Summary
Ce manuscrit montre l’épuisement d’expression de gène dans l’intestin moyen de la blatte germanique par ingestion orale de l’ARN double brin encapsulée dans des liposomes.
Abstract
L’interférence ARN (ARNi) a été largement appliqué pour découvrir les fonctions biologiques de nombreux gènes et il a été envisagé comme un outil de contrôle antiparasitaire marche par perturbation de l’expression des gènes essentiels. Bien que différentes méthodes, telles que l’injection, d’alimentation et de trempage, ont été signalés pour la mise en œuvre réussie de l’ARN double brin (dsRNA), l’efficacité de l’ARNi par administration orale de dsRNA est très variable entre les différents groupes d’insectes. La blatte germanique, Blattella germanica, est très sensible à l’injection d’ARNdb, comme en témoignent de nombreuses études publiées précédemment. La présente étude décrit une méthode pour démontrer que dsRNA encapsulé avec des transporteurs de liposome est suffisant pour retarder la dégradation de l’ARNdb par jus de l’intestin moyen. Notamment, l’alimentation continue des dsRNA encapsulé de liposomes significativement réduit l’expression de la tubuline dans l’intestin moyen et a causé la mort de cafards. En conclusion, la formulation et l’utilisation de lipoplexes dsRNA, qui protègent les ARNdb contre nucléases, pourraient être une utilisation pratique de l’ARNi pour le contrôle des insectes nuisibles à l’avenir.
Introduction
Arni a été démontrée comme une méthode efficace pour l’expression des gènes knockdown au moyen d’un mécanisme d’une voie de silencieux post-transcriptionnelle déclenchée par les molécules de dsRNA dans nombreux eucaryotes1. Ces dix dernières années d’étude, l’ARNi est devenu un outil utile pour étudier les fonctions des gènes du développement au comportement en appauvrissant l’expression de gènes spécifiques par injection et/ou alimentation d’ARNdb dans divers taxons d’insectes2,3. En raison de la spécificité et la robustesse de l’appauvrissant la couche d’effet, l’application de l’ARNi est actuellement considérée comme une stratégie potentielle de pest control management4,5. Cependant, l’efficacité de l’ARNi varie considérablement entre les espèces d’insectes, selon les différents gènes ciblés et les méthodes de livraison. Un corps croissant d’évidence suggère que l’instabilité des ARNdb, qui est dégradée par les ribonucléases, est un facteur critique dans l’efficacité limitée des Arni5,6. Par exemple, la faible sensibilité de l’ARNi dans Manduca sexta a été expliquée par le fait que l’ARNdb mélangé à l’hémolymphe était rapidement dégradé dans 1 heure7. De même, la présence des nucléases alcalines dans l’intestin moyen, qui efficacement dégrader dsRNA ingéré, est fortement corrélée à faible efficacité de RNAi dans des ordres différents insectes8,9,10.
L’administration orale de dsRNA est particulièrement intéressante pour l’application de l’ARNi dans une stratégie de lutte antiparasitaire, mais une méthode pour retarder la dégradation de l’ARNdb par les nucléases dans l’intestin n'a pas encore été développée, qui aurait le potentiel d’assurer efficacement ARNi en se nourrissant. Toutefois, le problème de blocage de l’ARNi pour administration orale de dsRNA a été signalé par la grande quantité de dsRNA, par exemple 50 µg du Bombyx mori, d’alimentation ou d’alimentation sans interruption pendant 8 jours (8 µg dsRNA au total) chez les espèces de criquets. La blatte germanique, Blatella germinica, est très sensible aux Arni par l’injection d’ARNdb11,12,13,14, mais ne répondre pas aux ARNdb en se nourrissant. Récemment, Lin et al. (2017) ont démontré que dsRNA encapsulés avec résultats porteurs liposome dans RNAi réussie à knockdown l’expression du gène α-tubuline dans l’intestin moyen et déclencher une mortalité significative de la blatte germanique15. Comme la dégradation des ARNdb dans l’intestin moyen est le facteur limitant pour RNAi orale, les transporteurs de liposome servent de véhicule pour protéger dsRNA de dégradation, qui est facilement applicable chez d’autres insectes avec activités nucléase forte dans le tube digestif. À noter, la raison d’avoir choisi le réactif de transfection particulière (voir Table des matières), nous avons utilisé comme transporteur de liposome dans le protocole actuel, c’est qu’il a été testé pour la transfection de cellules insectes ligne avec moins de toxicité, conformément à la instructions du fabricant. D’après la comparaison des systèmes de transfection différentes liposome Gharavi et al. (2013) 16, l’efficacité de transfection des petits ARN interférents (siARN) est approximativement la même entre ceci et d’autres systèmes disponibles dans le commerce qui ont été utilisés pour les systèmes de livraison de dsRNA dans autres insectes17,18 . De plus, notre méthode d’alimentation est assez prudent afin d’assurer une quantité suffisante de dsRNA est ingérée par chaque cafard, et que les résultats sont robustes et confirmés. En résumé, le présent protocole et les résultats démontrent qu’à l’aide de dsRNA lipoplexes améliore la stabilité de l’ARNdb et ouvre la voie à la conception de l’administration orale de stratégie de l’ARNi, qui est une approche prometteuse pour la lutte contre les ravageurs à l’avenir.
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Protocol
1. synthèse et préparation d’ARNdb
- Identifier les sites dsRNA de cibles dans la région non traduite en 3' des gènes cibles. Le dsTub est utilisé pour cibler le gène α-tubuline (tub) (numéro de GenBank accession : KX228233), et dsEGFP comme un contrôle négatif dsRNA est conçu à partir de la séquence d’une protéine de fluorescence verte (EGFP ; Numéro d’accession GenBank : LC311024).
- Effectuer l’amplification par PCR standard pour synthétiser les modèles dsRNA avec des amorces de gène-spécifique contenant la séquence du promoteur T7 (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'). Les conditions d’amplification PCR et les informations d’apprêt utilisé sont celles rapportées par Lin et al. (2017) 12 (voir Table des matières).
- Procéder à la préparation de dsRNA utilisant une Transcription T7 Kit (voir Table des matières), suivant les instructions du fabricant.
Remarque : Pour obtenir la quantité élevée de dsRNA, mélanger deux réactions dans un tube (au total 40 µL) et incuber à 37 ° C pendant la nuit. - Ajouter 2 µL de DNase (voir Table des matières) dans des échantillons de dsRNA pendant 15 min à 37 ° C à digérer l’ADN modèles.
- Ajouter 200 µL de réactif d’extraction (voir Table des matières) et chloroforme 40 µL, puis vortexer.
- Centrifuger pendant 10 min à 13 000 x g à 4 ° C, puis recueillir le surnageant (150 µL) dans un nouveau tube de microcentrifuge.
- Précipiter les ARNdb en ajoutant 150 µL isopropanol et incuber pendant 15 minutes sur la glace.
- Centrifuger à 13 000 x g à 4 ° C pendant 15 minutes, puis enlever le surnageant.
- Ajouter 200 µL de l’éthanol à 70 % à laver dsRNA granulés. Centrifugation pendant 10 min à 13 000 x g à 4 ° C.
- Enlever l’éthanol et répéter les étapes de lavage de l’éthanol.
- Supprimer l’éthanol et les granulés secs dsRNA par centrifuges concentrateurs sous vide pendant 3 min, puis remettre en suspension les ARNdb eau exempte de RNase.
- Déterminer la quantité de l’ARNdb purifiée à l’aide d’un spectrophotomètre UV-Vis de micro-volume (voir Table des matières) selon les instructions du fabricant et de s’adapter à la concentration désirée (par exemple, 0,25 µg/µL pour la préparation de dsRNA lipoplexes).
- Stocker les échantillons de dsRNA à-20 ° C pendant 3 mois.
2. préparation d’ARNdb Lipoplexes
- Diluer 4 µL de réactif de la transfection (voir Table des matières) en ajoutant 4 µL de solution de glucose à 5 %. Diluer 4 µL de l’ARNdb (1 µg) en ajoutant 4 µL de solution de glucose à 5 %.
- Ajouter la solution de réactif dilué liposome immédiatement dans la solution diluée de dsRNA tout à la fois. Vortex brièvement pour mélanger, puis incuber pendant 15 min à 25 ° C.
Remarque : Ne pas mélanger les solutions dans l’ordre inverse. - Les lipoplexes ARNdb sont prêts à l’emploi. Utiliser dans 1 heure de préparation et mettre au rebut après 1 heure.
Remarque : Selon les instructions du fabricant, les lipoplexes doit être utilisé dès que possible.
3. perception des Enzymes extracellulaires de l’hémolymphe et Midgut jus
-
Insecte tampon salin (stock de x 10)
- Mélanger 900 mL eau bidistillée à 109,3 g NaCl, 15,7 g KCl, 6,3 g de CaCl2et 8,3 g MgCl2·6H2O.
- Ajuster le pH à 6,8 et compléter à 1 000 mL.
-
Collection de l’hémolymphe
- Anesthésier les cafards sur la glace jusqu'à ce qu’ils ne bougent pas pendant 3 min.
- Maintenez la blatte avec deux doigts (pouce et index) et augmentez la face ventrale de la blatte.
- Le ciseaux de dissection permet de couper l’extrémité d’une coxa d’une patte arrière.
Remarque : Couper l’intersection connectée entre la coxa et trochanter. L’excision de l’autre partie de coxa était moins efficace pour collecter l’hémolymphe. - Presser l’abdomen doucement avec le doigt du milieu et recueillir l’hémolymphe des saignements de l’incision avec une micropipette 10 µL.
- Piscine de l’hémolymphe de plusieurs cafards (5 personnes) dans un tube de microcentrifuge.
Remarque : Garder les tubes de microcentrifuge sur glace pour empêcher la mélanisation. Le volume moyen de l’hémolymphe provenant d’un cafard masculin est 2-3 µL. - Tournez en bas l’hémolymphe brièvement avec une centrifugeuse de paillasse pendant 10 s.
- Transférer le volume souhaité de l’hémolymphe (c.-à-d., 10 µL) et le mélanger avec 50 µL de tampon saline au x insectes 1.
- Centrifuger pendant 10 min à 1 000 x g à 4 ° C, pour filer vers le bas hémocytes. Transférer le surnageant dans un tube de microcentrifuge propre.
- Quantifier la concentration de protéines totales à l’aide d’un spectrophotomètre UV-Vis de micro-volume en mesurant A28015.
- Ajuster chaque échantillon pour avoir la même concentration de protéine (6 µL/mg de protéine totale).
-
Collection de jus strié
- Anesthésier les cafards sur la glace. Fixer les cafards face ventrale vers le haut sur la plaque de dissection avec tampon saline au insectes froid 1 x à l’aide d’épingles à insectes.
- Disséquer l’abdomen avec des pinces fines. Enlever l’intestin entier (y compris l’intestin avant, milieu et arrière) pour un plat frais avec 1 x tampon saline insecte.
- Enlever l’intestin avant et arrière et transférer rapidement l’intestin moyen dans un tube de microcentrifuge qui contient 100 µL de tampon saline insectes.
- La piscine de l’intestin moyen de six cafards dans le même tube et vortexer pendant 10 s.
- Centrifuger pendant 10 min à 1 000 x g à 4 ° C, pour filer vers le bas les hémocytes et les tissus de l’intestin. Transférer le surnageant dans un tube de microcentrifuge propre.
- Quantifier la concentration de protéines totales à l’aide d’un spectrophotomètre UV-Vis de micro-volume en mesurant A28015.
- Ajuster chaque échantillon pour avoir la même concentration de protéine (6 µL/mg de protéine totale).
4. dsRNA dégradation Assay
- Fraîchement préparer 4 µL de l’ARNdb nu ou dsRNA lipoplexes (1 µg).
- Mélanger dsRNA enzymes de solutions avec 10 µL de tampon saline insecte (contrôle), extraites de l’hémolymphe, ou de l’intestin moyen le jus.
- Ajouter 2 µL de EGTA (20 mM) ou de l’eau exempte de RNase pour séparer les échantillons sous forme de contrôles pour l’inhibition de l’activité enzymatique.
- Incuber pendant 1 heure ou plus long (6, 12 ou 24 heures) à 25 ° C.
- Ajouter 200 µL de réactif d’extraction et de 40 µL chloroforme, puis vortexer.
- Centrifuger pendant 10 min à 13 000 x g à 4 ° C, puis recueillir le surnageant (150 µL) dans un nouveau tube de microcentrifuge.
- Précipiter les ARNdb en ajoutant 150 µL isopropanol et incuber pendant 15 minutes sur la glace.
- Centrifuger à 13 000 x g à 4 ° C pendant 15 minutes, puis enlever le surnageant.
- Ajouter 200 µL de l’éthanol à 70 % à laver dsRNA granulés. Centrifugation pendant 10 min à 13 000 x g à 4 ° C.
- Enlever l’éthanol et répéter les étapes de lavage de l’éthanol.
- Supprimer l’éthanol et les granulés secs dsRNA par centrifuges concentrateurs sous vide pour 3 min. remettre dsRNA avec de l’eau exempte de RNase 10 µL.
- Vérifier l’intégrité des traités dsRNA par électrophorèse sur un gel d’agarose de 1,5 %.
5. orale d’ARNdb
- Maintenir les cafards sur une alimentation ad libitum de nourriture sèche (dog ChowMD). Priver d’eau les blattes un jour avant les expériences de dsRNA ingestion.
- Tenez un cafard en saisissant ses ailes avec la pince flexible (Figure 1, échelon 5).
Remarque : Ne prenez pas les parties du corps de cafards. - Préparer les lipoplexes dsRNA, ainsi que dsRNA nu, destinés à l’alimentation, tel que décrit à l’article 2.
Remarque : Les lipoplexes dsRNA devrait être fraîchement préparées avant la tétée. - 4 µL d’ARNdb lipoplexes ou dsRNA nu d’alimentation (250 ng) avec une micropipette.
- Lentement pipette la goutte de la solution de dsRNA à proximité les pièces buccales de cafards et laissez les cafards ingèrent la gouttelette complètement.
- Réaliser les expériences de l’ingestion deux fois par jour (1 h après s’allume et 1 h avant les lumières) pour 8 jours ou 16 jours en continu.
Remarque : Tous les cancrelats acquis l’eau que par le biais d’une alimentation manuelle avec dsRNA réactifs de solution ou de contrôle (par exemple, eau gratuite nucléase, solution de glucose et réactif aux liposomes) au cours d’expériences de l’ingestion. - Fournir des bouteilles d’eau pour les cafards après 16 jours d’ingestion d’ARNdb expériences.
6. évaluer le Knockdown
- Au moment choisi points (2, 9 et 17 jours après l’essai d’ingestion de dsRNA), collecter les insectes traités dsEGFP et dsTub et disséquer les tissus choisis (par exemple, de l’intestin moyen).
- Effectuer une PCR en temps réel quantitative (qRT-PCR). Les qRT-PCR amplification conditions et les informations d’apprêt tel que rapporté par Lin et coll.. (2017) 12.
- Évaluer le contrôle et les insectes de dsRNA-traités quotidiennement pour vérifier la mortalité et supprimer les cafards qui ne sont plus mobiles.
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Representative Results
Un schéma simplifié du protocole pour l’administration orale de dsRNA est présenté dans la Figure 1, où figurent les principales étapes pour la préparation de dsRNA lipoplexes.
Afin d’étudier la protection accordée par les transporteurs aux liposomes à la dégradation de l’ARNdb dans le jus de l’intestin moyen de b. germanica, un test ex vivo où dsTub lipoplexes sont incubées avec du jus de l’intestin a été réalisée et l’intégrité de l’ARNdb a été analysée par la suite sur un gel d’agarose de 1,5 %. La figure 2 montre que la forte activité nucléasique de RNA était présente dans le jus de l’intestin moyen de b. germanica (Figure 2A), alors que les transporteurs de liposomes ont pu protéger dsRNA contre la dégradation au moins pendant 1 heure dans le ex vivo incubation (Figure 2A, B). Ainsi, l’ingestion orale de dsRNA lipoplexes a été appliquée deux fois par jour pour augmenter la sensibilité des tissus de l’intestin moyen à Arni dans les expériences suivantes.
Validation de la réponse d’Arni par administration orale de dsRNA a été évaluée en mesurant l’effet d’appauvrissement de l’expression des ARNm de baignoire dans l’intestin à des moments différents après l’ingestion continue de dsRNA (Figure 3A). L’expression de la baignoire dans l’intestin a été considérablement appauvrie après l’ingestion continue de lipoplexes dsTub pendant 8 jours. Tandis que l’alimentation continue des ARNdb a duré 16 jours, l’expression de la baignoire dans l’intestin moyen était considérablement épuisée dans les groupes de lipoplexes de dsTub et nu dsTub (environ de 24 et 60 %, respectivement) à la différence des contrôles. Figure 3 B montre une augmentation cohérente et significative de la mortalité après l’administration orale de lipoplexes dsTub pendant 16 jours.
Figure 1 : Régime simplifié de l’administration orale de dsRNA lipoplexes pour cafards. Les principales étapes pour la préparation de dsRNA lipoplexes sont représentées pour les étapes 1 à 4. La technique d’alimentation (étape 5) est montrée sur la photo. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2: Ex vivo dégradation de dsRNA par b. germanica l’hémolymphe (hémo) ou jus de midgut. (A) 1 µg de le dsTub nu ou liposome-cojugated est incubé pendant 1 h avec tampon saline et enzymes extraites de l’hémolymphe (hémo) ou le jus de l’intestin moyen, respectivement. Le dsTub nu, mais pas aux liposomes conjugué dsTub, a été dégradé complètement incubés avec 1 x jus de l’intestin moyen. Les facteurs de dilution différent du jus de l’intestin moyen (1 x) sont indiqués. La dégradation a été inhibée par chélation des ions due au traitement EGTA comme un contrôle. (B) protection dépendant du temps de dsTub de liposome-encapsulé (1 µg) contre la dégradation des ex vivo dans le jus de l’hémolymphe ou strié. À noter, le dsTub conjugué aux liposomes a été dégradé complètement incubés avec du jus de l’intestin moyen après 24h. Le jus de l’hémolymphe et l’intestin moyen on a utilisé la concentration originale pour différentes périodes d’incubation. Les résultats constituent des adaptations de Lin et al. (2017) 12. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Effets de RNAi réponse par ingestion de dsRNA sur b. germanica. (A) en temps réel PCR Quantitative (qRT-PCR) pour la détermination de l’expression relative baignoire dans l’intestin moyen de la blatte germanique après différents traitements d’alimentation. Les niveaux d’expression de différents traitements ont été normalisées au groupe de Glucose à jour 2. Les valeurs sont la moyenne ± écart type de trois expériences indépendantes (n = 3), chacune avec 3 à 5 répétitions biologiques. Des lettres différentes sur les barres montrent des différences significatives à p < 0,05 (ANOVA suivant le test Post Hoc de HSD de Tukey) parmi les groupes de traitement différents. (B) la survie des cafards qui ingéré nu dsTub ou dsTub lipoplexes pendant 8 jours (8d) ou 16 jours (16d) (chaque cohorte de 12 à 15 personnes ; n = 3 expériences indépendantes). Les valeurs sont la moyenne ± SE. différentes lettres sur le groupe de traitement montrent des différences significatives à p < 0,05 (test de Kruskal-Wallis) pour la survie. Les résultats constituent des adaptations de Lin et al. (2017) 12. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Ce protocole présente une méthode pour RNAi efficace par administration orale de dsRNA lipoplexes, impliquant la protection contre la digestion de la ribonucléase dans le jus de l’intestin moyen de la blatte germanique. Comme indiqué dans d’autres études dans diverses espèces d’insectes, l’effet de RNAi pauvre par administration orale de dsRNA est principalement expliquée par la dégradation de l’ARNdb8,9,10. Ce protocole produit des liposomes qui servent de protection véhicules en administration orale de dsRNA contre la dégradation dans l’intestin. En outre, la préparation des lipoplexes dsRNA est simple et facilement applicable comme Arni par voie orale, en particulier chez les insectes avec l’activité de la ribonucléase forte dans le tube digestif.
Par rapport à d’autres études qui alimentent des quantités relativement importantes de dsRNA nue dans différents insectes10,18,19, ce protocole utilise l’administration orale d’une quantité relativement faible d’ARNdb (0,5 µg par jour), ce qui provoque une déplétion significative de l’expression des gènes de cible dans l’intestin moyen de b. germanica. Des aspects cruciaux du protocole comprennent la méthode précise d’alimentation et accumulé d’ingestion de petites quantités d’ARNdb. Tout d’abord, la technique d’alimentation convient pour un dosage de l’ingestion continue et réduit au minimum la variation de la quantité ingérée de dsRNA par différents insectes. Deuxièmement, l’effet de l’appauvrissement de l’expression de la baignoire dans l’intestin moyen s’est avéré augmenter de 40 % au jour 9 à 60 % au jour 17 avec l’administration orale continue de lipoplexes dsTub (Figure 3A). Bien que l’ARNdb nue était rapidement dégradé avec ex vivo l’incubation du jus de l’intestin moyen moins de 1 h (Figure 2A), l’alimentation continue d’ARNdb nue pendant 16 jours a aussi entraîné une importante diminution d’expression de la baignoire dans l’intestin moyen (Figure 3A). En outre, la plus longue période d’alimentation continue de dsRNA lipoplexes pendant 16 jours est une exigence pour causer un effet létal visible par Arni.
Bien que les transporteurs de liposome (voir Table des matières) utilisées ici ont été à l’origine pour in vitro la transfection d’ADN dans des cellules d’insecte, il n’y avait aucun problème pour appliquer ce réactif aux liposomes comme vecteur d’ARNdb pour administration orale dans notre modèle d’insectes. Plusieurs études ont démontré avec succès l’amélioration de RNAi mise sous silence chez d’autres espèces d’insectes à l’aide de réactifs différents aux liposomes, qui sont conçus pour l’ADN ou ARN molécules17,20,21. Néanmoins, le mécanisme de l’ARNdb absorption dans l’intestin des insecte n’a pas encore été complètement étudié, et le système de largage de liposome pourrait améliorer l’absorption de l’ARNdb dans les cellules, en raison de sa biocompatibilité avec phospholipides structure22. Donc, l’administration orale de dsRNA encapsulé dans les liposomes pourrait constituer une stratégie appropriée pour atteindre RNAi efficace en raison du retard de la dégradation par les RNases (Figure 2).
Un seul inconvénient de ce protocole pourrait être la petite quantité d’ARNdb dans les transporteurs liposome et donc nécessiter des périodes plus longues de l’alimentation en continu. La restriction d’un rapport particulier entre dsRNA de liposome (0,25 µg:1 µL) est due à la conception du réactif commercial liposome, selon suggestion du fabricant. Les formulations en préparation de nanoparticules de liposome avec plus gros diamètre et des frais différents sur la surface de lipoplexes, sont censés augmenter l’encapsulation des siARN et Arni silencieux efficacité23,24. Donc, les nanoparticules de liposome différents aussi permet d’améliorer les procédures d’alimentation.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Cette étude a été financée par des subventions de Taiwan (ministère de la Science et la technologie, plus 100-2923-B-002-002-MY3 et 106-2313-B-002-011-MY3 à H.J.L.), la République tchèque (subvention Agence de Bohême du sud Université, Gamal accorder 065/2017/P à Y.H.L) et (Espagne) Ministère espagnol de l’économie et la compétitivité, subventions CGL2012-36251 et CGL2015-64727-P X.B., et le gouvernement Catalan, accorder 2014 SGR / 619 à X.B.) ; Il a également reçu un soutien financier du Fonds européen pour le développement économique et régional (fonds FEDER à X.B.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GenJe Plus DNA in vitro Transfection reagent | SignaGen | SL100499 | for lipoplexes preparation |
| Blend Taq plus | TOYOBO | BTQ-201 | for PCR |
| Fast SYBR Green Master Mix | ABI | 4385612 | for qPCR |
| FirstChoice RLM-RACE Kit | Invitrogen | AM1700 | for 3' UTR identification |
| MEGAscript T7 Transcription Kit | Invitrogen | AMB13345 | for dsRNA synthesis |
| TURBO DNase | Invitrogen | AM2239 | remove DNA template from dsRNA |
| TRIzol | Invitrogen | 15596018 | for dsRNA or total RNA extraction |
| RQ1 RNase-Free Dnase | Promega | M6101 | remove DNA template from total RNA |
| chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | for dsRNA or total RNA extraction |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | I9516 | for dsRNA or total RNA extraction |
| ethanol | Sigma-Aldrich | 24102 | for dsRNA or total RNA extraction |
| Diethyl pyrocarbonate, DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | for RNase free water preparation |
| glucose solution | Sigma-Aldrich | G3285 | for lipoplexes preparation |
| Sodium chloride, NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | insect saline buffer formula |
| Potassium chloride, KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | insect saline buffer formula |
| Calcium chloride, CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | insect saline buffer formula |
| Magnesium chloride hexahydrate, MgCl2.6H2O | Sigma-Aldrich | M2670 | insect saline buffer formula |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | enzyme inhibitor |
| dissecting scissor | F.S.T. | cockroach dissection | |
| fine tweezers | F.S.T. | cockroach dissection | |
| flexible tweezer | F.S.T. | cockroach holding | |
| pipetman | RAININ | P10 | sample preparation |
| microcentrifuge tube | Axygen | MCT175C, PCR02C | sample preparation |
| pipette tip | Axygen | sample preparation | |
| vortexter | Digisystem | vm1000 | sample preparation |
| Minispin centrifuge | The Gruffin Group | GMC 206 | for liquid spin down |
| Centrifuge | ALC | PK121R | sample preparation |
| pH meter | JENCO | 6071 | for pH adjust |
| micro-volume spectrophotometer | Quawell | Q3000 | nucleic acid quantitative |
| PCR Thermal cycler | ABI | 2720 | for template PCR or dsRNA synthesis incubation |
| quantitative real-time PCR | ABI | StepOne plus | gene expression quantitative |
| Centrifugal Vacuum Concentrators | eppendorf | 5301 | for dsRNA or total RNA extraction |
| Multipette | eppendorf | xstream | for real-time PCR sample loading |
| Agarose I | amresco | 0710 | for nucleic acid electrophoresis |
| tub gene specfifc forward preimer | tri-I biotech | GGG ACA AGC CGG AGT GCA GA | |
| tub gene specfifc reverse preimer | tri-I biotech | TCC TGC TCC TGT CTC GCT GA | |
| dsTub template forward primer | tri-I biotech | TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA CAA GCC GGA GTG CAG | |
| dsTub template reverse primer | tri-I biotech | TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT CCT GCT CCT GTC TCG CTG | |
| dsEGFP template forward preimer | tri-I biotech | TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT ATG GTG AGC AAG GGC GAG GAG | |
| dsEGFP template reverse preimer | tri-I biotech | TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT GGC GGA TCT TGA AGT TCA CC | |
| tub qPCR forward primer | tri-I biotech | GGA CCG CAT CAG GAA ACT GGC | |
| tub qPCR reverse preimer | tri-I biotech | CCA CAG ACA GCC TCT CCA TGA GC | |
| ef1 qPCR forward primer | tri-I biotech | CGC TTG AGG AAA TCA AGA AGG A | |
| ef1 qPCRreverse preimer | tri-I biotech | CCT GCA GAG GAA GAC GAA G |
References
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