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Bioengineering

Synthèse des Nanotubes de carbone Multi modifiés avec des nanoparticules d’argent et de l’évaluation de leurs activités antibactériennes et propriétés cytotoxiques

Published: May 10, 2018 doi: 10.3791/57384
Automatic Translation
*1, *2, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 3, 2
1Center for Biomaterials, Biomedical Research Institute, Korea Institute of Science and Technology, 2School of Integrative Engineering, Chung-Ang University, 3Division of Synthetic Biology and Regenerative Medicine, Institute for Quantitative Health Science and Engineering, Michigan State University
* These authors contributed equally

Summary

Dans cette étude, les nanomatériaux antimicrobiens ont été synthétisés par oxydation acide de multiwalled nanotubes de carbone et ultérieures dépôts réductrice des nanoparticules d’argent. Des tests de cytotoxicité et une activité antimicrobiennes ont été réalisées avec les nanomatériaux comme préparés.

Abstract

Dans cette étude, les nanotubes de carbone multi (NCPM) ont été traités avec une solution aqueuse d’acide sulfurique pour former un groupe fonctionnel de base d’oxygène. NCPM argent ont été préparés par la déposition réductrice d’orfèvrerie de solution aqueuse d’AgNO3 sur le NCPM oxydé. Compte tenu de la couleur unique des CNTs, il n’était pas possible de les appliquer à la concentration minimale inhibitrice ou les épreuves de toxicité mitochondriale pour évaluer les propriétés antibactériennes et de toxicité, car il interférerait avec les dosages. La zone d’inhibition et de la concentration bactéricide minimale pour l’Ag-NCPM ont été mesurés et Live/Dead et bleu Trypan dosages ont été utilisés pour mesurer les propriétés antibactériennes et de toxicité sans interférer avec la couleur des CNTs.

Introduction

Le but ultime de cette étude doit faire des nanomatériaux antibactériens respectueuses de l’environnement qui peuvent inhiber la croissance des bactéries qui forme des biofilms. Ces nanomatériaux antibactériens est susceptibles de surmonter les problèmes de résistance antibiotique et la toxicité des produits chimiques couramment utilisés ou composés chimiques aux antibiotiques. Un biofilm est une substance polymérique extracellulaire hydratée (EPS) qui est composée de polysaccharides, protéines, acides nucléiques et lipides1,2. Les biofilms empêcher l’intrusion des substances étrangères et aider les bactéries à croître vigoureusement3,4. Biofilms causer des odeurs et des maladies infectieuses chroniques5,6. Methylobacterium spp., par exemple, pousse en adhérant aux endroits où l’eau est toujours présente ou lorsqu’il est difficile de garantir l’éradication bactérienne sur une base continue, tels que les échangeurs de chaleur à air conditionné, salles de douche et des dispositifs médicaux. Ces types de biofilms causent l’odeur et les maladies infectieuses chroniques5,6.

En général, produits chimiques ou composés chimiques aux antibiotiques sont utilisés pour inhiber la croissance des bactéries qui forment des biofilms. L’émergence de bactéries résistantes aux antibiotiques et les préoccupations au sujet de in vivo la sécurité des produits chimiques sont à l’origine la nécessité de développer de nouveaux matériaux afin d’empêcher la formation de biofilms et d’inhiber la croissance des bactéries.

Dans cette étude, nanomatériaux antimicrobiens est synthétisées que sont exempts de toxicité et de la résistance aux antibiotique. L’argent est une substance antimicrobienne bien connue, et les développements récents en nanosciences et nanotechnologies ont conduit à une recherche active sur les effets antimicrobiens de nanoparticules métalliques7,8. Des études récentes ont rapporté que la petite taille et surface-volume élevé des nanoparticules entraîne l’augmentation de l’activité antibactérienne9,10,11.

Les nanomatériaux présentées ici combine des nanoparticules d’argent avec une augmentation des propriétés antimicrobiennes et nanotubes de carbone avec un haut rapport d’aspect, ce qui augmente la surface par unité de volume. Composite fabriqué argent NANOPARTICULE-carbone nanotube pièces importantes propriétés antimicrobiennes et toxicité minimale aux cellules humaines et animales. Les procédés de synthèse dans les études précédentes utilisent dangereux agents réducteurs comme NaBH4, formamide, diméthylformamide et l’hydrazine. Le processus est compliqué, dangereux et beaucoup de temps. Le processus synthétique rapporté ici utilise l’éthanol comme agent réducteur beaucoup moins dangereux.

La zone d’inhibition et les concentration minimale bactéricide (MBC) pour l’Ag-NCPM ont été mesurés ; Live/Dead et le bleu Trypan dosages ont été utilisés pour mesurer la toxicité et des propriétés antibactériennes. Concentration minimale inhibitrice (CMI) et les épreuves de toxicité mitochondriale (MTT) ne étaient pas effectuées en raison de la couleur inhabituelle des nanotubes de carbone qui aurait dû intervenir avec les dosages. Enfin, la concentration minimale pour empêcher la croissance de Methylobacterium spp sans affecter les cellules de mammifères a été déterminée.

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Protocol

1. oxydation de le MWCNT

  1. Mesurer de 30 à 50 mg de MWCNT dans un flacon de 50 mL. Ajouter lentement 8 mL d’un H2SO4: solution HNO3 (90 % de concentration initiale, 3:1 vol/vol) avec pointes de pipette de 1 mL à l’aide d’une pipette.
    ATTENTION : Cette préparation doit être effectuée sous une hotte chimique.
    1. Laisser 30 min pour la réaction exothermique terminer.
  2. Laisser agir la solution à 60-80 ° C et 160 W pendant 1 h jusqu'à ce que MWCNT se dépose au fond du flacon.
    ATTENTION : Le niveau d’eau dans le sonicateur doit être inférieur à la partie supérieure du flacon afin que l’eau ne sera pas introduite dans le flacon.
  3. Transvaser la solution dans un tube à centrifuger.
    1. Avec une micropipette, ajouter 30 mL d’eau distillée goutte à goutte la solution de MWCNT-COOH.
      ATTENTION : Une forte réaction exothermique se produit au cours de l’addition d’eau distillée. Ajouter lentement de l’eau distillée et laisser le temps de refroidissement.
  4. Centrifuger la solution MWCNT-COOH à 12 000 x g et à température ambiante pendant 15 min.
    ATTENTION : Lorsque vous utilisez une centrifugeuse, assurer que la centrifugeuse reste équilibrée en plaçant un tube avec le même poids en face le tube à essais.
  5. Retirez le surnageant avec une pipette et la pointe de pipette de 1 mL. Ajouter 5 mL d’éthanol avec une pipette et la pointe de pipette de 1 mL. Rincer les parois de la cuvette avec de l’éthanol pipeté supplémentaire. Centrifuger la solution à 12 000 x g et à température ambiante pendant 15 min.
    1. Déterminer le pH du liquide surnageant avec du papier pH. Répéter le lavage et centrifugation jusqu'à ce que le surnageant pH est neutre.
  6. Retirez tous les surnageant. Ajouter 1 mL d’eau distillée à précipiter et disperser MWCNT-COOH uniformément dans la solution. Freeze-Dry solution à-60 ° C sous vide jusqu’au sec.

2. argent NANOPARTICULAIRE dépôts sur NCPM

  1. Placer 10 mg de MWCNT-COOH dans un tube conique de 50 mL et diluer avec 30 mL d’eau distillée. Laisser agir la solution à 60 ° C et 160 W pendant 1 h.
  2. Placer 6 mL de 0,1 N AgNO3 dans un tube conique de 50 mL et diluer avec 18 mL d’eau distillée. Laisser agir la solution à 60 ° C et 160 W pendant 1 h.
    ATTENTION : Ajouter AgNO3 proportionnellement à la masse totale de NCPM tel que la masse totale des Ag ne dépasse pas 20 %.
  3. Ajouter l’AgNO3 solution goutte à goutte la solution de NCPM avec une pipette et la pointe de pipette 1 mL tout en sonification le mélange à 60 ° C et 160 w. continuer sonification pendant 1 h après avoir ajouté l’AgNO3.
  4. Centrifuger la solution à 12 000 x g et à température ambiante pendant 15 min et retirez le surnageant. Centrifuger la solution et éliminer le surnageant deux fois supplémentaires.
  5. Ajouter 1 mL d’eau distillée dans le mélange d’Ag-NCPM et disperser le précipité uniformément dans la solution. Ajouter 5 mL d’éthanol et de permettre la réaction de procéder à la température ambiante pendant 1 h.
  6. Centrifuger la solution à 12 000 x g et à température ambiante pendant 15 min et retirez le surnageant.
  7. Déterminer le pH du liquide surnageant avec du papier pH. Répéter le lavage et centrifugation jusqu'à ce que le surnageant pH est neutre.
  8. Ajouter 1 mL d’eau distillée à Ag-NCPM et disperse uniformément dans la solution. Freeze-Dry de la solution à-70 ° C sous vide pendant 24 h.

3. zone d’Inhibition Test

  1. Mélanger 18,12 g d’agar R2A et 1 L d’eau distillée dans une fiole. Stériliser le mélange dans un autoclave à 121 ° C pendant 15 min.
  2. Laisser refroidir à température ambiante. Placer 10 mL de gel en Pétri avant durcissement de préparer le milieu solide.
  3. Place 100 µL de bactéries sur le support solid. Transmettre la bactérie sur le milieu solide à l’aide d’un épandeur.
    ATTENTION : Cette procédure doit être effectuée sous une hotte chimique, éclairée par une lampe à alcool.
  4. Incuber les boîtes à 30 ° C pendant 48 h.
  5. Mélanger 3,12 g de bouillon R2A avec 1 L d’eau distillée dans une fiole. Stériliser le mélange dans un autoclave à 121 ° C pendant 15 min.
  6. Transférer les colonies cultivées dans un milieu liquide à l’aide d’une boucle et une aiguille et incuber dans un incubateur à 180 tr/min et 30 ° C.
  7. Enregistrer la valeur do (densité optique) par spectrophotométrie UV à 600 nm sur une base horaire pour mesurer la croissance bactérienne.
    NOTE : Agar R2A a été utilisé dans cet essai, plutôt que la gélose de Mueller-Hinton standard, car R2A est la gélose préférée pour la croissance de Methylobacterium spp.
  8. Placer 10 mL de prêt agar R2A dans une boîte de Pétri pour préparer une gélose de fond.
    1. Mélanger 3,12 g de bouillon R2A et 8 g d’agar avec 1 L d’eau distillée. Stériliser le mélange dans un autoclave à 121 ° C pendant 15 min. placer 10 mL de ce gel sur l’agar de fond.
  9. Charge 50 µL de solution d’Ag-NCPM sur disque papier stérile avec une micropipette.
    1. Sécher et stériliser Ag-NCPM d’échantillon dans une chambre à vide sous ultraviolets pendant 30 min.
  10. Échantillon place Ag-NCPM sur agar.
  11. Incuber la gélose à 30 ° C pendant 48 h.
  12. Zone de mesure de l’inhibition12.
    Remarque : Les Instructions pour les logiciels utilisés sont incluses dans les références.

4. antibactérien Test

  1. Répétez les étapes 3.1 à 3.7 pour préparer la culture bactérienne.
  2. Au maximum OD, ensemencer 100 µL de bactéries dans 3 mL de milieu liquid frais avec une pointe de pipette micro pipette et 100 µL.
  3. Préparer cinq 50 échantillons µL de la solution de contrôle dans les tubes coniques 15 mL. Ajoutez le code suivant dans chaque tube : 1) méthanol ; 2) 1000 µg/mL MWCNT-COOH ; 3) 50 µg/mL Ag-NCPM ; 4) 40 µg/mL Ag-MWMWCNTs ; 5) 30 µg/mL Ag-NCPM.
  4. Incuber à 180 tr/min et 30 ° C jusqu'à ce que le contrôle soit au maximum actif telle que déterminée par spectrophotométrie UV comme décrit ci-dessus.
  5. Mesurer la valeur de la D.O. de chaque échantillon et calculer la concentration de MIC. La valeur de l’OD est directement liée au nombre de cellules bactériennes dans le bouillon de l’échantillon.
  6. Propager les bactéries cultivées sur un milieu solide avec un épandeur.
  7. Incuber le plat à 30 ° C pendant 48 h.
  8. Compter les colonies bactériennes et les valeurs d’UFC de mesure pour déterminer l’activité antibactérienne12.
    Remarque : Les Instructions pour les logiciels utilisés sont incluses dans les références.

5. analyse de viabilité

  1. Après avoir enlevé les cellules de la culture de l’incubateur, le milieu de succion et laver trois fois avec un goutte à goutte lavage de 5 mL de PBS.
  2. Ajouter 1 mL de trypsine-EDTA dans du PBS aux cellules lavées et aspiration après 1 min.
    1. Taper la plaque pour déloger les cellules coincés.
  3. Ajouter 5 mL de DMEM (de l’aigle de la modification de Dulbecco moyen) et ensuite enlever les cellules. Centrifuger les échantillons à 200 x g pendant 3 min et retirez le surnageant.
    1. Ajouter 1 mL de SPD et mélanger.
    2. Compter les cellules dans 10 µL de la solution avec une machine de comptage cellulaire automatisée.
      NOTE : Instructions pour les machines de comptage cellulaire utilisé sont incluses dans les références13.
  4. Placez 1 × 105 de AML12 cellules / puits dans une plaque de six puits contenant une solution DMEM. Le milieu contient 1 % antibiotique stérile et sérum de veau fœtal 10 % (v/v).
  5. Incuber les plaques pendant 8-12 h à 37 ° C dans un environnement d’air 95 % 5 % CO2.
  6. Aspirer le surnageant des puits avec un aspirateur.
    1. Ajouter chaque échantillon composé de contrôle, NMS-DMSO (diméthyl sulfoxyde) et 30 à 40 µg/mL Ag-MWCNT à 1 mL de DMEM.
    2. Incuber à 37 ° C dans un environnement d’air 95 % 5 % CO2pendant 8 h.
  7. Prélèvement d’échantillons de surnageants et laver avec 5 mL de PBS.
  8. Ajouter 1 mL de prêt direct/dé kit (20 µL de 2 mM EthD-1 5 µl de 4 mM de calcéine AM dans le DMSO dans 10 mL de PBS) goutte à goutte à la cellule.
  9. Incuber à ambiant pendant 30-45 min ou 37 ° C pendant 10 min. fluorescence mesure avec la microscopie en fluorescence standard 100 X ou 300 X.

6. dosage de bleu Trypan

  1. Préparer les échantillons selon des mesures 5.1 et 5.6.2 ci-dessus.
  2. Retirez le surnageant.
  3. Laver la plaque avec 1 mL de 1 x DPBS et décanter.
  4. Ajouter 1 mL de trypsine à plaque et incuber pendant 3 min détacher les cellules de culture. Milieu de culture cellulaire permet de laver la plaque et de prélever des cellules. Placer les cellules recueillies dans un tube de 15 mL.
  5. Centrifuger le tube à 200 x g et 4 ° C pendant 3 min.
  6. Jeter le surnageant. Ajouter 1 mL de milieu frais à culot cellulaire et re-disperser les cellules.
  7. Ajouter 10 µL du bleu trypan avec 10 µL de cellules dispersées et compter les cellules avec une machine de comptage cellulaire automatisée.
    NOTE : Les Instructions pour machine de comptage cellulaire utilisé sont incluses dans les références.

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Representative Results

Images de microscopie électronique (met) de transmission confirment la formation d’Ag-NCPM (Figure 1 a et 1 b). Leur synthèse réussie a été confirmée par la variation de charge superficielle. La taille des particules déposées sur la NCPM Ag a été calculée (Figure 1). La taille moyenne des particules était environ 3,83 nm. Le modèle XRD de l’Ag-NCPM synthétisés comme est montré dans la Figure 1. Le pic à 20-30° correspond à MWCNT ; les sommets restants correspondent aux Ag. Données d’activité antimicrobienne sont illustrées à la Figure 2. Les populations de colonie bactérienne ont été confirmées par Methylobacterium contrôle (Figure 2 a) ; addition de méthanol a réduit la population 103 fois (Figure 2 b), et addition de MWCNT-COOH réduit la population 108 fois (Figure 2). Colonies n’a pas peuvent être identifiés dans les Ag-MWCNT (Figure 2D) 50 µg/mL et 40 échantillons d’Ag-MWCNT (Figure 2E) µg/mL. Dans l’échantillon de 20 µg/mL Ag-MWCNT la population fut réduite à 105 fois (Figure 2F). Dans la zone d’inhibition test contre Methylobacterium (Figure 3), la zone d’inhibition a été identifiée lors de 10 µg/mL a été ajouté. Une zone d’inhibition n’a pas été observée à une concentration de 1 µg/mL. Dans le test de cytotoxicité, l’essai Live/Dead (Figure 4) a confirmé l’absence de cytotoxicité dans le contrôle négatif (Figure 4 a) et la présence de cytotoxicité dans le contrôle positif (Figure 4 b) lorsque le méthanol a été utilisé. L’ajout de 40 µg/mL Ag-NCPM (Figure 4) a révélé une cytotoxicité, toutefois l’addition de 30 µg/mL Ag-NCPM (Ffigure 4D) n’a pas révélé une quantité importante de cytotoxicité. Un essai de bleu trypan a été réalisée (Figure5) pour le contrôle (Figure 5 a), le méthanol (Figure 5 b), 40 µg/mL Ag-NCPM (Figure 5) et 30 µg/mL d’échantillons Ag-NCPM (Figure 5). Les résultats ont confirmé qu’il y avait très peu de cytotoxicité à 30 µg/mL Ag-NCPM.

Figure 1
Figure 1 : caractérisation physico-chimique des Ag-NCPM. Images TEM (A) et (B) d’Ag-NCPM ; (C) distribution des tailles des Ag-NCPM tel qu’évalué par l’intermédiaire de TEM (n = 100) ; Modèle XRD (D) d’Ag-NCPM. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Évaluation antibactérienne des Ag-NCPM par rapport à Methylobacterium spp. (A) contrôler, le méthanol (B) , (C) MWCNT-COOH, (D) 50 μg/mL d’Ag-NCPM, (E) 40 μg/mL d’Ag-NCPM et (F) 30 μg/mL d’Ag-NCPM. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Zone de test d’inhibition des Ag-NCPM.

Figure 4
Figure 4 : tests de viabilité de cellules pour Ag-NCPM. photomicrographies des AML12 qui sont étiquetés fluorescent pour morts (rouge) et de vivre des cellules (vertes). (A) contrôle, méthanol (B) , (C) 40 μg/mL d’Ag-NCPM et (D) 30 μg/mL d’Ag-NCPM. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : le bleu Trypan dosages pour 30 et 40μg/mL Ag-NCPM. Contrôle (A) , (B) , méthanol, (C) 40 μg/mL d’Ag-NCPM, et (D) 30 μg/mL d’Ag-NCPM. (rouge : les cellules mortes ; bleu : vivent les cellules) s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Nous rapportons ici une méthode simple pour la préparation des NCPM avec des nanoparticules Ag déposés. Ce nanomatériau contenant de l’argent montre une activité antibactérienne importante et un potentiel minimal pour l’absorption non contrôlée de nanoparticules d’argent dans le corps. Nous démontrons que 30 µg/mL de synthèse Ag-NCPM est un niveau effectif d’une activité antibactérienne contre Methylobacterium spp avec négligeable cytotoxicité pour les cellules du foie chez les mammifères. Bien que des améliorations supplémentaires et les évaluations de la prévention des risques biotechnologiques pour Ag-NCPM sont exigées avant l’expansion dans le secteur commercial, à l’éthanol comme agent réducteur pourrait aider à produire Ag-NCPM écologique et peu coûteux.

Les points suivants sont démontrés. Il est possible de détruire les différents types de bactéries avec les nanomatériaux développés. Il est possible de plusieurs sites sur une surface de nanotubes sur lequel peuvent être déposés les nanoparticules d’argent de l’ingénieur. Propriétés antibactériennes peuvent également être adaptées en contrôlant la taille et le nombre de nanoparticules d’argent qui sont déposés sur la surface. Les nanomatériaux développés est toxiques pour les cellules bactériennes mais non toxique pour les cellules humaines et animales dans des concentrations appropriées.

Le mécanisme suivant est proposé pour l’activité antibactérienne. Les nanostructures Ag-MWCNT directement contact avec la surface de la cellule bactérienne, endommager la paroi cellulaire et provoque une oxydation secondaire des espèces réactives de l’oxygène ; ces processus causer du stress oxydatif. AG-MWCNT nanostructures ont été confirmés à libérer des ions d’argent qui empêchent le quorum sensing Methylobacterium spp., inhibant l’expression des gènes qui régissent la formation des biofilms.

Les limitations du protocole actuel comprendrait le montant maximal indéterminé de nanoparticules d’argent et d’Ag-NCPM admissibles dans les essais chez l’homme. Dans ce protocole, la quantité de nanoparticules d’argent inclus dans l’échantillon de 30 µg/mL d’Ag-NCPM a été estimée que 0,4 µg/mL, en moyenne. Cette concentration est considérée comme biocompatible avec les cellules de mammifère, comme indiqué dans précédentes études6,7,8,9. Alors que le mécanisme de cytotoxicité à une concentration de 40 µg/mL d’Ag-NCPM n’est pas déterminé, il est proposé que le non-attachement des globules au fond des plaques de culture augmente la probabilité de contact Ag-MWCNT dans la culture. À l’avenir, les études détaillées de la toxicité des nanoparticules d’argent avec une variété de types de cellules dans des conditions de culture différente peuvent être effectuées. Ces études peuvent fournir des informations supplémentaires sur le mécanisme d’interaction Ag-MWCNT avec les cellules.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Cette étude a été financée par des subventions de recherche de l’Université Chung-Ang (2016) et par le programme de développement de technologie de Nano-matériaux par le biais de la Fondation des recherches National de Korea(NRF) financé par le ministère de la Science et les TIC (no 2017M3A7B8061942).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1 N silver nitrate SIGMA-ALDRICH 1090811000
Carbon nanotube, multi-walled Tokyo Chemical Industry Co., LTD 308068-56-6
R2A agar MBcell MB-R1129
R2A broth MBcell MB-R2230
Methylobacterium spp. KCTC 12618 from Korea Collection for Type Cultures Daejeon Korea 12618, Daejon, Korea
LIVE/DEAD Cell imaging Kit ThermoFisher SCIENTIFIC R37601
AML12 from Chungnam University, Dajeon, Korea
human PBMC ATCC PCS-800-011
TEM JEOL JEM-2100F
XRD Rigaku D/MAX 2500 Cu K photon source (40kV, 100mA)
JuLI Br NanoEnTek JULI-BRSC 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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  2. Jennings, S., Moran, A., Carroll, C. Bioaerosols and biofilms. Biofilms in medicine, industry and environmental biotechnology. , IWA, London. 160-178 (2003).
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Bio-ingénierie numéro 135 biofilm nanotube de carbone monofeuillet multi nanoparticules métalliques propriété antibactérienne cytotoxicité bactéries
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Seo, Y., Park, C., Son, J., Lee, K., Hwang, J., Jo, Y., Lee, D., Khan, M. S., Chavan, S. G., Choi, Y., Kim, D., Gilad, A. A., Choi, J. Synthesis of Multi-walled Carbon Nanotubes Modified with Silver Nanoparticles and Evaluation of Their Antibacterial Activities and Cytotoxic Properties. J. Vis. Exp. (135), e57384, doi:10.3791/57384 (2018).

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