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Biology

आरएनए हस्तक्षेप के व्यावहारिक उपयोग: तिलचट्टे के लिए Liposome वाहक में डबल कतरा आरएनए के मौखिक वितरण

Published: May 1, 2018 doi: 10.3791/57385
Automatic Translation
1, 1, 1,2,3, 4, 1
1Department of Entomology, National Taiwan University, 2Biology Centre, Institute of Entomology, Czech Academy of Sciences, 3Faculty of Science, University of South Bohemia, 4Institute of Evolutionary Biology, CSIC-UPF

Summary

इस पांडुलिपि liposomes में समझाया डबल असहाय आरएनए के मौखिक घूस के माध्यम से जर्मन तिलचट्टा के midgut में जीन अभिव्यक्ति की कमी को दर्शाता है ।

Abstract

आरएनए हस्तक्षेप (RNAi) व्यापक रूप से कई जीनों के जैविक कार्यों को उजागर करने के लिए लागू किया गया है, और एक कीट नियंत्रण आवश्यक जीन अभिव्यक्ति के विघटन द्वारा संचालित उपकरण के रूप में परिकल्पना की गई है । हालांकि इंजेक्शन के रूप में विभिंन तरीकों, खिला, और भिगोने, डबल असहाय आरएनए (dsRNA) के सफल वितरण के लिए सूचित किया गया है, dsRNA के मौखिक वितरण के माध्यम से RNAi की दक्षता विभिंन कीट समूहों के बीच अत्यधिक परिवर्तनशील है । जर्मन तिलचट्टा, Blattella germanica, dsRNA के इंजेक्शन के लिए अत्यधिक संवेदनशील है, के रूप में कई पहले प्रकाशित अध्ययनों से दिखाया गया है । वर्तमान अध्ययन एक विधि का वर्णन करने के लिए प्रदर्शित करता है कि dsRNA liposome वाहक के साथ समझाया midgut रस से dsRNA के क्षरण मंदबुद्धि के लिए पर्याप्त है । विशेष रूप से, dsRNA के निरंतर खिला liposomes द्वारा समझाया काफी midgut में tubulin अभिव्यक्ति कम कर देता है, और तिलचट्टे की मौत के लिए नेतृत्व किया । निष्कर्ष में, dsRNA lipoplexes के निर्माण और उपयोग, जो nucleases के खिलाफ dsRNA की रक्षा, भविष्य में कीट कीट नियंत्रण के लिए RNAi का व्यावहारिक उपयोग हो सकता है ।

Introduction

RNAi एक के बाद एक तंत्र के माध्यम से जीन अभिव्यक्ति पछाड़ना के लिए एक प्रभावी विधि के रूप में प्रदर्शन किया गया है transcriptional मुंह बंद करने मार्ग कई dsRNA में eukaryotes अणुओं द्वाराट्रिगर1 । अध्ययन के पिछले एक दशक से अधिक, RNAi एक उपयोगी उपकरण के लिए विकास से जीन के कार्यों का अध्ययन करने के लिए इंजेक्शन और कीड़े के विभिंन taxa में dsRNA के द्वारा विशिष्ट जीन की अभिव्यक्ति घट द्वारा व्यवहार करने के लिए हो गया है2,3। घट रहे प्रभाव की विशिष्टता और मजबूती के कारण वर्तमान में RNAi के आवेदन को कीट नियंत्रण प्रबंधन4,5के लिए संभावित रणनीति के रूप में माना जा रहा है । हालांकि, RNAi की दक्षता कीट प्रजातियों के बीच व्यापक रूप से बदलता है, अलग जीन लक्षित किया जा रहा है और वितरण के तरीकों पर निर्भर करता है । सबूत के एक बढ़ती शरीर पता चलता है कि dsRNA, जो ribonucleases द्वारा अपमानित है की अस्थिरता, RNAi5,6की सीमित प्रभावकारिता में एक महत्वपूर्ण कारक है । उदाहरण के लिए, Manduca sexta में कम RNAi संवेदनशीलता तथ्य यह है कि dsRNA hemolymph के साथ मिश्रित जल्दी से 1 घंटे7के भीतर अपमानित किया गया था द्वारा समझाया गया है । इसी तरह, midgut में क्षारीय nucleases की उपस्थिति, जो कुशलता से नीचा dsRNAed, विभिन्न कीट आदेश में कम RNAi दक्षता के साथ दृढ़ता से संबंधित है8,9,10.

dsRNA के मौखिक वितरण एक कीट नियंत्रण रणनीति में RNAi के आवेदन के लिए विशेष रूप से दिलचस्प है, लेकिन एक विधि midgut में nucleases द्वारा dsRNA की गिरावट मंदबुद्धि अभी तक विकसित नहीं किया गया है, जो क्षमता को प्रभावी सुनिश्चित करने के लिए होगा RNAi के माध्यम से खिला । हालांकि, dsRNA की मौखिक प्रसव के लिए RNAi की प्रतिक्रिया dsRNA की बड़ी मात्रा में खिलाने के द्वारा सूचित किया गया है, जैसे Bombyx मोरीमें ५० µ जी, या लगातार 8 दिनों के लिए खिला (8 µ जी dsRNA कुल में) locust प्रजातियों में । जर्मन तिलचट्टा, Blattella germinica, dsRNA11,12,13,14के इंजेक्शन द्वारा RNAi के लिए अत्यधिक संवेदनशील है, लेकिन खिलाने के माध्यम से dsRNA के लिए उत्तरदायी नहीं है । हाल ही में, लिन एट अल । (२०१७) ने दिखा दिया है कि dsRNA सफल RNAi में liposome वाहक परिणामों के साथ encapsulated को α में tubulin -midgut जीन अभिव्यक्ति पछाड़ना और ट्रिगर जर्मन तिलचट्टा15के महत्वपूर्ण मृत्यु दर । midgut में dsRNA के क्षरण के रूप में मौखिक RNAi के लिए सीमित कारक है, liposome वाहक एक वाहन के रूप में क्षरण से dsRNA की रक्षा के लिए, जो पेट में मजबूत nuclease गतिविधियों के साथ अन्य कीड़ों में आसानी से लागू है की सेवा है । नोट की, विशेष अभिकर्मक एजेंट को चुनने के लिए कारण ( सामग्री की तालिकादेखें) हम वर्तमान प्रोटोकॉल में liposome वाहक के रूप में इस्तेमाल किया है कि यह कीट सेल लाइन अभिकर्मक कम विषाक्तता के साथ के लिए परीक्षण किया गया है, के अनुसार निर्माता के निर्देश । Gharavi एट अल में अलग liposome अभिकर्मक प्रणालियों की तुलना के अनुसार । (२०१३) 16, transfecting छोटे हस्तक्षेप आरएनए (सिरना) की दक्षता लगभग एक ही है कि अन्य कीड़ों में dsRNA वितरण प्रणालियों के लिए इस्तेमाल किया गया है इस और अन्य व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्रणालियों के बीच17,18 . इसके अलावा, हमारे खिला विधि dsRNA की उचित मात्रा में प्रत्येक तिलचट्टा द्वारा घूस लेना सुनिश्चित करने के लिए पर्याप्त सावधान है, और है कि परिणाम मजबूत और पुष्टि कर रहे हैं । सारांश में, वर्तमान प्रोटोकॉल और परिणाम प्रदर्शित करता है कि dsRNA lipoplexes का उपयोग dsRNA स्थिरता में सुधार और रणनीति मौखिक डिलीवरी के डिजाइन के लिए दरवाजे खोलता है RNAi, जो भविष्य में कीट नियंत्रण के लिए एक आशाजनक दृष्टिकोण है ।

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Protocol

1. संश्लेषण और dsRNA की तैयारी

  1. लक्ष्य जीन के 3 ' unअनुवादित क्षेत्र में dsRNA लक्ष्य साइटों की पहचान । dsTub को लक्षित करने के लिए प्रयोग किया जाता है α-tubulin (टब) जीन (GenBank प्रवेश संख्या: KX228233), और एक नकारात्मक dsEGFP नियंत्रण के रूप में dsRNA बढ़ाया हरी प्रतिदीप्ति प्रोटीन के अनुक्रम से बनाया गया है (EGFP; GenBank प्रवेश संख्या: LC311024) ।
  2. T7 प्रवर्तक अनुक्रम (5 '-TAATACGACTCACTATAGGG-3 ') युक्त जीन-विशिष्ट प्राइमरों के साथ dsRNA टेम्पलेट्स को संश्लेषित करने के लिए मानक पीसीआर प्रवर्धन करते हैं. पीसीआर प्रवर्धन शर्तों और प्राइमर जानकारी इस्तेमाल लिन एट अलद्वारा रिपोर्ट कर रहे है उन । (२०१७) 12 ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
  3. dsRNA तैयारी के साथ आगे बढ़ें एक T7 प्रतिलेखन किट का उपयोग ( सामग्री की तालिकादेखें), निर्माता के निर्देशों का पालन.
    नोट: उच्च मात्रा dsRNA उपज के लिए, एक ट्यूब में दो प्रतिक्रियाओं मिश्रण (कुल ४० µ एल में), और ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात भर गर्मी ।
  4. DNase के 2 µ l जोड़ें ( सामग्री की तालिकादेखें) ३७ डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए dsRNA नमूनों में डीएनए टेम्पलेट्स को पचाने के लिए.
  5. जोड़ें २०० µ एल निष्कर्षण रिएजेंट ( सामग्री की तालिकादेखें) और ४० µ l क्लोरोफॉर्म, तो भंवर ।
  6. 4 डिग्री सेल्सियस पर १३,००० x g पर 10 मिनट के लिए केंद्रापसारक, तो एक नया microcentrifuge ट्यूब में supernatant (१५० µ एल) इकट्ठा ।
  7. १५० µ l isopropanol और बर्फ पर 15 मिनट के लिए मशीन जोड़कर हाला dsRNA.
  8. 4 डिग्री सेल्सियस पर १३,००० x g पर 15 मिनट के लिए केंद्रापसारक, तो supernatant निकालें ।
  9. जोड़ें ७०% इथेनॉल के २०० µ एल dsRNA छर्रों धोने के लिए । 4 डिग्री सेल्सियस पर १३,००० x g पर 10 मिनट के लिए केंद्रापसारक ।
  10. इथेनॉल निकालें और इथेनॉल धोने कदम दोहराने ।
  11. 3 मिनट के लिए केंद्रापसारक वैक्यूम संकेन्द्रित द्वारा इथेनॉल और सूखी dsRNA गोली निकालें, तो RNase के साथ dsRNA reसस्पेंड मुक्त पानी ।
  12. शुद्ध dsRNA की मात्रा का निर्धारण एक सूक्ष्म मात्रा यूवी विज़ spectrophotometer का उपयोग ( सामग्री की तालिकादेखें) निर्माता के निर्देशों के अनुसार और वांछित एकाग्रता को समायोजित (जैसे, ०.२५ µ जी/µ एल की तैयारी के लिए dsRNA lipoplexes) ।
  13. 3 महीने के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर dsRNA नमूनों की दुकान ।

2. dsRNA Lipoplexes की तैयारी

  1. 5% ग्लूकोज समाधान के 4 µ एल जोड़कर अभिकर्मक रिएजेंट ( सामग्री की तालिकादेखें) के 4 µ l पतला. 5% ग्लूकोज सॉल्यूशन के 4 µ l को जोड़कर dsRNA (1 µ g) के 4 µ l को पतला कर दीजिये ।
  2. पतला liposome रिएजेंट समाधान को तुरंत पतला dsRNA समाधान में जोड़ें । भंवर संक्षेप में उंहें मिश्रण करने के लिए, तो 25 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए गर्मी ।
    नोट: समाधान रिवर्स क्रम में मिश्रण नहीं है ।
  3. dsRNA lipoplexes उपयोग के लिए तैयार हैं । तैयारी के 1 घंटे के भीतर का उपयोग करें, और 1 घंटे के बाद त्यागें ।
    नोट: निर्माता के निर्देश के अनुसार, lipoplexes का उपयोग जल्द किया जाना चाहिए ।

3. Hemolymph और Midgut जूस से Extracellular एंजाइमों का संग्रह

  1. कीट खारा बफर (10x स्टॉक)
    1. मिक्स ९०० एमएल डबल आसुत जल विथ १०९.३ g NaCl, १५.७ g KCl, ६.३ g CaCl2, र ८.३ g MgCl2· 6H2O.
    2. ६.८ के लिए पीएच समायोजित करें, और १,००० मिलीलीटर तक भरें ।
  2. Hemolymph संग्रह
    1. जब तक वे 3 मिनट के लिए कदम नहीं है बर्फ पर तिलचट्टे Anesthetize ।
    2. दो उंगलियों (अंगूठे और तर्जनी) के साथ तिलचट्टा पकड़ो, और तिलचट्टा के ऊपर ventral की ओर मुड़ें ।
    3. दूर एक हिंद पैर की एक coxa की नोक काट करने के लिए विदारक कैंची का प्रयोग करें ।
      नोट: coxa और trochanter के बीच जुड़े चौराहे काट दिए । coxa के दूसरे भाग का आबकारी hemolymph इकट्ठा करने में कम दक्ष था.
    4. मध्यम उंगली के साथ धीरे पेट निचोड़, और एक 10 µ एल micropipette के साथ चीरा से खून बह रहा hemolymph इकट्ठा ।
    5. एक microcentrifuge ट्यूब में कई तिलचट्टे (5 व्यक्तियों) से hemolymph पूल ।
      नोट: melanization को रोकने के लिए बर्फ पर microcentrifuge ट्यूबों रखें । एक पुरुष तिलचट्टे से प्राप्त hemolymph की औसत मात्रा 2-3 µ एल है ।
    6. hemolymph के लिए एक benchtop केंद्रापसारक के साथ संक्षेप में नीचे स्पिन 10 एस ।
    7. hemolymph (यानी, 10 µ एल) के वांछित मात्रा स्थानांतरण, और यह 1x कीट खारा बफर के ५० µ एल के साथ मिश्रण ।
    8. १,००० एक्स जी में 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए केंद्रापसारक नीचे स्पिन hemocytes । एक स्वच्छ microcentrifuge ट्यूब करने के लिए supernatant हस्तांतरण ।
    9. A28015को मापने के द्वारा एक सूक्ष्म मात्रा यूवी की तुलना spectrophotometer का उपयोग कर कुल प्रोटीन एकाग्रता को बढ़ाता है ।
    10. एक ही प्रोटीन एकाग्रता (कुल प्रोटीन के 6 मिलीग्राम/µ एल) के लिए प्रत्येक नमूना समायोजित करें ।
  3. Midgut रस संग्रह
    1. बर्फ पर तिलचट्टे Anesthetize । कीट पिन का उपयोग कर कोल्ड 1x कीट खारा बफर के साथ विच्छेदन प्लेट पर ventral ओर तिलचट्टे को ठीक करें ।
    2. पेट को ठीक चिमटी से काटना । 1x कीट खारा बफर के साथ एक ताजा पकवान के लिए (सामने, मध्य, और हिंद पेट सहित) पूरे पेट को हटा दें ।
    3. सामने और हिंद आंत निकालें, और जल्दी से एक microcentrifuge ट्यूब है कि १०० µ एल कीट खारा बफर शामिल करने के लिए midgut हस्तांतरण ।
    4. एक ही ट्यूब में छह तिलचट्टे से midguts पूल, और भंवर के लिए 10 एस.
    5. hemocytes और आंत के ऊतकों नीचे स्पिन करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर १,००० x g पर 10 मिनट के लिए केंद्रापसारक । एक स्वच्छ microcentrifuge ट्यूब करने के लिए supernatant हस्तांतरण ।
    6. A28015को मापने के द्वारा एक सूक्ष्म मात्रा यूवी की तुलना spectrophotometer का उपयोग कर कुल प्रोटीन एकाग्रता को बढ़ाता है ।
    7. एक ही प्रोटीन एकाग्रता (कुल प्रोटीन के 6 मिलीग्राम/µ एल) के लिए प्रत्येक नमूना समायोजित करें ।

4. dsRNA क्षरण परख

  1. नए सिरे से तैयार 4 µ l को नंगी dsRNA या dsRNA lipoplexes (1 µ g) के.
  2. कीट खारा बफर (नियंत्रण), hemolymph, या midgut रस से निकाले एंजाइमों के 10 µ एल के साथ dsRNA समाधान मिक्स ।
  3. या तो EGTA (20 मिमी) या RNase-मुक्त पानी एंजाइम गतिविधियों के निषेध के लिए नियंत्रण के रूप में अलग नमूनों के लिए 2 µ एल जोड़ें ।
  4. 1 घंटे या अब (6, 12, या 24 घंटे) 25 डिग्री सेल्सियस पर के लिए मशीन ।
  5. जोड़ें २०० µ एल निष्कर्षण रिएजेंट और ४० µ l क्लोरोफॉर्म, तो भंवर ।
  6. 4 डिग्री सेल्सियस पर १३,००० x g पर 10 मिनट के लिए केंद्रापसारक, तो एक नया microcentrifuge ट्यूब में supernatant (१५० µ एल) इकट्ठा ।
  7. १५० µ l isopropanol और बर्फ पर 15 मिनट के लिए मशीन जोड़कर हाला dsRNA.
  8. 4 डिग्री सेल्सियस पर १३,००० x g पर 15 मिनट के लिए केंद्रापसारक, तो supernatant निकालें ।
  9. जोड़ें ७०% इथेनॉल के २०० µ एल dsRNA छर्रों धोने के लिए । 4 डिग्री सेल्सियस पर १३,००० x g पर 10 मिनट के लिए केंद्रापसारक ।
  10. इथेनॉल निकालें और इथेनॉल धोने कदम दोहराने ।
  11. के लिए केंद्रापसारक वैक्यूम संकेन्द्रित द्वारा इथेनॉल और सूखी dsRNA गोली निकालें 3 min. reसस्पैंड 10 µ l RNase के साथ dsRNA-मुफ्त पानी ।
  12. एक १.५% agarose जेल पर जेल ट्रो के माध्यम से इलाज dsRNA की अखंडता की जांच करें ।

5. dsRNA के मौखिक प्रशासन

  1. शुष्क भोजन (डॉग चाउ) के एक विज्ञापन libitum आहार पर तिलचट्टे बनाए रखें । dsRNA घूस प्रयोगों से एक दिन पहले तिलचट्टे से पानी की आपूर्ति से वंचित.
  2. लचीला संदंश (चित्रा 1, चरण 5) के साथ अपने पंख हथियाने के द्वारा एक तिलचट्टा पकड़ो ।
    नोट: तिलचट्टे के शरीर के अंगों को हड़पने नहीं है ।
  3. dsRNA lipoplexes तैयार करें, साथ ही नग्न dsRNA, खिलाने के लिए, जैसा कि खंड 2 में वर्णित है ।
    नोट: dsRNA lipoplexes को खिलाने से पहले नए सिरे से तैयार करना चाहिए ।
  4. एक micropipette के साथ dsRNA lipoplexes या नग्न dsRNA (२५० एनजी) के 4 µ एल फ़ीड ।
  5. धीरे dsRNA समाधान की छोटी बूंद प्लास्टिक तिलचट्टे के mouthparts के करीब है, और तिलचट्टे छोटी बूंद पूरी तरह से निगलने देते हैं ।
  6. एक दिन में दो बार घूस प्रयोगों प्रदर्शन (पर रोशनी के बाद 1 ज और 1 घंटे से पहले रोशनी बंद) के लिए 8 दिन या 16 दिन लगातार ।
    नोट: सभी तिलचट्टे dsRNA समाधान या नियंत्रण रिएजेंट के साथ मैनुअल खिलाने के माध्यम से केवल पानी का अधिग्रहण (उदा., nuclease मुक्त पानी, ग्लूकोज समाधान, और liposome रिएजेंट) घूस प्रयोगों के दौरान.
  7. dsRNA प्रयोगों की घूस के 16 दिनों के बाद तिलचट्टे को पानी की बोतलें प्रदान करते हैं ।

6. पछाड़ना का आकलन करें

  1. चुना समय अंक (2, 9, और 17 दिन dsRNA घूस परख के बाद), dsEGFP-और dsTub-इलाज कीड़ों को इकट्ठा करने और चुना ऊतकों (उदा, midgut) काटना ।
  2. मात्रात्मक रीयल-टाइम पीसीआर (qRT-पीसीआर) निष्पादित करें । qRT-पीसीआर प्रवर्धन शर्तों और प्राइमर जानकारी के रूप में लिन एट अलद्वारा सूचना दी । (२०१७) 12.
  3. नियंत्रण और dsRNA-इलाज कीड़ों दैनिक मृत्यु दर की जांच करने के लिए और तिलचट्टे कि अब आगे बढ़ रहे है हटाने का आकलन करें ।

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Representative Results

dsRNA के मौखिक वितरण के लिए प्रोटोकॉल की एक सरलीकृत योजना को चित्रा 1में प्रस्तुत किया गया है, जहां dsRNA lipoplexes की तैयारी के लिए महत्वपूर्ण कदम दिखाए गए हैं ।

आदेश में liposome वाहकों द्वारा दिए गए संरक्षण की जांच करने के लिए midgut के रस में dsRNA क्षरण पर बी germanica, एक पूर्व विवो परख जहां dsTub lipoplexes midgut रस के साथ थे आयोजित किया गया था, और dsRNA की अखंडता बाद में एक १.५% agarose जेल पर विश्लेषण किया गया था । चित्रा 2 से पता चलता है कि मजबूत आरएनए nuclease गतिविधि बी germanica (चित्रा 2ए) के midgut के रस में मौजूद था, जबकि liposome वाहकों गिरावट के खिलाफ dsRNA की रक्षा करने में सक्षम थे पूर्व vivo में 1 घंटे के लिए मशीन (चित्रा 2ए, बी) । नतीजतन, dsRNA lipoplexes के मौखिक घूस midgut ऊतकों की संवेदनशीलता को बढ़ाने के लिए एक दिन में दो बार लागू किया गया था निम्नलिखित प्रयोगों में RNAi.

dsRNA के मौखिक वितरण के माध्यम से RNAi प्रतिक्रिया के सत्यापन midgut में dsRNA की सतत घूस (चित्रा 3) के बाद अलग समय बिंदुओं पर टब mRNA अभिव्यक्ति की कमी प्रभाव को मापने के द्वारा मूल्यांकन किया गया था । midgut में टब अभिव्यक्ति काफी 8 दिनों के लिए dsTub lipoplexes की लगातार घूस के बाद समाप्त हो गया था । जबकि dsRNA के निरंतर खिला 16 दिनों तक चली, midgut में टब अभिव्यक्ति काफी नग्न dsTub और dsTub lipoplexes समूहों में समाप्त हो गया था (लगभग 24 और ६०% से, क्रमशः) नियंत्रण के विपरीत । चित्र 3 बी 16 दिनों के लिए dsTub lipoplexes के मौखिक प्रशासन के बाद मृत्यु दर की एक सुसंगत, उल्लेखनीय वृद्धि से पता चलता है ।

Figure 1
चित्र 1 : तिलचट्टे के लिए dsRNA lipoplexes के मौखिक वितरण की सरलीकृत योजना. चरण 1 से 4 के लिए dsRNA lipoplexes तैयार करने के लिए महत्वपूर्ण चरणों का प्रतिनिधित्व कर रहे हैं । फोटो में खिलाई तकनीक (स्टेप 5) दिखाई जाती है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: germanica hemolymph (हेमो) या midgut रस द्वारा dsRNA के पूर्व विवो क्षरण । (क) 1 नग्न या liposome के µ जी-cojugated dsTub खारा बफर और hemolymph (हेमो) या midgut रस, क्रमशः से निकाले एंजाइमों के साथ 1 एच के लिए मशीन था । नग्न dsTub, लेकिन नहीं liposome-संयुग्मित dsTub, पूरी तरह से नीचा था जब 1x midgut रस के साथ मशीन । मूल midgut रस (1x) के विभिंन कमजोर पड़ने कारकों संकेत कर रहे हैं । क्षरण आयन केलेशनथेरेपी द्वारा बाधित किया गया था एक नियंत्रण के रूप में EGTA उपचार के कारण । (ख) liposome-encapsulated dsTub (1 µ g) के hemolymph या midgut रस में पूर्व vivo क्षरण के खिलाफ समय पर निर्भर संरक्षण । नोट की, liposome-संयुग्मित dsTub पूरी तरह से नीचा था जब midgut रस के साथ मशीन 24 घंटे के बाद । hemolymph और midgut रस मशीन के विभिंन समय अवधि के लिए मूल एकाग्रता में इस्तेमाल किया गया । परिणाम लिन एट अलसे अनुकूलित कर रहे हैं । (२०१७) 12. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3 : germanicaपर dsRNA की घूस द्वारा RNAi प्रतिक्रिया का प्रभाव. (एक) मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर (qRT-पीसीआर) अलग खिला उपचार के बाद जर्मन तिलचट्टा के midgut में रिश्तेदार टब अभिव्यक्ति का निर्धारण करने के लिए । विभिंन उपचार के अभिव्यक्ति स्तर 2 दिन में ग्लूकोज समूह के लिए सामान्यीकृत किया गया । मान तीन स्वतंत्र प्रयोगों (एन = 3), 3-5 जैविक प्रतिकृति के साथ प्रत्येक से मतलब ± एसई रहे हैं । पट्टियों के विभिंन पत्र विभिंन उपचार समूहों के बीच p < 0.05 (ANOVA निंनलिखित Tukey की एचएसडी पोस्ट हॉक परीक्षण) में महत्वपूर्ण अंतर दर्शाते हैं । (B) तिलचट्टे के उत्तरजीवियों कि 8 दिनों के लिए नग्न dsTub या dsTub lipoplexes घूस (8 घ) या 16 दिन (16 डी) (12-15 व्यक्तियों के प्रत्येक पलटन; n = 3 स्वतंत्र प्रयोग) । मान मतलब ± एसई हैं । उपचार समूह के विभिंन पत्र उत्तरजीवी के लिए p < 0.05 (Kruskal-वालिस test) में महत्वपूर्ण अंतर दर्शाते हैं । परिणाम लिन एट अलसे अनुकूलित कर रहे हैं । (२०१७) 12. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल dsRNA lipoplexes के मौखिक प्रसव के माध्यम से प्रभावी RNAi के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है, जर्मन तिलचट्टा के midgut के रस में ribonuclease पाचन के खिलाफ संरक्षण शामिल । के रूप में विभिंन कीट प्रजातियों में अंय अध्ययनों में दिखाया गया है, dsRNA के मौखिक वितरण के माध्यम से गरीब RNAi प्रभाव ज्यादातर dsRNA8,9,10की गिरावट से हिसाब है । इस प्रोटोकॉल liposomes कि आंत में क्षरण के खिलाफ dsRNA के मौखिक प्रसव में सुरक्षात्मक वाहनों के रूप में सेवा पैदा करता है । इसके अलावा, dsRNA lipoplexes की तैयारी सरल और मौखिक RNAi के रूप में आसानी से लागू है, पेट में मजबूत ribonuclease गतिविधि के साथ कीड़ों के लिए विशेष रूप से ।

अंय अध्ययनों कि अलग कीड़े10,18,19में नंगे dsRNA की अपेक्षाकृत बड़ी मात्रा में फ़ीड की तुलना में, इस प्रोटोकॉल dsRNA की एक अपेक्षाकृत कम राशि के मौखिक प्रशासन का उपयोग करता है (प्रति दिन ०.५ µ जी), जो कारण बनता है एक germanicaके midgut में लक्ष्य जीन अभिव्यक्ति की महत्वपूर्ण कमी. प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण पहलुओं सटीक खिला विधि और dsRNA की छोटी मात्रा में संचित घूस शामिल हैं । सबसे पहले, खिला तकनीक एक सतत घूस परख के लिए उपयुक्त है और व्यक्तिगत कीट प्रति घूस dsRNA मात्रा की भिंनता को कम करता है । दूसरा, midgut में टब अभिव्यक्ति की कमी प्रभाव dsTub lipoplexes (चित्रा 3एक) के सतत मौखिक प्रशासन के साथ दिन में 9 से ६०% पर ४०% से वृद्धि करने के लिए दिखाया गया था । हालांकि नग्न dsRNA तेजी से midgut रस के पूर्व vivo की मशीन के साथ नीचा था 1 ज (चित्रा 2ए), 16 दिनों के लिए नग्न dsRNA के निरंतर खिला भी टब अभिव्यक्ति की एक महत्वपूर्ण कमी के परिणामस्वरूप midgut (चित्रा 3ए) में । इसके अलावा, 16 दिनों के लिए dsRNA lipoplexes के निरंतर खिलाने की लंबी अवधि के लिए एक आवश्यकता है RNAi द्वारा एक विशिष्ट घातक प्रभाव पैदा करने के लिए ।

हालांकि liposome वाहक ( सामग्री की तालिकादेखें) यहां इस्तेमाल के लिए मूल रूप से थे इन विट्रो में डीएनए के अभिकर्मक में कीट कोशिकाओं, वहां कोई समस्या नहीं थी हमारे कीट मॉडल में मौखिक वितरण के लिए dsRNA के एक वाहन के रूप में इस liposome रिएजेंट लागू । कई अध्ययनों ने भी सफलतापूर्वक अन्य कीट प्रजातियों में RNAi मुंह बंद करने के सुधार का प्रदर्शन किया है विभिन्न liposome रिएजेंट का उपयोग कर, जो या तो डीएनए या आरएनए के अणुओं के लिए तैयार कर रहेहैं17, 20, 21. फिर भी, कीट आंत में dsRNA के तंत्र अभी तक पूरी तरह से अध्ययन नहीं किया गया है, और liposome वितरण प्रणाली कोशिकाओं में dsRNA के ऊपर बढ़ाने हो सकता है, फॉस्फोलिपिड संरचना के साथ अपनी असंगति के कारण22. इसलिए, dsRNA के मौखिक वितरण liposomes में समझाया एक उपयुक्त रणनीति RNases द्वारा गिरावट के मंदता के कारण कुशल RNAi प्राप्त करने के लिए हो सकता है (चित्रा 2) ।

इस प्रोटोकॉल का एक नुकसान liposome वाहक में dsRNA की छोटी राशि हो सकती है, और इस तरह निरंतर भोजन की लंबी अवधि की आवश्यकता हो सकती है । dsRNA से liposome के बीच इस तरह के एक विशेष अनुपात के प्रतिबंध (०.२५ µ g: 1 µ l) वाणिज्यिक liposome एजेंट के डिजाइन के कारण है, निर्माता के सुझाव के अनुसार । बड़ा व्यास आकार के साथ liposome नैनोकणों की तैयारी में योगों, और lipoplexes सतह पर अलग चार्ज, सिरना और RNAi मुंह बंद करनेदक्षता23, 24 के encapsulation बढ़ाने के लिए सूचित कर रहे हैं । इसलिए, अलग liposome नैनोकणों भी खिला प्रक्रियाओं में सुधार किया जा सकता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस अध्ययन के ताइवान (विज्ञान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था, सबसे ज्यादा 100-2923-बी-002-002-MY3 और 106-2313-बी-002-011-MY3 से H.J.L.), चेक गणराज्य (साउथ बोहेमिया यूनिवर्सिटी की ग्रांट एजेंसी, गाजू ग्रांट 065/2017/पी टू वाइ. एच. एल.), और स्पेन ( स्पेनी अर्थव्यवस्था और प्रतिस्पर्धा के मंत्रालय, अनुदान CGL2012-36251 और CGL2015-64727-पी X.B. के लिए, और कातालान सरकार, अनुदान २०१४ SGR ६१९ को X.B.); इसके साथ ही आर्थिक और क्षेत्रीय विकास के लिए यूरोपीय कोष से वित्तीय सहायता (FEDER फंड्स टू X.B.) भी प्राप्त हुई ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
GenJe Plus DNA in vitro Transfection reagent SignaGen SL100499 for lipoplexes preparation
Blend Taq plus TOYOBO  BTQ-201 for PCR
Fast SYBR Green Master Mix ABI  4385612 for qPCR
FirstChoice RLM-RACE Kit Invitrogen AM1700 for 3' UTR identification 
MEGAscript T7 Transcription Kit Invitrogen AMB13345 for dsRNA synthesis
TURBO DNase Invitrogen AM2239 remove DNA template from dsRNA
TRIzol Invitrogen 15596018 for dsRNA or total RNA extraction
RQ1 RNase-Free Dnase Promega M6101 remove DNA template from total RNA 
chloroform  Sigma-Aldrich C2432 for dsRNA or total RNA extraction
2-Propanol Sigma-Aldrich I9516 for dsRNA or total RNA extraction
ethanol Sigma-Aldrich 24102 for dsRNA or total RNA extraction
Diethyl pyrocarbonate, DEPC Sigma-Aldrich D5758 for RNase free water preparation
glucose solution Sigma-Aldrich G3285 for lipoplexes preparation
Sodium chloride, NaCl Sigma-Aldrich S7653 insect saline buffer formula
Potassium chloride, KCl Sigma-Aldrich P9333 insect saline buffer formula
Calcium chloride, CaCl2 Sigma-Aldrich C1016 insect saline buffer formula
Magnesium chloride hexahydrate, MgCl2.6H2O Sigma-Aldrich M2670 insect saline buffer formula
EGTA  Sigma-Aldrich E3889 enzyme inhibitor 
dissecting scissor F.S.T. cockroach dissection
fine tweezers F.S.T. cockroach dissection
flexible tweezer F.S.T. cockroach holding 
pipetman RAININ P10 sample preparation
microcentrifuge tube Axygen MCT175C, PCR02C sample preparation
pipette tip  Axygen sample preparation
vortexter Digisystem vm1000 sample preparation
Minispin centrifuge The Gruffin Group GMC 206 for liquid spin down 
Centrifuge ALC PK121R sample preparation
pH meter  JENCO 6071 for pH adjust
micro-volume spectrophotometer Quawell Q3000 nucleic acid quantitative
PCR Thermal cycler ABI  2720 for template PCR or  dsRNA synthesis incubation 
quantitative real-time PCR ABI  StepOne plus gene expression quantitative
Centrifugal Vacuum Concentrators eppendorf 5301 for dsRNA or total RNA extraction
Multipette  eppendorf xstream for real-time PCR sample loading 
Agarose I amresco 0710 for nucleic acid electrophoresis
tub gene specfifc forward preimer tri-I biotech GGG ACA AGC CGG AGT GCA GA
tub gene specfifc reverse preimer tri-I biotech TCC TGC TCC TGT CTC GCT GA
dsTub template forward primer tri-I biotech TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA CAA GCC GGA GTG CAG 
dsTub template reverse primer tri-I biotech TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT CCT GCT CCT GTC TCG CTG 
dsEGFP template forward preimer tri-I biotech TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT ATG GTG AGC AAG GGC GAG GAG
dsEGFP template reverse preimer tri-I biotech TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT GGC GGA TCT TGA AGT TCA CC
tub qPCR forward primer tri-I biotech GGA CCG CAT CAG GAA ACT GGC
tub qPCR reverse preimer tri-I biotech CCA CAG ACA GCC TCT CCA TGA GC
ef1 qPCR forward primer tri-I biotech CGC TTG AGG AAA TCA AGA AGG A
ef1 qPCRreverse preimer tri-I biotech CCT GCA GAG GAA GAC GAA G

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References

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जीवविज्ञान अंक १३५ आरएनए हस्तक्षेप Blattella Germanica Liposome ओरल डिलिवरी dsRNA फीडिंग
आरएनए हस्तक्षेप के व्यावहारिक उपयोग: तिलचट्टे के लिए Liposome वाहक में डबल कतरा आरएनए के मौखिक वितरण
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Huang, J. H., Liu, Y., Lin, Y. H., Belles, X., Lee, H. J. Practical Use of RNA Interference: Oral Delivery of Double-stranded RNA in Liposome Carriers for Cockroaches. J. Vis. Exp. (135), e57385, doi:10.3791/57385 (2018).

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