Summary
כתב יד זה מדגים דלדול של ביטוי גנים ב פיתול של המקק הגרמני באמצעות בליעה דרך הפה של זוגיות גדילי RNA במארז ליפוזומים.
Abstract
התערבות ב RNA (RNAi) הוחל באופן נרחב על חשיפת בפונקציות ביולוגיות של גנים רבים, יש כבר וליטוש של המזיק שליטה בכלי הפועלים על ידי הפרעה של ביטוי גנים חיוניים. למרות שיטות שונות, כגון זריקה, האכלה, ההשרייה דווחו על מסירה מוצלחת של זוגיות גדילי RNA (dsRNA), היעילות של RNAi דרך משלוח אוראלי של dsRNA זה משתנה מאוד בין קבוצות חרקים שונים. המקק הגרמני, במיוחד גרמנית, היא רגישה מאוד ההזרקה של dsRNA, כפי שמוצג על ידי מחקרים רבים שפורסמו בעבר. המחקר הנוכחי מתאר שיטה כדי להדגים כי dsRNA אנקפסולציה עם נשאים ליפוזום מספיקה מפגר ההשפלה של dsRNA מאת מיץ פיתול. ראוי לציין, ההזנה רציפה של dsRNA אנקפסולציה באמצעות ליפוזומים משמעותית מפחית את הביטוי טובולין, פיתול, והוביל למוות של מקקים. לסיכום, ניסוח וניצול מיטבי של dsRNA lipoplexes, אשר להגן dsRNA נגד nucleases, יכול להיות שימוש מעשי של RNAi הדברת חרקים בעתיד.
Introduction
RNAi הוכח בתור שיטה יעילה כדי ביטוי גנים תמונות ציפורים באמצעות מנגנון של שביל שתיקה post-transcriptional מופעלות על ידי מולקולות dsRNA פרוקריוטים רבים1. בעשור האחרון של המחקר, RNAi הפך להיות כלי שימושי כדי ללמוד את הפונקציות של גנים מפיתוח להתנהגות depleting הביטוי של גנים ספציפיים באמצעות הזרקת ו/או האכלה של dsRNA ב taxa שונים של חרקים2,3. בשל ירידה לפרטים החוסן של אפקט depleting, היישום של RNAi הוא להיות נחשב כיום כאסטרטגיה פוטנציאליים על המזיק בקרת ניהול4,5. עם זאת, היעילות של RNAi משתנה מאוד בין מיני חרקים, בהתאם של גנים שונים מהווים מטרה ואת שיטות משלוח. גוף גדל והולך של הראיות עולה כי חוסר היציבות של dsRNA, אשר נפגמים בשל ribonucleases, הוא גורם קריטי היעילות המוגבלת של RNAi5,6. למשל, הרגישות RNAi הנמוכה בסקסטה Manduca יש כבר מוסברת על ידי העובדה dsRNA מעורבב עם hemolymph היה מפורק במהירות בתוך שעה7. באופן דומה, הנוכחות של אלקליין nucleases ב פיתול, אשר ביעילות לבזות dsRNA בלע, הוא בחריפות מתואם עם יעילות נמוכה RNAi הזמנות חרקים שונים8,9,10.
מסירת dsRNA אוראלי הוא מעניין במיוחד עבור היישום של RNAi אסטרטגיה בקרת מזיקים, אבל שיטה מפגר ההשפלה של dsRNA מאת nucleases ב פיתול לא עדיין פותחה, אשר היה פוטנציאל כדי להבטיח אפקטיביות RNAi באמצעות האכלה. עם זאת, בעיית חוסר של RNAi כדי משלוח אוראלי של dsRNA דווחה על-ידי להאכיל כמות גדולה של dsRNA, למשל 50 µg, טוואי המשי, או האכלה ברציפות במשך 8 ימים (8 dsRNA µg סה כ) בהמין המדומה. המקק הגרמני, במיוחד germinica, היא רגישה מאוד RNAi על ידי ההזרקה של dsRNA11,12,13,14, אך לא מגיבים dsRNA באמצעות האכלה. לאחרונה, לין. et al. (2017) הדגימו כי dsRNA במארז עם תוצאות נושאות ליפוזום RNAi מוצלחת כדי נוקאאוט בביטוי הגן α-טובולין התמותה משמעותי פיתול והקו הדק של תיקן גרמני15. כמו ההשפלה של dsRNA בפיתול הגורם המגביל של RNAi אוראלי, נושאות ליפוזום לשמש רכב על dsRNA מפני השפלה, אשר זה רלוונטי ברצון ושאר חרקים עם פעילויות נוקלאז חזק בבטן. ראוי לציין, הסיבה לבחירת הכימית תרביות תאים מסוים (ראה טבלה של חומרים) היינו כמו מנשא ליפוזום בפרוטוקול הנוכחי הוא זה נבדק על תרביות תאים קו תא חרקים עם רעילות פחות, על פי הוראות היצרן. לפי ההשוואה של תרביות תאים ליפוזום שונים במערכות Gharavi. ואח (2013) 16, היעילות של RNA מפריעות קטן transfecting (siRNA) הוא כ זהה בין זה לבין מערכות אחרות זמינים מסחרית אשר שימשו dsRNA מערכות אספקה אחר חרקים17,18 . יתר על כן, שיטת האכלה שלנו הוא זהיר מספיק כדי להבטיח שהכמות הנכונה של dsRNA בליעתו על ידי כל מקק, כי התוצאות אינן מאושרות ועמיד. לסיכום, הפרוטוקול הנוכחי לבין תוצאות מדגימים כי השימוש dsRNA lipoplexes משפר את יציבות dsRNA ופותח את הדלת בעיצוב של משלוח אוראלי האסטרטגיה של RNAi, אשר הינה גישה מבטיחה להדברה של עתיד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. סינתזה והכנה של dsRNA
- לזהות את האתרים היעד dsRNA באזור 3' לא מתורגם של גנים היעד. DsTub משמש עבור מיקוד הגן α-טובולין (באמבטיה) (מספר גישה GenBank: KX228233), dsEGFP כמו פקד dsRNA שלילי מתוכנן מרצף משופר פלורסצנטיות ירוק חלבון (EGFP; מספר גישה GenBank: LC311024).
- לבצע הגברה סטנדרטי PCR לסנתז את התבניות dsRNA עם גנים ספציפיים תחל המכיל את רצף יזם T7 (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'). ה-PCR הגברה תנאים ומידע פריימר להשתמש הם אלה דיווח מאת לין ואח. (2017) 12 (ראה טבלה של חומרים).
- להמשיך עם הכנה dsRNA באמצעות תיעוד T7 קיט (ראה טבלה של חומרים), ההוראות של היצרן.
הערה: להניב כמות גבוהה dsRNA, לערבב שני בתגובות שפופרת אחת (ב µL 40 סה כ), דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. - להוסיף 2 µL של DNase (ראה טבלה של חומרים) לתוך dsRNA דגימות למשך 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס לתבניות DNA תקציר.
- להוסיף 200 ריאגנט החילוץ µL (ראה טבלה של חומרים), 40 µL כלורופורם, ואז מערבולת.
- צנטריפוגה 10 דקות ב g x 13,000 ב 4 ° C, ואז לאסוף את תגובת שיקוע (150 µL) צינור microcentrifuge חדש.
- לזרז dsRNA ע י הוספת אלכוהול איזופרופיל µL 150 המקננת למשך 15 דקות על קרח.
- צנטריפוגה למשך 15 דקות ב g x 13,000 ב 4 ° C ולאחר מכן להסיר את תגובת שיקוע.
- להוסיף 200 µL של האתנול 70% לשטוף dsRNA כדורי. צנטריפוגה 10 דקות ב 13,000 g x-4 מעלות צלזיוס.
- הסר האתנול, חזור על השלבים שטיפת אתנול.
- להסיר את אתנול וביו -גלולה dsRNA יבש על ידי ריכוז ואקום צנטריפוגלי למשך 3 דקות, ולאחר מכן resuspend dsRNA עם RNase ללא מים.
- לקבוע את כמות dsRNA מטוהרים באמצעות ספקטרופוטומטרים UV-Vis של מיקרו-נפח (ראה טבלה של חומרים) לפי הוראות היצרן ולהתאים לריכוז הרצוי (לדוגמה, µg/µL 0.25 עבור הכנת dsRNA lipoplexes).
- אחסן את הדגימות dsRNA ב-20 ° C עד 3 חודשים.
2. הכנת dsRNA Lipoplexes
- µL 4 מהתרכובת תרביות תאים למהול (ראה טבלה של חומרים) על-ידי הוספת 4 µL של תמיסת גלוקוז 5%. לדלל 4 µL של dsRNA (1 µg) על-ידי הוספת 4 µL של תמיסת גלוקוז 5%.
- להוסיף את הפתרון ריאגנט ליפוזום מדולל מיד לתוך הפתרון מדולל dsRNA בבת אחת. מערבולת בקצרה כדי לערבב אותם, ואז תקופת דגירה של 15 דקות ב 25 º C.
הערה: לא מערבבים את הפתרונות בסדר הפוך. - Lipoplexes dsRNA מוכנים לשימוש. בתוך שעה של הכנה ושימוש למחוק לאחר 1 שעה.
הערה: על פי הוראות היצרן, lipoplexes אמור לשמש בהקדם האפשרי.
3. אוסף של אנזימים חוץ-תאית מ Hemolymph ומיץ פיתול
-
מאגר מלוחים חרקים (מניות x 10)
- מערבבים את 900 מ"ל מים מזוקקים כפול עם 109.3 g NaCl, 15.7 גרם אשלגן כלורי, 6.3 g CaCl2ו- 8.3 g MgCl2·6H2O.
- להתאים את ה-pH את 6.8, ולמלא עד 1,000 מ.
-
אוסף hemolymph
- עזים ומתנגד הג'וקים על הקרח עד שהם לא זזים במשך 3 דקות.
- החזק את הג'וק עם שתי אצבעות (באגודל ובאצבע) ולאחר תגביר את הצד הבטני של המקק.
- השתמש את המספריים ויבתר כדי לחתוך את הקצה של coxa של רגל אחורית.
הערה: חותכים לצומת המחובר בין coxa לבין תל הירך. הכריתה של החלק השני של coxa היה פחות יעיל כדי לאסוף את hemolymph. - לסחוט את הבטן בעדינות עם האצבע האמצעית, ולאסוף את hemolymph לדמם החתך עם micropipette 10 µL.
- מאגר של hemolymph של כמה ג'וקים (5 אנשים) צינור microcentrifuge.
הערה: שמור את צינורות microcentrifuge על הקרח כדי למנוע melanization. נפח ממוצע של hemolymph המתקבל מקק זכר הוא 2-3 µL. - ספין למטה hemolymph בקצרה עם צנטריפוגה benchtop 10 s.
- העברת לנפח הרצוי של hemolymph (כלומר, 10 µL), ערבב את זה עם µL 50 x 1 מאגר מלוחים חרקים.
- צנטריפוגה 10 דקות ב g x 1,000 ב 4 ° C עד שיהיו תוצאות hemocytes. להעביר את תגובת שיקוע צינור נקי microcentrifuge.
- לכמת את ריכוז חלבון הכולל שימוש ספקטרופוטומטרים UV-Vis של מיקרו-נפח על ידי מדידת A28015.
- התאם כל מדגם יש ריכוז חלבון זהה (6 מ ג/µL של חלבון סה כ).
-
אוסף מיץ פיתול
- עזים ומתנגד הג'וקים על קרח. לשדך הג'וקים בצד הגחוני על הצלחת ניתוח קר 1 x מאגר מלוחים חרקים באמצעות סיכות חרקים.
- לנתח את הבטן עם פינצטה משובחים. הסר את הבטן כולה (כולל הבטן הקדמי, אמצע, האחוריות) כדי מאכל טריים עם 1 x מאגר מלוחים חרקים.
- להסיר את הבטן הקדמי ואת האחוריות, העבר במהירות את פיתול לרכבת התחתית microcentrifuge המכיל 100 µL מאגר מלוחים חרקים.
- מאגר של midguts של מקקים 6 באותו צינור ו מערבולת 10 s.
- צנטריפוגה 10 דקות ב g x 1,000 ב 4 ° C כדי לסובב את hemocytes ואת הבטן רקמות. להעביר את תגובת שיקוע צינור נקי microcentrifuge.
- לכמת את ריכוז חלבון הכולל שימוש ספקטרופוטומטרים UV-Vis של מיקרו-נפח על ידי מדידת A28015.
- התאם כל מדגם יש ריכוז חלבון זהה (6 מ ג/µL של חלבון סה כ).
4. dsRNA Assay השפלה
- להכין טרי 4 µL של dsRNA עירום או dsRNA lipoplexes (1 µg).
- מערבבים מיץ dsRNA אנזימים פתרונות עם µL 10 מאגר מלוחים חרקים (בקרה), שחולצו מן hemolymph, או פיתול.
- להוסיף 2 µL של EGTA (20 מ מ) או מים נטולי RNase כדי להפריד בין דגימות כפקדי עבור עיכוב של אנזים פעילויות.
- תקופת דגירה של שעה אחת או יותר (6, 12 או 24 שעות) ב 25 º C.
- להוסיף 200 ריאגנט החילוץ µL ו- 40 µL כלורופורם, ואז מערבולת.
- צנטריפוגה 10 דקות ב g x 13,000 ב 4 ° C, ואז לאסוף את תגובת שיקוע (150 µL) צינור microcentrifuge חדש.
- לזרז dsRNA ע י הוספת אלכוהול איזופרופיל µL 150 המקננת למשך 15 דקות על קרח.
- צנטריפוגה למשך 15 דקות ב g x 13,000 ב 4 ° C ולאחר מכן להסיר את תגובת שיקוע.
- להוסיף 200 µL של האתנול 70% לשטוף dsRNA כדורי. צנטריפוגה 10 דקות ב 13,000 g x-4 מעלות צלזיוס.
- הסר האתנול, חזור על השלבים שטיפת אתנול.
- להסיר את אתנול צניפה dsRNA יבש על ידי ריכוז ואקום צנטריפוגלי עבור 3 מינימלית dsRNA Resuspend עם מים ללא RNase µL 10.
- בדוק את תקינות dsRNA שטופלו באמצעות אלקטרופורזה בג'ל על 1.5% agarose ג'ל.
5. אוראלי מינהל dsRNA
- לשמור על ג'וקים בדיאטה ad libitum של מזון יבש (מזון). לשלול אספקת מים המקקים יום אחד לפני dsRNA בליעה ניסויים.
- החזק מקק על ידי גרירה כנפיו עם המלקחיים גמיש (איור 1, שלב 5).
הערה: לא אתפוס את חלקי הגופות של ג'וקים. - להכין את dsRNA lipoplexes, וכן dsRNA עירום, האכלה, כמתואר בסעיף 2.
הערה: Lipoplexes dsRNA צריך להיות מוכן טרי לפני האכלה. - להאכיל µL 4 של dsRNA lipoplexes או dsRNA עירום (250 ng) עם micropipette.
- לאט לאט pipet ה-droplet של הפתרון dsRNA לסגור mouthparts של מקקים ולתת את הג'וקים להבלע ה-droplet לחלוטין.
- ביצוע הניסויים בליעה פעמיים ביום (h 1 לאחר אורות ו- h 1 לפני האורות) עבור 8 ימים או 16 ימים ברציפות.
הערה: כל המקקים רכשה מים רק באמצעות האכלה ידנית עם dsRNA ריאגנטים פתרון או שליטה (למשלמים חינם נוקלאז, תמיסת גלוקוז, ריאגנט ליפוזום) במהלך הניסויים בליעה. - לספק בקבוקי מים המקקים לאחר 16 ימי בליעה של dsRNA ניסויים.
6. להעריך את נוקאאוט
- בזמן שבחרת נקודות (2, 9, 17 ימים לאחר assay בליעה dsRNA), לאסוף את החרקים dsEGFP - או dsTub-מתייחסים ומנתחים הרקמות שבחרת (למשל, פיתול).
- לבצע PCR כמותי בזמן אמת (לרביעיית-PCR). לרביעיית-PCR הגברה התנאים והמידע תחל כפי שדווח על ידי לין ואח. (2017) 12.
- להעריך את הבקרה וחרקים שטופלו dsRNA מדי יום כדי לבדוק את התמותה ולהסיר את הג'וקים כי הם כבר לא נעים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ערכה פשוטה של הפרוטוקול למסירה אוראלי של dsRNA מוצג באיור 1, שבו מוצגים השלבים המפתח עבור הכנת dsRNA lipoplexes.
על מנת לחקור את ההגנות המוקנות על ידי ליפוזום נושאות על השפלה dsRNA במיץ פיתול של גרמנית דרבוזמינותו של ex-vivo שבו נערך dsTub lipoplexes היו מודגרות בעסיס פיתול, שלמות dsRNA לאחר מכן נותחו על 1.5% agarose ג'ל. איור 2 מציג פעילות חזקה של נוקלאז RNA נכח במיצי פיתול גרמנית דרב (איור 2א), ואילו נושאות ליפוזום הצליחו להגן dsRNA נגד השפלה לפחות למשך שעה ב ex-vivo דגירה (איור 2א, ב'). כתוצאה מכך, בליעה דרך הפה של dsRNA lipoplexes הוחל פעמיים ביום כדי להגדיל את הרגישות של רקמות פיתול RNAi בניסויים הבאים.
אימות של RNAi תגובה באמצעות משלוח אוראלי של dsRNA הוערכה על ידי מדידת השפעת המחסור האמבטיה mRNA ביטוי פיתול בנקודות זמן שונות לאחר הבליעה רציפה של dsRNA (איור 3א). הביטוי אמבט ב פיתול הייתה דלה באופן משמעותי לאחר הבליעה רציפה של dsTub lipoplexes במשך 8 ימים. עוד ההזנה רציפה של dsRNA נמשך 16 ימים, הביטוי אמבט ב פיתול משמעותית הייתה דלה dsTub עירום ובקבוצות lipoplexes dsTub (ב- 24, 60%, בהתאמה) בניגוד הפקדים. איור 3 B מראה עלייה עקבית, משמעותי של תמותה לאחר הממשל אוראלי של dsTub lipoplexes במשך 16 ימים.
איור 1 : ערכה פשוטה של משלוח אוראלי של dsRNA lipoplexes עבור מקקים. השלבים המפתח עבור הכנת dsRNA lipoplexes מיוצגים על שלבים 1 עד 4. הטכניקה האכלה (שלב 5) מוצג בתמונה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: Ex-vivo השפלה של dsRNA מאת גרמנית ב hemolymph (חמו) או פיתול מיץ. (א) 1 µg של dsTub עירום או ליפוזום-cojugated, נדגרה לשעה עם מאגר מלח ואנזימים שחולצו מן hemolymph (חמו) או מיץ פיתול, בהתאמה. DsTub עירום, אבל לא מצומדת ליפוזום dsTub, היה יורד לחלוטין כאשר מודגרות עם 1 x פיתול מיץ. הגורמים השונים דילול של מיץ פיתול המקורי (1 x) מסומנים. ההשפלה הייתה מעוכבים על ידי יון קלאציה עקב טיפול EGTA כפקד. (B) תלויי-זמן ההגנה של ליפוזום כמוס dsTub (1 µg) נגד שמחוץ השפלה מיץ hemolymph או פיתול. ראוי לציין, dsTub מצומדת ליפוזום היה יורד לחלוטין כאשר מודגרות בעסיס פיתול לאחר 24 שעות. המיץ hemolymph, פיתול שימשו את הריכוז המקורי עבור תקופות זמן שונות של דגירה. התוצאות הן ממאמרו של לין ואח. (2017) 12. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : השפעות RNAi התגובה על ידי בליעה של dsRNA על גרמנית ב- (א) כמותית בזמן אמת PCR (לרביעיית-PCR) לקביעת הביטוי יחסי ג'קוזי ב פיתול של המקק הגרמני לאחר טיפולים האכלה שונים. רמות הביטוי של טיפולים שונים היו מנורמל לקבוצה גלוקוז-יום 2. ערכים הם זאת אומרת ± SE מ 3 ניסויים עצמאית (n = 3), כל אחד עם משכפל הביולוגי של 3-5. אותיות שונות על הסורגים מצביעים על הבדלים משמעותיים ב- p < 0.05 (ANOVA בעקבות הבדיקה HSD פוסט הוק של Tukey) בין קבוצות הטיפול שונה. (B) שאירים של המקקים זה עירום dsTub או lipoplexes dsTub 8 ימים (8 יח) או 16 ימים (16 יח) (כל קוהורטה של יחידים 12-15; n = 3 ניסויים עצמאית). ערכים הם זאת אומרת ± SE. שונה מכתבים בקבוצת הטיפול מצביעות על הבדלים משמעותיים ב- p < 0.05 (מבחן Kruskal-איי ווליס) עבור שאירים. התוצאות הן ממאמרו של לין ואח. (2017) 12. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה מציג שיטה עבור RNAi יעיל באמצעות משלוח אוראלי של dsRNA lipoplexes, הכוללת הגנה מפני עיכול ribonuclease במיץ פיתול המקק הגרמני. כפי שמוצג מחקרים אחרים במינים חרקים שונים, האפקט RNAi המסכן דרך משלוח אוראלי של dsRNA בעיקר מהצהוב מאת ההשפלה של dsRNA8,9,10. פרוטוקול זה מייצר ליפוזומים לשרת בתור רכב מגן ב משלוח אוראלי של dsRNA נגד השפלה בבטן. בנוסף, הכנת dsRNA lipoplexes הוא פשוטים וישימים בקלות כמו אוראלי RNAi, בפרט עבור חרקים עם פעילות ribonuclease חזק בבטן.
לעומת מחקרים אחרים הפיד כמויות גדולות יחסית של dsRNA עירום חרקים שונים10,18,19, פרוטוקול זה משתמש מינהל אוראלי כמות נמוכה יחסית של dsRNA (0.5 µg ליום), הגורמת דלדול משמעותי של ביטוי גנים היעד ב- פיתול של גרמנית דרב. היבטים קריטיים של הפרוטוקול כוללים את שיטת האכלה מדויקות שהצטברו בליעה של כמויות קטנות של dsRNA. ראשית, הטכניקה האכלה מתאים וזמינותו בליעה רציפה וממזערת את הווריאציה של הכמות dsRNA בלע לכל חרק בודדים. שנית, השפעת המחסור האמבטיה ביטוי פיתול הוצגה התייקר מ 40% ב- % 9 עד 60 יום יום 17 עם הממשל אוראלי רציפה של dsTub lipoplexes (איור 3א). למרות dsRNA עירום היה מושפל במהירות עם ex-vivo דגירה של פיתול מיץ בתוך 1 h (איור 2א), האכלה רצופה של dsRNA עירומה במשך 16 ימים הביא גם דלדול משמעותי של הביטוי באמבטיה ב פיתול (איור 3א). יתר על כן, התקופה של האכלה רצופה של dsRNA lipoplexes במשך 16 ימים היא דרישה לגרום השפעה קטלנית בולט ידי RNAi.
למרות נושאות ליפוזום (ראה טבלה של חומרים) משמש כאן היו במקור עבור במבחנה תקנים של ה-DNA בתאים חרקים, לא הייתה שום בעיה החלת הזה ריאגנט ליפוזום כרכב של dsRNA עבור משלוח אוראלי במודל שלנו חרקים. מחקרים רבים הראו גם בהצלחה את השיפור של RNAi שתיקת במינים חרקים אחרים בעזרת ריאגנטים ליפוזום שונים, אשר תוכננו עבור ה-DNA או RNA מולקולות17,20,21. למרות זאת, מנגנון ספיגת dsRNA בבטן חרקים לא עדיין לגמרי נחקרה, מערכת משלוח ליפוזום יכול להגביר את ספיגת dsRNA לתוך התאים, עקב התאימות שלה עם מבנה פוספוליפיד22. לכן, מסירת dsRNA במארז ליפוזומים אוראלי יכול להיות אסטרטגיית המתאימה להשגת RNAi יעיל עקב האטה של השפלה מאת RNases (איור 2).
חיסרון אחד של פרוטוקול זה אולי להיות כמות קטנה של dsRNA ב נושאות ליפוזום, ובכך עשויים לדרוש תקופות ארוכות יותר של הזנה רציפה. ההגבלה על יחס מסוים בין dsRNA כדי ליפוזום (0.25 µg:1 µL) הוא העיצוב של ליפוזום מסחרי הכימית, לפי הצעתו של היצרן. על ניסוחים בהכנה של ליפוזום חלקיקים עם קוטר גדול, והחיוב שונים על פני השטח lipoplexes, מדווחים להגדיל את ומגעים siRNA ו RNAi-23,יעילות-שתיקה-24. לכן, חלקיקים ליפוזום שונים ניתן גם לשיפור תהליכי ההאכלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי מענקים מטייוואן (משרד המדע והטכנולוגיה, 100-2923-B-002-002-MY3 ביותר 106-2313-B-002-011-MY3 כדי H.J.L.), צ'כיה (גרנט אוניברסיטת סוכנות דרום בוהמיה, gaju ב להעניק 065/2017/P Y.H.L), ו (ספרד משרד הכלכלה הספרדית ואת התחרותיות, מעניקה CGL2012-36251 ו- CGL2015-64727-P X.B., הממשלה קטלאנית, להעניק 2014 SGR 619 X.B.); זה גם קיבלו תמיכה כספית מהקרן האירופאית כלכלי ולפיתוח אזורי (פדר כספים X.B.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GenJe Plus DNA in vitro Transfection reagent | SignaGen | SL100499 | for lipoplexes preparation |
| Blend Taq plus | TOYOBO | BTQ-201 | for PCR |
| Fast SYBR Green Master Mix | ABI | 4385612 | for qPCR |
| FirstChoice RLM-RACE Kit | Invitrogen | AM1700 | for 3' UTR identification |
| MEGAscript T7 Transcription Kit | Invitrogen | AMB13345 | for dsRNA synthesis |
| TURBO DNase | Invitrogen | AM2239 | remove DNA template from dsRNA |
| TRIzol | Invitrogen | 15596018 | for dsRNA or total RNA extraction |
| RQ1 RNase-Free Dnase | Promega | M6101 | remove DNA template from total RNA |
| chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | for dsRNA or total RNA extraction |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | I9516 | for dsRNA or total RNA extraction |
| ethanol | Sigma-Aldrich | 24102 | for dsRNA or total RNA extraction |
| Diethyl pyrocarbonate, DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | for RNase free water preparation |
| glucose solution | Sigma-Aldrich | G3285 | for lipoplexes preparation |
| Sodium chloride, NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | insect saline buffer formula |
| Potassium chloride, KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | insect saline buffer formula |
| Calcium chloride, CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | insect saline buffer formula |
| Magnesium chloride hexahydrate, MgCl2.6H2O | Sigma-Aldrich | M2670 | insect saline buffer formula |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | enzyme inhibitor |
| dissecting scissor | F.S.T. | cockroach dissection | |
| fine tweezers | F.S.T. | cockroach dissection | |
| flexible tweezer | F.S.T. | cockroach holding | |
| pipetman | RAININ | P10 | sample preparation |
| microcentrifuge tube | Axygen | MCT175C, PCR02C | sample preparation |
| pipette tip | Axygen | sample preparation | |
| vortexter | Digisystem | vm1000 | sample preparation |
| Minispin centrifuge | The Gruffin Group | GMC 206 | for liquid spin down |
| Centrifuge | ALC | PK121R | sample preparation |
| pH meter | JENCO | 6071 | for pH adjust |
| micro-volume spectrophotometer | Quawell | Q3000 | nucleic acid quantitative |
| PCR Thermal cycler | ABI | 2720 | for template PCR or dsRNA synthesis incubation |
| quantitative real-time PCR | ABI | StepOne plus | gene expression quantitative |
| Centrifugal Vacuum Concentrators | eppendorf | 5301 | for dsRNA or total RNA extraction |
| Multipette | eppendorf | xstream | for real-time PCR sample loading |
| Agarose I | amresco | 0710 | for nucleic acid electrophoresis |
| tub gene specfifc forward preimer | tri-I biotech | GGG ACA AGC CGG AGT GCA GA | |
| tub gene specfifc reverse preimer | tri-I biotech | TCC TGC TCC TGT CTC GCT GA | |
| dsTub template forward primer | tri-I biotech | TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA CAA GCC GGA GTG CAG | |
| dsTub template reverse primer | tri-I biotech | TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT CCT GCT CCT GTC TCG CTG | |
| dsEGFP template forward preimer | tri-I biotech | TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT ATG GTG AGC AAG GGC GAG GAG | |
| dsEGFP template reverse preimer | tri-I biotech | TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT GGC GGA TCT TGA AGT TCA CC | |
| tub qPCR forward primer | tri-I biotech | GGA CCG CAT CAG GAA ACT GGC | |
| tub qPCR reverse preimer | tri-I biotech | CCA CAG ACA GCC TCT CCA TGA GC | |
| ef1 qPCR forward primer | tri-I biotech | CGC TTG AGG AAA TCA AGA AGG A | |
| ef1 qPCRreverse preimer | tri-I biotech | CCT GCA GAG GAA GAC GAA G |
References
- Hammond, S. M. Dicing and slicing: The core machinery of the RNA interference pathway. FEBS Lett. 579, 5822-5829 (2005).
- Bellés, X. Beyond drosophila: RNAi in vivo and functional genomics in insects. Annu. Rev. Entomol. 55, 111-128 (2010).
- Wynant, N., Santos, D., Vanden Broeck, J. Chapter Five - Biological Mechanisms Determining the Success of RNA Interference in Insects. International Review of Cell and Molecular Biology. Jeon, K. W. 312, Academic Press. 139-167 (2014).
- San Miguel, K., Scott, J. G. The next generation of insecticides: dsRNA is stable as a foliar-applied insecticide. Pest Manag. Sci. 72, 801-809 (2016).
- Scott, J. G., et al. Towards the elements of successful insect RNAi. J. Insect Physiol. 59, 1212-1221 (2013).
- Joga, M. R., Zotti, M. J., Smagghe, G., Christiaens, O. RNAi efficiency, systemic properties, and novel delivery methods for pest insect control: What we know so far. Front. Physiol. 7, (2016).
- Garbutt, J. S., Bellés, X., Richards, E. H., Reynolds, S. E. Persistence of double-stranded RNA in insect hemolymph as a potential determiner of RNA interference success: Evidence from Manduca sexta and Blattella germanica. J. Insect Physiol. 59, 171-178 (2013).
- Arimatsu, Y., Kotani, E., Sugimura, Y., Furusawa, T. Molecular characterization of a cDNA encoding extracellular dsRNase and its expression in the silkworm, Bombyx mori. Insect Biochem. Mol. Biol. 37, 176-183 (2007).
- Wang, K., et al. Variation in RNAi efficacy among insect species is attributable to dsRNA degradation in vivo. Insect Biochem. Mol. Biol. 77, 1-9 (2016).
- Wynant, N., et al. Identification, functional characterization and phylogenetic analysis of double stranded RNA degrading enzymes present in the gut of the desert locust, Schistocerca gregaria. Insect Biochem. Mol. Biol. 46, 1-8 (2014).
- Huang, J. -H., Belles, X., Lee, H. -J. Functional characterization of hypertrehalosemic hormone receptor in relation to hemolymph trehalose and to oxidative stress in the cockroach Blattella germanica. Exp. Endocrinol. 2, 114 (2012).
- Lin, Y. -H., Lee, C. -M., Huang, J. -H., Lee, H. -J. Circadian regulation of permethrin susceptibility by glutathione S-transferase (BgGSTD1) in the German cockroach (Blattella germanica). J. Insect Physiol. 65, 45-50 (2014).
- Lozano, J., Kayukawa, T., Shinoda, T., Belles, X. A role for taiman in insect metamorphosis. PLOS Genet. 10, 1004769 (2014).
- Lozano, J., Montañez, R., Belles, X. MiR-2 family regulates insect metamorphosis by controlling the juvenile hormone signaling pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. 112, 3740-3745 (2015).
- Lin, Y. -H., Huang, J. -H., Liu, Y., Belles, X., Lee, H. -J. Oral delivery of dsRNA lipoplexes to German cockroach protects dsRNA from degradation and induces RNAi response. Pest Manag. Sci. 73, 960-966 (2017).
- Gharavi, J., et al. Chiral cationic polyamines for chiral microcapsules and siRNA delivery. Bioorg. Med. Chem. Lett. 23, 5919-5922 (2013).
- Whyard, S., Singh, A. D., Wong, S. Ingested double-stranded RNAs can act as species-specific insecticides. Insect Biochem. Mol. Biol. 39, 824-832 (2009).
- Luo, Y., et al. Differential responses of migratory locusts to systemic RNA interference via double-stranded RNA injection and feeding. Insect Mol. Biol. 22, 574-583 (2013).
- Liu, J., Smagghe, G., Swevers, L. Transcriptional response of BmToll9-1 and RNAi machinery genes to exogenous dsRNA in the midgut of Bombyx mori. J. Insect Physiol. 59, 646-654 (2013).
- Airs, P. M., Bartholomay, L. C. RNA interference for mosquito and mosquito-borne disease control. Insects. 8, 4 (2017).
- Taning, C. N. T., et al. Oral RNAi to control Drosophila suzukii: Laboratory testing against larval and adult stages. J. Pest Sci. 89, 803-814 (2016).
- Wu, S. Y., McMillan, N. A. J. Lipidic systems for in vivo siRNA delivery. AAPS J. 11, 639-652 (2009).
- Tam, Y. Y. C., Chen, S., Cullis, P. R. Advances in lipid nanoparticles for siRNA delivery. Pharmaceutics. 5, 498-507 (2013).
- Xia, Y., Tian, J., Chen, X. Effect of surface properties on liposomal siRNA delivery. Biomaterials. 79, 56-68 (2016).
