Summary
Dette manuskriptet viser uttømming av byggkorn under midttarmen og blir av den tysk kakerlakk gjennom muntlig svelging av double-strandet innkapslet i liposomer.
Abstract
RNA-interferens (RNAi) har vært mye brukt for avdekke biologiske funksjonene til mange gener, og har vært forutsett som en pest kontroll verktøyet drift ved avbrudd av viktige genuttrykk. Selv om ulike metoder, for eksempel injeksjon, fôring og soaking, er rapportert for vellykket levering av double-strandet RNA (dsRNA), er effektiviteten av RNAi gjennom muntlig levering av dsRNA svært variabel blant annet insekt-grupper. Den tyske affinitet Blattella germanicaer svært følsom for injeksjon av dsRNA, som vist av mange studier publisert tidligere. Studien beskriver en metode for å demonstrere at dsRNA innkapslet med liposome bærere er tilstrekkelig for å retard nedbrytning av dsRNA av midttarmen juice. Spesielt kontinuerlig fôring av dsRNA innkapslet av liposomer betydelig reduserer det tubulin uttrykket i midttarmen og blir, og førte til døden av cockroaches. Avslutningsvis kan formulering og utnyttelse av dsRNA lipoplexes, som beskytter dsRNA mot nucleases, være en praktisk bruk av RNAi til insekt skadedyrbekjempelse i fremtiden.
Introduction
RNAi har vist som en effektiv metode for å pusse genuttrykk gjennom en mekanisme av en post-transcriptional stanse sti utløst av dsRNA molekyler i mange eukaryoter1. Det siste tiåret av studien, har RNAi blitt et nyttig verktøy å studere funksjonene av gener fra utvikling til oppførsel av tappe uttrykk for bestemte gener via injeksjon og/eller fôring av dsRNA i ulike arter av insekter2,3. Spesifisitet og robusthet tappe effekt vurderes anvendelse av RNAi nå som potensielle strategi for pest kontroll management4,5. Men varierer effektiviteten av RNAi mellom insekt arter, avhengig av de ulike genene målrettet og leveringsmetodene. En voksende mengde bevis antyder at ustabilitet i dsRNA, som er nedverdiget ved ribonucleases, er en kritisk faktor i begrenset effekten av RNAi5,6. For eksempel har den lave RNAi følsomheten i Manduca sexta blitt forklart av det faktum at dsRNA blandet med hemolymph var raskt dårligere innen 1 time7. Tilsvarende er tilstedeværelsen av alkalisk nucleases i midttarmen og blir, som effektivt redusere inntatt dsRNA, sterkt korrelert med lav RNAi effektivitet i forskjellige insekt bestillinger8,9,10.
Muntlig levering av dsRNA er spesielt interessant anvendelse av RNAi i en pest kontroll strategi, men en metode for å retard nedbrytning av dsRNA av nucleases i midttarmen og blir ikke ennå har utviklet, som ville ha potensial til å sikre effektiv RNAi gjennom fôring. Imidlertid har fungere bedre av RNAi muntlig levering av dsRNA blitt rapportert av fôring store mengder dsRNA, f.eks 50 µg i Bombyx mori, eller kontinuerlig mating 8 dager (8 µg dsRNA totalt) locust arter. Den tyske affinitet Blattella germinica, er svært følsom for RNAi av injeksjon av dsRNA11,12,13,14, men svarer ikke til dsRNA gjennom fôring. Lin et al. nylig (2017) har vist at dsRNA innkapslet med liposome bærere gir vellykket RNAi til knockdown genuttrykk α-tubulin i midttarmen og utløse betydelig dødeligheten av tysk kakerlakk15. Som nedbrytning av dsRNA i midttarmen og blir den begrensende faktoren for muntlig RNAi, tjene liposome bærere som et redskap for å beskytte dsRNA fra fornedrelse, som er lett tilgjengelig i andre insekter med sterk nuclease aktiviteter i tarmen. Av notatet, grunnen til å velge bestemt hva reagensen (se Tabell for materiale) vi brukte liposome transportør i gjeldende protokollen er at det er testet for insekt cellen linje transfection med mindre toksisitet, ifølge den produsentens instruksjoner. I henhold til sammenligning av ulike liposome transfection systemer i Gharavi et al. (2013) 16, effektiviteten av transfecting lite forstyrrende RNA (siRNA) er omtrent det samme mellom denne og andre tilgjengelige systemer som har vært brukt i dsRNA leveringssystemer i andre insekter17,18 . Videre er våre fôring metoden forsiktig nok til å sikre riktig mengde dsRNA blir svelget av hver kakerlakk, og at resultatene er robust og bekreftet. Oppsummert viser stede protokollen og resultatene at bruker dsRNA lipoplexes forbedrer dsRNA stabilitet og åpner døren til design av strategi muntlig levering av RNAi, som er en lovende tilnærming til skadedyrbekjempelse i fremtiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. syntese og forberedelse av dsRNA
- Identifisere dsRNA målområdene i 3 uoversatt regionen målet gener. DsTub brukes for målretting α-tubulin (badekar) genet (GenBank tiltredelse nummer: KX228233), og dsEGFP som en negativ dsRNA kontroll er designet av forbedret grønne fluorescens protein (EGFP; GenBank tiltredelse nummer: LC311024).
- Utføre standard PCR forsterkning for å syntetisere dsRNA maler med gene-spesifikke primer som inneholder T7 promoter sekvensen (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3 "). PCR forsterkning betingelsene og primer-informasjon som brukes er de rapporterte av Lin et al. (2017) 12 (se Tabell for materiale).
- Fortsette med dsRNA forberedelse på en T7 transkripsjon Kit (se Tabell for materiale), følg produsentens instruksjoner.
Merk: Å gi høy mengde dsRNA, blande to reaksjoner i en tube (i totalt 40 µL) og ruge på 37 ° C over natten. - Legge til 2 µL av DNase (se Tabell for materiale) i dsRNA prøvene i 15 min på 37 ° C digest DNA maler.
- Legge til 200 µL utvinning reagens (se Tabell for materiale) og 40 µL kloroform, så vortex.
- Sentrifuge for 10 min 13 000 x g på 4 ° C, og deretter samle nedbryting (150 µL) i en ny microcentrifuge tube.
- Utløse dsRNA ved å legge 150 µL isopropanol og rugende i 15 min på is.
- Virvel i 15 min 13 000 x g på 4 ° C, og deretter fjerner nedbryting.
- Legge til 200 µL av 70% etanol å vaske dsRNA pellets. Sentrifuge for 10 min 13 000 x g på 4 ° C.
- Fjern etanol og gjenta etanol vask.
- Fjerne etanol og tørr dsRNA pellets av sentrifugal vakuum konsentratorene for 3 min, og resuspend dsRNA med RNase-fritt vann.
- Bestemme mengden av det renset dsRNA bruker et micro-volum UV-Vis spektrofotometer (se Tabell for materiale) i henhold til produsentens instruksjoner og Juster til ønsket konsentrasjonen (f.eks, 0,25 µg/µL for utarbeidelse av dsRNA lipoplexes).
- Lagre dsRNA samples ved 20 ° C for inntil 3 måneder.
2. forberedelse av dsRNA Lipoplexes
- Fortynne 4 µL av transfection reagensen (se Tabell for materiale) ved å legge 4 µL av 5% glukose løsning. Fortynne 4 µL av dsRNA (1 µg) ved å legge 4 µL av 5% glukose løsning.
- Legge til umiddelbart utvannet liposome reagens løsningen i utvannet dsRNA løsningen samtidig. Vortex kort å blande dem, så ruge i 15 min på 25 ° C.
Merk: Bland ikke løsninger i omvendt rekkefølge. - DsRNA lipoplexes er klar til bruk. Bruk innen 1 time forberedelser, og forkaste etter 1 time.
Merk: I henhold til produsentens instruksjoner, bør lipoplexes brukes så snart som mulig.
3. samling av ekstracellulære enzymer fra Hemolymph og midttarmen Juice
-
Insekt saltvann buffer (10 x lager)
- Bland 900 mL dobbel destillert vann med 109.3 g NaCl, 15,7 g KCl, 6,3 g CaCl2og 8.3 g MgCl2·6H2O.
- Justere pH til 6,8, og fyll opp til 1000 mL.
-
Hemolymph samling
- Bedøve cockroaches på is inntil de ikke flytte i 3 minutter.
- Hold kakerlakk med to fingre (tommelen og pekefingeren), og snu ventrale av kakerlakk opp.
- Bruk den dissecting saks for å kutte tipset en hofte av en bakben ben.
Merk: Kuttet tilkoblede skjæringspunktet mellom hofte og trochanter. Eksisjon av den andre delen av hofte var mindre effektivt å samle hemolymph. - Klemmer magen forsiktig med langfingeren, og samle hemolymph blødning fra i snitt 10 µL brønnene med.
- Basseng hemolymph fra flere cockroaches (5 personer) i et microcentrifuge rør.
Merk: Hold microcentrifuge rør på is for å hindre melanization. Gjennomsnittlig antall hemolymph fra en mannlig kakerlakk er 2-3 µL. - Nedspinning hemolymph kort med en Borstemmaskin sentrifuge for 10 s.
- Overføre ønsket antall hemolymph (dvs., 10 µL) og bland det med 50 µL 1 x insekt saltvann bufferen.
- Sentrifuge for 10 min 1000 x g på 4 ° C å spinne ned hemocytes. Overføre nedbryting slik rent microcentrifuge.
- Kvantifisere totale protein konsentrasjonen med et micro-volum UV-Vis spektrofotometer ved å måle A28015.
- Juster hver prøve å ha samme protein konsentrasjonen (6 mg/µL totale protein).
-
Midttarmen juice samling
- Bedøve cockroaches på is. Fikse cockroaches ventral side opp på disseksjon tallerkenen med kaldt 1 x insekt saltvann buffer ved hjelp insekt pinner.
- Dissekere magen med fine pinsett. Fjerne hele tarmen (inkludert front, midt og bakben tarmen) til en frisk rett med 1 x insekt saltvann buffer.
- Fjern forsiden og bakben tarmen, og raskt overføre midttarmen og blir til et microcentrifuge rør som inneholder 100 µL insekt saltvann buffer.
- Pool midguts fra seks cockroaches i samme rør og vortex for 10 s.
- Sentrifuge for 10 min 1000 x g på 4 ° C å spinne ned hemocytes og gut vev. Overføre nedbryting slik rent microcentrifuge.
- Kvantifisere totale protein konsentrasjonen med et micro-volum UV-Vis spektrofotometer ved å måle A28015.
- Juster hver prøve å ha samme protein konsentrasjonen (6 mg/µL totale protein).
4. dsRNA fornedrelse analysen
- Fersk forberede 4 µL av nakne dsRNA eller dsRNA lipoplexes (1 µg).
- Bland dsRNA løsninger med 10 µL av insekt saltvann buffer (kontroll), utvunnet enzymer fra hemolymph eller midttarmen juice.
- Legg 2 µL EGTA (20 mM) eller RNase-fritt vann å skille prøver som kontroller for hemming av enzymet aktiviteter.
- Ruge på 1 time eller lengre (6, 12 eller 24 timer) på 25 ° C.
- Legge til 200 µL utvinning reagens og 40 µL kloroform, deretter vortex.
- Sentrifuge for 10 min 13 000 x g på 4 ° C, og deretter samle nedbryting (150 µL) i en ny microcentrifuge tube.
- Utløse dsRNA ved å legge 150 µL isopropanol og rugende i 15 min på is.
- Virvel i 15 min 13 000 x g på 4 ° C, og deretter fjerner nedbryting.
- Legge til 200 µL av 70% etanol å vaske dsRNA pellets. Sentrifuge for 10 min 13 000 x g på 4 ° C.
- Fjern etanol og gjenta etanol vask.
- Fjern etanol og tørr dsRNA pellets av sentrifugal vakuum konsentratorene for 3 min. Resuspend dsRNA med 10 µL RNase-fritt vann.
- Kontroller integriteten til behandlet dsRNA via gel geleelektroforese på en 1,5% agarose gel.
5. peroral administrering av dsRNA
- Opprettholde cockroaches på en ad libitum kosthold tørr mat (hunden chow). Frata vannforsyning fra cockroaches dagen før dsRNA inntak eksperimenter.
- Hold en kakerlakk fanget vingene med fleksible tang (figur 1, trinn 5).
Merk: Ikke ta kroppsdeler av cockroaches. - Forberede dsRNA lipoplexes, i tillegg til nakne dsRNA, fôring, som beskrevet i del 2.
Merk: DsRNA-lipoplexes bør være forberedt fersk tidligere mate. - Mate 4 µL dsRNA lipoplexes eller naken dsRNA (250 ng) med brønnene.
- Sakte Pipetter slippverktøyet dsRNA løsningen nær munndelene av cockroaches, og la cockroaches ingest slippverktøyet helt.
- Utføre inntak eksperimenter to ganger om dagen (1t etter lysene på og 1 time før lys av) 8 dager eller 16 dager sammenhengende.
Merk: Alle cockroaches kjøpt vann gjennom manuell mating med dsRNA løsning eller kontroll reagenser (f.eks, nuclease gratis vann, glukose løsning og liposome reagens) under svelging eksperimenter. - Gi vannflasker til cockroaches etter 16 dager med inntak av dsRNA eksperimenter.
6. vurdere Knockdown
- På valgt tidspunkt poeng (2, 9 og 17 dager etter dsRNA inntak analysen), samle dsEGFP - og dsTub-behandlet insekter og dissekere valgte vev (f.eks, midttarmen).
- Utføre kvantitativ sanntid PCR (qRT-PCR). QRT PCR forsterkning betingelsene og primer informasjon som rapportert av Lin et al. (2017) 12.
- Vurdere kontroll og dsRNA-behandlet insekter daglig sjekke dødelighet og fjerne cockroaches som ikke lenger flytter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En forenklet plan for protokollen for muntlig levering av dsRNA vises i figur 1, der de viktigste trinnene for utarbeidelse av dsRNA lipoplexes er vist.
For å undersøke beskyttelse gitt av liposome operatører på dsRNA fornedrelse i midttarmen juice B. germanica, ex vivo analysen der dsTub lipoplexes ble inkubert med midttarmen juice var gjennomført og integriteten til dsRNA senere ble analysert på en 1,5% agarose gel. Figur 2 viser at sterke RNA nuclease aktivitet var tilstede i B. germanica (figur 2A), midttarmen appelsinjuice mens liposome bærere kunne beskytte dsRNA mot nedbrytning minst 1 time i ex vivo inkubering (figur 2A, B). Resultatet ble av oralt inntak av dsRNA lipoplexes brukt to ganger om dagen for å øke mottakelighet av midttarmen vev å RNAi i følgende eksperimenter.
Validering av RNAi svar gjennom muntlig levering av dsRNA ble vurdert ved å måle uttømming effekten av badekar mRNA uttrykk i midttarmen og blir på ulike tidspunkt etter kontinuerlig inntak av dsRNA (Figur 3A). Badekar uttrykket i midttarmen og blir var betydelig utarmet etter kontinuerlig inntak av dsTub lipoplexes i 8 dager. Mens kontinuerlig fôring av dsRNA varte 16 dager, badekar uttrykket i midttarmen og blir betydelig var oppbrukt i naken dsTub og dsTub lipoplexes grupper (omtrent ved 24 og 60%, henholdsvis) i motsetning til kontrollene. Figur 3 B viser en konsekvent, betydelig økning av dødelighet etter peroral administrering av dsTub lipoplexes 16 dager.
Figur 1 : Forenklet ordningen muntlig levering av dsRNA lipoplexes for cockroaches. De viktigste trinnene for utarbeidelse av dsRNA lipoplexes representeres for trinn 1 til 4. Fôring teknikken (trinn 5) vises i bildet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Ex vivo nedbrytning av dsRNA av B. germanica hemolymph (Hemo) eller midttarmen juice. (A) 1 µg av den nakne eller liposome-cojugated dsTub ble inkubert 1t med saltvann buffer og utdraget enzymer fra hemolymph (hemo) eller midttarmen juice, henholdsvis. Den naken dsTub, men ikke liposome-konjugerte dsTub, ble degradert helt når inkubert med 1 x midttarmen juice. De ulike fortynning faktorene av den opprinnelige midttarm juicen (1 x) angis. Nedbrytning ble hemmet av ion chelation på grunn av EGTA behandling som en kontroll. (B) tidsavhengige beskyttelse av liposome innkapslet dsTub (1 µg) mot ex vivo degradering hemolymph eller midttarmen. Av notatet, var liposome-konjugerte dsTub degradert helt når inkubert med midttarmen juice etter 24 timer. Hemolymph og midttarmen saften ble brukt i den opprinnelige konsentrasjonen for ulike tidsperioder med inkubering. Resultatene er tilpasset fra Lin et al. (2017) 12. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Effekter av RNAi respons ved inntak av dsRNA på B. germanica. (A) Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) for determining the relative tub expression in the midgut of the German cockroach after different feeding treatments. Uttrykket nivåer av ulike behandlinger var normalisert glukose gruppen på dag 2. Er de gjennomsnittlig ± SE fra tre uavhengige eksperimenter (n = 3), hver med 3-5 biologiske gjentak. Forskjellige bokstaver på barer indikerer betydelige forskjeller på p < 0,05 (ANOVA etter Tukeys "HSD" Post Hoc test) blant annen behandling. (B) Survivorship av cockroaches som inntatt naken dsTub eller dsTub lipoplexes i 8 dager (8 d) eller 16 dager (16 d) (hver kohort av 12-15 personer, n = 3 uavhengige eksperimenter). Er de gjennomsnittlig ± SE. forskjellige bokstaver på behandlingsgruppe indikerer betydelige forskjeller på p < 0,05 (Kruskal-Wallis test) for survivorship. Resultatene er tilpasset fra Lin et al. (2017) 12. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
This protocol presents a method for effective RNAi through oral delivery of dsRNA lipoplexes, involving protection against ribonuclease digestion in the midgut juice of the German cockroach. Som vist i andre studier i ulike insekt arter, er dårlig RNAi effekten gjennom muntlig levering av dsRNA hovedsakelig regnskapsføres etter nedbrytning av dsRNA8,9,10. Denne protokollen gir liposomer tjene som beskyttende biler i muntlig levering av dsRNA mot fornedrelse i tarmen. I tillegg er utarbeidelsen av dsRNA lipoplexes enkel og lett gjeldende som muntlig RNAi, spesielt for insekter med sterk ribonuclease aktivitet i tarmen.
Sammenlignet med andre studier som feed relativt store mengder naken dsRNA i ulike insekter10,18,19, denne protokollen bruker peroral administrering av en relativt lav mengde dsRNA (0,5 µg per dag), som fører til en betydelig uttømming av målet genuttrykk i midttarmen og blir av B. germanica. Viktige aspekter av protokollen inkluderer presis fôring metoden og akkumulert inntak av små mengder dsRNA. Først fôring teknikken er egnet for en kontinuerlig inntak analysen og reduserer variasjonen av inntatt dsRNA antallet per personlige insekt. Andre ble uttømming effekten av badekar uttrykk i midttarmen og blir vist å øke fra 40% på dag 9 til 60% i dag 17 med kontinuerlig peroral administrering av dsTub lipoplexes (Figur 3A). Selv om den nakne dsRNA ble raskt degradert med ex vivo inkubering av midttarmen saft inne 1 h (figur 2A), resultert kontinuerlig fôring av nakne dsRNA 16 dager også i en betydelig uttømming av badekar uttrykk i midttarmen (Figur 3A). Videre er lengre kontinuerlig mating av dsRNA lipoplexes 16 dager et krav til en iøynefallende dødelig effekt av RNAi.
Men liposome bærere (se Tabell for materiale) brukt her var opprinnelig i vitro transfection DNA i insekt celler, var det ingen problem å bruke denne liposome reagensen som et redskap for dsRNA for muntlig levering i insekt modellen. Mange studier har også vist forbedring av RNAi stanse i andre insekt arter med forskjellige liposome reagenser, som er utviklet for DNA eller RNA molekyler17,20,21. Likevel, mekanismen av dsRNA opptak i insekt tarmen har ikke ennå blitt helt studert og liposome leveringssystemet kan øke opptaket av dsRNA inn i celler, på grunn av sin biocompatibility med phospholipid struktur22. Derfor kan oral levering av dsRNA innkapslet i liposomer være en passende strategi å oppnå effektiv RNAi på grunn av retardasjon nedbrytningsprodukter av RNases (figur 2).
En ulempe med denne protokollen kan være den lille mengden av dsRNA i liposome bærere, og dermed krever lengre perioder med kontinuerlig mating. Begrensning av slike et bestemt forhold mellom dsRNA til liposome (0,25 µg:1 µL) er design av kommersielle liposome reagens, ifølge produsentens forslag. Formuleringer i utarbeidelsen av liposome nanopartikler med større diameter, og ulike kostnaden på lipoplexes overflaten, rapporteres å øke innkapsling av siRNA og RNAi stanse effektivitet23,24. Derfor kan ulike liposome nanopartikler også brukes til å forbedre fôring prosedyrer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av tilskudd fra Taiwan (departementet for vitenskap og teknologi, mest 100-2923-B-002-002-MY3 og 106-2313-B-002-011-MY3 til H.J.L.), den tsjekkiske republikk (gi byrå av Sør-Böhmen University, GAJU gi 065 2017 inngående Y.H.L), og Spania ( Spanske departementet for økonomi og konkurranseevne, gir CGL2012-36251 og CGL2015-64727-P til X.B., og den katalanske regjeringen, gi 2014 SGR 619 til X.B.); Det har også mottatt økonomisk støtte fra europeiske fondet for økonomiske og regionaldepartementet (ble tildelt und midler til X.B.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GenJe Plus DNA in vitro Transfection reagent | SignaGen | SL100499 | for lipoplexes preparation |
| Blend Taq plus | TOYOBO | BTQ-201 | for PCR |
| Fast SYBR Green Master Mix | ABI | 4385612 | for qPCR |
| FirstChoice RLM-RACE Kit | Invitrogen | AM1700 | for 3' UTR identification |
| MEGAscript T7 Transcription Kit | Invitrogen | AMB13345 | for dsRNA synthesis |
| TURBO DNase | Invitrogen | AM2239 | remove DNA template from dsRNA |
| TRIzol | Invitrogen | 15596018 | for dsRNA or total RNA extraction |
| RQ1 RNase-Free Dnase | Promega | M6101 | remove DNA template from total RNA |
| chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | for dsRNA or total RNA extraction |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | I9516 | for dsRNA or total RNA extraction |
| ethanol | Sigma-Aldrich | 24102 | for dsRNA or total RNA extraction |
| Diethyl pyrocarbonate, DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | for RNase free water preparation |
| glucose solution | Sigma-Aldrich | G3285 | for lipoplexes preparation |
| Sodium chloride, NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | insect saline buffer formula |
| Potassium chloride, KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | insect saline buffer formula |
| Calcium chloride, CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | insect saline buffer formula |
| Magnesium chloride hexahydrate, MgCl2.6H2O | Sigma-Aldrich | M2670 | insect saline buffer formula |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | enzyme inhibitor |
| dissecting scissor | F.S.T. | cockroach dissection | |
| fine tweezers | F.S.T. | cockroach dissection | |
| flexible tweezer | F.S.T. | cockroach holding | |
| pipetman | RAININ | P10 | sample preparation |
| microcentrifuge tube | Axygen | MCT175C, PCR02C | sample preparation |
| pipette tip | Axygen | sample preparation | |
| vortexter | Digisystem | vm1000 | sample preparation |
| Minispin centrifuge | The Gruffin Group | GMC 206 | for liquid spin down |
| Centrifuge | ALC | PK121R | sample preparation |
| pH meter | JENCO | 6071 | for pH adjust |
| micro-volume spectrophotometer | Quawell | Q3000 | nucleic acid quantitative |
| PCR Thermal cycler | ABI | 2720 | for template PCR or dsRNA synthesis incubation |
| quantitative real-time PCR | ABI | StepOne plus | gene expression quantitative |
| Centrifugal Vacuum Concentrators | eppendorf | 5301 | for dsRNA or total RNA extraction |
| Multipette | eppendorf | xstream | for real-time PCR sample loading |
| Agarose I | amresco | 0710 | for nucleic acid electrophoresis |
| tub gene specfifc forward preimer | tri-I biotech | GGG ACA AGC CGG AGT GCA GA | |
| tub gene specfifc reverse preimer | tri-I biotech | TCC TGC TCC TGT CTC GCT GA | |
| dsTub template forward primer | tri-I biotech | TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA CAA GCC GGA GTG CAG | |
| dsTub template reverse primer | tri-I biotech | TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT CCT GCT CCT GTC TCG CTG | |
| dsEGFP template forward preimer | tri-I biotech | TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT ATG GTG AGC AAG GGC GAG GAG | |
| dsEGFP template reverse preimer | tri-I biotech | TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT GGC GGA TCT TGA AGT TCA CC | |
| tub qPCR forward primer | tri-I biotech | GGA CCG CAT CAG GAA ACT GGC | |
| tub qPCR reverse preimer | tri-I biotech | CCA CAG ACA GCC TCT CCA TGA GC | |
| ef1 qPCR forward primer | tri-I biotech | CGC TTG AGG AAA TCA AGA AGG A | |
| ef1 qPCRreverse preimer | tri-I biotech | CCT GCA GAG GAA GAC GAA G |
References
- Hammond, S. M. Dicing and slicing: The core machinery of the RNA interference pathway. FEBS Lett. 579, 5822-5829 (2005).
- Bellés, X. Beyond drosophila: RNAi in vivo and functional genomics in insects. Annu. Rev. Entomol. 55, 111-128 (2010).
- Wynant, N., Santos, D., Vanden Broeck, J. Chapter Five - Biological Mechanisms Determining the Success of RNA Interference in Insects. International Review of Cell and Molecular Biology. Jeon, K. W. 312, Academic Press. 139-167 (2014).
- San Miguel, K., Scott, J. G. The next generation of insecticides: dsRNA is stable as a foliar-applied insecticide. Pest Manag. Sci. 72, 801-809 (2016).
- Scott, J. G., et al. Towards the elements of successful insect RNAi. J. Insect Physiol. 59, 1212-1221 (2013).
- Joga, M. R., Zotti, M. J., Smagghe, G., Christiaens, O. RNAi efficiency, systemic properties, and novel delivery methods for pest insect control: What we know so far. Front. Physiol. 7, (2016).
- Garbutt, J. S., Bellés, X., Richards, E. H., Reynolds, S. E. Persistence of double-stranded RNA in insect hemolymph as a potential determiner of RNA interference success: Evidence from Manduca sexta and Blattella germanica. J. Insect Physiol. 59, 171-178 (2013).
- Arimatsu, Y., Kotani, E., Sugimura, Y., Furusawa, T. Molecular characterization of a cDNA encoding extracellular dsRNase and its expression in the silkworm, Bombyx mori. Insect Biochem. Mol. Biol. 37, 176-183 (2007).
- Wang, K., et al. Variation in RNAi efficacy among insect species is attributable to dsRNA degradation in vivo. Insect Biochem. Mol. Biol. 77, 1-9 (2016).
- Wynant, N., et al. Identification, functional characterization and phylogenetic analysis of double stranded RNA degrading enzymes present in the gut of the desert locust, Schistocerca gregaria. Insect Biochem. Mol. Biol. 46, 1-8 (2014).
- Huang, J. -H., Belles, X., Lee, H. -J. Functional characterization of hypertrehalosemic hormone receptor in relation to hemolymph trehalose and to oxidative stress in the cockroach Blattella germanica. Exp. Endocrinol. 2, 114 (2012).
- Lin, Y. -H., Lee, C. -M., Huang, J. -H., Lee, H. -J. Circadian regulation of permethrin susceptibility by glutathione S-transferase (BgGSTD1) in the German cockroach (Blattella germanica). J. Insect Physiol. 65, 45-50 (2014).
- Lozano, J., Kayukawa, T., Shinoda, T., Belles, X. A role for taiman in insect metamorphosis. PLOS Genet. 10, 1004769 (2014).
- Lozano, J., Montañez, R., Belles, X. MiR-2 family regulates insect metamorphosis by controlling the juvenile hormone signaling pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. 112, 3740-3745 (2015).
- Lin, Y. -H., Huang, J. -H., Liu, Y., Belles, X., Lee, H. -J. Oral delivery of dsRNA lipoplexes to German cockroach protects dsRNA from degradation and induces RNAi response. Pest Manag. Sci. 73, 960-966 (2017).
- Gharavi, J., et al. Chiral cationic polyamines for chiral microcapsules and siRNA delivery. Bioorg. Med. Chem. Lett. 23, 5919-5922 (2013).
- Whyard, S., Singh, A. D., Wong, S. Ingested double-stranded RNAs can act as species-specific insecticides. Insect Biochem. Mol. Biol. 39, 824-832 (2009).
- Luo, Y., et al. Differential responses of migratory locusts to systemic RNA interference via double-stranded RNA injection and feeding. Insect Mol. Biol. 22, 574-583 (2013).
- Liu, J., Smagghe, G., Swevers, L. Transcriptional response of BmToll9-1 and RNAi machinery genes to exogenous dsRNA in the midgut of Bombyx mori. J. Insect Physiol. 59, 646-654 (2013).
- Airs, P. M., Bartholomay, L. C. RNA interference for mosquito and mosquito-borne disease control. Insects. 8, 4 (2017).
- Taning, C. N. T., et al. Oral RNAi to control Drosophila suzukii: Laboratory testing against larval and adult stages. J. Pest Sci. 89, 803-814 (2016).
- Wu, S. Y., McMillan, N. A. J. Lipidic systems for in vivo siRNA delivery. AAPS J. 11, 639-652 (2009).
- Tam, Y. Y. C., Chen, S., Cullis, P. R. Advances in lipid nanoparticles for siRNA delivery. Pharmaceutics. 5, 498-507 (2013).
- Xia, Y., Tian, J., Chen, X. Effect of surface properties on liposomal siRNA delivery. Biomaterials. 79, 56-68 (2016).
