Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Проверка роли применим плазмид в эволюции антибиотикорезистентности

Published: May 2, 2018 doi: 10.3791/57386
Automatic Translation
1,2, 3, 4
1Department of Animal Health, Universidad Complutense de Madrid, 2Visavet Health Surveillance Centre, Universidad Complutense de Madrid, 3Department of Zoology, University of Oxford, 4Department of Microbiology, Hospital Universitario Ramon y Cajal (IRYCIS) and CIBERESP

Summary

Здесь мы представляем экспериментальный метод для проверки роли применим плазмид в эволюции к антибиотикам.

Abstract

Применим плазмиды прокариот чрезвычайно изобилуют, но их роль в бактериальных эволюция по-прежнему осознаются. Недавно мы показали, что увеличение числа копии гена в ячейке, представленной применим плазмид может ускорить эволюцию генов плазмида кодировке. В этой работе мы представляем экспериментальная система для тестирования применим плазмид способность содействовать эволюции ген. С помощью простых молекулярной биологии методов, мы построили модель системы, где ген устойчивости к антибиотикам может быть вставлен в Escherichia coli MG1655, хромосомы или на применим плазмиды. Мы используем подход экспериментальной эволюции для распространения различных штаммов под все возрастающей концентрации антибиотиков и мы измеряем выживания бактериальных популяций с течением времени. Выбор антибиотиков молекулы и сопротивление гена — так, что ген может лишь придать сопротивление путем приобретения мутаций. Этот подход «эволюционная спасения» предоставляет простой метод для проверки потенциала применим плазмиды для содействия приобретению устойчивости к антибиотикам. На следующем шаге экспериментальной системы характеризуются молекулярные основы устойчивости к антибиотикам. Для выявления мутаций отвечает за приобретение антибиотикорезистентности мы используем глубокая секвенирования ДНК образцов, полученных из всего населения и клоны. Наконец чтобы подтвердить роль мутаций в гене под исследование, мы восстановить их в родительский фон и проверить сопротивление фенотип результате штаммов.

Introduction

Устойчивость к антибиотикам у бактерий является серьезной медицинской проблемой1. На фундаментальном уровне распространение устойчивости к антибиотикам болезнетворных бактерий является простой пример эволюции путем естественного отбора2,3. Проще говоря, использование антибиотиков генерирует выбор для устойчивых штаммов. Ключевой проблемой в эволюционной биологии, поэтому, необходимо понять, какие факторы, которые влияют на способность развиваться устойчивость к антибиотикам бактериальных популяций. Выбор эксперименты появились как очень мощный инструмент для расследования эволюционной биологии бактерий, и это поле дало невероятные идеи в широкий спектр эволюционных проблемы4,5,6. В экспериментальной эволюции бактериальных популяций, инициированных из одного родительского штамма серийно пассированной определенных и жестко контролируемых условиях. Некоторые мутации, происходящие во время роста этих культур увеличения бактериальной фитнес, и они распространяются через культур путем естественного отбора. В ходе эксперимента образцы населения периодически криогенно сохраняются для создания не развивается замороженных окаменелостей. Широкий ряд подходов может использоваться для характеристики развивается бактериальных популяций, но наиболее распространенными методами являются два фитнес анализов, которые измеряют развивались бактерий способность конкурировать против их далеких предков и всего генома, что используется для идентификации генетические изменения что адаптация привода. После новаторскую работу Ричард Ленский и коллеги7,8, стандартный подход в экспериментальной эволюции был бросить вызов сравнительно небольшое количество реплицировать населения (обычно < 10) с адаптации к новой экологические проблемы, например новых источников углерода, температуры или хищных ФАГ.

Инфекции, вызванные устойчивых к антибиотикам бактерий стать большой проблемой, когда сопротивление является достаточно высоким, что это не возможно для увеличения концентрации антибиотиков для смертельными уровнями в тканях пациента. Поэтому врачи заинтересованы в что позволяет бактериям развиваться сопротивления для высоких доз антибиотиков, которые превышают этот порог концентрации антибиотиков, клинической точки останова. Как учиться это экспериментально? Если небольшое количество бактериальных популяций оспариваются с высокой дозы антибиотика, как в стиле Ленски эксперимент, то наиболее вероятный результат является что антибиотик будет диск все населения к вымиранию. В то же время если доза антибиотика, который используется низкий, ниже минимальной ингибирующее концентрации (MIC) штамма родителей, то маловероятно что бактериальных популяций будет развиваться клинически значимых уровней сопротивления, особенно если сопротивление влечет за собой большие издержки. Один компромисс между этими двумя сценариями заключается в использовании10,9,эксперимент «эволюционная спасения»11. В этом подходе, очень большое количество культур (обычно > 40) оспаривается с дозы антибиотиков, которые увеличивают над временем, обычно путем удвоения концентрации антибиотиков каждый день12. Отличительной чертой этого эксперимента является, что население, которое не развиваться повышенное сопротивление будет управляться на вымирание. Большинство населения, которые оспариваются таким образом будет определяться вымерли, но незначительное меньшинство будет сохраняться меняющимися высокий уровень сопротивления. В этой статье мы покажем, как этот экспериментальный дизайн может использоваться для изучения применим плазмида вклад в развитие сопротивления.

Бактерии приобретают устойчивость к антибиотикам через два основных маршрутов, хромосомных мутаций и приобретение мобильных генетических элементов, главным образом плазмид13. Плазмиды играть ключевую роль в эволюции антибиотикорезистентности, потому что они способны переносить гены резистентности бактерий путем конъюгации14,15. Плазмиды можно разделить на две группы в зависимости от их размера и биология: «маленькие», с высоким копии номер в бактериальной клетке и «большой», с низкой скопировать номер16,17. Роль крупных плазмид в эволюции антибиотикорезистентности был хорошо документированы, потому что они включают сопряженных плазмиды, которые являются ключевыми факторами распространения сопротивления и сопротивления multi среди бактерий15. Малые применим плазмиды также чрезвычайно распространены в бактерии17,18, и они часто код для генов антибиотикорезистентности19. Однако в меньшей степени была изучена роль малых применим плазмид в эволюции антибиотикорезистентности.

В недавней работе мы предложили, что применим плазмид может ускорить эволюцию генов, которую они несут путем увеличения скорости мутации гена из-за большего числа копии гена в ячейке12. С штамм E. coli MG1655 и β-лактамаз гена блаТЭМ-1 с использованием экспериментальной модели было показано, что применим плазмид ускорить темпы появления мутаций ТЭМ-1, присвоении сопротивление третьего поколения Цефтазидим цефалоспоринов. Эти результаты показали, что применим плазмиды могут играть важную роль в эволюции к антибиотикам.

Здесь мы представляем подробное описание метода, мы разработали расследовать применим при посредничестве плазмида эволюции к антибиотикам. Этот метод имеет три различных этапа: во-первых, включение гена изучается в применим плазмида или хромосому бактерии хозяина. Во-вторых использование экспериментальной эволюции (эволюционной спасения) оценить потенциал различных штаммов адаптироваться к селективного давления. И в-третьих, определение молекулярные основы, лежащие в основе плазмид опосредованной эволюции, с помощью ДНК секвенирования и реконструкции подозреваемых мутации индивидуально в родительский генотипа.

Наконец хотя для изучения эволюции антибиотикорезистентности, был разработан протокол, описанные здесь, можно утверждать, что этот метод может быть вообще полезным для анализа эволюции инноваций, приобретена мутации в любой multicopy кодировке плазмид ген.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. строительство экспериментальной системы кодирования генов антибиотикорезистентности

Примечание: Здесь E. coli MG1655 был использован в качестве получателя штамм генов антибиотикорезистентности плазмида или хромосома кодировке. Устойчивость к антибиотикам ген закодированы в хромосомы или применим плазмида в противном случае isogenic штамм (рис. 1).

  1. Вставки антибиотикорезистентности гена в λ Фаговые интеграции сайта (attB)20 хромосоме MG1655.
    1. Усилить 500 bp Лонг регионов по обе стороны от хромосомных attB сайта методом ПЦР. Используйте олигонуклеотиды YbhC-F (5'-CCTGTACCGTACAGAGTAAT-3') и attB-R (5'-GCCCGCCACCCTCCGGGCCGGTATAAAAAAGCAGGCTTCA-3') для левой гомологии региона и attB-F (5'-AGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTATACTAACTTGAGCGAAA-3') и YbhB/R (5'- TGGCGATAATATTTCACCGC-3') для правильный. Усилить гена сопротивления блаТЭМ-1 , с помощью грунтовки ТЭМ1 pBAD-F (5'-TGAAGCCTGCTTTTTTATACCGGCCCGGAGGGTGGCGGGC-3') и ТЭМ1 pBAD-R (5'-TTTCGCTCAAGTTAGTATAAGGAGCGGGCGCTAGGGCGCT-3'). Дизайн грунты с приблизительно 20 bp (в 5' конца) показаны взаимодополняемости на фрагмент, что собирается быть слиты в последовательности.
    2. Предохранитель гомологии регионов к антибиотикам ген продукт PCR (включая его промоутер региона) с использованием изотермических Ассамблеи21, при 50 ° C за 30 мин.
    3. Electroporate MG1655 клеток, содержащих плазмида pKOBEG.
      Примечание: pKOBEG является термочувствительных вектор, содержащий λ красные машины, поощрение основанных на гомологии аллельные обменов между хромосомы и ПЦР продукты22.
      1. Использовать 1 мкл продукта от шаг 1.1.223 40 мкл electrocompetent клеток в 2 мм кюветы на 4 ° C и 2,5 кв. Ресуспензируйте клеток в 1 мл бульона LB + 0,2% арабинозы поддерживать выражение λ красные машины.
      2. Общий объем передать трубку отцентрифугировать и проинкубируйте 2 ч при 30 ° C (разрешительный температура для pKOBEG) с интенсивной тряски (200 об/мин в орбитальный шейкер) для обеспечения фенотипические выражения маркеров сопротивления, вставляется в хромосоме.
      3. Пластина клетки на агаре LB, содержащие соответствующие антибиотик для выбора для антибиотикам ген (ампициллин или carbenicillin на 100 мг/л для блаТЭМ-1).
    4. Пластина 100 мкл на одной чашке Петри и спина вниз остальной объем, Ресуспензируйте в 100 мкл свежие LB отвара и пластины на другой чашке Петри. Инкубируйте на ночь на 42 ° C.
      Примечание: Эта температура не разрешительной для репликации pKOBEG. Колонии способны расти в таких условиях будет потеряли pKOBEG и представит генов сопротивления, интегрированы в сайт attB (для простоты будет называться этот штамм MG1655::реса здесь).
    5. Тест для потери pKOBEG путем репликации колоний интерес в плитах с хлорамфениколом (антибиотик, против которого pKOBEG содержит маркер сопротивления).
      Примечание: Отсутствие роста в хлорамфеникол пластины разрешительной температуре 30 ºC свидетельствует об отсутствии плазмиды.
    6. Чтобы проверить клоны, PCR усиливает строительства, с использованием внешних праймеры YbhC-Экстерн (5'-TTTGTGACCAGAAGACCGCA-3') и YbhB-Экстерн (5'-CTCATCAGTAACGATCTGCG-3'), проверить путем электрофореза геля правильный размер ампликон и последовательности очищенный продукт чтобы убедиться, что последовательность гена вставлена правильно.
  2. Вставьте генов антибиотикорезистентности в применим плазмиды.
    Примечание: Поскольку плазмид с числа сверхвысокого копии, как правило, навязать большого сокращения в бактериальных принимающей фитнес, мы рекомендуем использовать применим плазмид природного происхождения репликации, таких как p3655 (pSU18T-pBADgfp2, ColE1-тип происхождения 24репликации). Эти плазмиды обычно представляют ряд умеренных копии около 15-20 копий в клетку.
    1. ПЦР усилить генов антибиотикорезистентности выбора (включая промоутер региона), фосфорилировать продукт PCR и перевязать в ПЦР усиливается костяк плазмида:
      1. PCR усиливает устойчивость к антибиотикам ген; для блаТЭМ-1 используют грунтовки ТЭМ1 pBAD-F (5'-TGAAGCCTGCTTTTTTATACCGGCCCGGAGGGTGGCGGGC-3') и ТЭМ1 pBAD-R (5'-TTTCGCTCAAGTTAGTATAAGGAGCGGGCGCTAGGGCGCT-3').
      2. Фосфорилировать очищенный продукт с помощью T4 полинуклеотид киназы, следуя инструкциям производителя.
      3. ПЦР усилить плазмиду позвоночника с использованием высокоточных полимеразы и олигонуклеотидов pBAD-F (5'-CGTTGATCGGCACGTAAGAG-3') и pBAD-R (5'-AAACGACGGCCAGTGCCAAG-3').
      4. Перевязать обоих ПЦР фрагментов с помощью T4-лигаза следование рекомендациям производителя.
    2. Electroporate, как описано ранее, 40 мкл electrocompetent E. coli DH5-α клеток с максимум 1 мкл лигирование продукта и выберите соответствующие антибиотики для антибиотикам ген (ампициллин или carbenicillin на 100 мг/Л для блаТЭМ-1) и плазмиды позвоночника.
      Примечание: Дополняющего LB с арабинозы здесь нет необходимости.
    3. Экстракт плазмида с использованием коммерческих мини-готовит комплект Выбор читателя:
      1. Урожай 5 мл на ночь культуры центрифугированием при 12000 x g при комнатной температуре. Ресуспензируйте клетки в 250 мкл раствора ресуспендирования и хорошо перемешать. 250 мкл раствора лизис и хорошо перемешать. 350 мкл нейтрализации и хорошо перемешать.
      2. Передача супернатант в столбце привязки ДНК, комплект, центрифуги за 1 мин и отбросить через поток. Мыть дважды столбец с 500 мкл моющего раствора, центрифугирование на одну минуту и отменяя проточные при каждом мытье. Центрифуга пустой столбец 1 дополнительных минут для удаления остаточного Отмывающий буфер.
      3. Место столбца в чистой трубку и добавьте 50 мкл ультра-чистой воды к мембране элюировать очищенная ДНК. Центрифуги для 1-2 мин и собирать, через который поток содержит очищенные плазмид. Сэнгер последовательность гена интереса в плазмиду с праймерами от за пределами вставленные последовательность для подтверждения, что последовательность является правильным и что нет мутации присутствуют в гене сопротивления до эволюции экспериментов.
    4. После проверки последовательности electroporate плазмид в штамм E. coli MG1655, как описано выше.
      Примечание: Это дает штамм MG1655/Преса.

2. Эволюционная спасения подход к экспериментально развиваться к антибиотикам (рис. 1)

  1. Полоса из штаммов изучается на ФУНТ пластин: MG1655::реса и MG1655/Преса плюс восприимчивы родительский сорт, MG1655.
    Примечание: Плазмида pRESA должно быть стабильным в MG1655, поэтому нет необходимости для добавления антибиотиков фунтов пластин. Скорости мутации в E. coli являются достаточно низкими, так как только строительство проверяется это не нужно проверить плазмида последовательности на каждом шагу.
  2. Подготовить 96-луночных пластины с 200 мкл фунтов в каждой скважине и прививать 48 изолированной колонии каждого штамма в независимых скважин (одна пластина на штамм). Инкубируйте пластины на ночь при 37 ° C и 200 об/мин. Храните замороженные запас этих основатель групп населения.
    Примечание: Для предотвращения и контроля для культуры перекрестное загрязнение в 96-луночных пластин, используемых дизайн плита клетчатый вставочный привитых скважин с бактерии, свободной среде на протяжении 96-луночных пластины. Используйте этот дизайн пластине в течение всей экспериментальной эволюции.
  3. Запустите эксперимент эволюционной спасения, пересевать 2 мкл от каждой скважины пластин с основатель населения в новых 96-луночных пластины с 198 мкл фунтов в каждой скважине с sub-inhibitory концентрация антибиотика в исследование. Для эволюционной спасения подхода начинаются с ¼ или 1/8 минимальный тормозной концентрации (MIC, определено ранее25) антибиотика в LB для каждого из трех штаммов и удвоить концентрацию антибиотиков ежедневно. Используйте этот подход, чтобы максимизировать шансы населения приобретать сопротивление мутации26. Инкубируйте пластин при 37 ° C и 200 rpm для 20 h.
    Примечание: Измерения на ночь ОД основатель населения. Если имеются существенные различия среди штаммов в ОД исправьте первоначальный посевным материалом, чтобы начать эксперимент с же количество ячеек на хорошо.
  4. Каждый день, измерить ОД каждого населения после ночи культуры и выполнить передачу культур, как описано в разделе 2.3, чтобы новые 96-луночных пластины с двойной концентрации антибиотика, чем за день до. Инкубируйте пластины 20 ч при 37 ° C и 200 об/мин.
    Примечание: Коэффициент разбавления 1: 100 производит около 6-7 поколений в день.
  5. Параллельно распространять контроля населения каждого штамма в тех же условиях, как описано в 2.3 и 2.4, но в отсутствие антибиотиков.
    Примечание: Населения управления поможет различать мутации, возникающие вследствие наличия антибиотиков и общих мутаций, помогая бактерий адаптироваться к экспериментальных условиях. Параллельные мутации, возникающие в отсутствие антибиотиков, скорее всего будут помогать бактерий адаптироваться к экспериментальных условий и не связанные с устойчивостью к антибиотикам.
  6. Отслеживать количество сохранившихся популяций каждый день путем измерения поглощение на длине волны 600 Нм (OD) культур с помощью пластины читателя.
    Примечание: Значения оптической плотности меньше 0,1 указывают вымирание населения. Смотрите Рисунок 2 пример кривых выживания.
  7. Храните замороженные запас всего населения периодически (каждые 3-5 дней).
  8. Используйте журнал ранг тесты [пакет «выживания» в RStudio (версия 0.99.486)] для определения статистических различий в выживание населения различных штаммов со временем под повышение концентрации антибиотиков12.
    Примечание: Этот эксперимент будет определять, если применим плазмид полифункциональное эволюции к антибиотикам для конкретного антибиотика и гена под исследование.

3. молекулярные основы эволюции к антибиотикам (рис. 1)

  1. Выполнение общей экстракции ДНК от представителя количество населения и клоны различных штаммов и лечения. Включить родительский штаммов (MG1655, MG1655::реса и MG1655/Преса) чтобы иметь возможность обнаружить мутации, накапливается в ходе эксперимента.
    Примечание: Примеры извлечения ДНК комплекты таблица материалов. Каждый набор имеет различные протоколы; Следуйте инструкциям производителей.
  2. Количественную оценку качества ДНК и концентрации. Существуют различные методы для определения качества ДНК и концентрации. Определите качество измерения коэффициенты поглощения 260 Нм/280 Нм и 260 Нм/230 Нм. Использование флуоресцентных, ДНК связывающих краситель для измерения концентрации ДНК, следуя инструкциям производителя, и электрофорез геля агарозы подтвердить, что это не деградации ДНК или РНК загрязнения.
  3. Использование глубокой секвенирования ДНК от образцов всего населения и отдельных клонов для изучения генетической основы устойчивости к антибиотикам.
    Примечание: Мы провели все последовательности в центре доверять Уэллком генетики человека, Оксфорд, Великобритания. Более подробную информацию см. в Сан-Миллан и др. 201612.
  4. Использование конвейера27,в breseq 0.26.128 для обнаружения мутаций, использование полиморфизма режим для оценки частоты мутаций в популяциях. Сравните различные развивались геномов родителей генома для обнаружения мутаций, которые накопились за время эксперимента.
  5. Сравните мутации накопленных параллельно в населенностях управления с деятельностью населения развивалась под увеличением концентрации антибиотиков для различения мутации, помогая бактерий адаптироваться к общим экспериментальных условий ( те нашли в населенностях управления) и тех, кто причастен к антибиотикам (те нашли исключительно в популяциях, антибиотик давление).
    Примечание: Количество параллельных мутации обычно низкий, так что можно легко оценить различные параллельные мутаций между процедурами. Помимо мутации в гене антибиотикам под исследование, что вполне вероятно найти другие мутации, связанные с антибиотикорезистентности в хромосоме, такие перегласовки в porins или измеряем систем12.
  6. Реконструировать мутации в гене антибиотикорезистентности в родительский сорт, используя тот же подход, как и раздел 1 данного протокола. Выполните пункты 1.1 и 1.2 протокола представить новые мутации в родительский фон (с помощью развивались гены как шаблон ПЦР). Анализируйте антибиотикорезистентности фенотипы этих новых конструкций для подтверждения роли мутаций.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

В нашей предыдущей работы была исследована эволюция β-лактамаз гена блаТЭМ-1 на присвоении сопротивление третьего поколения цефалоспоринов Цефтазидим12 . Этот ген был выбран потому, что, хотя ТЭМ-1 не дает сопротивление цефтазидим, мутации в blaТЭМ-1 можно расширить спектр деятельности ТЕА-1 для гидролизуют цефалоспорины, такие как Цефтазидим29. Мутации в антибиотикам ферментов, таких как β-лактамаз или аминогликозидов, изменяя ферментов приводит к изменениям в их спектр деятельности являются общие29,30. Эта экспериментальная система идеально подходит для изучения эволюции этого типа ферментов. Подробный отчет о успешный эксперимент после этого протокола смотрите Сан-Миллан и др. 201612.

Здесь пример возможных результатов этой экспериментальной системы представлен проиллюстрировать протокол (Обратите внимание, что данные, используемые для этого примера не является реальной). Для изучения потенциальной роли multicopy плазмид в эволюции к антибиотикам ген под учиться в этом примере (назовем его реса), мы разрабатываем экспериментальной системы, после раздела 1 протокола, описанных выше. Эксперименты производят трех штаммов: MG1655, MG1655::реса и MG1655/Преса. Эволюция сопротивления для двух разных β лактамные антибиотики (Цефтазидим и меропенем) был опробован следующие шаги, описанные в разделе 2 протокола. Рисунок 2 показывает кривых выживания населения исследуемого. В этом примере, является значительное увеличение выживания населения, принадлежащих к MG1655/Преса развивается в цефтазидим, по сравнению с теми из MG1655 или MG1655::реса (лог ранг тест, P< 0,05). С другой стороны, в случае меропенем, есть никаких существенных различий в выживание населения, принадлежащих к разных штаммов (лог ранг тест, P> 0.05). Таким образом эти результаты показывают, что присутствие гена реса в применим плазмида потенцирует развитие сопротивления цефтазидим, но не меропенем.

На заключительном этапе эксперимента молекулярные основы антибиотикорезистентности исследуется, как описано в разделе 3 протокола. Во-первых секвенирование ДНК будет выявить мутации в реса , который мог бы отвечать за сопротивление фенотип. И во-вторых, реконструкция реса мутаций в родительских MG1655 (как в хромосоме и плазмиды) будет подтвердить или отменить их роль на фенотип антибиотикорезистентности.

Figure 1
Рисунок 1 . Схематическое представление различных этапов протокола. Слева направо: (i) строительство экспериментальной системы: MG1655, MG1655::реса и MG1655/Преса. Бактериальная хромосома представлена в Браун, плазмида синим цветом и resA гена в красном. (ii) эволюционной спасения подход к экспериментально развиваться устойчивость к антибиотикам: несколько популяций различных штаммов, распространяются под увеличением концентрации антибиотика. (iii) анализ молекулярные основы устойчивости к антибиотикам: секвенирования ДНК образцов из развивались населения и клоны, определение наличия мутаций антибиотикорезистентности и реконструкции этих мутаций в родительский сорт. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2. Кривых выживания с увеличением концентрации антибиотиков. Представление числа жизнеспособных популяций, принадлежащие штаммов MG1655, MG1655::ресаи MG1655/Преса с течением времени. 48 населения каждого штамма были переданы под повышение концентраций антибиотиков цефтазидим и меропенем, начиная с 1/8 микрофон на 1 день и удвоения концентрации антибиотиков каждый день. Красная пунктирная вертикальная линия представляет MIC антибиотиков под исследование. Обратите внимание, что в случае Цефтазидим существуют значительные различия в выживание населения, принадлежащих к разных штаммов со временем (лог ранг тест, P< 0,05). Очень важно только населения, перевозящих плазмида способны выживать до высокого уровня концентрации антибиотика. С другой стороны, в случае меропенем, есть никаких существенных различий в выживание различных групп населения с течением времени (лог ранг тест, P> 0.05). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Мы представляем новый протокол, молекулярной биологии, экспериментальной эволюции и глубокой секвенирования ДНК, предназначенные для расследования роли применим плазмид в эволюции к антибиотикам у бактерий. Хотя этот протокол сочетает в себе методы из разных областей, все методы, необходимые для разработки его просты и могут быть выполнены в лаборатории регулярно микробиологии. Наиболее важные шаги в протоколе вероятно являются строительство модели системы штаммов и реконструкция мутаций, наблюдается после экспериментальной эволюции (которые выполняются точно тем же способом). Однако изотермические Ассамблея системы21, существенно упрощает этот протокол, так что любой пользователь с промежуточным уровнем опыта в области молекулярной биологии можно реализовать его.

Еще один важный шаг протокола является экспериментальной эволюции под все возрастающей концентрации антибиотиков. В качестве примера этот протокол начинается эксперимент с ¼-1/8 микрофон штаммов и затем удвоения концентрации антибиотика каждый день. Однако более низкий уровень антибактериальной изменения может увеличить вероятность эволюционного спасение от вымирания26. Таким образом скорость изменения концентрации антибиотиков является одним из параметров, которые могут быть изменены для поощрения развития устойчивости к антибиотикам.

Секвенирование ДНК и анализа также являются ключевыми аспектами планирования эксперимента. Результаты более просты при виртуализации выполняется на образцы ДНК как от всего населения, так и от отдельных клонов, в разное время точках в эксперименте. Секвенирование результаты от населения будет выявить общие различия в профилях мутаций среди лечения, избирательное зачисток полезных мутаций со временем и потенциальных событий клоновых вмешательства. При анализе последовательностей от населения, это лучше для фильтрации мутации, которые никогда не превысил 10% частоты в любой популяции. Последовательности от индивидуальных клонов помогают подтвердить результаты, полученные от населения и, самое главное, выявить конкретные комбинации между различных мутаций, наблюдается на уровне населения. Эти конкретные ассоциации могут помочь раскрыть epistatic взаимодействий между мутации, которые играют решающую роль в бактериальных адаптации31.

С помощью этого метода, мы недавно показали, что применим плазмид ускорить развитие устойчивости к антибиотикам, сначала путем увеличения частоты появления новых мутаций, а затем путем усиления эффекта мутации вследствие увеличения гена дозировка12 . Таким образом мы разработали метод как инструмента для изучения эволюции к антибиотикам, но он может иметь гораздо более широкий спектр приложений. А именно эта система может использоваться для расследования любых бактериальных генов способность развиваться в направлении новой или усовершенствованной функции, в более общем виде. Эта система может использоваться, например, для проверки способности метаболические фермента/путь для использования новых углеродных подложках32. Кроме того, она может быть использована вместо hypermutators (бактерии с дефектом в клеточных системах, участвующих в репарации ДНК несоответствие) для изучения эволюции адаптивных гена в бактерий, избегая мутационного предвзятости, представленный hypermutators.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана Instituto de Salud Карлоса III (план Estatal де я + D + я 2013-2016 гг.): гранты, CP15-00012, PI16-00860 и CIBER (CB06/02/0053), финансируется совместно Европейским фондом регионального развития '' способ достижения Европы '' (ERDF). JAE поддерживается Atracción де Таленто программы правительства региона Мадрид (2016-T1/био-1105) и I + D Джубая испанской Ministerio де Economía, Industria y развитию (BIO2017-85056-P). ASM поддерживается Мигель Сервет стипендий от Институту Salud Карлоса III (MS15/00012) финансируется Европейским социальным фондом «Инвестиции в ваше будущее» (ЕСФ) и ЕФРР.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Thermocycler BioRad C1000
Electroporator BiorRad 1652660
Electroporation cuvettes Sigma-Aldrich Z706078
NanoDrop 2000/2000c Thermo Fisher Scientific ND-2000 Determine DNA quality measuring the ratios of absorbance 260nm/280nm and 260nm/230nm
Incubator Memmert UF1060
Incubator (shaker) Cole-Parmer Ltd SI500
Electrophoresis power supply BioRad 1645070 Agarose gel electrophoresis
Electrophoresis chamber BioRad 1704405 Agarose gel electrophoresis
Pippettes Biohit 725020, 725050, 725060, 725070
Multi-channel pippetes Biohit 728220, 728230,
728240
Plate reader Synergy HTX BioTek BTS1LF
Inoculating loops Sigma-Aldrich I8388
96-well plates Falcon 351172
LB BD Difco DF0446-17-3
LB agar Fisher scientific BP1425-500
Phusion Polymerase Thermo Fisher Scientific F533S
Gibson Assembly New England Biolabs E2611S
Resctriction enzymes Fermentas FastDigest
Antibiotics Sigma-Aldrich
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27104 Plasmid extraction kit
Wizard Genomic DNA Purification Kit Promega A1120 gDNA extraction kit
DNeasy Blood & Tissue Kits Qiagen 69506 gDNA extraction kit
Electroporation cuvettes Sigma-Aldrich Z706078
Petri dishes Sigma-Aldrich D9054
Cryotubes ClearLine 390701
96-well plates (-80ºC storage) Thermo Fisher Scientific 249945
QuantiFluor dsDNA System Promega E2670 Quantification of DNA concentartion
Agarose BioRad 1613100 Agarose gel electrophoresis
50x TAE buffer BioRad 1610743 Agarose gel electrophoresis
T4 Polynucleotide Kinase Thermo Fisher Scientific EK0031
T4 DNA Ligase Thermo Fisher Scientific EL0014

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Neill, J. TACKLING DRUG-RESISTANT INFECTIONS GLOBALLY: FINAL REPORT AND RECOMMENDATIONS. Review on Antimicrobal Resistance. , (2016).
  2. Palmer, A. C., Kishony, R. Understanding, predicting and manipulating the genotypic evolution of antibiotic resistance. Nat Rev Genet. 14 (4), 243-248 (2013).
  3. MacLean, R. C., Hall, A. R., Perron, G. G., Buckling, A. The population genetics of antibiotic resistance: integrating molecular mechanisms and treatment contexts. Nat Rev Genet. 11 (6), 405-414 (2010).
  4. Buckling, A., Maclean, R. C., Brockhurst, M. A., Colegrave, N. The Beagle in a bottle. Nature. 457 (7231), 824-829 (2009).
  5. Barrick, J. E., Lenski, R. E. Genome dynamics during experimental evolution. Nature Reviews Genetics. 14 (12), 827-839 (2013).
  6. Elena, S. F., Lenski, R. E. Evolution experiments with microorganisms: The dynamics and genetic bases of adaptation. Nature Reviews Genetics. 4 (6), 457-469 (2003).
  7. Lenski, R. E., Rose, M. R., Simpson, S. C., Tadler, S. C. Long-Term Experimental Evolution in Escherichia coli. I. Adaptation and Divergence During 2,000 Generations. The American Naturalist. 138 (6), 1315-1341 (1991).
  8. Bennett, A. F., Dao, K. M., Lenski, R. E. Rapid evolution in response to high-temperature selection. Nature. 346 (6279), 79-81 (1990).
  9. Bell, G. Evolutionary rescue and the limits of adaptation. Philosophical Transactions of the Royal Society B-Biological Sciences. 368 (1610), (2013).
  10. Bell, G., Gonzalez, A. Adaptation and Evolutionary Rescue in Metapopulations Experiencing Environmental Deterioration. Science. 332 (6035), 1327-1330 (2011).
  11. Bell, G., Gonzalez, A. Evolutionary rescue can prevent extinction following environmental change. Ecology Letters. 12 (9), 942-948 (2009).
  12. San Millan, A., Escudero, J. A., Gifford, D. R., Mazel, D., MacLean, R. C. Multicopy plasmids potentiate the evolution of antibiotic resistance in bacteria. Nature Ecology & Evolution. 1, 0010 (2016).
  13. Alekshun, M. N., Levy, S. B. Molecular mechanisms of antibacterial multidrug resistance. Cell. 128 (6), 1037-1050 (2007).
  14. Ochman, H., Lawrence, J. G., Groisman, E. A. Lateral gene transfer and the nature of bacterial innovation. Nature. 405 (6784), 299-304 (2000).
  15. Carattoli, A. Plasmids and the spread of resistance. Int J Med Microbiol. 303 (6-7), 298-304 (2013).
  16. Smillie, C., Garcillán-Barcia, M. P., Francia, M. V., Rocha, E. P., de la Cruz, F. Mobility of plasmids. Microbiol Mol Biol Rev. 74 (3), 434-452 (2010).
  17. San Millan, A., Heilbron, K., Maclean, R. C. Positive epistasis between co-infecting plasmids promotes plasmid survival in bacterial populations. ISME J. , (2013).
  18. Stoesser, N., et al. Evolutionary History of the Global Emergence of the Escherichia coli Epidemic Clone ST131. MBio. 7 (2), (2016).
  19. San Millan, A., et al. Multiresistance in Pasteurella multocida is mediated by coexistence of small plasmids. Antimicrob Agents Chemother. 53 (8), 3399-3404 (2009).
  20. Escudero, J. A., et al. Unmasking the ancestral activity of integron integrases reveals a smooth evolutionary transition during functional innovation. Nat Commun. 7, 10937 (2016).
  21. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  22. Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (12), 6640-6645 (2000).
  23. Chaveroche, M. K., Ghigo, J. M., d'Enfert, C. A rapid method for efficient gene replacement in the filamentous fungus Aspergillus nidulans. Nucleic Acids Res. 28 (22), 97 (2000).
  24. Le Roux, F., Binesse, J., Saulnier, D., Mazel, D. Construction of a Vibrio splendidus mutant lacking the metalloprotease gene vsm by use of a novel counterselectable suicide vector. Appl Environ Microbiol. 73 (3), 777-784 (2007).
  25. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; 19th ed. Approved standard M100-S19. , Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA, USA. (2009).
  26. Lindsey, H. A., Gallie, J., Taylor, S., Kerr, B. Evolutionary rescue from extinction is contingent on a lower rate of environmental change. Nature. 494 (7438), 463-467 (2013).
  27. Deatherage, D. E., Barrick, J. E. Identification of mutations in laboratory-evolved microbes from next-generation sequencing data using breseq. Methods Mol Biol. 1151, 165-188 (2014).
  28. Barrick, J. E., et al. Identifying structural variation in haploid microbial genomes from short-read resequencing data using breseq. BMC Genomics. 15, 1039 (2014).
  29. Salverda, M. L., De Visser, J. A., Barlow, M. Natural evolution of TEM-1 β-lactamase: experimental reconstruction and clinical relevance. FEMS Microbiol Rev. 34 (6), 1015-1036 (2010).
  30. Ramirez, M. S., Tolmasky, M. E. Aminoglycoside modifying enzymes. Drug Resist Updat. 13 (6), 151-171 (2010).
  31. Jerison, E. R., Desai, M. M. Genomic investigations of evolutionary dynamics and epistasis in microbial evolution experiments. Current Opinion in Genetics & Development. 35, 33-39 (2015).
  32. Toll-Riera, M., San Millan, A., Wagner, A., MacLean, R. C. The Genomic Basis of Evolutionary Innovation in Pseudomonas aeruginosa. PLoS Genet. 12 (5), 1006005 (2016).

Tags

Генетика выпуск 135 плазмиды антибиотикорезистентности эволюция эволюционная спасения применим плазмид мутации экспериментальной эволюции
Проверка роли применим плазмид в эволюции антибиотикорезистентности
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Escudero, J. A., MacLean, R. C., San … More

Escudero, J. A., MacLean, R. C., San Millan, A. Testing the Role of Multicopy Plasmids in the Evolution of Antibiotic Resistance. J. Vis. Exp. (135), e57386, doi:10.3791/57386 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter