Summary
Diese Handschrift zeigt die Erschöpfung der Gen-Expression in den Mitteldarm der deutschen Schabe durch orale Einnahme von doppelsträngige RNA in Liposomen verkapselt.
Abstract
RNA-Interferenz (RNAi) hat für die Aufdeckung der biologischen Funktionen von zahlreichen Genen weit angewendet worden und hat als eine Pest Control Tool betriebliche durch Störung der wesentlichen Genexpression vorgesehen. Obwohl verschiedene Methoden, wie Injektion, füttern und Tränken, für die erfolgreiche Durchführung der doppelsträngige RNA (DsRNA) gemeldet worden sind, ist die Effizienz der RNAi durch mündliche Lieferung von DsRNA hochvariablen unter verschiedenen Insektengruppen. Die Deutsche Schabe, Blattella Germanica, ist sehr empfindlich auf die Injektion von DsRNA, wie von vielen bisher veröffentlichten Studien gezeigt. Die vorliegende Studie beschreibt eine Methode, um nachzuweisen, dass die DsRNA gekapselt mit Liposomen Träger ausreichen, um den Abbau von DsRNA Mitteldarm Fruchtsaft zu verzögern. Vor allem die kontinuierliche Beschickung der DsRNA deutlich von Liposomen verkapselt reduziert den Tubulin-Ausdruck in den Mitteldarm und führte zum Tod von Kakerlaken. Abschließend könnte die Formulierung und Verwendung von DsRNA Lipoplexes, die DsRNA gegen Nukleasen zu schützen, eine praktische Anwendung der RNAi für Schädlingsbekämpfung in der Zukunft.
Introduction
RNAi ist durch einen Mechanismus eines Posttranskriptionale stummschaltungs-Signalwegs, ausgelöst durch DsRNA Moleküle in viele Eukaryonten1als eine wirksame Methode, Knockdown Genexpression nachgewiesen. Im letzten Jahrzehnt Studie geworden RNAi ein nützliches Werkzeug, um die Funktionen von Genen aus Entwicklung, Verhalten zu studieren, durch Abbau der Expression bestimmter Gene mittels Injektion und/oder Fütterung von DsRNA in verschiedenen Taxa Insekten2,3. Aufgrund der Spezifität und Robustheit der abbauende Wirkung ist die Anwendung der RNAi derzeit als mögliche Strategie zur Pest Control Management4,5geprüft. Jedoch sehr unterschiedlich die Effizienz der RNAi Insektenarten, je nach den verschiedenen Genen angestrebt und die Versandmethoden. Eine wachsende Zahl von beweisen deutet darauf hin, dass die Instabilität der DsRNA, die durch Ribonuclease abgebaut wird, ein kritischer Faktor bei der begrenzten Wirksamkeit von RNAi5,6 ist. Zum Beispiel hat die geringe Sensitivität der RNAi in Manduca Sexta durch die Tatsache erklärt worden, dass die DsRNA gemischt mit Hämolymphe innerhalb von 1 Stunde7schnell abgebaut wurde. Ebenso ist die Anwesenheit von Alkali Nukleasen in den Mitteldarm die aufgenommenen DsRNA effizient zu degradieren, stark korreliert mit geringe RNAi-Effizienz in verschiedenen Insektenordnungen8,9,10.
Die mündlichen Lieferung von DsRNA ist besonders interessant für die Anwendung der RNAi in einer Pest Control-Strategie, sondern eine Methode, um den Abbau von DsRNA durch Nukleasen in den Mitteldarm verzögern nicht noch entwickelt wurde, die hätten des Potenzials, wirksam sichern RNAi durch Fütterung. Jedoch wurde die Teilnahmslosigkeit der RNAi mündlichen Lieferung von DsRNA berichtet, durch große Menge an DsRNA, z. B. 50 µg in Bombyx Mori, Fütterung oder kontinuierlich füttern für 8 Tage (8 µg DsRNA insgesamt) in der Locust-Spezies. Die Deutsche Schabe, Blattella Germinica, reagiert sehr empfindlich auf RNAi durch die Injektion von DsRNA11,12,13,14, aber ist nicht ansprechend auf DsRNA durch Fütterung. Vor kurzem, Lin Et al. (2017) haben gezeigt, dass die DsRNA mit Liposomen Träger führt zu erfolgreichen RNAi, Zuschlag die α-Tubulin -gen-Expression in den Mitteldarm und Trigger erhebliche Mortalität der deutschen Schabe15gekapselt. Wie der Abbau von DsRNA in den Mitteldarm der limitierende Faktor für mündliche RNAi ist, dienen die Liposomen-Träger als Vehikel DsRNA vor Erniedrigung, zu schützen, die bei anderen Insekten mit starken Nuklease Aktivitäten im Darm leicht anwendbar ist. Der Hinweis, der Grund für die Wahl des bestimmten Transfection Reagens (siehe Tabelle der Materialien) wir verwendet wie Liposomen Träger in das aktuelle Protokoll ist, dass es für Insekten Zelle Zeile Transfektion mit weniger Toxizität getestet wurde nach dem Anweisungen des Herstellers. Nach dem Vergleich der verschiedenen Liposom Transfection Systeme in Gharavi Et al. (2013) 16, ist die Effizienz der transfecting kleine interferierende RNA (SiRNA) ungefähr gleich zwischen diesem und anderen handelsüblichen Systemen, die für DsRNA-Delivery-Systeme in anderen Insekten17,18 verwendet wurden . Darüber hinaus ist unsere Fütterung Methode vorsichtig genug, um die richtige Menge an DsRNA von jeder Schabe eingenommen wird, und dass die Ergebnisse sind robust und bestätigten zu gewährleisten. Zusammenfassend lässt sich sagen zeigen die dieses Protokolls und die Ergebnisse, dass mit DsRNA Lipoplexes DsRNA Stabilität verbessert und die Tür für das Design der Strategie mündlichen Lieferung von RNAi öffnet, die ist ein vielversprechender Ansatz zur Schädlingsbekämpfung in der Zukunft.
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Protocol
(1) Synthese und Vorbereitung der dsRNA
- DsRNA-Ziel-Sites in der 3' untranslatierten Region der Zielgene zu identifizieren. Die DsTub dient zur Ausrichtung auf das α-Tubulin (Wanne) Gen (GenBank Zbl-Nummer: KX228233), und DsEGFP wie ein negativer DsRNA-Steuerelement aus der Abfolge von konzipiert ist grüne Fluoreszenz-Protein (EGFP; GenBank Zbl-Nummer: LC311024).
- Führen Sie standard PCR Verstärkung um die DsRNA-Vorlagen mit Gen-spezifische Primer, enthält die T7 promotorsequenz synthetisieren (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3 "). Die PCR-Amplifikation Zustände und Primer-Informationen verwendet sind die gemeldeten Lin Et Al. (2017) 12 (siehe Tabelle der Materialien).
- Fahren Sie mit DsRNA Vorbereitung mit einer T7 Transkription Kit (siehe Tabelle der Materialien), nach den Anweisungen des Herstellers.
Hinweis: Hohe Quantität DsRNA, mischen zwei Reaktionen in einem Rohr (in insgesamt 40 µL), und über Nacht bei 37 ° C inkubieren. - Fügen Sie 2 µL DNase (siehe Tabelle der Materialien) in DsRNA Proben für 15 min bei 37 ° C zu verdauen DNA-Vorlagen.
- Fügen Sie 200 µL Extraktion Reagenz (siehe Tabelle der Materialien) und 40 µL Chloroform, dann Wirbel.
- Zentrifugieren Sie für 10 min bei 13.000 x g bei 4 ° C, dann sammeln Sie überstand (150 µL) in einem neuen Microcentrifuge Schlauch.
- Überstürzen Sie DsRNA durch Hinzufügen von 150 µL Isopropanol und Inkubation für 15 min auf Eis.
- Für 15 min bei 13.000 x g bei 4 ° C zentrifugiert, dann entfernen Sie überstand.
- Fügen Sie 200 µL 70 % Ethanol DsRNA Pellets zu waschen. Zentrifuge für 10 min bei 13.000 x g bei 4 ° C.
- Entfernen Sie das Ethanol und wiederholen Sie die Schritte Ethanol waschen.
- Entfernen Sie das Ethanol und trockenen DsRNA Pellet durch zentrifugale Vakuum-Konzentratoren für 3 min, dann Aufschwemmen Sie DsRNA mit RNase-freies Wasser.
- Bestimmen Sie die Menge der gereinigten DsRNA mit einem Mikro-Volume UV-Vis Spektralphotometer (siehe Tabelle der Materialien) nach den Anweisungen des Herstellers und Anpassung an die gewünschte Konzentration (z.B., 0,25 µg/µL für Zubereitung von DsRNA Lipoplexes).
- Speichern Sie die DsRNA Proben bei-20 ° C für bis zu 3 Monaten.
2. Vorbereitung des DsRNA Lipoplexes
- Verdünnen Sie 4 µL des Transfection Reagens (siehe Tabelle der Materialien) durch Zugabe von 4 µL 5 % Glukoselösung verdünnt werden. Verdünnen Sie 4 µL DsRNA (1 µg) durch Zugabe von 4 µL 5 % Glukoselösung.
- Hinzufügen der verdünnten Liposomen Reagenzlösung unmittelbar in die verdünnte DsRNA-Lösung auf einmal. Vortex kurz zu vermischen, dann 15 Minuten bei 25 ° c inkubieren
Hinweis: Verwechseln Sie nicht die Lösungen in umgekehrter Reihenfolge. - DsRNA Lipoplexes sind einsatzbereit. Innerhalb von 1 Stunde Vorbereitung, und verwerfen nach 1 Stunde.
Hinweis: Nach den Anweisungen des Herstellers sollte so bald wie möglich den Lipoplexes verwendet werden.
3. Sammlung von extrazellulären Enzyme vom Hämolymphe und Mitteldarm Saft
-
Insekt-saline-Puffer (10 X verfügbar)
- Mischen Sie 900 mL mit 109,3 g NaCl, 15,7 g KCl und 6,3 g CaCl28,3 g MgCl2·6H2O. Doppeltes destilliertes Wasser
- Passen Sie pH-Wert auf 6,8 an, und füllen Sie bis zu 1.000 mL.
-
Hämolymphe Sammlung
- Betäuben Sie die Kakerlaken auf Eis, bis sie sich 3 Minuten lang nicht bewegen.
- Halten Sie die Schabe mit zwei Fingern (Daumen und Zeigefinger) und auftauchen Sie der Bauchseite die Schabe.
- Verwenden Sie die sezierenden Scheren aus der Spitze von einer Coxa ein Hinterbein abgeschnitten.
Hinweis: Schneiden Sie die angeschlossenen Schnittpunkt zwischen Coxa und Trochanter. Die Exzision des anderen Teils Coxa war weniger effizient, Hämolymphe zu sammeln. - Drücken Sie den Bauch sanft mit Mittelfinger und sammeln Sie die Hämolymphe Blutungen aus der Schnitt mit einer 10 µL Mikropipette.
- Die Hämolymphe aus mehreren Kakerlaken (5 Personen) in einem Microcentrifuge Schlauch zu bündeln.
Hinweis: Halten Sie die Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis, Melanization zu verhindern. Das durchschnittliche Volumen der Hämolymphe erhalten von einem männlichen Schabe ist ca. 2-3 µL. - Spin-down der Hämolymphe kurz mit einem Benchtop-Zentrifuge für 10 s.
- Übertragen Sie gewünschte Lautstärke der Hämolymphe (d.h. 10 µL) zu, und mischen Sie es mit 50 µL 1 X Insekt saline Puffer.
- Zentrifuge für 10 min bei 1.000 x g bei 4 ° C, unten Hemocytes zu spinnen. Übertragen Sie den überstand auf eine saubere Microcentrifuge Schlauch.
- Die Gesamt-Protein-Konzentration mit einer Mikro-Lautstärke UV-Vis Spektralphotometer durch Messung A28015zu quantifizieren.
- Passen Sie jede Probe um die gleiche Protein Konzentration (6 mg/µL Gesamt-Protein).
-
Mitteldarm Saft Sammlung
- Die Kakerlaken auf dem Eis zu betäuben. Repariere die Kakerlaken Bauchseite auf der Dissektion Platte mit kalten 1 X Insekt saline Puffer mit Insekt Pins.
- Zerlegen Sie den Bauch mit einer feinen Pinzette. Gesamte Darm (einschließlich des vorderen Mitte und Hinterbeinen Darms) auf einen frischen Teller mit 1 x Insekt saline Puffer zu entfernen.
- Entfernen Sie den vorderen und hinteren Darm und schnelle Übertragung der Mitteldarm zu einem Microcentrifuge Schlauch, der 100 µL Insekt saline Puffer enthält.
- Bündeln Sie die Midguts von sechs Kakerlaken im gleichen Rohr und Wirbel für 10 s.
- Zentrifuge für 10 min bei 1.000 x g bei 4 ° C, die Hemocytes und Darm Gewebe zu spinnen. Übertragen Sie den überstand auf eine saubere Microcentrifuge Schlauch.
- Die Gesamt-Protein-Konzentration mit einer Mikro-Lautstärke UV-Vis Spektralphotometer durch Messung A28015zu quantifizieren.
- Passen Sie jede Probe um die gleiche Protein Konzentration (6 mg/µL Gesamt-Protein).
4. DsRNA Abbau Assay
- Frisch bereiten Sie 4 µL des nackten DsRNA oder DsRNA Lipoplexes (1 µg zu).
- Mischen Sie DsRNA Lösungen mit 10 µL Insekt saline Puffer (Kontrolle), extrahiert Enzyme vom Hämolymphe oder Mitteldarm Saft.
- Fügen Sie 2 µL RNase-freies Wasser oder EGTA (20 mM), Proben als Steuerelemente für die Hemmung der Enzym-Aktivitäten zu trennen.
- 1 Stunde oder länger (6, 12 oder 24-Stunden) bei 25 ° c inkubieren
- Fügen Sie 200 µL Extraktion Reagenz und 40 µL Chloroform, dann Wirbel.
- Zentrifugieren Sie für 10 min bei 13.000 x g bei 4 ° C, dann sammeln Sie überstand (150 µL) in einem neuen Microcentrifuge Schlauch.
- Überstürzen Sie DsRNA durch Hinzufügen von 150 µL Isopropanol und Inkubation für 15 min auf Eis.
- Für 15 min bei 13.000 x g bei 4 ° C zentrifugiert, dann entfernen Sie überstand.
- Fügen Sie 200 µL 70 % Ethanol DsRNA Pellets zu waschen. Zentrifuge für 10 min bei 13.000 x g bei 4 ° C.
- Entfernen Sie das Ethanol und wiederholen Sie die Schritte Ethanol waschen.
- Ethanol und trockenen DsRNA Pellet durch zentrifugale Vakuum-Konzentratoren für 3 min. Aufschwemmen DsRNA mit 10 µL RNase-freies Wasser zu entfernen.
- Überprüfen Sie die Integrität der behandelten DsRNA per Gelelektrophorese auf einem 1,5 % Agarose-Gel.
(5) die orale Verabreichung von dsRNA
- Kakerlaken auf eine Ad Libitum Ernährung Trockenfutter (Hund Chow) zu erhalten. Wasserversorgung von den Kakerlaken DsRNA Einnahme Experimente am Vortag zu berauben.
- Halten Sie eine Kakerlake, packte seine Flügel mit der flexiblen Zange (Abbildung 1, Schritt 5).
Hinweis: Berühren Sie nicht die Körperteile von Kakerlaken. - Vorbereiten der DsRNA Lipoplexes sowie nackt DsRNA, Fütterung, wie in Abschnitt 2 beschrieben.
Hinweis: DsRNA Lipoplexes sollte vor der Fütterung frisch zubereitet werden. - Futter 4 µL DsRNA Lipoplexes oder nackt DsRNA (250 ng) mit einer Mikropipette.
- Langsam pipettieren der Tropfen der DsRNA-Lösung die Mundwerkzeuge der Kakerlaken in der Nähe und lassen Sie die Kakerlaken aufnehmen des tröpfchens komplett.
- Durchführen Sie zweimal täglich (1 h nach Lichter auf und 1 h vor dem Licht aus) die Einnahme Experimente, für 8 oder 16 Tage kontinuierlich.
Hinweis: Alle Kakerlaken erworben Wasser nur durch manuelles zuführen mit DsRNA Lösung oder Kontrolle Reagenzien (z. B.Nuklease freies Wasser, Glukoselösung und Liposomen Reagenz) während der Einnahme Experimente. - Die Kakerlaken ermöglichen Sie Wasserflaschen nach 16 Tagen der Einnahme von DsRNA Experimente.
6. beurteilen Knockdown
- Gewählten Zeitpunkt Punkte (2, 9 und 17 Tage nach DsRNA Einnahme Assay), die DsEGFP und DsTub-behandelten Insekten sammeln und sezieren die gewählten Gewebe (z.B. Mitteldarm).
- Führen Sie quantitative Echtzeit-PCR (qRT-PCR). Die qRT-PCR-Amplifikation Bedingungen und Primer-Informationen wie Lin Et al.berichtet. (2017) 12.
- Beurteilen Sie die Kontrolle und DsRNA-behandelte Insekten täglich Sterblichkeit zu überprüfen und entfernen die Kakerlaken, die nicht mehr in Bewegung sind.
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Representative Results
Ein vereinfachtes Schema des Protokolls für die mündlichen Lieferung von DsRNA präsentiert sich in Abbildung 1, wo die wichtigsten Schritte für die Vorbereitung der DsRNA Lipoplexes gezeigt werden.
Um den Schutz von Liposomen Trägern auf DsRNA Abbau in den Mitteldarm Saft B. Germanica, ein ex-Vivo -Test wo DsTub Lipoplexes mit Mitteldarm Saft inkubiert wurden durchgeführt wurde und die Integrität der DsRNA zu untersuchen wurde anschließend auf einem 1,5 % Agarose-Gel analysiert. Abbildung 2 zeigt, dass starker RNA-Nuklease-Aktivität in den Mitteldarm Saft von B. Germanica (Abb. 2A), vorhanden war, während die Liposomen-Träger DsRNA gegen Abbau mindestens für 1 Stunde in der ex Vivo schützen konnten Inkubation (Abbildung 2A, B). Infolgedessen wurde die orale Einnahme von DsRNA Lipoplexes zweimal täglich angewendet, um die Anfälligkeit der Mitteldarm Gewebe für RNAi in den folgenden Experimenten zu erhöhen.
Validierung von RNAi Reaktion durch mündliche Lieferung von DsRNA wurde durch Messung der Wirkung der Entleerung der Wanne mRNA Expression in den Mitteldarm zu verschiedenen Zeitpunkten nach der kontinuierlichen Einnahme von DsRNA(Abbildung 3)beurteilt. Der Wanne Ausdruck in den Mitteldarm war deutlich nach der kontinuierlichen Einnahme von DsTub Lipoplexes für 8 Tage aufgebraucht. Während der kontinuierlichen Beschickung von DsRNA 16 Tage dauerte, war deutlich der Wanne Ausdruck in den Mitteldarm in die nackten DsTub und DsTub Lipoplexes Gruppen erschöpft (etwa durch 24 und 60 %, beziehungsweise) im Gegensatz zu den Steuerelementen. Abbildung 3 B zeigt eine konsistente, signifikante Erhöhung der Sterblichkeit nach der oralen Verabreichung von DsTub Lipoplexes für 16 Tage.
Abbildung 1 : Vereinfachtes Schema der mündlichen Lieferung von DsRNA Lipoplexes für Schaben. Die wichtigsten Schritte für die Vorbereitung der DsRNA Lipoplexes werden für die Schritte 1 bis 4 dargestellt. Die Fütterung Technik (Schritt 5) ist auf dem Foto gezeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Ex Vivo Abbau von DsRNA von B. Germanica Hämolymphe (Hemo) oder Mitteldarm Saft. (A) 1 µg nackt oder Liposomen-Cojugated DsTub wurde jeweils 1 h mit Kochsalzlösung Puffer und extrahierten Enzyme vom Hämolymphe (Hemo) oder Mitteldarm Saft, inkubiert. Die nackten DsTub, aber nicht Liposomen konjugiert DsTub wurde abgebaut, völlig wenn mit 1 x Mitteldarm Saft inkubiert. Die verschiedenen Verdünnungsfaktoren der ursprünglichen Mitteldarm Saft (1 X) sind angegeben. Der Abbau wurde durch Ionen-Chelat aufgrund der EGTA-Behandlung als Kontrolle gehemmt. (B) zeitabhängig Schutz der Liposomen verkapselt DsTub (1 µg) gegen ex-Vivo Abbau in Hämolymphe oder Mitteldarm Saft. Der Hinweis wurde die Liposomen konjugiert DsTub vollständig abgebaut, wenn mit Mitteldarm Saft nach 24 h inkubiert. Die Hämolymphe und Mitteldarm Saft dienten in der ursprünglichen Konzentration für verschiedene Zeiträume der Inkubation. Die Ergebnisse sind von Lin Et al.angepasst. (2017) 12. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : Beeinflussung der RNAi Reaktion durch Einnahme von DsRNA B. Germanica. (A) Quantitative Echtzeit-PCR (qRT-PCR) zur Bestimmung des relativen Wanne Ausdrucks in den Mitteldarm die Deutsche Schabe nach verschiedenen Fütterung Behandlungen. Der Ausdruck Niveaus der verschiedenen Behandlungen wurden auf die Glukose-Gruppe am Tag2 normalisiert. Werte sind der Mittelwert ± SE aus drei unabhängigen Experimenten (n = 3), jeweils mit 3-5 biologischen repliziert. Verschiedene Buchstaben auf den Balken zeigen signifikante Unterschiede bei p < 0,05 (Tukey HSD Post Hoc Test nach ANOVA) unter verschiedenen Behandlungsgruppen. (B) Survivorship von Kakerlaken, die nackte DsTub oder DsTub Lipoplexes für 8 Tage (8d) oder 16 Tage (16 d) aufgenommen (jeder Kohorte von 12-15 Personen; n = 3 unabhängige Experimente). Werte sind der Mittelwert ± SE. verschiedene Buchstaben auf der Behandlungsgruppe zeigen signifikante Unterschiede bei p < 0,05 (Kruskal-Wallis-Test) für die Überlebenden. Die Ergebnisse sind von Lin Et al.angepasst. (2017) 12. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Dieses Protokoll stellt eine Methode für wirksame RNAi durch mündliche Lieferung von DsRNA Lipoplexes, denen Schutz gegen Ribonuklease Verdauung in den Mitteldarm Saft der deutschen Schabe. Wie in anderen Studien in verschiedenen Insektenarten gezeigt, der Armen RNAi-Effekt durch mündliche Lieferung von DsRNA vor allem durch den Abbau von DsRNA8,9,10entfallen. Dieses Protokoll produziert Liposomen, die als schützende Fahrzeuge in mündlichen Lieferung von DsRNA gegen Abbau im Darm dienen. Darüber hinaus ist die Vorbereitung der DsRNA Lipoplexes einfach und leicht anwendbar als mündliche RNAi, insbesondere für Insekten mit starken Ribonuklease-Aktivität im Darm.
Im Vergleich zu anderen Studien, die relativ große Mengen an nackt DsRNA in verschiedenen Insekten10,18,19 Feed, dieses Protokoll verwendet oralen Verabreichung eine relativ geringe Menge an DsRNA (0,5 µg pro Tag), wodurch eine signifikante Erschöpfung der Ziel-gen-Expression in den Mitteldarm von B. Germanica. Wesentliche Aspekte des Protokolls sind die genaue Fütterung Methode und kumulierte Einnahme von geringen Mengen an DsRNA. Erstens die Fütterung Technik eignet sich für eine kontinuierliche Einnahme-Assay und minimiert die Variation der aufgenommenen DsRNA Menge pro einzelne Insekt. Zweitens war die Erschöpfung Wirkung der Wanne Ausdruck in den Mitteldarm gezeigt, Steigerung von 40 % am Tag 9 bis 60 % am Tag 17 mit kontinuierliche orale Verabreichung von DsTub Lipoplexes(Abbildung 3). Obwohl die nackten DsRNA mit ex Vivo Inkubation der Mitteldarm Saft innerhalb von 1 h (Abb. 2A) schneller abgebaut wurde, führte die kontinuierliche Fütterung nackt DsRNA für 16 Tage auch eine bedeutende Entleerung der Wanne Ausdruck in den Mitteldarm(Abbildung 3). Darüber hinaus ist die längere kontinuierliche Beschickung der DsRNA Lipoplexes für 16 Tage eine Anforderung, eine auffällige tödliche Wirkung von RNAi verursachen.
Obwohl die Liposomen-Träger (siehe Tabelle der Materialien) verwendet hier waren ursprünglich für in-vitro- Transfektion von DNA in Insektenzellen, gab es kein Problem diese Liposomen-Reagenz als Vehikel der DsRNA für mündliche Lieferung in unserem Insekt Modell anwenden. Viele Studien belegen auch erfolgreich zur Verbesserung der RNAi zum Schweigen zu bringen, in anderen Insektenarten mit verschiedenen Liposomen Reagenzien, die für entweder DNA oder RNA Moleküle17,20,21ausgelegt sind. Dennoch, der Mechanismus der DsRNA Aufnahme im Insekt Darm ist noch nicht vollständig untersucht und die Liposomen-Delivery-System könnte die Aufnahme von DsRNA in die Zellen aufgrund seiner Biokompatibilität mit Phospholipid Struktur22erhöhen. Daher könnte die mündlichen Lieferung von DsRNA in Liposomen verkapselt eine geeignete Strategie zur effizienten RNAi aufgrund der Verzögerung des Abbaus von RNases (Abbildung 2) zu erreichen.
Ein Nachteil dieses Protokolls möglicherweise die kleine Menge von DsRNA in den Liposomen-Trägern und somit erfordern längere kontinuierliche Beschickung. Die Beschränkung von einem solchen besonderen Verhältnis zwischen DsRNA, Liposomen (0,25 µg:1 µL) ist aufgrund des Designs des kommerziellen Liposomen Reagens, nach Empfehlung des Herstellers. Die Formulierungen in der Vorbereitung von Liposomen Nanopartikeln mit größeren Durchmesser und unterschiedlicher Ladung auf der Oberfläche Lipoplexes sind berichtet, die Verkapselung von SiRNA und RNAi-Stummschaltung-Effizienz23,24zu erhöhen. Daher die verschiedenen Liposomen-Nanopartikel auch einsetzbar, Fütterung Verfahren zu verbessern.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Studie wurde unterstützt durch Zuschüsse aus Taiwan (Ministerium für Wissenschaft und Technologie, 100-2923-B-002-002-MY3 und 106-2313-B-002-011-MY3, H.J.L.), der Tschechischen Republik (gewähren Agentur der Südböhmischen Universität, GAJU gewähren Y.H.L 065/2017/P), und Spanien ( Gewähren Sie spanischen Wirtschaftsministerium und Wettbewerbsfähigkeit, räumt CGL2012-36251 und CGL2015-64727-P X.B. und der katalanischen Regierung 2014 SGR 619 X.B.); Es erhielt auch finanzielle Unterstützung aus dem Europäischen Fonds für wirtschaftliche und Regionalentwicklung (FEDER Mittel zu X.B.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GenJe Plus DNA in vitro Transfection reagent | SignaGen | SL100499 | for lipoplexes preparation |
| Blend Taq plus | TOYOBO | BTQ-201 | for PCR |
| Fast SYBR Green Master Mix | ABI | 4385612 | for qPCR |
| FirstChoice RLM-RACE Kit | Invitrogen | AM1700 | for 3' UTR identification |
| MEGAscript T7 Transcription Kit | Invitrogen | AMB13345 | for dsRNA synthesis |
| TURBO DNase | Invitrogen | AM2239 | remove DNA template from dsRNA |
| TRIzol | Invitrogen | 15596018 | for dsRNA or total RNA extraction |
| RQ1 RNase-Free Dnase | Promega | M6101 | remove DNA template from total RNA |
| chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | for dsRNA or total RNA extraction |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | I9516 | for dsRNA or total RNA extraction |
| ethanol | Sigma-Aldrich | 24102 | for dsRNA or total RNA extraction |
| Diethyl pyrocarbonate, DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | for RNase free water preparation |
| glucose solution | Sigma-Aldrich | G3285 | for lipoplexes preparation |
| Sodium chloride, NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | insect saline buffer formula |
| Potassium chloride, KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | insect saline buffer formula |
| Calcium chloride, CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | insect saline buffer formula |
| Magnesium chloride hexahydrate, MgCl2.6H2O | Sigma-Aldrich | M2670 | insect saline buffer formula |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | enzyme inhibitor |
| dissecting scissor | F.S.T. | cockroach dissection | |
| fine tweezers | F.S.T. | cockroach dissection | |
| flexible tweezer | F.S.T. | cockroach holding | |
| pipetman | RAININ | P10 | sample preparation |
| microcentrifuge tube | Axygen | MCT175C, PCR02C | sample preparation |
| pipette tip | Axygen | sample preparation | |
| vortexter | Digisystem | vm1000 | sample preparation |
| Minispin centrifuge | The Gruffin Group | GMC 206 | for liquid spin down |
| Centrifuge | ALC | PK121R | sample preparation |
| pH meter | JENCO | 6071 | for pH adjust |
| micro-volume spectrophotometer | Quawell | Q3000 | nucleic acid quantitative |
| PCR Thermal cycler | ABI | 2720 | for template PCR or dsRNA synthesis incubation |
| quantitative real-time PCR | ABI | StepOne plus | gene expression quantitative |
| Centrifugal Vacuum Concentrators | eppendorf | 5301 | for dsRNA or total RNA extraction |
| Multipette | eppendorf | xstream | for real-time PCR sample loading |
| Agarose I | amresco | 0710 | for nucleic acid electrophoresis |
| tub gene specfifc forward preimer | tri-I biotech | GGG ACA AGC CGG AGT GCA GA | |
| tub gene specfifc reverse preimer | tri-I biotech | TCC TGC TCC TGT CTC GCT GA | |
| dsTub template forward primer | tri-I biotech | TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA CAA GCC GGA GTG CAG | |
| dsTub template reverse primer | tri-I biotech | TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT CCT GCT CCT GTC TCG CTG | |
| dsEGFP template forward preimer | tri-I biotech | TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT ATG GTG AGC AAG GGC GAG GAG | |
| dsEGFP template reverse preimer | tri-I biotech | TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT GGC GGA TCT TGA AGT TCA CC | |
| tub qPCR forward primer | tri-I biotech | GGA CCG CAT CAG GAA ACT GGC | |
| tub qPCR reverse preimer | tri-I biotech | CCA CAG ACA GCC TCT CCA TGA GC | |
| ef1 qPCR forward primer | tri-I biotech | CGC TTG AGG AAA TCA AGA AGG A | |
| ef1 qPCRreverse preimer | tri-I biotech | CCT GCA GAG GAA GAC GAA G |
References
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