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Bioengineering

Sintesi di nanotubi di carbonio Multi-parete modificati con nanoparticelle di argento e valutazione dell'attività antibatterica e proprietà citotossiche

Published: May 10, 2018 doi: 10.3791/57384
Automatic Translation
*1, *2, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 3, 2
1Center for Biomaterials, Biomedical Research Institute, Korea Institute of Science and Technology, 2School of Integrative Engineering, Chung-Ang University, 3Division of Synthetic Biology and Regenerative Medicine, Institute for Quantitative Health Science and Engineering, Michigan State University
* These authors contributed equally

Summary

In questo studio, nanomateriali antimicrobici sono stati sintetizzati da ossidazione acida di nanotubi di carbonio e riduttiva successiva deposizione di nanoparticelle d'argento. Test di citotossicità ed attività antimicrobica sono stati effettuati con i nanomateriali come preparato.

Abstract

In questo studio, nanotubi di carbonio multi-parete (MWCNT) sono stati trattati con una soluzione acquosa di acido solforico per formare un gruppo funzionale di base di ossigeno. MWCNT d'argento sono stati preparati dalla deposizione riduttiva di argento da una soluzione acquosa di AgNO3 sulla MWCNT ossidato. Dato il colore unico del CNT, non era possibile applicarli alla concentrazione minima inibente o saggi di tossicità mitocondriale per valutare la tossicità e proprietà antibatteriche, poiché potrebbe interferire con i dosaggi. La zona di inibizione e la concentrazione minima battericida per l'Ag-MWCNT sono stati misurati e Live/Dead e saggi di Trypan Blue sono stati usati per misurare le proprietà antibatteriche e tossicità senza interferire con il colore del CNT.

Introduction

L'obiettivo finale di questo studio è di rendere ecologici nanomateriali antibatterici che possono inibire la crescita di batteri che forma biofilm. Questi nanomateriali antibatterici hanno il potenziale per superare i problemi di resistenza di tossicità e Antibiotico di antibiotici composti chimici o di prodotti chimici comunemente usati. Un biofilm è una sostanza polimerica extracellulare idratata (EPS) che è composta da polisaccaridi, proteine, acidi nucleici e lipidi1,2. Biofilm impediscono l'intrusione di sostanze estranee e aiutano i batteri crescono vigorosamente3,4. Biofilm causano odori e malattie infettive croniche5,6. Methylobacterium spp., ad esempio, cresce aderendo ai luoghi dove l'acqua è sempre presente o dove è difficile garantire l'eradicazione batterica su una base continua, come scambiatori di calore del condizionatore d'aria, bagni con doccia e dispositivi medici. Questi tipi di biofilm causano odori e malattie infettive croniche5,6.

In genere, prodotti chimici o antibiotici composti chimici vengono utilizzati per inibire la crescita di batteri che formano biofilm. La comparsa di batteri resistenti agli antibiotici e le preoccupazioni circa sicurezza in vivo delle sostanze chimiche stanno determinando l'esigenza di sviluppare nuovi materiali per prevenire la formazione di biofilm e di inibire la crescita di batteri.

In questo studio, antimicrobici nanomateriali sono sintetizzati che sono esenti da tossicità e resistenza agli antibiotico. L'argento è una sostanza antimicrobica ben nota, e recenti sviluppi nella nanoscienza e nanotecnologia hanno portato alla ricerca attiva in effetti antimicrobici di nanoparticelle metalliche7,8. Studi recenti hanno riferito che le dimensioni ridotte e l'elevato rapporto superficie-volume delle nanoparticelle di provocare una maggiore attività antibatterica9,10,11.

I nanomateriali presentati qui combinano le nanoparticelle d'argento con maggiore proprietà antimicrobiche e nanotubi di carbonio con un alto allungamento, aumentando così la superficie per unità di volume. Il composito di nanotubi fabbricato delle nanoparticelle d'argento-carbonio esibisce notevoli proprietà antimicrobiche e minima tossicità per le cellule umane e animali. I processi sintetici negli studi precedenti utilizzano pericolosi agenti riducenti quali NaBH4, formammide, dimetilformammide e idrazina. Il processo è complicato, pericoloso e richiede molto tempo. Il processo sintetico segnalato qui utilizza l'etanolo come agente riduttore significativamente meno pericoloso.

L'area di inibizione e la concentrazione minima battericida (MBC) per l'Ag-MWCNT sono stati misurati; Live/Dead e saggi di Trypan Blue sono stati usati per misurare la tossicità e proprietà antibatteriche. Concentrazione inibitoria minima (MIC) e saggi di tossicità mitocondriale (MTT) non sono stati effettuati a causa del colore insolito i nanotubi di carbonio che avrebbe interferito con i dosaggi. Infine, è stata determinata la concentrazione minima per prevenire la crescita di Methylobacterium spp senza influire sulle cellule di mammiferi.

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Protocol

1. MWCNT ossidazione

  1. Misura 30-50 mg di MWCNT in un flaconcino da 50 mL. Lentamente aggiungere 8 mL di H2così4: HNO3 soluzione (90% concentrazione iniziale, 3:1 vol/vol) di pipetta con puntali per pipette da 1 mL.
    Attenzione: Questa preparazione deve essere condotta in una cappa chimica.
    1. Consentire 30 min per la reazione esotermica completare.
  2. Sonicare la soluzione a 60-80 ° C e 160 W per 1 h fino a MWCNT si deposita nella parte inferiore della fiala.
    Attenzione: Il livello dell'acqua nel sonicatore dovrebbe essere inferiore rispetto alla parte superiore della fiala affinché l'acqua non verrà introdotto nel flaconcino.
  3. Trasferire la soluzione in una provetta da centrifuga.
    1. Con una micropipetta, aggiungere 30 mL di acqua distillata goccia a goccia la soluzione di MWCNT-COOH.
      Attenzione: Una forte reazione esotermica si verifica durante l'aggiunta di acqua distillata. Aggiungere acqua distillata lentamente e lasciare il tempo per il raffreddamento.
  4. Centrifughi la soluzione MWCNT-COOH a 12.000 x g e a temperatura ambiente per 15 min.
    Attenzione: Quando si opera una centrifuga, accertarsi che la centrifuga rimane equilibrata inserendo un tubo con lo stesso peso di fronte la provetta del campione.
  5. Rimuovere il surnatante con una pipetta e la punta della pipetta da 1 mL. Aggiungere 5 mL di etanolo con una pipetta e la punta della pipetta da 1 mL. Sciacquare le pareti del flaconcino con etanolo pipettato aggiuntiva. Centrifughi la soluzione a 12.000 x g e a temperatura ambiente per 15 min.
    1. Determinare il pH del surnatante con carta pH. Ripetere il lavaggio e la centrifugazione fino a quando il surnatante pH è neutro.
  6. Rimuovere il surnatante tutti. Aggiungere 1 mL di acqua distillata per precipitare e disperdere uniformemente MWCNT-COOH in soluzione. Liofilizza la soluzione a-60 ° C sotto vuoto fino a secco.

2. argento nanoparticelle deposizione su MWCNT

  1. Porre in una provetta conica da 50 mL 10 mg di MWCNT-COOH e diluire con 30 mL di acqua distillata. Sonicare soluzione a 60 ° C e 160 W per 1 h.
  2. Posto 6 mL di 0,1 N AgNO3 in una provetta conica da 50 mL e diluire con 18 mL di acqua distillata. Sonicare soluzione a 60 ° C e 160 W per 1 h.
    Attenzione: Aggiungere AgNO3 in proporzione la massa totale di MWCNT tale che la massa totale di Ag non superi il 20%.
  3. Aggiungere la soluzione di AgNO3 goccia a goccia alla soluzione di MWCNT con una pipetta e la punta della pipetta 1ml mentre sonicating la miscela a 60 ° C e 160 w. continua sonicating per 1 h dopo l'aggiunta della AgNO3.
  4. Centrifughi la soluzione a 12.000 x g e a temperatura ambiente per 15 minuti e rimuovere il surnatante. Centrifugare la soluzione e rimuovere il surnatante due volte.
  5. Aggiungere 1 mL di acqua distillata per la miscela di Ag-MWCNT e disperdere il precipitato in modo uniforme nella soluzione. Aggiungere 5 mL di etanolo e lasciare che la reazione di procedere a temperatura ambiente per 1 h.
  6. Centrifughi la soluzione a 12.000 x g e a temperatura ambiente per 15 minuti e rimuovere il surnatante.
  7. Determinare il pH del surnatante con carta pH. Ripetere il lavaggio e la centrifugazione fino a quando il surnatante pH è neutro.
  8. Aggiungere 1 mL di acqua distillata a Ag-MWCNT e disperdere uniformemente nella soluzione. Liofilizzare la soluzione a-70 ° C sotto vuoto per 24 h.

3. zona di inibizione Test

  1. Mescolare 18,12 g di agar R2A e 1 L di acqua distillata in un fiasco. Sterilizzare la miscela in autoclave a 121 ° C per 15 min.
  2. Lasciare il gel a raffreddare a temperatura ambiente. Mettere 10 mL di gel in capsule di Petri prima dell'indurimento per preparare il terreno solido.
  3. Posto 100 µ l di batteri su terreno solido. Diffondere i batteri sul media solido utilizzando una spatola.
    Attenzione: Questa procedura deve essere svolta in una cappa chimica illuminata con una lampada di alcol.
  4. Incubare le piastre a 30 ° C per 48 h.
  5. Mescolare 3,12 g di brodo di R2A con 1 L di acqua distillata in un fiasco. Sterilizzare la miscela in autoclave a 121 ° C per 15 min.
  6. Trasferire le colonie coltivate in un mezzo liquido usando un ciclo e l'ago e incubare in un incubatore a 180 giri/min e 30 ° C.
  7. Registrare il valore di OD (densità ottica) mediante spettrofotometria UV a 600 nm su base oraria per misurare la crescita batterica.
    Nota: R2A agar è stato utilizzato in questo test, piuttosto che l'agar Mueller-Hinton standard, perché R2A è preferito agar per la crescita di Methylobacterium spp.
  8. Posto 10 mL di preparato R2A agar in una capsula Petri per preparare un agar di fondo.
    1. Mescolare 3,12 g di brodo di R2A e 8 g di agar con 1 L di acqua distillata. Sterilizzare la miscela in autoclave a 121 ° C per 15 min Place 10 mL di questo gel sull'agar inferiore.
  9. Caricare 50 µ l di soluzione di Ag-MWCNT su disco di carta sterile con una micropipetta.
    1. Asciugare e sterilizzare Ag-MWCNT campione in una camera a vuoto sotto luce UV per 30 min.
  10. Posto Ag-MWCNT campione sull'agar.
  11. Incubare la piastra di agar a 30 ° C per 48 h.
  12. Zona di misura di inibizione12.
    Nota: Le istruzioni per il software utilizzato sono inclusi nei riferimenti.

4. antibatterico Test

  1. Ripetere i passaggi da 3.1 a 3.7 per preparare la coltura batterica.
  2. Al massimo OD, inoculare 100 µ l di batteri in 3 mL di terreno liquido fresco con una punta di pipetta micro pipetta e 100-µ l.
  3. Preparare cinque campioni di 50 µ l della soluzione di controllo in provette coniche da 15 mL. Aggiungere quanto segue per ogni tubo: 1) metanolo; 2) 1000 µ g/mL MWCNT-COOH; 3) 50 µ g/mL Ag-MWCNT; 4) 40 µ g/mL Ag-MWMWCNTs; 5) 30 µ g/mL Ag-MWCNT.
  4. Incubare a 180 giri/min e 30 ° C fino a quando il controllo è al massimo attivo come determinato mediante spettrofotometria UV come descritto sopra.
  5. Misurare il valore di OD di ogni campione e calcolare la concentrazione di MIC. Il valore di OD è direttamente correlato al numero di cellule batteriche nel brodo del campione.
  6. Diffondere i batteri coltivati su un terreno solido con una spatola.
  7. Incubare la piastra a 30 ° C per 48 h.
  8. Contare le colonie batteriche e i valori CFU di misura per determinare attività antibatterica12.
    Nota: Le istruzioni per il software utilizzato sono inclusi nei riferimenti.

5. attuabilità

  1. Dopo la rimozione delle cellule di cultura da incubatrice, il mezzo di aspirazione e lavare tre volte con un lavaggio goccia a goccia di 5 mL di PBS.
  2. Aggiungere 1 mL di tripsina-EDTA in PBS per l'aspirazione e cella lavato dopo 1 min.
    1. Toccare la piastra per rimuovere cellule bloccate.
  3. Aggiungere 5 mL di DMEM (Medium dell'Aquila di Dulbecco per volta) e quindi rimuovere le cellule. Centrifugare i campioni a 200 x g per 3 minuti e rimuovere il surnatante.
    1. Aggiungere 1 mL di DPBS e mescolare.
    2. Contare le celle in 10 µ l della soluzione con una macchina automatica di conta cellulare.
      Nota: Le istruzioni per la macchina conta cellulare utilizzato sono inclusi nei riferimenti13.
  4. Posto 1 × 105 di AML12 cellule per pozzetto in una piastra di sei pozzetti contenenti soluzione DMEM. Il supporto contiene siero bovino fetale 10% (v/v) e 1% sterile antibiotico.
  5. Incubare la piastra per 8-12 h a 37 ° C in un ambiente di aria 95% 5% CO2.
  6. Aspirare il surnatante da pozzi con un aspiratore.
    1. Aggiungere ciascun campione composto da controllo, NMS-DMSO (dimetilsolfossido) e 30-40 µ g/mL Ag-MWCNT a 1 mL di DMEM.
    2. Incubare a 37 ° C in un ambiente di aria 95% 5% CO2per 8 h.
  7. Rimuovere il surnatante e lavare campioni con 5 mL di PBS.
  8. Aggiungere 1 mL di preparato live/dead kit (20 µ l di 2mm EthD-1 con 5 µ l di 4 mM in DMSO calceina in 10 mL di PBS) goccia a goccia alla cella.
  9. Incubare a temperatura per 30-45 min o 37 ° C per 10 min. di fluorescenza misura con microscopia di fluorescenza standard a 100 X o 300 X.

6. tripan blu Assay

  1. Preparare i campioni secondo passi 5.1 attraverso 5.6.2 sopra.
  2. Rimuovere il surnatante.
  3. Lavare la piastra con 1 mL di 1 x DPBS e decantare.
  4. Aggiungere 1 mL di tripsina piastra e incubare per 3 min staccare le cellule dalla cultura. Utilizzare medium della coltura cellulare per lavare la piastra e raccogliere le cellule. Luogo raccolto le cellule in una provetta da 15 mL.
  5. Centrifugare la provetta a 200 x g e a 4 ° C per 3 min.
  6. Gettare il surnatante. Aggiungere 1 mL di terreno nuovo a pellet cellulare e ri-disperdere le cellule.
  7. Aggiungere 10 µ l di trypan blu con 10 µ l di cellule disperse e contare le celle con una macchina automatica di conta cellulare.
    Nota: Le istruzioni per la macchina conta cellulare utilizzato sono inclusi nei riferimenti.

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Representative Results

Immagini di microscopia elettronica (TEM) di trasmissione confermano la formazione di Ag-MWCNT (Figura 1A e 1B). Loro successo sintesi è stata confermata dal cambiamento in carica superficiale. È stata calcolata la dimensione delle particelle Ag depositato sul MWCNT (Figura 1). La dimensione media delle particelle era approssimativamente 3,83 nm. Il modello XRD di come sintetizzato Ag-MWCNT è illustrato nella Figura 1. Il picco a 20-30° corrisponde a MWCNT; i rimanenti picchi corrispondono a Ag. Dati relativi all'attività antimicrobica sono illustrati nella Figura 2. Popolazioni di Colonia batterica sono stati confermati da Methylobacterium controllo (Figura 2A); Aggiunta di metanolo ha ridotto la popolazione 103 volte (Figura 2B), e l'aggiunta di MWCNT-COOH ha ridotto la popolazione 108 volte (Figura 2). Colonie non potrebbero essere identificati in 40 µ g/mL Ag-MWCNT (Figura 2E) campioni e 50 µ g/mL Ag-MWCNT (Figura 2D). Nell'esempio di 20 µ g/mL Ag-MWCNT la popolazione era ridotta 105 volte (Figura 2F). Nella zona del test di inibizione contro Methylobacterium (Figura 3), la zona di inibizione è stata identificata quando è stato aggiunto 10 µ g/mL. Una zona di inibizione non è stata osservata ad una concentrazione di 1 µ g/mL. Nel test di citotossicità, il dosaggio di Live/Dead (Figura 4) ha confermato l'assenza di citotossicità del controllo negativo (Figura 4A) e la presenza di citotossicità nel controllo positivo (Figura 4B) quando è stato usato metanolo. L'aggiunta di 40 µ g/mL Ag-MWCNT (Figura 4) ha rivelato alcuni citotossicità, tuttavia l'aggiunta di 30 µ g/mL Ag-MWCNT (Figura 4D) non ha rivelato una quantità significativa di citotossicità. Un'analisi trypan blu è stata eseguita (Figura5) per il controllo (Figura 5A), metanolo (figura 5B), Ag-MWCNT (Figura 5) 40 µ g/mL e 30 µ g/mL Ag-MWCNT (Figura 5) campioni. I risultati hanno confermato che c'era molto poco citotossicità a 30 µ g/mL Ag-MWCNT.

Figure 1
Figura 1: caratterizzazione fisico-chimica di Ag-MWCNT. (A) e (B) immagini TEM di Ag-MWCNT; (C) distribuzione delle dimensioni di Ag-MWCNT come valutata tramite TEM (n = 100); Modello XRD (D) di Ag-MWCNT. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Valutazione antibatterica di Ag-MWCNT relativo Methylobacterium spp. (A) controllo, metanolo (B) , (C) MWCNT-COOH, (D) 50 μg/mL di Ag-MWCNT, (E) 40 μg/mL di Ag-MWCNT e (F) 30 μg/mL di Ag-MWCNT. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Zona di prova di inibizione di Ag-MWCNT.

Figure 4
Figura 4: saggi di vitalità di cella per Ag-MWCNT. microfotografie di AML12 che sono etichettati fluorescente per morto (rosso) e (verde) cellule vive. (A) controllo, metanolo (B) , (C) 40 μg/mL di Ag-MWCNT e (D) 30 μg/mL di Ag-MWCNT. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: tripan blu dosaggi per 30 e 40μg/mL Ag-MWCNT. (A) controllo, metanolo (B) , (C) 40 μg/mL di Ag-MWCNT, e (D) 30 μg/mL di Ag-MWCNT. (rosso: le cellule morte; blu: cellule vive) Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Qui, segnaliamo un metodo semplice per la preparazione di MWCNT con nanoparticelle di Ag depositate. Questo nanomateriale contenenti argento dimostra notevole attività antibatterica e minimo potenziale di assorbimento incontrollato delle nanoparticelle d'argento nel corpo. Dimostriamo che 30 µ g/mL di sintetizzato Ag-MWCNT è un efficace livello di attività antibatterica contro le speci Methylobacterium con trascurabile citotossicità per le cellule di fegato dei mammiferi. Anche se ulteriori miglioramenti e le valutazioni di biosicurezza per Ag-MWCNT sono tenute prima espansione nel settore commerciale, utilizzando etanolo come agente riduttore potrebbe contribuire a produrre Ag-MWCNT ecologico ed economico.

Vengono illustrati i seguenti punti. È possibile distruggere vari tipi di batteri con i nanomateriali sviluppati. È possibile progettare più siti su una superficie di nanotubi su cui le nanoparticelle d'argento possono essere depositate. Proprietà antibatteriche può anche essere adattato controllando la dimensione e il numero delle nanoparticelle d'argento che si depositano sulla superficie. I nanomateriali sviluppati sono tossici per le cellule batteriche, ma sono non tossici alle cellule umane e animali in concentrazioni appropriate.

Per l'attività antibatterica è proposto il seguente meccanismo. Le nanostrutture Ag-MWCNT direttamente contatto con la superficie della cellula batterica, danneggiare la parete delle cellule e causare ossidazione secondaria di specie reattive dell'ossigeno; questi processi causare stress ossidativo. AG-MWCNT nanostrutture sono stati confermati per rilasciare ioni d'argento che inibiscono il quorum sensing di Methylobacterium spp., inibendo l'espressione dei geni che regolano la formazione di biofilm.

Le limitazioni dell'attuale protocollo dovrebbe includere la massima quantità indeterminata di nanoparticelle di argento e Ag-MWCNT ammissibile nelle prove umane. In questo protocollo, la quantità di nanoparticelle d'argento incluse nel campione 30 µ g/mL di Ag-MWCNT era stimata come 0,4 µ g/mL, in media. Questa concentrazione è considerata biocompatibile con le cellule di mammifero, come riferito in precedenti studi6,7,8,9. Mentre il meccanismo di citotossicità alla concentrazione di 40 µ g/mL di Ag-MWCNT è indeterminato, si propone che il non-attaccamento di cellule del sangue verso il basso di piatti di coltura può aumentare la probabilità di contatto Ag-MWCNT durante la coltura. In futuro, gli studi di tossicità dettagliate delle nanoparticelle d'argento con una varietà di tipi cellulari sotto differenti condizioni di coltura possono essere eseguiti. Questi studi possono fornire ulteriori informazioni sul meccanismo di interazione di Ag-MWCNT con le cellule.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Questo studio è stato sostenuto da Chung-Ang University Research Grants (2016) e dal programma di sviluppo di tecnologia Nano-materiale attraverso National Research Foundation di Korea(NRF) finanziato dal Ministero della scienza e ICT (n. 2017M3A7B8061942).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1 N silver nitrate SIGMA-ALDRICH 1090811000
Carbon nanotube, multi-walled Tokyo Chemical Industry Co., LTD 308068-56-6
R2A agar MBcell MB-R1129
R2A broth MBcell MB-R2230
Methylobacterium spp. KCTC 12618 from Korea Collection for Type Cultures Daejeon Korea 12618, Daejon, Korea
LIVE/DEAD Cell imaging Kit ThermoFisher SCIENTIFIC R37601
AML12 from Chungnam University, Dajeon, Korea
human PBMC ATCC PCS-800-011
TEM JEOL JEM-2100F
XRD Rigaku D/MAX 2500 Cu K photon source (40kV, 100mA)
JuLI Br NanoEnTek JULI-BRSC 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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  2. Jennings, S., Moran, A., Carroll, C. Bioaerosols and biofilms. Biofilms in medicine, industry and environmental biotechnology. , IWA, London. 160-178 (2003).
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