Summary
Dette manuskript viser nedbrydningen af genekspression i midgut af tysk kakerlak gennem oral indtagelse af dobbelt-strenget RNA indkapslet i Liposomer.
Abstract
RNA-interferens (RNAi) er blevet bredt anvendt til afdække de biologiske funktioner af mange gener, og har været tænkt som en pest kontrol værktøj fungerer ved afbrydelse af væsentlige genekspression. Selv om forskellige metoder, såsom injektion, fodring, og iblødsætning, er blevet rapporteret om succesfulde levering af dobbelt-strenget RNA (dsRNA), er RNAi effektivitet gennem oral levering af dsRNA meget varierende blandt forskellige insekt grupper. Den tyske kakerlak, Blattella germanica, er meget følsom over for injektion af dsRNA, som det fremgår af mange undersøgelser offentliggjort tidligere. Den nuværende undersøgelse beskriver en metode til at påvise, at dsRNA indkapslet med Liposom luftfartsselskaber er tilstrækkelig til at forsinke nedbrydning af dsRNA af midgut juice. Især, kontinuerlig fodring af dsRNA indkapslet af Liposomer betydeligt reducerer tubulin udtryk i midgut, og førte til døden af kakerlakker. Afslutningsvis, kunne formulering og anvendelse af dsRNA lipoplexes, som beskytter dsRNA mod nukleaser, være en praktisk anvendelse af RNAi for insekt Skadedyrsbekæmpelse i fremtiden.
Introduction
RNAi er blevet bevist som en effektiv metode til knockdown genekspression gennem en mekanisme for en post-transcriptional silencing pathway udløst af dsRNA molekyler i mange eukaryoter1. I det sidste årti af undersøgelse, er RNAi blevet et nyttigt redskab til at studere funktionerne af gener fra udvikling til opførsel af nedbryder udtryk for specifikke gener via injektion og/eller fodring af dsRNA i forskellige taxa af insekter2,3. Specificitet og robusthed af de ozonlagsnedbrydende virkning, er anvendelsen af RNAi i øjeblikket betragtes som en potentiel strategi for pest control management4,5. Dog, effektiviteten af RNAi varierer meget mellem insektarter, afhængigt af de forskellige gener bliver målrettet og leveringsmetoder. En voksende mængde af beviser tyder på, at ustabilitet i dsRNA, som er nedbrudt af ribonukleaser, er en kritisk faktor i en begrænset effekt af RNAi5,6. For eksempel, er lave RNAi følsomhed i Manduca sexta blevet forklaret ved, at dsRNA blandet med hemolymph var hurtigt forringede senest 1 time7. På samme måde, tilstedeværelsen af alkalisk nukleaser i midgut, som effektivt forringe indtaget dsRNA, er stærkt korreleret med lav RNAi effektivitet i forskellige insekt ordrer8,9,10.
Oral levering af dsRNA er særligt interessant for anvendelsen af RNAi i en strategi til kontrol med pest, men en metode til at forsinke nedbrydning af dsRNA af nukleaser i midgut har ikke endnu blevet udviklet, som ville have potentiale til at sikre en effektiv RNAi gennem fodring. Dog er passivitet af RNAi til oral levering af dsRNA blevet rapporteret af fodring stor mængde dsRNA, fx 50 µg i Bombyx mori, eller konstant fodring i 8 dage (8 µg dsRNA i alt) i arternes locust. Den tyske kakerlak, Blattella germinica, er meget følsom over for RNAi ved injektion af dsRNA11,12,13,14, men er ikke lydhør over for dsRNA gennem fodring. For nylig, Lin et al. (2017) har vist, at dsRNA indkapslet med Liposom luftfartsselskaber resultater i vellykket RNAi til knockdown α-tubulin genekspression i den midgut og udløser betydelig dødelighed af tysk kakerlak15. Som nedbrydning af dsRNA i midgut er den begrænsende faktor for mundtlige RNAi, tjene Liposom luftfartsselskaber som et middel til at beskytte dsRNA mod nedbrydning, som er umiddelbart gældende i andre insekter med stærk nukleasen aktiviteter i tarmen. Af note, grunden til at vælge bestemte Transfektion reagens (Se Tabel af materialer) vi brugt som Liposom luftfartsselskab i den nuværende protokol er at det er blevet testet for insekt celle linje Transfektion med mindre toksicitet, ifølge den producentens anvisninger. I henhold til sammenligning af forskellige Liposom Transfektion systemer i Gharavi et al. (2013) 16, effektiviteten af transfecting lille interfererende RNA (siRNA) er omtrent den samme mellem denne og andre kommercielt tilgængelige systemer, der har været brugt i dsRNA levering systemer i andre insekter17,18 . Desuden er vores fodring metode forsigtig nok til at sikre den rette mængde af dsRNA indtages af hver kakerlak, og at resultaterne er robust og bekræftet. I Resumé viser denne protokol og resultater, at bruge dsRNA lipoplexes forbedrer dsRNA stabilitet og åbner døren til udformningen af strategien oral levering af RNAi, som er en lovende tilgang til skadedyrsbekæmpelse i fremtiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Sammenfatning og forberedelse af dsRNA
- Identificere dsRNA målwebsteder i den 3' utranslaterede region af target gener. DsTub bruges til at målrette α-tubulin (badekar) gen (GenBank stammesamlingsnummer: KX228233), og dsEGFP som en negativ dsRNA kontrol er designet fra sekvensen af forbedret grønne fluorescens protein (EGFP; GenBank stammesamlingsnummer: LC311024).
- Udføre standard PCR-amplifikation for at syntetisere dsRNA skabeloner med gen-specifikke primere indeholdende T7 promotor sekvens (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'). PCR forstærkning betingelser og primer oplysninger anvendes er disse rapporteret af Lin mfl. (2017) 12 (Se Tabel af materialer).
- Fortsætte med dsRNA forberedelse en T7 transskription Kit (Se Tabel af materialer), efter fabrikantens anvisninger.
Bemærk: At give høj mængde dsRNA, blande to reaktioner i en tube (i alt 40 µL), og der inkuberes ved 37 ° C natten over. - Tilføj 2 µL af DNase (Se Tabel af materialer) i dsRNA prøver for 15 min ved 37 ° C til digest DNA skabeloner.
- Tilføje 200 µL udvinding reagens (Se Tabel af materialer) og 40 µL chloroform, så vortex.
- Der centrifugeres i 10 min på 13.000 x g ved 4 ° C, derefter indsamle supernatanten (150 µL) i en ny microcentrifuge tube.
- Bundfald dsRNA ved at tilføje 150 µL isopropanol og inkubere for 15 min på is.
- Der centrifugeres i 15 min. ved 13.000 x g ved 4 ° C, så Fjern supernatanten.
- Tilføje 200 µL af 70% ethanol til at vaske dsRNA pellets. Der centrifugeres i 10 min på 13.000 x g ved 4 ° C.
- Fjerne ethanolen og Gentag trinene ethanol vask.
- Fjern ethanol og tør dsRNA pellet af centrifugal vakuum koncentratorer i 3 min., derefter resuspend dsRNA med RNase-fri vand.
- Bestemme mængden af den renset dsRNA ved hjælp af en mikro-volumen UV-Vis spektrofotometeret (jf. Tabel af materialer) i henhold til producentens anvisninger og justere til den ønskede koncentration (fx, 0,25 µg/µL til forberedelse af dsRNA lipoplexes).
- Gemme dsRNA prøver på-20 ° C i op til 3 måneder.
2. forberedelse af dsRNA Lipoplexes
- Fortynd 4 µL Transfektion reagens (Se Tabel af materialer) ved at tilføje 4 µL af 5% glukose løsning. Fortynd 4 µL af dsRNA (1 µg) ved at tilføje 4 µL af 5% glukose løsning.
- Den fortyndede Liposom reagens løsning straks tilføje i den fortyndede dsRNA løsning på én gang. Vortex kortvarigt at blande dem, derefter inkuberes i 15 min. ved 25 ° C.
Bemærk: Bland ikke løsninger i omvendt rækkefølge. - DsRNA lipoplexes er klar til brug. Brug inden for 1 times forberedelse, og kassér efter 1 time.
Bemærk: Ifølge producentens anvisninger, bør at lipoplexes anvendes hurtigst muligt.
3. samling af ekstracellulære enzymer fra Hemolymph og Midgut Juice
-
Insekt saltvand buffer (10 x stock)
- Bland 900 mL dobbeltdestilleret vand med 109.3 g NaCl, 15,7 g KCl, 6,3 g CaCl2og 8,3 g MgCl2·6H2O.
- Justere pH på 6.8, og fylde op til 1000 mL.
-
Hemolymph samling
- Bedøver kakerlakker på is, indtil de ikke bevæger sig i 3 min.
- Hold kakerlak med to fingre (tommelfinger og pegefinger), og drej den ventrale side af kakerlak.
- Brug dissekere saks til at skære fra spidsen af en coxa af et bagben.
Bemærk: Skær det tilsluttede skæringspunktet mellem coxa og trochanter. Excision af anden del af coxa var mindre effektiv til at indsamle hemolymph. - Klem maven blidt med langfinger, og indsamle hemolymph blødning fra snit med en 10 µL mikropipette.
- Pool hemolymph fra flere kakerlakker (5 personer) i et microcentrifuge rør.
Bemærk: Holde microcentrifuge rør på isen for at forhindre melanization. Den gennemsnitlige mængde af hemolymph fremstillet af en mandlig kakerlak er 2-3 µL. - Spin ned hemolymph kort med en benchtop centrifuge for 10 s.
- Overføre ønskede volumen af hemolymph (dvs., 10 µL), og bland det med 50 µL 1 x insekt saltvand buffer.
- Der centrifugeres i 10 min ved 1000 x g ved 4 ° C til spin ned hemocytes. Overføre supernatanten til en ren microcentrifuge tube.
- Kvantificere den samlede proteinkoncentration ved hjælp af en mikro-volumen UV-Vis Spektrofotometer ved at måle A28015.
- Justere hver prøve at have den samme proteinkoncentration (6 mg/µL af total protein).
-
Midgut juice samling
- Bedøver kakerlakker på is. Lave kakerlakker ventrale side på dissektion plade med koldt 1 x insekt saltvand buffer ved hjælp af insekt pins.
- Dissekere maven med fine pincet. Fjerne hele tarmen (herunder front, midten, og bagben tarmen) til en frisk skål med 1 x insekt saltvand buffer.
- Fjern den forreste og bageste gut, og hurtigt overføre midgut til et microcentrifuge rør, der indeholder 100 µL insekt saltvand buffer.
- Pool midguts fra seks kakerlakker i samme rør og vortex for 10 s.
- Der centrifugeres i 10 min ved 1000 x g ved 4 ° C til spin ned hemocytes og gut væv. Overføre supernatanten til en ren microcentrifuge tube.
- Kvantificere den samlede proteinkoncentration ved hjælp af en mikro-volumen UV-Vis Spektrofotometer ved at måle A28015.
- Justere hver prøve at have den samme proteinkoncentration (6 mg/µL af total protein).
4. dsRNA nedbrydning Assay
- Frisk forberede 4 µL af den nøgne dsRNA eller dsRNA lipoplexes (1 µg).
- Bland dsRNA løsninger med 10 µL af insekt saltvand buffer (kontrol), udvundet enzymer fra hemolymph eller midgut juice.
- Tilføj 2 µL af enten EGTA (20 mM) eller RNase-fri vand at adskille prøver som kontrolelementer til hæmning af enzym aktiviteter.
- Inkuber i 1 time eller længere (6, 12 eller 24 timer) på 25 ° C.
- Tilføje 200 µL udvinding reagens og 40 µL chloroform, derefter vortex.
- Der centrifugeres i 10 min på 13.000 x g ved 4 ° C, derefter indsamle supernatanten (150 µL) i en ny microcentrifuge tube.
- Bundfald dsRNA ved at tilføje 150 µL isopropanol og inkubere for 15 min på is.
- Der centrifugeres i 15 min. ved 13.000 x g ved 4 ° C, så Fjern supernatanten.
- Tilføje 200 µL af 70% ethanol til at vaske dsRNA pellets. Der centrifugeres i 10 min på 13.000 x g ved 4 ° C.
- Fjerne ethanolen og Gentag trinene ethanol vask.
- Fjerne ethanol og tør dsRNA pellet af centrifugal vakuum koncentratorer til 3 min. Resuspend dsRNA med 10 µL RNase-fri vand.
- Tjekke integriteten af behandlede dsRNA via gelelektroforese på en 1,5%-agarosegel.
5. oral Administration af dsRNA
- Vedligeholde kakerlakker på en diæt, ad libitum tørfoder (hund chow). Fratage vandforsyning fra kakerlakker én dag før dsRNA indtagelse eksperimenter.
- Hold en kakerlak ved at snuppe sine vinger med den fleksible pincet (figur 1, trin 5).
Bemærk: Ikke få fat i kroppen dele af kakerlakker. - Forberede dsRNA lipoplexes, samt nøgne dsRNA, fodring, som beskrevet i afsnit 2.
Bemærk: DsRNA lipoplexes bør tilberedes frisk før fodring. - Fodre 4 µL af dsRNA lipoplexes eller nøgen dsRNA (250 ng) med en mikropipette.
- Langsomt afpipetteres dråbe af dsRNA løsning tæt på mouthparts af kakerlakker og lad kakerlakker indtage slipværktøjet helt.
- Udføre indtagelse eksperimenter to gange om dagen (1 h efter lys på og 1 h før lys slukket) for 8 dage eller 16 dage kontinuerligt.
Bemærk: Alle kakerlakker erhvervet vand kun via manuel fodring med dsRNA løsning eller kontrol reagenser (fxnukleasen gratis vand, glukose løsning og Liposom reagens) under indtagelse eksperimenter. - Give vand flasker til kakerlakker efter 16 dage efter indtagelse af dsRNA eksperimenter.
6. vurdere Knockdown
- På valgte tidspunkt punkter (2, 9 og 17 dage efter dsRNA indtagelse assay), indsamle dsEGFP - og dsTub-behandlet insekterne og dissekere de valgte væv (f.eks, midgut).
- Udføre kvantitative real-time PCR (qRT-PCR). QRT-PCR forstærkning betingelser og primer oplysninger som rapporteret af Lin mfl. (2017) 12.
- Vurdere kontrollen og dsRNA-behandlet insekter dagligt at kontrollere dødelighed og fjerne de kakerlakker, der ikke længere flytter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En forenklet ordning i protokollen for den mundtlige levering af dsRNA er præsenteret i figur 1, hvor de vigtigste skridt til forberedelse af dsRNA lipoplexes er vist.
For at undersøge den beskyttelse af Liposom luftfartsselskaber ved dsRNA nedbrydning i midgut juice af B. germanica, en ex vivo assay hvor dsTub lipoplexes blev inkuberet med midgut juice blev gennemført og integriteten af dsRNA blev efterfølgende analyseret på en 1,5%-agarosegel. Figur 2 viser, at stærke RNA nukleasen aktivitet var til stede i midgut saft af B. germanica (fig. 2A), mens Liposom luftfartsselskaber var i stand til at beskytte dsRNA mod nedbrydning mindst 1 time i ex vivo inkubation (figur 2A, B). Som et resultat blev af oral indtagelse af dsRNA lipoplexes anvendt to gange om dagen for at forøge modtageligheden over midgut væv for RNAi i de følgende eksperimenter.
Validering af RNAi svar gennem oral levering af dsRNA blev vurderet ved at måle effekten udtynding af karret mRNA udtryk i midgut på forskellige tidspunkter efter kontinuerlig indtagelse af dsRNA (fig. 3A). Karret udtryk i midgut var betydeligt forarmet efter kontinuerlig indtagelse af dsTub lipoplexes for 8 dage. Mens de løbende fodring af dsRNA varede 16 dage, balje udtryk i midgut var betydeligt forarmet i nøgen dsTub og dsTub lipoplexes grupper (ca med 24 og 60%, henholdsvis) i modsætning til kontrolelementerne. Figur 3 B viser en konsekvent og betydelig stigning i dødeligheden efter oral indgift af dsTub lipoplexes for 16 dage.
Figur 1 : Forenklede ordning af oral levering af dsRNA lipoplexes for kakerlakker. De vigtigste skridt til forberedelse af dsRNA lipoplexes er repræsenteret for trin 1 til 4. Den fodring teknik (trin 5) er vist i fotoet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Ex vivo nedbrydning af dsRNA af B. germanica hemolymph (Hemo) eller midgut juice. (A) 1 µg af den nøgne eller Liposom-cojugated dsTub blev inkuberet i 1 h med saltvand buffer og udpakkede enzymer fra hemolymph (hemo) eller midgut juice, henholdsvis. Nøgne dsTub, men ikke Liposom-konjugeret dsTub, blev nedbrudt helt når inkuberes med 1 x midgut juice. De forskellige fortynding faktorer af den oprindelige midgut juice (1 x) er angivet. Nedbrydningen var hæmmet af ion Chelat på grund af EGTA behandling som et kontrolelement. (B) tidsafhængig beskyttelse af Liposom-indkapslet dsTub (1 µg) mod ex vivo nedbrydning i hemolymph eller midgut juice. Af note, var Liposom-konjugeret dsTub helt nedbrudt når inkuberes med midgut juice efter 24 h. Hemolymph og midgut saften blev brugt i den oprindelige koncentration for forskellige perioder af inkubation. Resultaterne er tilpasset fra Lin mfl. (2017) 12. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Virkningerne af RNAi svar ved indtagelse af dsRNA på B. germanica. (A) kvantitative real-time PCR (qRT-PCR) til bestemmelse af det relative balje udtryk i midgut af tysk kakerlak efter forskellige fodring behandlinger. Udtrykket niveauer af forskellige behandlinger var normaliseret til gruppen Glucose på dag 2. Værdier er den gennemsnit ± SE fra tre uafhængige eksperimenter (n = 3), hver med 3-5 biologiske replikater. Forskellige bogstaver på søjlerne angiver betydelige forskelle på p < 0,05 (ANOVA efter Tukey's HSD Post Hoc test) blandt forskellige behandlingsgrupper. (B) efterladte af kakerlakker, der indtages nøgen dsTub eller dsTub lipoplexes for 8 dage (8 d) eller 16 dage (16 d) (hver kohorte af 12-15 individer, n = 3 uafhængige forsøg). Værdier er den gennemsnit ± SE. forskellige bogstaver på gruppen behandling viser væsentlige forskelle på p < 0,05 (Kruskal-Wallis test) for efterladte. Resultaterne er tilpasset fra Lin mfl. (2017) 12. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol udgør en metode til effektiv RNAi gennem oral levering af dsRNA lipoplexes, der omfatter beskyttelse mod ribonuklease fordøjelsen i midgut juice af tysk kakerlak. Som vist i andre undersøgelser vedrørende forskellige insektarter, regnskabsmæssigt den fattige RNAi virkning gennem oral levering af dsRNA for det meste ved nedbrydningen af dsRNA8,9,10. Denne protokol producerer Liposomer, der tjener som beskyttende køretøjer i oral levering af dsRNA mod nedbrydning i tarmen. Desuden er udarbejdelse af dsRNA lipoplexes enkel og let anvendelig som mundtlige RNAi, navnlig for insekter med stærk ribonuklease aktivitet i tarmen.
Sammenlignet med andre studier, der sætter forholdsvis store mængder af nøgne dsRNA i forskellige insekter10,18,19, denne protokol bruger oral administration af et relativt lavt antal dsRNA (0,5 µg pr. dag), som forårsager en betydelig udtynding af target genekspression i midgut af B. germanica. Afgørende aspekter ved protokollen omfatter præcise fodring metode og akkumulerede indtagelse af små mængder af dsRNA. For det første fodring teknikken er velegnet til en kontinuerlig indtagelse assay og minimerer variation af den indtagne dsRNA mængde pr. enkelte insekt. Andet, udtynding effekten af karret udtryk i midgut blev vist sig at øge fra 40% på dag 9 til 60% på dag 17 med kontinuerlig oral administration af dsTub lipoplexes (fig. 3A). Selv om den nøgne dsRNA blev hurtigt forringet med ex vivo inkubation af midgut juice i 1 h (fig. 2A), resulteret den kontinuerlige fodring af nøgen dsRNA for 16 dage også i en betydelig udtynding af karret udtryk i midgut (fig. 3A). De længere løbende fodring af dsRNA lipoplexes for 16 dage er desuden et krav om at forårsage en iøjnefaldende dødbringende effekt af RNAi.
Selvom Liposom luftfartsselskaber (Se Tabel af materialer) brugt her var oprindeligt for in vitro- Transfektion af DNA i insekt celler, var der ingen problemer, anvende denne Liposom reagens som et køretøj af dsRNA for oral levering i vores insekt model. Mange undersøgelser har også vist en forbedring af RNAi silencing i andre insektarter, ved hjælp af forskellige Liposom reagenser, som er designet til enten DNA eller RNA molekyler17,20,21. Ikke desto mindre mekanisme for dsRNA optagelse i insekt tarmen er endnu ikke blevet helt undersøgt, og Liposom leveringssystem kan øge optagelsen af dsRNA ind i cellerne, på grund af dens biokompatibilitet med phospholipid struktur22. Derfor, den mundtlige levering af dsRNA indkapslet i Liposomer kunne være en passende strategi for at opnå effektiv RNAi på grund af retardering af nedbrydning af RNases (figur 2).
En ulempe ved denne protokol kan være den lille mængde af dsRNA i Liposom luftfartsselskaber, og dermed kan kræve længere perioder med konstant fodring. Begrænsning af sådan et bestemt forhold mellem dsRNA til Liposom (0,25 µg:1 µL) er på grund af udformningen af den kommercielle Liposom reagens, som pr fabrikantens forslag. Formuleringer i forberedelsen af Liposom nanopartikler med større diameter størrelse, og de forskellige afgift på lipoplexes overflade, er rapporteret at øge indkapsling af siRNA og RNAi silencing effektivitet23,24. Derfor kan de forskellige Liposom nanopartikler bruges også til at forbedre fodring procedurer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra Taiwan (Ministeriet for videnskab og teknologi, mest 100-2923-B-002-002-MY3 og 106-2313-B-002-011-MY3 til H.J.L.), Tjekkiet (giver agenturet i Sydböhmen Universitet, Andreas give Y.H.L 2017-065-P), og Spanien ( Spanske Ministeriet for økonomi og konkurrenceevne, giver CGL2012-36251 og CGL2015-64727-P til X.B. og den catalanske regering, give 2014 SGR 619 til X.B.); Det har også modtaget økonomisk støtte fra den europæiske fond for økonomisk og Regionaludvikling (EFRU-midler til X.B.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GenJe Plus DNA in vitro Transfection reagent | SignaGen | SL100499 | for lipoplexes preparation |
| Blend Taq plus | TOYOBO | BTQ-201 | for PCR |
| Fast SYBR Green Master Mix | ABI | 4385612 | for qPCR |
| FirstChoice RLM-RACE Kit | Invitrogen | AM1700 | for 3' UTR identification |
| MEGAscript T7 Transcription Kit | Invitrogen | AMB13345 | for dsRNA synthesis |
| TURBO DNase | Invitrogen | AM2239 | remove DNA template from dsRNA |
| TRIzol | Invitrogen | 15596018 | for dsRNA or total RNA extraction |
| RQ1 RNase-Free Dnase | Promega | M6101 | remove DNA template from total RNA |
| chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | for dsRNA or total RNA extraction |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | I9516 | for dsRNA or total RNA extraction |
| ethanol | Sigma-Aldrich | 24102 | for dsRNA or total RNA extraction |
| Diethyl pyrocarbonate, DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | for RNase free water preparation |
| glucose solution | Sigma-Aldrich | G3285 | for lipoplexes preparation |
| Sodium chloride, NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | insect saline buffer formula |
| Potassium chloride, KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | insect saline buffer formula |
| Calcium chloride, CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | insect saline buffer formula |
| Magnesium chloride hexahydrate, MgCl2.6H2O | Sigma-Aldrich | M2670 | insect saline buffer formula |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | enzyme inhibitor |
| dissecting scissor | F.S.T. | cockroach dissection | |
| fine tweezers | F.S.T. | cockroach dissection | |
| flexible tweezer | F.S.T. | cockroach holding | |
| pipetman | RAININ | P10 | sample preparation |
| microcentrifuge tube | Axygen | MCT175C, PCR02C | sample preparation |
| pipette tip | Axygen | sample preparation | |
| vortexter | Digisystem | vm1000 | sample preparation |
| Minispin centrifuge | The Gruffin Group | GMC 206 | for liquid spin down |
| Centrifuge | ALC | PK121R | sample preparation |
| pH meter | JENCO | 6071 | for pH adjust |
| micro-volume spectrophotometer | Quawell | Q3000 | nucleic acid quantitative |
| PCR Thermal cycler | ABI | 2720 | for template PCR or dsRNA synthesis incubation |
| quantitative real-time PCR | ABI | StepOne plus | gene expression quantitative |
| Centrifugal Vacuum Concentrators | eppendorf | 5301 | for dsRNA or total RNA extraction |
| Multipette | eppendorf | xstream | for real-time PCR sample loading |
| Agarose I | amresco | 0710 | for nucleic acid electrophoresis |
| tub gene specfifc forward preimer | tri-I biotech | GGG ACA AGC CGG AGT GCA GA | |
| tub gene specfifc reverse preimer | tri-I biotech | TCC TGC TCC TGT CTC GCT GA | |
| dsTub template forward primer | tri-I biotech | TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA CAA GCC GGA GTG CAG | |
| dsTub template reverse primer | tri-I biotech | TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT CCT GCT CCT GTC TCG CTG | |
| dsEGFP template forward preimer | tri-I biotech | TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT ATG GTG AGC AAG GGC GAG GAG | |
| dsEGFP template reverse preimer | tri-I biotech | TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT GGC GGA TCT TGA AGT TCA CC | |
| tub qPCR forward primer | tri-I biotech | GGA CCG CAT CAG GAA ACT GGC | |
| tub qPCR reverse preimer | tri-I biotech | CCA CAG ACA GCC TCT CCA TGA GC | |
| ef1 qPCR forward primer | tri-I biotech | CGC TTG AGG AAA TCA AGA AGG A | |
| ef1 qPCRreverse preimer | tri-I biotech | CCT GCA GAG GAA GAC GAA G |
References
- Hammond, S. M. Dicing and slicing: The core machinery of the RNA interference pathway. FEBS Lett. 579, 5822-5829 (2005).
- Bellés, X. Beyond drosophila: RNAi in vivo and functional genomics in insects. Annu. Rev. Entomol. 55, 111-128 (2010).
- Wynant, N., Santos, D., Vanden Broeck, J. Chapter Five - Biological Mechanisms Determining the Success of RNA Interference in Insects. International Review of Cell and Molecular Biology. Jeon, K. W. 312, Academic Press. 139-167 (2014).
- San Miguel, K., Scott, J. G. The next generation of insecticides: dsRNA is stable as a foliar-applied insecticide. Pest Manag. Sci. 72, 801-809 (2016).
- Scott, J. G., et al. Towards the elements of successful insect RNAi. J. Insect Physiol. 59, 1212-1221 (2013).
- Joga, M. R., Zotti, M. J., Smagghe, G., Christiaens, O. RNAi efficiency, systemic properties, and novel delivery methods for pest insect control: What we know so far. Front. Physiol. 7, (2016).
- Garbutt, J. S., Bellés, X., Richards, E. H., Reynolds, S. E. Persistence of double-stranded RNA in insect hemolymph as a potential determiner of RNA interference success: Evidence from Manduca sexta and Blattella germanica. J. Insect Physiol. 59, 171-178 (2013).
- Arimatsu, Y., Kotani, E., Sugimura, Y., Furusawa, T. Molecular characterization of a cDNA encoding extracellular dsRNase and its expression in the silkworm, Bombyx mori. Insect Biochem. Mol. Biol. 37, 176-183 (2007).
- Wang, K., et al. Variation in RNAi efficacy among insect species is attributable to dsRNA degradation in vivo. Insect Biochem. Mol. Biol. 77, 1-9 (2016).
- Wynant, N., et al. Identification, functional characterization and phylogenetic analysis of double stranded RNA degrading enzymes present in the gut of the desert locust, Schistocerca gregaria. Insect Biochem. Mol. Biol. 46, 1-8 (2014).
- Huang, J. -H., Belles, X., Lee, H. -J. Functional characterization of hypertrehalosemic hormone receptor in relation to hemolymph trehalose and to oxidative stress in the cockroach Blattella germanica. Exp. Endocrinol. 2, 114 (2012).
- Lin, Y. -H., Lee, C. -M., Huang, J. -H., Lee, H. -J. Circadian regulation of permethrin susceptibility by glutathione S-transferase (BgGSTD1) in the German cockroach (Blattella germanica). J. Insect Physiol. 65, 45-50 (2014).
- Lozano, J., Kayukawa, T., Shinoda, T., Belles, X. A role for taiman in insect metamorphosis. PLOS Genet. 10, 1004769 (2014).
- Lozano, J., Montañez, R., Belles, X. MiR-2 family regulates insect metamorphosis by controlling the juvenile hormone signaling pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. 112, 3740-3745 (2015).
- Lin, Y. -H., Huang, J. -H., Liu, Y., Belles, X., Lee, H. -J. Oral delivery of dsRNA lipoplexes to German cockroach protects dsRNA from degradation and induces RNAi response. Pest Manag. Sci. 73, 960-966 (2017).
- Gharavi, J., et al. Chiral cationic polyamines for chiral microcapsules and siRNA delivery. Bioorg. Med. Chem. Lett. 23, 5919-5922 (2013).
- Whyard, S., Singh, A. D., Wong, S. Ingested double-stranded RNAs can act as species-specific insecticides. Insect Biochem. Mol. Biol. 39, 824-832 (2009).
- Luo, Y., et al. Differential responses of migratory locusts to systemic RNA interference via double-stranded RNA injection and feeding. Insect Mol. Biol. 22, 574-583 (2013).
- Liu, J., Smagghe, G., Swevers, L. Transcriptional response of BmToll9-1 and RNAi machinery genes to exogenous dsRNA in the midgut of Bombyx mori. J. Insect Physiol. 59, 646-654 (2013).
- Airs, P. M., Bartholomay, L. C. RNA interference for mosquito and mosquito-borne disease control. Insects. 8, 4 (2017).
- Taning, C. N. T., et al. Oral RNAi to control Drosophila suzukii: Laboratory testing against larval and adult stages. J. Pest Sci. 89, 803-814 (2016).
- Wu, S. Y., McMillan, N. A. J. Lipidic systems for in vivo siRNA delivery. AAPS J. 11, 639-652 (2009).
- Tam, Y. Y. C., Chen, S., Cullis, P. R. Advances in lipid nanoparticles for siRNA delivery. Pharmaceutics. 5, 498-507 (2013).
- Xia, Y., Tian, J., Chen, X. Effect of surface properties on liposomal siRNA delivery. Biomaterials. 79, 56-68 (2016).
