of single-cell dynamics. Nat Biotechnol. 34 (11), 1137-1144 (2016).
- Jones, T. R., et al. Scoring diverse cellular morphologies in image-based screens with iterative feedback and machine learning. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (6), 1826-1831 (2009).
- Lukas, C., Falck, J., Bartkova, J., Bartek, J., Lukas, J. Distinct spatiotemporal dynamics of mammalian checkpoint regulators induced by DNA damage. Nat Cell Biol. 5 (3), 255-260 (2003).
- Bekker-Jensen, S., Lukas, C., Melander, F., Bartek, J., Lukas, J. Dynamic assembly and sustained retention of 53BP1 at the sites of DNA damage are controlled by Mdc1/NFBD1. J Cell Biol. 170 (2), 201-211 (2005).
- Loewer, A., Batchelor, E., Gaglia, G., Lahav, G. Basal dynamics of p53 reveal transcriptionally attenuated pulses in cycling cells. Cell. 142 (1), 89-100 (2010).
- Lekshmi, A., et al. A quantitative real-time approach for discriminating apoptosis and necrosis. Cell Death Discovery. 3, 16101 (2017).
- Jullien, D., Vagnarelli, P., Earnshaw, W. C., Adachi, Y. Kinetochore localisation of the DNA damage response component 53BP1 during mitosis. J Cell Sci. 115 (Pt 1), 71-79 (2002).
