Summary
Questo manoscritto viene illustrato lo svuotamento dell'espressione genica in midgut il tedesco scarafaggio attraverso ingestione orale di RNA double-stranded incapsulato in liposomi.
Abstract
Interferenza del RNA (RNAi) è stato ampiamente applicato per scoprire le funzioni biologiche di numerosi geni ed è stata prevista come un parassita controllo strumento operativo tramite rottura di espressione genica essenziale. Sebbene diversi metodi, come l'iniezione, alimentazione e ammollo, sono stati segnalati per il recapito corretto del RNA double-stranded (dsRNA), l'efficienza di RNAi attraverso la consegna orale di dsRNA è altamente variabile tra i diversi gruppi degli insetti. Il tedesco scarafaggio, Blattella germanica, è altamente sensibile all'iniezione del dsRNA, come dimostrato da numerosi studi pubblicati in precedenza. Il presente studio descrive un metodo per dimostrare che il dsRNA incapsulato con vettori liposoma è sufficiente per ritardare la degradazione di dsRNA dal succo del midgut. In particolare, l'alimentazione in continuo di dsRNA incapsulato da liposomi significativamente riduce l'espressione di tubulina in midgut e ha portato alla morte di scarafaggi. In conclusione, la formulazione e l'utilizzo di dsRNA lipoplessi, che proteggono il dsRNA contro nucleasi, potrebbe essere in futuro un uso pratico di RNAi per controllo dei parassiti dell'insetto.
Introduction
RNAi è stato dimostrato come un metodo efficace per l'espressione genica atterramento attraverso un meccanismo di silenziamento post-trascrizionale via innescato da molecole di dsRNA in molti eucarioti1. Nell'ultimo decennio di studi, RNAi è diventata uno strumento utile per studiare le funzioni dei geni dallo sviluppo di comportamento che riducono l'espressione di specifici geni tramite iniezione e/o alimentazione di dsRNA in vari taxa di insetti2,3. A causa della specificità e robustezza dell'effetto di svuotamento, l'applicazione di RNAi è attualmente considerato come una strategia potenziale per pest control gestione4,5. Tuttavia, l'efficienza di RNAi varia ampiamente tra specie di insetti, a seconda di diversi geni presi di mira e i metodi di consegna. Un corpo crescente di prova suggerisce che l'instabilità del dsRNA, che è stato degradato dalla ribonucleasi, è un fattore critico per la limitata efficacia della RNAi5,6. Per esempio, la bassa sensibilità di RNAi in Manduca sexta è stata spiegata dal fatto che il dsRNA mescolato con l'emolinfa è stato rapidamente degradato entro 1 ora7. Allo stesso modo, la presenza di nucleasi alcaline in midgut, che degradano in modo efficiente dsRNA ingerito, è fortemente correlata con bassa efficienza di RNAi in diversi ordini di insetti8,9,10.
La somministrazione orale di dsRNA è particolarmente interessante per l'applicazione del RNAi in una strategia di controllo dei parassiti, ma un metodo per ritardare la degradazione di dsRNA di nucleasi a midgut non è ancora stato sviluppato, che avrebbe il potenziale per garantire un efficace RNAi attraverso l'alimentazione. Tuttavia, il problema del blocco di RNAi per consegna orale di dsRNA è stato segnalato dalla grande quantità di dsRNA, ad es. 50 µ g in Bombyx mori, o alimentazione alimentazione continuamente per 8 giorni (8 µ g dsRNA in totale) nelle specie di locusta. Il tedesco scarafaggio, germinica di Blattella, è altamente sensibile alla RNAi tramite l'iniezione del dsRNA11,12,13,14, ma non è rispondente a dsRNA attraverso l'alimentazione. Recentemente, Lin et al. (2017) hanno dimostrato che il dsRNA incapsulato con risultati di vettori liposomi in successo RNAi per atterramento l'espressione genica α-tubulina nella mortalità significativa del midgut e trigger del tedesco scarafaggio15. Come la degradazione di dsRNA in midgut è il fattore limitante per RNAi orale, i vettori di liposomi servono come veicolo di proteggere dsRNA dalla degradazione, che è facilmente applicabile in altri insetti con le attività della nucleasi forte nell'intestino. Della nota, la ragione per la scelta del reagente di transfezione particolare (Vedi Tabella materiali) abbiamo usato come vettore di liposomi nel protocollo attuale è che è stato testato per la transfezione di cellule di insetto linea con meno tossicità, secondo la istruzioni del produttore. Secondo il confronto dei sistemi di transfezione diversi liposoma Gharavi et al. (2013) 16, l'efficienza di trasfezione Short interfering RNA (siRNA) è circa la stessa tra questo e altri sistemi disponibili in commercio che sono stati utilizzati per sistemi di dsRNA in altri insetti17,18 . Inoltre, il nostro metodo di alimentazione sia abbastanza attento a garantire la corretta quantità di dsRNA è ingerita da ogni scarafaggio, e che i risultati siano robusti e confermato. In sintesi, il presente protocollo e i risultati dimostrano che utilizzando dsRNA lipoplessi migliora la stabilità di dsRNA e apre la porta alla progettazione della consegna orale strategia di RNAi, che è un approccio promettente per controllo dei parassiti in futuro.
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Protocol
1. sintesi e preparazione di dsRNA
- Identificare i siti di destinazione di dsRNA nella regione 3' non tradotta dei geni bersaglio. La dsTub è utilizzato per il targeting il gene α-tubulina (tub) (numero di accessione GenBank: KX228233), e dsEGFP come un controllo negativo dsRNA è progettato dalla sequenza di intensificare la proteina fluorescenza verde (EGFP; Numero di accessione GenBank: LC311024).
- Eseguire l'amplificazione di PCR standard per sintetizzare i modelli di dsRNA con gli iniettori di gene-specific contenente la sequenza del promotore T7 (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'). Le condizioni di amplificazione di PCR e informazioni sul primer utilizzati sono quelli segnalati da Lin et al. (2017) 12 (Vedi Tabella materiali).
- Procedere con la preparazione di dsRNA utilizzando una trascrizione di T7 Kit (Vedi Tabella materiali), seguendo le istruzioni del produttore.
Nota: Resa elevata quantità dsRNA, mescolare due reazioni in un tubo (in totale 40 µ l) e incubare a 37 ° C durante la notte. - Aggiungere 2 µ l di dnasi (Vedi Tabella materiali) in campioni di dsRNA per 15 min a 37 ° C per modelli del DNA del digest.
- Aggiungere 200 µ l di reagente di estrazione (Vedi Tabella materiali) e cloroformio 40 µ l, poi vortice.
- Centrifugare per 10 min a 13.000 x g a 4 ° C, quindi raccogliere il surnatante (150 µ l) in un nuovo tubo del microcentrifuge.
- Precipitare dsRNA aggiungendo 150 µ l isopropanolo e incubare per 15 minuti in ghiaccio.
- Centrifugare per 15 min a 13.000 x g a 4 ° C, quindi rimuovere il surnatante.
- Aggiungere 200 µ l di etanolo 70% per lavare dsRNA pellet. Centrifugare per 10 min a 13.000 x g a 4 ° C.
- Rimuovere l'etanolo e ripetere le fasi di lavaggio di etanolo.
- Rimuovere l'etanolo e asciutto dsRNA pellet da concentratori centrifughi vuoto per 3 min, quindi risospendere dsRNA con acqua RNAsi-libera.
- Determinare la quantità del dsRNA purificato utilizzando uno spettrofotometro UV-Vis di micro-volume (Vedi Tabella materiali) secondo le istruzioni del produttore e regolare fino alla concentrazione desiderata (ad es., 0,25 µ g / µ l per la preparazione di dsRNA lipoplessi).
- Conservare i campioni di dsRNA a-20 ° C fino a 3 mesi.
2. preparazione del dsRNA lipoplessi
- Diluire 4 µ l di reagente di transfezione (Vedi Tabella materiali) aggiungendo 4 µ l di soluzione glucosata al 5%. Diluire 4 µ l di dsRNA (1 µ g) aggiungendo 4 µ l di soluzione glucosata al 5%.
- Aggiungere la soluzione di reagente liposoma diluito immediatamente nella soluzione diluita dsRNA tutti in una volta. Vortice brevemente per mescolarli, quindi incubare per 15 minuti a 25 ° C.
Nota: Non mescolare le soluzioni nell'ordine inverso. - I dsRNA lipoplessi sono pronti all'uso. Usare entro 1 ora di preparazione e scartare dopo 1 ora.
Nota: Secondo le istruzioni del produttore, il lipoplessi dovrebbero essere usato appena possibile.
3. raccolta di enzimi extracellulari dall'emolinfa e succo del Midgut
-
Insetto buffer saline (stock x 10)
- Mescolare 900 mL acqua distillata doppia con 109,3 g NaCl, 15,7 g KCl, 6,3 g CaCl2e 8,3 g MgCl2·6H2O.
- Aggiustare il pH a 6,8 e riempire fino a 1.000 mL.
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Collezione di emolinfa
- Anestetizzare gli scarafaggi sul ghiaccio fino a quando non si muovono per 3 min.
- Tenere lo scarafaggio con due dita (pollice e indice) e alzare il lato ventrale del scarafaggio.
- Utilizzare le forbici per dissezione per tagliare fuori la punta di una coxa di una gamba posteriore.
Nota: Tagliare l'intersezione collegato tra la coxa e il trocantere. L'asportazione della parte del coxa era meno efficiente per raccogliere l'emolinfa. - Spremere l'addome delicatamente con il dito medio e raccogliere l'emolinfa sanguinamento dall'incisione con una micropipetta 10 µ l.
- Piscina l'emolinfa da scarafaggi (5 persone) in un tubo del microcentrifuge.
Nota: Mantenere le provette microcentrifuga sul ghiaccio per prevenire melanizzazione. Il volume medio di emolinfa ottenuto da uno scarafaggio maschio è 2-3 µ l. - Rotazione verso il basso l'emolinfa brevemente con una centrifuga da banco per 10 s.
- Trasferire il volume desiderato di emolinfa (vale a dire, 10 µ l) e mescolare con 50 µ l di tampone salino insetto 1x.
- Centrifugare per 10 minuti a 1.000 x g a 4 ° C a girare giù emociti. Trasferire il surnatante in una provetta pulita microcentrifuga.
- Quantificare la concentrazione di proteine totali utilizzando uno spettrofotometro UV-Vis di micro-volume misurando A28015.
- Regolare ogni campione per avere la stessa concentrazione di proteina (6 mg / µ l di proteina totale).
-
Raccolta di succo del midgut
- Anestetizzare gli scarafaggi sul ghiaccio. Sistemare gli scarafaggi lato ventrale sulla piastra di dissezione con freddo 1x insetto Salina buffer mediante spilli entomologici.
- Sezionare l'addome con una pinzetta bene. Rimuovere l'intestino intero (compreso l'intestino anteriore, media e posteriore) per un piatto fresco con 1 x insetto tampone salino.
- Rimuovere l'intestino anteriore e posteriore e di trasferire velocemente midgut ad un tubo del microcentrifuge che contiene 100 µ l di tampone salino dell'insetto.
- Piscina l'intestino da sei scarafaggi nel tubo stesso e vortexare per 10 s.
- Centrifugare per 10 minuti a 1.000 x g a 4 ° C per rallentare gli emociti e tessuti di intestino. Trasferire il surnatante in una provetta pulita microcentrifuga.
- Quantificare la concentrazione di proteine totali utilizzando uno spettrofotometro UV-Vis di micro-volume misurando A28015.
- Regolare ogni campione per avere la stessa concentrazione di proteina (6 mg / µ l di proteina totale).
4. dsRNA degradazione Assay
- Appena preparare 4 µ l del dsRNA nudo o lipoplessi dsRNA (1 µ g).
- Mescolare il succo di dsRNA enzimi di soluzioni con 10 µ l di tampone salino dell'insetto (controllo), estratti dall'emolinfa, o del midgut.
- Aggiungere 2 µ l di EGTA (20 mM) o acqua RNAsi-libera per separare campioni come controlli per inibizione delle attività enzimatiche.
- Incubare per 1 ora o più a lungo (6, 12 o 24 ore) a 25 ° C.
- Aggiungere 200 µ l di reagente di estrazione e cloroformio 40 µ l, poi vortice.
- Centrifugare per 10 min a 13.000 x g a 4 ° C, quindi raccogliere il surnatante (150 µ l) in un nuovo tubo del microcentrifuge.
- Precipitare dsRNA aggiungendo 150 µ l isopropanolo e incubare per 15 minuti in ghiaccio.
- Centrifugare per 15 min a 13.000 x g a 4 ° C, quindi rimuovere il surnatante.
- Aggiungere 200 µ l di etanolo 70% per lavare dsRNA pellet. Centrifugare per 10 min a 13.000 x g a 4 ° C.
- Rimuovere l'etanolo e ripetere le fasi di lavaggio di etanolo.
- Rimuovere l'etanolo e asciutto dsRNA pellet da concentratori centrifughi vuoto per 3 min. Risospendere dsRNA con acqua RNAsi-libera di 10 µ l.
- Verificare l'integrità del dsRNA Trattato tramite elettroforesi su gel di agarosio 1.5%.
5. la somministrazione orale di dsRNA
- Mantenere gli scarafaggi su una dieta ad libitum di cibo secco (chow cane). Privare l'approvvigionamento idrico dagli scarafaggi un giorno prima gli esperimenti di ingestione di dsRNA.
- Tenere uno scarafaggio afferrando le ali con le pinze flessibili (Figura 1, punto 5).
Nota: Non afferrare le parti del corpo di scarafaggi. - Preparare il dsRNA lipoplessi, come pure di dsRNA nuda, per l'alimentazione, come descritto nella sezione 2.
Nota: Il dsRNA lipoplessi devono essere preparata fresca prima della poppata. - Alimentazione 4 µ l di dsRNA lipoplessi o nudo dsRNA (250 ng) con una micropipetta.
- Lentamente dispensare la goccia della soluzione dsRNA vicino all'apparato boccale di scarafaggi e lasciare che gli scarafaggi ingerire la goccia completamente.
- Eseguire gli esperimenti di ingestione due volte al giorno (1 h dopo luci su e 1 h prima luci spente) per 8 giorni o 16 giorni di continuo.
Nota: Tutte le blatte acquisito acqua solo tramite alimentazione manuale con reagenti soluzione o controllo di dsRNA (ad es., acqua gratuita nucleasi, soluzione di glucosio e reagente liposoma) durante gli esperimenti di ingestione. - Fornire bottiglie d'acqua per gli scarafaggi dopo 16 giorni di ingestione di dsRNA esperimenti.
6. valutare atterramento
- Al momento scelto punti (2, 9 e 17 giorni dopo il test di ingestione di dsRNA), raccogliere gli insetti dsEGFP - e dsTub-trattati e sezionare i tessuti selezionati (per esempio, del midgut).
- Eseguire PCR quantitativa in tempo reale (qRT-PCR). Le condizioni di amplificazione qRT-PCR e informazioni sul primer come riportato da Lin et al. (2017) 12.
- Valutare il controllo e il dsRNA-Trattato insetti ogni giorno per controllare la mortalità e rimuovere gli scarafaggi che sono più in movimento.
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Representative Results
Uno schema semplificato del protocollo per la somministrazione orale di dsRNA è presentato nella Figura 1, dove sono mostrati i passaggi chiave per la preparazione di dsRNA lipoplessi.
Al fine di indagare la protezione fornita dai vettori liposomi al degrado di dsRNA nel succo del midgut di b. germanica, un'analisi ex vivo in cui si svolse la dsTub lipoplessi sono state incubate con il succo del midgut e l'integrità del dsRNA successivamente è stato analizzato su gel di agarosio 1.5%. La figura 2 Mostra che forte attività di RNA nucleasi era presente nel succo del midgut di b. germanica (Figura 2A), mentre i vettori liposomi sono stati in grado di proteggere il dsRNA contro degradazione almeno per 1 ora in ex vivo incubazione (Figura 2A, B). Di conseguenza, l'ingestione orale di dsRNA lipoplessi è stato applicato due volte al giorno per aumentare la suscettibilità dei tessuti del midgut a RNAi nei seguenti esperimenti.
Convalida della risposta di RNAi attraverso la consegna orale di dsRNA è stata valutata misurando l'effetto di svuotamento vasca dell'espressione del mRNA nel midgut in diversi momenti dopo ingestione continua di dsRNA (Figura 3A). L'espressione di vasca nel midgut è stata vuotata significativamente dopo ingestione continua di dsTub lipoplessi per 8 giorni. Mentre l'alimentazione in continuo di dsRNA è durata 16 giorni, l'espressione di vasca nel midgut è stata vuotata significativamente nei gruppi di lipoplessi dsTub e dsTub nudo (approssimativamente da 24 e 60%, rispettivamente) in contrasto con i controlli. Figura 3 B Mostra un coerenza, significativo aumento della mortalità dopo la somministrazione orale di dsTub lipoplessi per 16 giorni.
Figura 1 : Schema semplificato di consegna orale di dsRNA lipoplessi per scarafaggi. Per i passaggi da 1 a 4 sono rappresentati i passaggi chiave per la preparazione di dsRNA lipoplessi. La tecnica d'alimentazione (passo 5) è mostrata nella foto. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Ex vivo degradazione di dsRNA da b. germanica emolinfa (Hemo) o succo di frutta del midgut. (A), 1 µ g della dsTub nudo o liposoma-cojugated è stato incubato per 1 h con tampone salino ed enzimi estratti dall'emolinfa (hemo) o succo di frutta del midgut, rispettivamente. La dsTub nuda, ma non coniugato liposoma dsTub, è stato degradato completamente quando incubati con 1x succo del midgut. Sono indicati i fattori di diluizione differente del succo originale del midgut (1x). La degradazione è stata inibita tramite chelazione dello ione dovuto il trattamento di EGTA come controllo. (B) protezione di tempo-dipendente del liposoma-incapsulato dsTub (1 µ g) contro il degrado ex vivo nel succo di emolinfa o del midgut. Della nota, la dsTub liposoma-coniugato è stato degradato completamente quando incubati con il succo del midgut dopo 24 h. Il succo del midgut ed emolinfa sono stati utilizzati nella concentrazione originale per diversi periodi di incubazione. I risultati sono adattati da Lin et al. (2017) 12. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Effetti della risposta di RNAi per ingestione di dsRNA su b. germanica. (A) PCR in tempo reale quantitativa (qRT-PCR) per determinare l'espressione relativa vasca nel midgut il tedesco scarafaggio dopo diversi trattamenti di alimentazione. I livelli di espressione di diversi trattamenti sono stati normalizzati per il gruppo di glucosio al giorno 2. I valori sono la media ± SE da tre esperimenti indipendenti (n = 3), ciascuno con 3-5 ripetizioni biologici. Diverse lettere sulle barre indicano differenze significative a p < 0.05 (ANOVA dopo il test di Tukey HSD Post Hoc) tra diversi gruppi di trattamento. (B) sopravvivenza degli scarafaggi che ingerita dsTub nudo o dsTub lipoplessi per 8 giorni (8D) o 16 giorni (16d) (ogni coorte di 12-15 individui; n = 3 esperimenti indipendenti). I valori sono la media ± SE. Different lettere nel gruppo di trattamento indicano differenze significative a p < 0,05 (test di Kruskal-Wallis) per la sopravvivenza. I risultati sono adattati da Lin et al. (2017) 12. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo protocollo presenta un metodo per RNAi efficace attraverso la consegna orale di dsRNA lipoplessi, che comprende la protezione contro la digestione di ribonucleasi nel succo del midgut il tedesco scarafaggio. Come dimostrato in altri studi in varie specie di insetti, l'effetto di RNAi povero attraverso la consegna orale di dsRNA è rappresentato principalmente dalla degradazione di dsRNA8,9,10. Questo protocollo produce liposomi che fungono da protezione veicoli in consegna orale di dsRNA contro degradazione nell'intestino. Inoltre, la preparazione di dsRNA lipoplessi è semplice e facilmente applicabile come RNAi orale, in particolare per gli insetti con attività ribonucleasica forte nell'intestino.
Rispetto ad altri studi che alimentano quantità relativamente elevate di dsRNA nuda in diversi insetti10,18,19, questo protocollo utilizza la somministrazione orale di una quantità relativamente bassa di dsRNA (0,5 µ g al giorno), che provoca una svuotamento significativo di espressione genica nel midgut di b. germanica. Aspetti cruciali del protocollo includono il metodo di alimentazione precisa e accumulato ingestione di piccole quantità di dsRNA. In primo luogo, la tecnica di alimentazione è adatta per un dosaggio di ingestione continua e riduce al minimo la variazione della quantità ingerita dsRNA per singolo insetto. In secondo luogo, l'effetto di svuotamento della vasca espressione nel midgut ha mostrato di aumentare dal 40% al giorno 9 a 60% al giorno 17 con somministrazione orale continuo di dsTub lipoplessi (Figura 3A). Sebbene il dsRNA nudo era rapidamente degradato con ex vivo incubazione del succo del midgut entro 1 h (Figura 2A), il carico continuo del dsRNA nuda per 16 giorni ha anche provocato uno svuotamento significativo di espressione di vasca nel midgut (Figura 3A). Inoltre, il periodo più lungo di alimentazione in continuo di dsRNA lipoplessi per 16 giorni è un requisito per causare un effetto letale cospicuo di RNAi.
Sebbene i vettori di liposomi (Vedi Tabella materiali) utilizzato qui erano originariamente per la transfezione in vitro del DNA in cellule di insetto, non c'era nessun problema con l'applicazione di questo reagente di liposomi come veicolo di dsRNA per somministrazione orale nel nostro modello di insetto. Molti studi hanno dimostrato con successo anche il miglioramento del silenziamento RNAi in altre specie di insetti utilizzando reagenti diversi liposoma, che sono progettati per DNA o RNA molecole17,20,21. Tuttavia, il meccanismo dell'assorbimento di dsRNA nell'intestino degli insetti non è ancora stato completamente studiato, e il sistema di consegna del liposoma potrebbe aumentare l'assorbimento di dsRNA nelle cellule, grazie alla sua biocompatibilità con fosfolipidi struttura22. Pertanto, la somministrazione orale di dsRNA incapsulato in liposomi potrebbe essere un'adeguata strategia per conseguire RNAi efficiente a causa del ritardo della degradazione di RNAsi (Figura 2).
Uno svantaggio di questo protocollo potrebbe essere la piccola quantità di dsRNA negli elementi portanti liposoma e così può richiedere lunghi periodi di alimentazione in continuo. La restrizione di un particolare rapporto tra dsRNA ai liposomi (0,25 µ l di µg:1) è a causa del design del reagente commerciale liposoma, secondo il suggerimento del produttore. Le formulazioni in preparazione dei liposomi nanoparticelle con dimensione di diametro più grande e la carica differente sulla superficie lipoplessi, sono segnalati per incrementare l'incapsulamento di siRNA e RNAi silenziamento efficienza23,24. Pertanto, le nanoparticelle di liposomi differenti possono essere utilizzate anche migliorare le procedure di alimentazione.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni da Taiwan (Ministero della scienza e della tecnologia, più 100-2923-B-002-002-MY3 e 106-2313-B-002-011-MY3 a H.J.L.), Repubblica Ceca (concedere Università Agenzia della Boemia meridionale, GAJU concedere 065/2017/P a Y.H.L) e Spagna ( Ministero spagnolo dell'economia e della competitività, concede CGL2012-36251 e CGL2015-64727-P a X.B. e il governo catalano, concedere 2014 SGR 619 a X.B.); ha inoltre ricevuto il sostegno finanziario del Fondo europeo economica e lo sviluppo regionale (fondi FEDER a X.B.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GenJe Plus DNA in vitro Transfection reagent | SignaGen | SL100499 | for lipoplexes preparation |
| Blend Taq plus | TOYOBO | BTQ-201 | for PCR |
| Fast SYBR Green Master Mix | ABI | 4385612 | for qPCR |
| FirstChoice RLM-RACE Kit | Invitrogen | AM1700 | for 3' UTR identification |
| MEGAscript T7 Transcription Kit | Invitrogen | AMB13345 | for dsRNA synthesis |
| TURBO DNase | Invitrogen | AM2239 | remove DNA template from dsRNA |
| TRIzol | Invitrogen | 15596018 | for dsRNA or total RNA extraction |
| RQ1 RNase-Free Dnase | Promega | M6101 | remove DNA template from total RNA |
| chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | for dsRNA or total RNA extraction |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | I9516 | for dsRNA or total RNA extraction |
| ethanol | Sigma-Aldrich | 24102 | for dsRNA or total RNA extraction |
| Diethyl pyrocarbonate, DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | for RNase free water preparation |
| glucose solution | Sigma-Aldrich | G3285 | for lipoplexes preparation |
| Sodium chloride, NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | insect saline buffer formula |
| Potassium chloride, KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | insect saline buffer formula |
| Calcium chloride, CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | insect saline buffer formula |
| Magnesium chloride hexahydrate, MgCl2.6H2O | Sigma-Aldrich | M2670 | insect saline buffer formula |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | enzyme inhibitor |
| dissecting scissor | F.S.T. | cockroach dissection | |
| fine tweezers | F.S.T. | cockroach dissection | |
| flexible tweezer | F.S.T. | cockroach holding | |
| pipetman | RAININ | P10 | sample preparation |
| microcentrifuge tube | Axygen | MCT175C, PCR02C | sample preparation |
| pipette tip | Axygen | sample preparation | |
| vortexter | Digisystem | vm1000 | sample preparation |
| Minispin centrifuge | The Gruffin Group | GMC 206 | for liquid spin down |
| Centrifuge | ALC | PK121R | sample preparation |
| pH meter | JENCO | 6071 | for pH adjust |
| micro-volume spectrophotometer | Quawell | Q3000 | nucleic acid quantitative |
| PCR Thermal cycler | ABI | 2720 | for template PCR or dsRNA synthesis incubation |
| quantitative real-time PCR | ABI | StepOne plus | gene expression quantitative |
| Centrifugal Vacuum Concentrators | eppendorf | 5301 | for dsRNA or total RNA extraction |
| Multipette | eppendorf | xstream | for real-time PCR sample loading |
| Agarose I | amresco | 0710 | for nucleic acid electrophoresis |
| tub gene specfifc forward preimer | tri-I biotech | GGG ACA AGC CGG AGT GCA GA | |
| tub gene specfifc reverse preimer | tri-I biotech | TCC TGC TCC TGT CTC GCT GA | |
| dsTub template forward primer | tri-I biotech | TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA CAA GCC GGA GTG CAG | |
| dsTub template reverse primer | tri-I biotech | TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT CCT GCT CCT GTC TCG CTG | |
| dsEGFP template forward preimer | tri-I biotech | TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT ATG GTG AGC AAG GGC GAG GAG | |
| dsEGFP template reverse preimer | tri-I biotech | TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT GGC GGA TCT TGA AGT TCA CC | |
| tub qPCR forward primer | tri-I biotech | GGA CCG CAT CAG GAA ACT GGC | |
| tub qPCR reverse preimer | tri-I biotech | CCA CAG ACA GCC TCT CCA TGA GC | |
| ef1 qPCR forward primer | tri-I biotech | CGC TTG AGG AAA TCA AGA AGG A | |
| ef1 qPCRreverse preimer | tri-I biotech | CCT GCA GAG GAA GAC GAA G |
References
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