Summary
Detta manuskript visar utarmning av genuttryck i midgut av den tyska kackerlackan genom oralt intag av dubbelsträngat RNA inkapslade i liposomer.
Abstract
RNA-interferens (RNAi) har tillämpats allmänt för avtäckning de biologiska funktionerna av många gener och har planerats som en pest control verktyg drift av störningar av väsentliga genuttryck. Även om olika metoder, såsom injektion, utfodring och blötläggning, har rapporterats för framgångsrik leverans av dubbelsträngat RNA (dsRNA), är effektiviteten av RNAi genom muntliga leverans av dsRNA mycket varierande bland olika insekt grupper. Den tyska kackerlackan, Blattella germanica, är mycket känsliga för injektion av dsRNA, som visas av många studier publicerats tidigare. Föreliggande studie beskriver en metod för att påvisa att den dsRNA inkapslade med Liposom bärare är tillräcklig för att fördröja nedbrytningen av dsRNA genom midgut juice. Särskilt, kontinuerlig utfodring av dsRNA inkapslat av liposomer avsevärt minskar tubulin uttrycket i midgut, och ledde till döden av kackerlackor. Sammanfattningsvis, kan formulering och användning av dsRNA lipoplexes, som skyddar dsRNA mot nukleaser, vara en praktisk användning av RNAi för insekt skadedjursbekämpning i framtiden.
Introduction
RNAi har visats som en effektiv metod att knockdown genuttryck genom en mekanism av en post-transcriptional tysta vägen utlöses av dsRNA molekyler i många Eukaryoter1. Under det senaste decenniet av studien blivit RNAi ett användbart verktyg att studera funktionerna av gener från utveckling till uppförande av ozonnedbrytande uttrycket av specifika gener via injektion eller utfodring av dsRNA i olika taxa av insekter2,3. På grund av den specificitet och robusthet av nedbrytande effekten, är tillämpningen av RNAi för närvarande betraktas som en potentiell strategi för pest control management4,5. Dock varierar effektiviteten av RNAi mycket mellan insektsarter, beroende på de olika gener blir måltavla och leveransmetoder. En växande mängd bevis tyder på att instabiliteten i dsRNA, som bryts av ribonucleases, är en kritisk faktor i den begränsade effekten av RNAi5,6. Exempelvis har den låga RNAi-känsligheten i Manduca sexta förklarats av det faktum att den dsRNA blandat med hemolymph var snabbt försämrade inom 1 timme7. Likaså är förekomsten av alkaliska nukleaser i midgut, som effektivt försämra intas dsRNA, starkt korrelerad med låg RNAi effektivitet i olika insekters order8,9,10.
Den muntliga leveransen av dsRNA är särskilt intressant för tillämpningen av RNAi i en strategi för kontroll av skadedjur, men en metod för att fördröja nedbrytningen av dsRNA genom nukleaser i midgut har ännu inte utvecklats, som skulle ha potential att säkerställa en effektiv RNAi genom utfodring. Problemet inte svarar RNAi till muntliga leverans av dsRNA har dock rapporterats av utfodring stor mängd dsRNA, e.g. 50 µg i Bombyx mori, eller kontinuerligt utfodring för 8 dagar (8 µg dsRNA totalt) i locust arter. Den tyska kackerlackan, Blattella germinica, är mycket känslig för RNAi genom injektion av dsRNA11,12,13,14, men är inte mottaglig för dsRNA genom utfodring. Nyligen, Lin et al. (2017) har visat att dsRNA inkapslade med Liposom bärare resultat i framgångsrika RNAi till knockdown α-tubulin genuttrycket i midgut och utlösa betydande dödligheten hos den tyska kackerlacka15. Nedbrytningen av dsRNA i midgut är den begränsande faktorn för oral RNAi, fungera Liposom bärarna som ett fordon att skydda dsRNA från nedbrytning, som är lättillämpliga i andra insekter med stark nuclease aktiviteter i tarmen. Notera, anledningen till att välja särskilda transfection reagens (se Tabell för material) vi används som Liposom bärare i det nuvarande protokollet är att det har testats för insekt cell linje transfection med mindre toxicitet, enligt den tillverkarens instruktioner. Enligt jämförelsen av olika Liposom transfection system i Gharavi o.a. (2013) 16, effektiviteten i transfecting små störande RNA (siRNA) är ungefär lika mellan detta och andra kommersiellt tillgängliga system som har använts för dsRNA leverans system i andra insekter17,18 . Dessutom är vår utfodring metod försiktig nog att se till att rätt mängd dsRNA förtärs av varje kackerlacka, och att resultaten är robusta och bekräftade. Sammanfattningsvis visar den protokolls och resultaten att använda dsRNA lipoplexes förbättrar stabiliteten för dsRNA och öppnar dörren till utformningen av strategin muntliga leverans av RNAi, vilket är en lovande strategi för bekämpning av skadedjur i framtiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. syntes och beredning av dsRNA
- Identifiera dsRNA mål webbplatserna i 3' oöversatta regionen i målgener. DsTub används för att rikta genen α-tubulin (tub) (GenBank anslutningen nummer: KX228233), och dsEGFP som en negativ dsRNA kontroll är utformad i sekvens av förbättrad grön fluorescens protein (andra; GenBank anslutningen nummer: LC311024).
- Utföra vanliga PCR-amplifiering för att syntetisera dsRNA mallarna med gen-specifika primers som innehåller sekvensen T7 promotorn (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'). PCR-amplifiering villkor och primer-information som används är de rapporterade av Lin et al. (2017) 12 (se Tabell för material).
- Fortsätta med dsRNA Tillredning via en T7 Transcription Kit (se Tabell för material), följa tillverkarens instruktioner.
Obs: Att ge hög kvantitet dsRNA, blanda två reaktioner i en tub (i totalt 40 µL) och inkubera vid 37 ° C över natten. - Tillsätt 2 µL av DNAS (se Tabell för material) till dsRNA prover under 15 minuter vid 37 ° C till digest DNA mallar.
- Tillsätt 200 µL utvinning reagens (se Tabell av material) och 40 µL kloroform, då vortex.
- Centrifugera i 10 min vid 13 000 x g vid 4 ° C och sedan samla in supernatanten (150 µL) i en ny mikrocentrifug rör.
- Fällningen dsRNA genom att lägga 150 μl isopropanol och inkubation i 15 min på is.
- Centrifugera i 15 min på 13 000 x g vid 4 ° C och tar bort supernatanten.
- Tillsätt 200 µL av de 70% etanolen att tvätta dsRNA pellets. Centrifugera i 10 min vid 13 000 x g vid 4 ° C.
- Avlägsna etanolen och upprepa etanol tvätta stegen.
- Ta bort etanol och torr dsRNA pellets av centrifugal vakuum koncentratorer för 3 min och sedan Omsuspendera dsRNA med RNase-gratis vatten.
- Fastställa kvantiteten av den renade dsRNA med en mikro-volym UV-Vis spektrofotometer (se Tabell för material) enligt tillverkarens anvisningar och justera till önskad koncentration (t.ex., det 0,25 µg/µL för beredning av dsRNA lipoplexes).
- Lagra dsRNA proverna vid-20 ° C i upp till 3 månader.
2. beredning av dsRNA Lipoplexes
- Späd 4 µL av transfection reagens (se Tabell för material) genom att lägga till 4 µL av 5% glukoslösning. Späd 4 µL av dsRNA (1 µg) genom att tillsätta 4 µL av 5% glukoslösning.
- Lägg till utspädda Liposom reagenslösningen omedelbart in i utspädda dsRNA lösningen på en gång. Vortex kort att blanda dem, sedan Inkubera i 15 min vid 25 ° C.
Obs: Blanda inte lösningarna i omvänd ordning. - De dsRNA lipoplexes är redo för användning. Använd inom 1 timme efter förberedelse och kassera efter 1 timme.
Obs: Enligt tillverkarens anvisningar, bör lipoplexes användas så snart som möjligt.
3. insamling av extracellulära enzymer från Hemolymph och Midgut Juice
-
Insekt saltlösning buffert (10 x lager)
- Blanda 900 mL dubbel destillerat vatten med 109,3 g NaCl, 15,7 g KCl, 6,3 g CaCl2och 8,3 g MgCl2·6H2O.
- Justera pH till 6,8 och fyll upp till 1 000 mL.
-
Hemolymph samling
- Söva kackerlackorna på is tills de inte går i 3 min.
- Håll kackerlackan med två fingrar (tumme och pekfinger) och Höj den ventrala sidan av kackerlackan.
- Använd den dissekera scissor avskurna av spetsen på en coxa av ett bakben.
Obs: Skär anslutna skärningspunkten mellan coxa och trochanter. Excision av den andra delen av coxa var mindre effektiva att samla hemolymph. - Pressa i buken försiktigt med långfingret, och samla de hemolymph blödning från snittet med en 10 µL mikropipett.
- Poolen på hemolymph från flera kackerlackor (5 personer) i en mikrocentrifug rör.
Obs: Hålla mikrocentrifugrör på is för att förhindra melanization. Den genomsnittliga volymen av hemolymph som erhållits från en manlig kackerlacka är 2-3 µL. - Snurra ner hemolymph kort med en bänkmonterade centrifug för 10 s.
- Överföra önskad volym av hemolymph (dvs., 10 µL) och blanda det med 50 µL av 1 x insekt saltlösning buffert.
- Centrifugera i 10 min vid 1 000 x g vid 4 ° C att snurra ner hemocytes. Överför supernatanten till en ren mikrocentrifug rör.
- Kvantifiera totalprotein koncentrationen med en mikro-volym UV-Vis spektrofotometer genom att mäta A28015.
- Justera varje prov för att få samma proteinkoncentration (6 mg/µL av totalt protein).
-
Midgut juice samling
- Söva kackerlackorna på is. Fixa kackerlackorna ventrala sida upp på dissektion plattan med kall 1 x insekt saltlösning buffert med insekt pins.
- Dissekera buken med fin pincett. Ta bort hela tarmen (inklusive front, mitten och bakre tarmen) till en ny maträtt med 1 x insekt saltlösning buffert.
- Ta bort främre och bakre tarmen och snabbt överföra midgut i en mikrocentrifug rör som innehåller 100 µL insekt saltlösning buffert.
- Pool i midguts från sex kackerlackor i samma rör och virvel för 10 s.
- Centrifugera i 10 min vid 1 000 x g vid 4 ° C att snurra ner hemocytes och gut vävnader. Överför supernatanten till en ren mikrocentrifug rör.
- Kvantifiera totalprotein koncentrationen med en mikro-volym UV-Vis spektrofotometer genom att mäta A28015.
- Justera varje prov för att få samma proteinkoncentration (6 mg/µL av totalt protein).
4. dsRNA nedbrytning Assay
- Nymalen förbereda 4 µL av den nakna dsRNA eller dsRNA lipoplexes (1 µg).
- Blanda dsRNA lösningar med 10 µL insekt saltlösning buffert (kontroll), extraherade enzymer från hemolymph eller midgut juice.
- Tillsätt 2 µL av antingen EGTA (20 mM) eller RNase-fritt vatten till separata prover som kontroller för hämning av Enzymaktiviteter.
- Inkubera i 1 timme eller längre tid (6, 12 eller 24 timmar) vid 25 ° C.
- Tillsätt 200 µL utvinning reagens och 40 µL kloroform, sedan vortex.
- Centrifugera i 10 min vid 13 000 x g vid 4 ° C och sedan samla in supernatanten (150 µL) i en ny mikrocentrifug rör.
- Fällningen dsRNA genom att lägga 150 μl isopropanol och inkubation i 15 min på is.
- Centrifugera i 15 min på 13 000 x g vid 4 ° C och tar bort supernatanten.
- Tillsätt 200 µL av de 70% etanolen att tvätta dsRNA pellets. Centrifugera i 10 min vid 13 000 x g vid 4 ° C.
- Avlägsna etanolen och upprepa etanol tvätta stegen.
- Ta bort etanol och torr dsRNA pellets av centrifugal vakuum koncentratorer för 3 min. Omsuspendera dsRNA med 10 µL RNase-gratis vatten.
- Kontrollera integriteten hos behandlade dsRNA via gelelektrofores på en 1,5% agarosgel.
5. oral administrering av dsRNA
- Upprätthålla kackerlackor på en ad libitum diet torrfoder (hunden chow). Beröva vattenförsörjning från kackerlackorna en dag innan dsRNA förtäring experiment.
- Håll en kackerlacka högintressant vingarna med flexibla tången (figur 1, steg 5).
Obs: Kan inte greppa kroppsdelar av kackerlackor. - Förbereda den dsRNA lipoplexes, samt nakna dsRNA, utfodring, som beskrivs i avsnitt 2.
Obs: Den dsRNA lipoplexes bör beredas på nytt före utfodring. - Foder 4 µL dsRNA lipoplexes eller nakna dsRNA (250 ng) med en mikropipett.
- Långsamt Pipettera droplet-programmet av dsRNA lösningen nära mouthparts av kackerlackor och låt kackerlackorna äter droplet-programmet helt.
- Utföra de intag experiment gånger (1 h efter lampor på och 1 h innan släckt) för 8 eller 16 dagar kontinuerligt.
Obs: Alla kackerlackor förvärvade vatten endast genom manuell utfodring med dsRNA lösning eller kontroll reagens (t.ex., nuclease gratis vatten, glukos och Liposom reagens) under intag experiment. - Förse kackerlackorna vattenflaskor efter 16 dagar efter intag av dsRNA experiment.
6. Bedöm Knockdown
- Vid vald tidpunkt punkter (2, 9 och 17 dagar efter dsRNA förtäring assay), samla in de dsEGFP - och dsTub-behandlade insekterna och dissekera valt vävnader (t.ex., midgut).
- Utföra kvantitativ realtids-PCR (qRT-PCR). QRT-PCR amplifiering villkor och primer information som rapporterats av Lin et al. (2017) 12.
- Bedöma kontroll och dsRNA-behandlade insekter dagligen kontrollera dödlighet och avlägsna kackerlackorna som inte längre är rörliga.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En förenklad ordning för protokollet för den muntliga leveransen av dsRNA presenteras i figur 1, där de viktigaste stegen för beredning av dsRNA lipoplexes visas.
För att undersöka det skydd som ges av Liposom bärare vid dsRNA nedbrytning i midgut juice av B. germanica, ett ex vivo -test där dsTub lipoplexes inkuberades med midgut juice genomfördes och integriteten hos dsRNA analyserades därefter på en 1,5% agarosgel. Figur 2 visar att starka RNA nuclease verksamhet var närvarande i midgut saften av B. germanica (figur 2A), medan Liposom bärarna var kunna skydda dsRNA mot nedbrytning i minst 1 timme i ex vivo inkubation (figur 2A, B). Som ett resultat, tillämpades oralt intag av dsRNA lipoplexes dagligen för att öka känsligheten för midgut vävnader att RNAi i följande experiment.
Validering av RNAi svar genom muntliga leverans av dsRNA bedömdes genom att mäta effekten utarmning av badkar mRNA uttryck i midgut vid olika tidpunkter efter kontinuerliga intag av dsRNA (figur 3A). Badkar uttrycket i midgut var signifikant utarmat efter kontinuerliga intag av dsTub lipoplexes i 8 dagar. Medan kontinuerlig utfodring av dsRNA varade 16 dagar, badkar uttrycket i midgut var signifikant utarmat på de nakna dsTub och dsTub lipoplexes grupper (ungefärligt vid 24 och 60%, respektive) i motsats till kontrollerna. Figur 3 B visar en konsekvent, betydande ökning av dödligheten efter oral administrering av dsTub lipoplexes i 16 dagar.
Figur 1 : Förenklade ordningen av muntliga leverans av dsRNA lipoplexes för kackerlackor. De viktigaste stegen för beredning av dsRNA lipoplexes föreställs för steg 1 till 4. Den matande tekniken (steg 5) visas i bilden. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Ex vivo nedbrytning av dsRNA av B. germanica hemolymph (Hemo) eller midgut juice. (A), 1 µg av den nakna eller Liposom-cojugated dsTub var inkuberas i 1 h med saltlösning buffert och extraherade enzymer från hemolymph (hemo) eller midgut juice, respektive. Den nakna dsTub, men inte Liposom-konjugerad dsTub, var förstörd helt när inkuberas med 1 x midgut juice. De olika utspädningsfaktorer ursprungliga midgut saft (1 x) indikeras. Nedbrytningen hämmades av ion kelering på grund av EGTA behandling som en kontroll. (B) tidsberoende skydd för Liposom-inkapslat dsTub (1 µg) mot ex vivo nedbrytning i hemolymph eller midgut juice. Notera, var den Liposom-konjugerad dsTub helt förstörd när inkuberas med midgut juice efter 24 h. Hemolymph och midgut saft användes i den ursprungliga koncentrationen för olika tidsperioder inkubation. Resultaten är anpassade från Lin et al. (2017) 12. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3 : Effekter av RNAi svar av intag av dsRNA på B. germanica. (A) kvantitativ realtids-PCR (qRT-PCR) för att bestämma relativa badkar uttrycket i midgut av den tyska kackerlackan efter olika utfodring behandlingar. Uttrycksnivåerna av olika behandlingar var normaliserade till gruppen glukos på dag 2. Värden är det medelvärde ± SE från tre oberoende experiment (n = 3), vardera med 3-5 biologiska replikat. Olika bokstäver på staplarna anger signifikanta skillnader på p < 0,05 (ANOVA efter Tukey's HSD Post Hoc test) bland olika behandlingsgrupperna. (B) efterlevande av kackerlackorna som intas nakna dsTub eller dsTub lipoplexes i 8 dagar (8 d) eller 16 dagar (16 d) (varje kohort av 12-15 individer; n = 3 oberoende experiment). Värden är det medelvärde ± SE. olika bokstäver på behandlingsgruppen indikera signifikanta skillnader på p < 0,05 (Kruskal-Wallis test) för efterlevande. Resultaten är anpassade från Lin et al. (2017) 12. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll presenterar en metod för effektiv RNAi genom muntliga leverans av dsRNA lipoplexes, som omfattar skydd mot ribonunkleas matsmältningen i midgut saften av den tyska kackerlackan. Som visas i andra studier i olika insektsarter, utgörs dålig RNAi effekten genom muntliga leverans av dsRNA mestadels av nedbrytningen av dsRNA8,9,10. Detta protokoll producerar liposomer som fungerar som skyddande fordon i muntliga leverans av dsRNA mot nedbrytning i tarmen. Dessutom är utarbetandet av dsRNA lipoplexes enkel och lättillämpliga som oral RNAi, i synnerhet för insekter med stark ribonunkleas aktivitet i tarmen.
Jämfört med andra studier som foder relativt stora mängder nakna dsRNA i olika insekter10,18,19, detta protokoll använder oral administrering av en relativt låg mängd dsRNA (0,5 µg per dag), som orsakar en betydande utarmning av målet genuttryck i midgut av B. germanica. Avgörande aspekterna av protokollet är exakt utfodring metod och ackumulerade intag av små mängder dsRNA. För det första utfodring tekniken är lämplig för en kontinuerlig förtäring analys och minimerar variationen av förtärda dsRNA kvantiteten per enskild insekt. Det andra visades utarmning effekten av badkar uttryck i midgut att öka från 40% vid dag 9 till 60% på dag 17 med kontinuerlig oral administrering av dsTub lipoplexes (figur 3A). Även om den nakna dsRNA var snabbt förstörd med ex vivo inkubation midgut juice inom 1 h (figur 2A), resulterat den kontinuerlig matning av nakna dsRNA för 16 dagar också i en betydande uttömning av badkar uttryck i midgut (figur 3A). Den längre perioden av kontinuerlig utfodring av dsRNA lipoplexes för 16 dagar är dessutom ett krav på att orsaka en iögonfallande dödlig effekt av RNAi.
Även om Liposom transportörer (se Tabell för material) används här var ursprungligen för in vitro- transfection av DNA i insekt celler, det var inga problem tillämpa denna Liposom reagens som fordon av dsRNA för muntliga leverans i vår insekt modell. Många studier har också framgångsrikt visat förbättring av RNAi ljuddämpning i andra insektsarter som använder olika Liposom reagenser, utformade för antingen DNA eller RNA molekyler17,20,21. Dock mekanismen av dsRNA upptag i insekt tarmen har ännu inte helt studerats och Liposom leveranssystem kan förbättra upptaget av dsRNA in i celler, på grund av dess biokompatibilitet med fosfolipid struktur22. Därför kunde muntliga leverans av dsRNA inkapslade i liposomer vara en lämplig strategi för att uppnå effektiv RNAi på grund av försening av nedbrytning av RNaser (figur 2).
En nackdel med detta protokoll kan vara den lilla mängden dsRNA i Liposom bärare, och därmed kan kräva längre kontinuerlig utfodring. Begränsning av sådana särskilt förhållandet mellan dsRNA till Liposom (0,25 µg:1 µL) beror på utformningen av kommersiella Liposom reagens, enligt tillverkarens förslag. Formuleringarna i beredning av Liposom nanopartiklar med större diameter storlek, och den olika laddningen på lipoplexes yta, rapporteras att öka inkapsling av siRNA och RNAi ljuddämpningssystemet effektivitet23,24. Därför kan de olika Liposom nanopartiklarna också användas till förbättra utfodring förfaranden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av bidrag från Taiwan (ministeriet för vetenskap och teknik, mest 100-2923-B-002-002-MY3 och 106-2313-B-002-011-MY3 till H.J.L.), Tjeckien (bevilja byrån i södra Böhmen universitet, Lennart bevilja Y.H.L 065/2017/P), och Spanien ( Spanska ministeriet för ekonomi och konkurrenskraft, beviljar CGL2012-36251 och CGL2015-64727-P X.B., och den katalanska regeringen, bevilja 2014 SGR 619 X.B.); Det har också fått ekonomiskt stöd från Europeiska fonden för ekonomisk och regionutveckling (ERUF-medel till X.B.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GenJe Plus DNA in vitro Transfection reagent | SignaGen | SL100499 | for lipoplexes preparation |
| Blend Taq plus | TOYOBO | BTQ-201 | for PCR |
| Fast SYBR Green Master Mix | ABI | 4385612 | for qPCR |
| FirstChoice RLM-RACE Kit | Invitrogen | AM1700 | for 3' UTR identification |
| MEGAscript T7 Transcription Kit | Invitrogen | AMB13345 | for dsRNA synthesis |
| TURBO DNase | Invitrogen | AM2239 | remove DNA template from dsRNA |
| TRIzol | Invitrogen | 15596018 | for dsRNA or total RNA extraction |
| RQ1 RNase-Free Dnase | Promega | M6101 | remove DNA template from total RNA |
| chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | for dsRNA or total RNA extraction |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | I9516 | for dsRNA or total RNA extraction |
| ethanol | Sigma-Aldrich | 24102 | for dsRNA or total RNA extraction |
| Diethyl pyrocarbonate, DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | for RNase free water preparation |
| glucose solution | Sigma-Aldrich | G3285 | for lipoplexes preparation |
| Sodium chloride, NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | insect saline buffer formula |
| Potassium chloride, KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | insect saline buffer formula |
| Calcium chloride, CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | insect saline buffer formula |
| Magnesium chloride hexahydrate, MgCl2.6H2O | Sigma-Aldrich | M2670 | insect saline buffer formula |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | enzyme inhibitor |
| dissecting scissor | F.S.T. | cockroach dissection | |
| fine tweezers | F.S.T. | cockroach dissection | |
| flexible tweezer | F.S.T. | cockroach holding | |
| pipetman | RAININ | P10 | sample preparation |
| microcentrifuge tube | Axygen | MCT175C, PCR02C | sample preparation |
| pipette tip | Axygen | sample preparation | |
| vortexter | Digisystem | vm1000 | sample preparation |
| Minispin centrifuge | The Gruffin Group | GMC 206 | for liquid spin down |
| Centrifuge | ALC | PK121R | sample preparation |
| pH meter | JENCO | 6071 | for pH adjust |
| micro-volume spectrophotometer | Quawell | Q3000 | nucleic acid quantitative |
| PCR Thermal cycler | ABI | 2720 | for template PCR or dsRNA synthesis incubation |
| quantitative real-time PCR | ABI | StepOne plus | gene expression quantitative |
| Centrifugal Vacuum Concentrators | eppendorf | 5301 | for dsRNA or total RNA extraction |
| Multipette | eppendorf | xstream | for real-time PCR sample loading |
| Agarose I | amresco | 0710 | for nucleic acid electrophoresis |
| tub gene specfifc forward preimer | tri-I biotech | GGG ACA AGC CGG AGT GCA GA | |
| tub gene specfifc reverse preimer | tri-I biotech | TCC TGC TCC TGT CTC GCT GA | |
| dsTub template forward primer | tri-I biotech | TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA CAA GCC GGA GTG CAG | |
| dsTub template reverse primer | tri-I biotech | TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT CCT GCT CCT GTC TCG CTG | |
| dsEGFP template forward preimer | tri-I biotech | TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT ATG GTG AGC AAG GGC GAG GAG | |
| dsEGFP template reverse preimer | tri-I biotech | TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT GGC GGA TCT TGA AGT TCA CC | |
| tub qPCR forward primer | tri-I biotech | GGA CCG CAT CAG GAA ACT GGC | |
| tub qPCR reverse preimer | tri-I biotech | CCA CAG ACA GCC TCT CCA TGA GC | |
| ef1 qPCR forward primer | tri-I biotech | CGC TTG AGG AAA TCA AGA AGG A | |
| ef1 qPCRreverse preimer | tri-I biotech | CCT GCA GAG GAA GAC GAA G |
References
- Hammond, S. M. Dicing and slicing: The core machinery of the RNA interference pathway. FEBS Lett. 579, 5822-5829 (2005).
- Bellés, X. Beyond drosophila: RNAi in vivo and functional genomics in insects. Annu. Rev. Entomol. 55, 111-128 (2010).
- Wynant, N., Santos, D., Vanden Broeck, J. Chapter Five - Biological Mechanisms Determining the Success of RNA Interference in Insects. International Review of Cell and Molecular Biology. Jeon, K. W. 312, Academic Press. 139-167 (2014).
- San Miguel, K., Scott, J. G. The next generation of insecticides: dsRNA is stable as a foliar-applied insecticide. Pest Manag. Sci. 72, 801-809 (2016).
- Scott, J. G., et al. Towards the elements of successful insect RNAi. J. Insect Physiol. 59, 1212-1221 (2013).
- Joga, M. R., Zotti, M. J., Smagghe, G., Christiaens, O. RNAi efficiency, systemic properties, and novel delivery methods for pest insect control: What we know so far. Front. Physiol. 7, (2016).
- Garbutt, J. S., Bellés, X., Richards, E. H., Reynolds, S. E. Persistence of double-stranded RNA in insect hemolymph as a potential determiner of RNA interference success: Evidence from Manduca sexta and Blattella germanica. J. Insect Physiol. 59, 171-178 (2013).
- Arimatsu, Y., Kotani, E., Sugimura, Y., Furusawa, T. Molecular characterization of a cDNA encoding extracellular dsRNase and its expression in the silkworm, Bombyx mori. Insect Biochem. Mol. Biol. 37, 176-183 (2007).
- Wang, K., et al. Variation in RNAi efficacy among insect species is attributable to dsRNA degradation in vivo. Insect Biochem. Mol. Biol. 77, 1-9 (2016).
- Wynant, N., et al. Identification, functional characterization and phylogenetic analysis of double stranded RNA degrading enzymes present in the gut of the desert locust, Schistocerca gregaria. Insect Biochem. Mol. Biol. 46, 1-8 (2014).
- Huang, J. -H., Belles, X., Lee, H. -J. Functional characterization of hypertrehalosemic hormone receptor in relation to hemolymph trehalose and to oxidative stress in the cockroach Blattella germanica. Exp. Endocrinol. 2, 114 (2012).
- Lin, Y. -H., Lee, C. -M., Huang, J. -H., Lee, H. -J. Circadian regulation of permethrin susceptibility by glutathione S-transferase (BgGSTD1) in the German cockroach (Blattella germanica). J. Insect Physiol. 65, 45-50 (2014).
- Lozano, J., Kayukawa, T., Shinoda, T., Belles, X. A role for taiman in insect metamorphosis. PLOS Genet. 10, 1004769 (2014).
- Lozano, J., Montañez, R., Belles, X. MiR-2 family regulates insect metamorphosis by controlling the juvenile hormone signaling pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. 112, 3740-3745 (2015).
- Lin, Y. -H., Huang, J. -H., Liu, Y., Belles, X., Lee, H. -J. Oral delivery of dsRNA lipoplexes to German cockroach protects dsRNA from degradation and induces RNAi response. Pest Manag. Sci. 73, 960-966 (2017).
- Gharavi, J., et al. Chiral cationic polyamines for chiral microcapsules and siRNA delivery. Bioorg. Med. Chem. Lett. 23, 5919-5922 (2013).
- Whyard, S., Singh, A. D., Wong, S. Ingested double-stranded RNAs can act as species-specific insecticides. Insect Biochem. Mol. Biol. 39, 824-832 (2009).
- Luo, Y., et al. Differential responses of migratory locusts to systemic RNA interference via double-stranded RNA injection and feeding. Insect Mol. Biol. 22, 574-583 (2013).
- Liu, J., Smagghe, G., Swevers, L. Transcriptional response of BmToll9-1 and RNAi machinery genes to exogenous dsRNA in the midgut of Bombyx mori. J. Insect Physiol. 59, 646-654 (2013).
- Airs, P. M., Bartholomay, L. C. RNA interference for mosquito and mosquito-borne disease control. Insects. 8, 4 (2017).
- Taning, C. N. T., et al. Oral RNAi to control Drosophila suzukii: Laboratory testing against larval and adult stages. J. Pest Sci. 89, 803-814 (2016).
- Wu, S. Y., McMillan, N. A. J. Lipidic systems for in vivo siRNA delivery. AAPS J. 11, 639-652 (2009).
- Tam, Y. Y. C., Chen, S., Cullis, P. R. Advances in lipid nanoparticles for siRNA delivery. Pharmaceutics. 5, 498-507 (2013).
- Xia, Y., Tian, J., Chen, X. Effect of surface properties on liposomal siRNA delivery. Biomaterials. 79, 56-68 (2016).
