Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

בוחן את התפקיד של פלסמידים Multicopy באבולוציה של עמידות לאנטיביוטיקה

Published: May 2, 2018 doi: 10.3791/57386
Automatic Translation
1,2, 3, 4
1Department of Animal Health, Universidad Complutense de Madrid, 2Visavet Health Surveillance Centre, Universidad Complutense de Madrid, 3Department of Zoology, University of Oxford, 4Department of Microbiology, Hospital Universitario Ramon y Cajal (IRYCIS) and CIBERESP

Summary

כאן נציג של השיטה הניסיונית כדי לבחון את התפקיד של פלסמידים multicopy באבולוציה של עמידות לאנטיביוטיקה.

Abstract

פלסמידים multicopy נפוצים מאוד אאוקריוטים אך תפקידם באבולוציה חיידקי נשאר ממעטים להבין. לאחרונה הראינו כי העלייה במספר עותק גנטי בכל תא שסופקו על-ידי פלסמידים multicopy עלול להאיץ את האבולוציה של גנים פלסמיד מקודד. בעבודה זו, אנו מציגים מערכת ניסויית לבחון את היכולת של פלסמידים multicopy כדי לקדם את ג'ין האבולוציה. באמצעות שיטות בביולוגיה מולקולרית פשוטה, ואנחנו נבנה מערכת מודל שבו שניתן להוסיף של גנים עמידות לאנטיביוטיקה Escherichia coli MG1655, הכרומוזום או על פלסמיד multicopy. אנו משתמשים בגישה ניסויית האבולוציה כדי להפיץ זנים שונים תחת הגדלת ריכוזים של אנטיביוטיקה, אנו מודדים את ההישרדות של אוכלוסיות חיידקים לאורך זמן. הבחירה של המולקולה לאנטיביוטיקה ואת הגן ההתנגדות היא הגן יכול להתייעץ רק התנגדות באמצעות הרכישה של מוטציות. גישה זו "הצלה אבולוציונית" מספק שיטה פשוטה כדי לבחון את הפוטנציאל של פלסמידים multicopy לקדם הרכישה של עמידות לאנטיביוטיקה. בשלב הבא של מערכת ניסויית, מאופיינים הבסיסים מולקולרית של עמידות לאנטיביוטיקה. כדי לזהות מוטציות אחראי על הרכישה של עמידות לאנטיביוטיקה אנו משתמשים עמוק רצפי DNA של דגימות המתקבל באוכלוסיות שלמות, שיבוטים. לבסוף, כדי לאשר את התפקיד של מוטציות בגן שנבחנה, אנחנו לשחזר אותם על רקע הורים ובדוק את ההתנגדות פנוטיפ של זנים וכתוצאה מכך.

Introduction

עמידות לאנטיביוטיקה בחיידקים תהיה בעיה בריאות ור1. ברמה הבסיסית, ההתפשטות של עמידות לאנטיביוטיקה בחיידקים פתוגניים היא דוגמא פשוטה של אבולוציה על ידי הברירה הטבעית2,3. במילים פשוטות, השימוש באנטיביוטיקה יוצר מבחר זנים עמידים. בעיה מרכזיים בביולוגיה אבולוציונית, לכן היא להבין את הגורמים המשפיעים על היכולת של אוכלוסיות חיידקים לפתח עמידות לאנטיביוטיקה. מבחר ניסויים הופיעו בתור כלי רב עוצמה כדי לחקור את הביולוגיה האבולוציונית של חיידקים, שדה זה הפיק מדהים תובנות מגוון רחב של בעיות אבולוציונית-4,-5,-6. באבולוציה ניסיוני, אוכלוסיות חיידקים יזומות של זן הורים יחיד באופן סדרתי passaged בתנאים מגבילים והמוגדרים. חלק מוטציות להתרחש במהלך הצמיחה של תרבויות אלה להגדיל את כושר חיידקי, אלה מופצים דרך התרבויות על ידי הברירה הטבעית. במהלך הניסוי, דגימות של האוכלוסיות נשמרים מעת לעת cryogenically כדי ליצור שאינם הולכים ומתפתחים קפוא מאובנים רשומה. מספר רחב של גישות יכול לשמש כדי לאפיין המתפתחת אוכלוסיות חיידקים, אבל שתי השיטות הנפוצות ביותר הם מבחני כושר, המודדים את היכולת של החיידקים מפותחת כדי להתחרות נגד אבות מרוחק, רצף הגנום כולו, זה המשמש לזיהוי לשינויים גנטיים הסתגלות כונן זה. בעקבות עבודתו החלוצית על ידי ריצ'ארד לנסקי עמיתים7,8, כבר הגישה סטנדרטי באבולוציה ניסיוני לאתגר מספר קטן יחסית של אוכלוסיות שכפל (בדרך כלל < 10) עם הסתגלות חדשה אתגר סביבתי, כגון מקורות פחמן חדשים, טמפרטורה או של phage דורסנית.

זיהומים הנגרמים על ידי חיידקים עמידים בפני אנטיביוטיקה הופכים בעיה גדולה ההתנגדות היא גבוהה מספיק שזה לא אפשרי להגדיל בריכוזים אנטיביוטי לרמות קטלני ברקמות החולה. קלינאים מעוניינים ולכן מה מאפשר לחיידקים לפתח עמידות מינונים גבוהים של אנטיביוטיקה כי הם מעל סף הריכוז לאנטיביוטיקה, העצירה קליניים. איך ללמוד זאת השפעול? אם מספר קטן של אוכלוסיות חיידקים מאותגרים עם מינון גבוה של אנטיביוטיקה, כמו לנסקי-סגנון ניסוי, ואז התוצאה הסבירה ביותר היא כי האנטיביוטיקה לנהוג כל האוכלוסיות הכחדה. במקביל, אם המנה של אנטיביוטיקה המשמשת נמוכה, להלן ריכוז מעכבות מינימלי (MIC) של המתח הורים, אז זה לא סביר כי אוכלוסיות חיידקים תתפתח רמות הרלוונטית קלינית של התנגדות, במיוחד אם ההתנגדות נושא עלות גדולה. אחד פשרה בין שני תרחישים אלה היא להשתמש10,119,ניסוי "הצלה אבולוציונית". בגישה זו, מספר גדול מאוד של תרבויות (בדרך כלל > 40) נאלץ להתמודד עם מנות של אנטיביוטיקה להגדיל לאורך זמן, בדרך כלל על-ידי הכפלת ריכוז אנטיביוטיקה כל יום12. סימן ההיכר של הניסוי הזה היא כי כל התושבים לא להתפתח עמידות מוגברת תהיה מונעת הכחדה. רוב אוכלוסיות מאותגרים בדרך זו תהיה מונעת שנכחדו, אך מיעוט קטן יישמר על ידי מתפתח ברמות גבוהות של התנגדות. בנייר זה, אנו מראים איך עיצוב ניסיוני זה יכול לשמש כדי לחקור את תרומתו פלסמיד multicopy האבולוציה של עמידות.

חיידקים לרכוש עמידות לאנטיביוטיקה דרך שני מסלולים עיקריים, מוטציות כרומוזומליות, רכישת ניידת מרכיבים גנטיים, בעיקר פלסמידים13. פלסמידים לשחק תפקיד מפתח האבולוציה של עמידות לאנטיביוטיקה, כי הם מסוגלים להעביר גנים עמידות בין חיידקים על ידי ההטיה14,15. פלסמידים ניתן לחלק לשתי קבוצות על פי גודל וביולוגיה שלהם: "קטן", עם העתק גבוהה מספר לכל תא החיידק, "גדול", עם נמוך להעתיק16,מספר17. התפקיד של פלסמידים גדול באבולוציה של עמידות לאנטיביוטיקה תועד בהרחבה כי הם כוללים פלסמידים conjugative, אשר הם מניעי מפתח של הפצת ההתנגדות עמידות רב בקרב חיידקים15. פלסמידים multicopy קטנים גם הם נפוצים מאוד חיידקים17,18, הם לעיתים קרובות קוד עבור גנים עמידות לאנטיביוטיקה19. עם זאת, תפקידו של פלסמידים multicopy קטן של התפתחות של עמידות לאנטיביוטיקה נחקרה פחותה.

עבודה אחרונים, אנחנו הציע כי פלסמידים multicopy עלול להאיץ את האבולוציה של הגנים שהם נושאים על ידי הגדלת גנים מוטציה המחירים עקב מספר עותק גנטי גבוה יותר לכל תא12. באמצעות מדגם ניסיוני עם זן e. coli MG1655 הגן β לקטמאז בלהTEM-1 זה הוצג כי פלסמידים multicopy האצת הקצב של הופעת מוטציות TEM-1 היוועצות התנגדות הדור השלישי צפלוספורין ceftazidime. תוצאות אלו ציינו כי פלסמידים multicopy עשוי לשחק תפקיד חשוב באבולוציה של עמידות לאנטיביוטיקה.

כאן, אנו מציגים תיאור מפורט של השיטה פיתחנו לחקור את multicopy בתיווך פלסמיד האבולוציה של עמידות לאנטיביוטיקה. בשיטה זו יש שלושה שלבים שונים: הראשון, החדרת הגן שנבחנה על פלסמיד multicopy או הכרומוזום של החיידק המארח. שנית, שימוש ניסיוני האבולוציה (הצלה אבולוציונית) כדי להעריך את הפוטנציאל של זנים שונים כדי להתאים הלחץ הסלקטיבי. והשלישי, קביעת הבסיס המולקולרי שבבסיס בתיווך פלסמיד האבולוציה באמצעות DNA רצף, שיחזור של מוטציות חשד בנפרד גנוטיפ ההורים.

בסופו של דבר, למרות הפרוטוקול המתואר כאן תוכננה לחקור את התפתחות עמידות לאנטיביוטיקה, אפשר להתווכח כי שיטה זו יכול להיות שימושי בדרך כלל לנתח את האבולוציה של חידושים נרכשה על ידי מוטציות בכל multicopy פלסמיד מקודד ג'ין.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. בניית מערכת ניסויית קידוד גנטי עמידות לאנטיביוטיקה

הערה: כאן e. coli MG1655 שימש את המתח הנמען של הגן עמידות לאנטיביוטיקה פלסמיד או כרומוזום-מקודד. הגן עמידות לאנטיביוטיקה מקודד את הכרומוזום או על פלסמיד multicopy של זן isogenic אחרת (איור 1).

  1. החדרת הגן עמידות לאנטיביוטיקה λ phage שילוב האתר (attB)20 של הכרומוזום של MG1655.
    1. להגביר את האזורים bp באורך 500 משני צידי האתר כרומוזומלית attB על ידי ה-PCR. השתמש oligonucleotides YbhC-F (5'-CCTGTACCGTACAGAGTAAT-3') ו- attB-R (5'-GCCCGCCACCCTCCGGGCCGGTATAAAAAAGCAGGCTTCA-3') כדי להפוך את אזור הומולוגיה השמאלי attB-F (5'-AGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTATACTAACTTGAGCGAAA-3') ו- YbhB/R (5'- TGGCGATAATATTTCACCGC-3') עבור האדם הנכון. להגביר את הגן ההתנגדותTEM-1 בלהבאמצעות תחל Tem1-pBAD-F (5'-TGAAGCCTGCTTTTTTATACCGGCCCGGAGGGTGGCGGGC-3') ו- Tem1-pBAD-R (5'-TTTCGCTCAAGTTAGTATAAGGAGCGGGCGCTAGGGCGCT-3'). עיצוב תחל כ-20 bp (בסוף 5') של רצף מציג משלימים את החסר למקטע זה הולך להיות דבוקה.
    2. נתיך הומולוגיה אזורים למוצר ה-PCR גנים עמידות לאנטיביוטיקה (כולל והסביבה וכאמצעי) באמצעות הרכבה איזותרמי21, ב 50 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
    3. Electroporate MG1655 תאים pKOBEG פלסמיד המכיל.
      הערה: pKOBEG הוא וקטור thermosensitive המכיל את λ מכונות אדום, קידום מבוסס הומולוגיה חילופי allelic בין כרומוזום ה-PCR מוצרים22.
      1. השתמש µL 1 של המוצר של שלב 1.1.223 40 µL של תאים electrocompetent ב ביולוגיה מולקולרית 2 מ מ ב 4 ° C ו- 2.5 kV. Resuspend תאי 1 מ"ל של מרק LB + 0.2% אראבינוז כדי לשמור על הביטוי של λ מכונות אדום.
      2. להעביר את הנפח הכולל צינור microfuge, דגירה 2 h ב- 30 ° C (טמפרטורה מתירניות עבור pKOBEG) ברעידות אינטנסיבי (200 סל ד ב שייקר מסלולית) כדי לאפשר ביטוי פנוטיפי של הסמנים ההתנגדות מוכנס הכרומוזום.
      3. צלחת את התאים על אגר LB המכיל אנטיביוטיקה המתאימים כדי לבחור עבור הגן עמידות לאנטיביוטיקה (אמפיצילין או carbenicillin-100 mg/l עבור בלהTEM-1).
    4. צלחת µL 100 על אחד פטרי, ספין למטה שאר אמצעי האחסון, resuspend אותו ב- µL 100 מרק LB טריים, צלחת זה על אחר פטרי. דגירה בין לילה ב 42 º C.
      הערה: טמפרטורה זו היא בלתי-מתירניות עבור השכפול של pKOBEG. המושבות יוכל לגדול בתנאים אלו איבדו pKOBEG, יציג את הגן ההתנגדות משולב לתוך האתר attB (פשטות זן זה ייקרא MG1655::ריסה מכאן ואילך).
    5. מבחן על האובדן של pKOBEG על-ידי שכפול המושבות עניין בצלחות עם כלורמפניקול (האנטיביוטיקה נגד pKOBEG אשר מכיל סמן ההתנגדות).
      הערה: חוסר צמיחה כלורמפניקול צלחות בטמפרטורה ולקוד של 30 ºC הוא מעיד על העדר פלסמיד.
    6. על מנת לוודא שיבוטים, PCR להגביר את הבנייה באמצעות תחל החיצוני YbhC-מחלקת מיסוי וחשבונאות (5'-TTTGTGACCAGAAGACCGCA-3') ו- YbhB-מחלקת מיסוי וחשבונאות (5'-CTCATCAGTAACGATCTGCG-3'), לוודא באמצעות אלקטרופורזה בג'ל בגודל הנכון של אמפליקון ושל רצף מוצר מטוהרים כדי להבטיח רצף הגן שנוספו שהפרטים נכונים.
  2. הכנס את הגן עמידות לאנטיביוטיקה פלסמיד multicopy.
    הערה: כי פלסמידים עם מספר העתק גבוהה מאוד נוטים להטיל ירידה גדולה בכושר מארח חיידקי, אנו ממליצים על השימוש פלסמידים multicopy עם המקור הטבעי של שכפול, כגון p3655 (pSU18T-pBADgfp2, ColE1-סוג מקור שכפול24). פלסמידים אלה בדרך כלל להציג מספר עותק מתונה של 15-20 עותקים בכל תא.
    1. PCR להגביר את הגן עמידות לאנטיביוטיקה של בחירה (כולל אזור יזם), phosphorylate את המוצר PCR, מאתרים ומפסיקים את זה ל- backbone מוגבר-PCR של פלסמיד:
      1. PCR להגביר את הגן עמידות לאנטיביוטיקה; בלהTEM-1 לשימוש תחל Tem1-pBAD-F (5'-TGAAGCCTGCTTTTTTATACCGGCCCGGAGGGTGGCGGGC-3') ו- Tem1-pBAD-R (5'-TTTCGCTCAAGTTAGTATAAGGAGCGGGCGCTAGGGCGCT-3').
      2. Phosphorylate את המוצר מטוהרים באמצעות T4 polynucleotide קינאז, ההוראות של היצרן.
      3. PCR להגביר את עמוד השדרה פלסמיד באמצעות של אמינות גבוהה פולימראז ו oligonucleotides pBAD-F (5'-CGTTGATCGGCACGTAAGAG-3') ו- pBAD-R (5'-AAACGACGGCCAGTGCCAAG-3').
      4. מאתרים ומפסיקים בשני קטעים PCR באמצעות T4-ליגאז בעקבות הנחיות היצרן.
    2. Electroporate, כפי שתואר לעיל, µL 40 electrocompetent e. coli DH5-α תאים עם מספר מרבי של µL 1 של המוצר מצדו, בחר עם האנטיביוטיקה המתאימה עבור הגן עמידות לאנטיביוטיקה (אמפיצילין או carbenicillin-100 mg/L עבור בלהTEM-1), עמוד השדרה פלסמיד.
      הערה: שכשהם ליברות עם אראבינוז כאן אינה נחוצה.
    3. לחלץ את פלסמיד באמצעות ערכת הכנה מיני מסחרי של הבחירה של הקורא:
      1. הקציר 5 מ של תרבות לילה על ידי צריך שתוציאו ב g x 12,000 בטמפרטורת החדר. Resuspend תאי µL 250 resuspension פתרון ומערבבים היטב. להוסיף 250 µL של פירוק פתרון ומערבבים היטב. להוסיף 350 µL של ניטרול ומערבבים היטב.
      2. להעביר את תגובת שיקוע עמודת איגוד ה-DNA מסופק עם הקיט, צנטריפוגה עבור 1 דקות וזורקים את הזרימה. לשטוף פעמיים את העמודה עם 500 µL של כביסה פתרון, צריך שתוציאו לרגע אחד ומחיקת את flowthrough ברחיצת כל. Centrifuge את העמודה ריקה עבור 1 דקות נוספות להסיר את מאגר כביסה שיורית.
      3. מקם את העמודה צינור נקי ולהוסיף 50 µL של מים אולטרא טהורים הממברנה כדי elute את ה-DNA מטוהרים. צנטריפוגה למשך 1-2 דקות, לאסוף הזרימה זה מכיל את פלסמיד מטוהרים. סאנגר רצף הגן עניין ב- פלסמיד באמצעות תחל מ מחוץ הרצף שנוספו כדי לאשר כי הרצף הוא נכון כי אין מוטציות הן נוכח הגן התנגדות לפני הניסויים האבולוציה.
    4. לאחר שרצף אומתה, electroporate פלסמיד בנימה MG1655 e. coli , כמתואר לעיל.
      הערה: זה מניב זן MG1655/pRESA.

2. אבולוציונית הצלה הגישה להתפתח השפעול עמידות לאנטיביוטיקה (איור 1)

  1. פס החוצה זנים שנבחנה על צלחות LB: MG1655::ריסה MG1655/pRESA בתוספת המתח הורים רגישים, MG1655.
    הערה: פלסמיד pRESA צריך להיות יציב MG1655, כך שאין צורך להוסיף אנטיביוטיקה הלוחות ליברות. מוטציה ב- e. coli תעריפי נמוכה מספיק אז לאחר הבנייה אומתה זה לא הכרחי לוודא פלסמיד רצף בכל שלב.
  2. להכין 96-ובכן צלחות עם 200 µL של ליברות כל היטב, לחסן 48 מושבות המבודד של כל זן בבארות עצמאית (לוח אחד לכל זן). דגירה הלוחות בן לילה-37 ° C ו 200 סל ד. לשמור על מלאי קפוא של אוכלוסיות מייסד אלה.
    הערה: כדי למנוע, לשלוט על זיהום צולב תרבות לוחית 96-ובכן, יש להשתמש בעיצוב צלחת לוח שחמט על-ידי intercalating בארות חוסנו נטולי חיידקים בינונית ברחבי הבסיס 96-ובכן. להשתמש עיצוב זה צלחת במהלך האבולוציה הניסוי כולו.
  3. להתחיל את הניסוי הצלה אבולוציונית לחסן µL 2 מכל קידוח של הצלחות עם האוכלוסיות מייסד ב 96-ובכן את לוחיות הרישוי עם 198 µL של ליברות כל היטב עם ריכוז משנה המעכבת של אנטיביוטיקה שנבחנה. הגישה האבולוציונית הצלה להתחיל עם ¼ או 1/8 של ריכוז מעכבות מינימלי (מיקרופון, שנקבע בעבר25) של האנטיביוטיקה ב ליברות עבור כל אחד של שלושה זנים, להכפיל את הריכוז של היומון לאנטיביוטיקה. השתמש בגישה זו כדי להגדיל את הסיכויים של אוכלוסיות לרכוש התנגדות מוטציות26. דגירה הלוחות-37 ° C ו 200 סל ד עבור 20 h.
    הערה: למדוד OD לילה של האוכלוסיות מייסד. אם ישנם הבדלים משמעותיים בין זנים OD לתקן את inoculum הראשוני כדי להתחיל את הניסוי עם אותו מספר של תאים לכל טוב.
  4. כל יום, למדוד OD של כל אוכלוסייה לאחר לילה תרבות ולבצע העברה של התרבויות, כמתואר ב- 2.3, ללוחות 96-ובכן חדש עם להכפיל את הריכוז של אנטיביוטיקה מיום אתמול. דגירה הלוחות 20 h ב 37 ° C ו- 200 סל ד.
    הערה: הגורם דילול מטריים מייצרת כ 6-7 דורות לכל יום.
  5. במקביל, הפצת בקרה אוכלוסיות של כל זן באותם התנאים כפי שמתואר ב 2.3 ו- 2.4, אבל בהיעדרו של אנטיביוטיקה.
    הערה: בקרת אוכלוסיות תסייע להפלות בין מוטציות הנובעות בשל נוכחותם של אנטיביוטיקה, מוטציות כללי עוזר חיידקים להסתגל לתנאים ניסיוני. מוטציות מקבילות הנובעים בהיעדרו של אנטיביוטיקה הם נוטים לעזור חיידקים להסתגל לתנאים ניסיוני אינו קשור עמידות לאנטיביוטיקה.
  6. לעקוב אחר מספר אוכלוסיות ששרד בכל יום על ידי מדידת את ספיגת באורך-גל של 600 nm (OD) של התרבויות שימוש בקורא צלחת.
    הערה: צפיפות אופטית ערכים נמוכים מ- 0.1 מצביעים על הכחדה של האוכלוסייה. ראה איור 2 לקבלת דוגמה של הישרדות עקומות.
  7. לשמור על מלאי קפוא של כל האוכלוסיות מעת לעת (כל 3-5 ימים).
  8. השתמש במבחני יומן-דרגה [חבילה הישרדות RStudio (גירסה 0.99.486)] כדי לברר הבדלים סטטיסטיים ההישרדות של אוכלוסיות של זנים שונים לאורך זמן תחת הגדלת ריכוז של אנטיביוטיקה12.
    הערה: ניסוי זה יקבע אם פלסמידים multicopy פלאטין האבולוציה של עמידות לאנטיביוטיקה על אנטיביוטיקה מסוימת ועל ג'ין שנבחנה.

3. הבסיס המולקולרי של האבולוציה של עמידות לאנטיביוטיקה (איור 1)

  1. לבצע DNA הכולל, ושילוב מספר נציג של אוכלוסיות, שיבוטים על פני זנים וטיפולים. כולל זנים הורים (MG1655, MG1655::רסה , MG1655/pRESA) כדי להיות מסוגל לזהות מוטציות צובר במהלך הניסוי.
    הערה: לקבלת דוגמאות של ערכות חילוץ דנ א ראה את הטבלה של חומרים. כל ערכה יש פרוטוקולים שונים; בצע הוראות היצרנים.
  2. לכמת DNA איכות וריכוז. ישנן שיטות שונות לקביעת איכות DNA וריכוז. לקבוע את איכות מדידה את היחס של ספיגת 260 ננומטר/280 ננומטר, 260 ננומטר nm/230. להשתמש, מחייב הדי הפלורסנט למדידת ריכוז ה-DNA בעקבות הוראות היצרן, agarose בג'ל כדי לוודא כי שם אין השפלה DNA או RNA זיהום.
  3. שימוש רצפי DNA עמוק מדגימות באוכלוסיות שלמות, בודדים שיבוטים כדי לחקור את הבסיס הגנטי של עמידות לאנטיביוטיקה.
    הערה: ערכנו כל רצף במרכז Wellcome אמון עבור גנטיקה אנושית, אוקספורד, אנגליה. לפרטים נוספים ראה סן מילאן. et al. 201612.
  4. להשתמש את צינור27,של breseq 0.26.128 כדי לזהות מוטציות, באמצעות מצב ריבוי הצורות כדי להעריך את התדירות של מוטציות באוכלוסיות. השוואת הגנום מפותחת שונים כדי הגנום הורים כדי לזהות מוטציות שהצטברו במהלך הניסוי.
  5. השוואה מוטציות שנצבר במקביל על האוכלוסיות שליטה עם אלה של האוכלוסיות התפתחו תחת הגדלת ריכוז של אנטיביוטיקה כדי להבדיל בין מוטציות עוזר חיידקים להסתגל (תנאים כלליים ניסיוני אלה שנמצאו על האוכלוסיות שליטה), המעורבים עמידות לאנטיביוטיקה (אלה נמצאו אך ורק בקרב אוכלוסיות נתון ללחץ אנטיביוטי).
    הערה: מספר מוטציות מקבילות היא בדרך כלל נמוכה, אז שונה מוטציות מקבילות בין הטיפולים יכול להידרש בקלות. מלבד מוטציות בגן עמידות לאנטיביוטיקה שנבחנה שסביר בהחלט למצוא מוטציות אחרות המשויכות עמידות לאנטיביוטיקה כרומוזום, מוטציות כאלה מערכות porins או בזרימת12.
  6. לשחזר מוטציות בגן עמידות לאנטיביוטיקה בנימה הורים באמצעות אותה גישה כמו בסעיף 1 של פרוטוקול זה. עקוב אחר נקודות 1.1 ו- 1.2 של פרוטוקול להציג מוטציות חדשות ברקע הורים (באמצעות הגנים מפותחת כתבנית PCR). לנתח את פנוטיפים עמידות לאנטיביוטיקה של אלה מבנים חדשים כדי לאשר את התפקיד של מוטציות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בעבודה הקודמת, נחקר על האבולוציה β לקטמאז ג'ין בלהTEM-1 לכיוון היוועצות התנגדות השלישי דור צפלוספורין ceftazidime12 . גן זה נבחר, כי למרות TEM-1 אינה מעניקה עמידות ceftazidime, מוטציות בגן בלהTEM-1 יכול להרחיב את טווח הפעילות של TEM-1 כדי hydrolyze צפלוספורינים כגון ceftazidime29. מוטציות עמידות לאנטיביוטיקה אנזימים כגון β-lactamases או aminoglycoside שינוי אנזימים מובילים לשינויים שלהם טווח הפעילות הן נפוצות29,30. מערכת הניסוי הזה הוא אידיאלי כדי לחקור את האבולוציה של סוג זה של אנזימים. לקבלת דו ח מפורט של ניסוי יירוט מוצלח בעקבות פרוטוקול זה עיין סן מילאן ואח. 201612.

הנה, דוגמא תוצאות אפשריות של מערכת ניסויית זו מוצג כדי להמחיש את הפרוטוקול (שים לב כי הנתונים המשמשים עבור דוגמה זו אינה אמיתית). לחקור את התפקיד הפוטנציאלי של multicopy פלסמידים באבולוציה של הגן עמידות לאנטיביוטיקה תחת לומדים בדוגמה זו (בוא נקרא לזה רסה), אנו מפתחים את מערכת הניסוי בעקבות סעיף 1 של פרוטוקול המתואר לעיל. הניסויים לייצר שלושה זנים: MG1655, MG1655::רסה , MG1655/pRESA. האבולוציה של עמידות לאנטיביוטיקה ß lactam שונים שני (ceftazidime ו- meropenem) נבחנה ביצוע הפעולות המתוארות בסעיף 2 של הפרוטוקול. איור 2 מציג את עקומות הישרדות של אוכלוסיות שנבחנה. בדוגמה זו, יש עלייה משמעותית ההישרדות של אוכלוסיות השייכים MG1655/pRESA מתפתחים ב ceftazidime בהשוואה לאלו MG1655 או MG1655::רסה (בדיקת יומן-דרגה, P< 0.05). מצד שני, במקרה של meropenem, אין הבדלים משמעותיים ההישרדות של האוכלוסיות השייכים זנים שונים (בדיקת יומן-דרגה, P> 0.05). לכן, תוצאות אלה מראים כי הנוכחות של ג'ין רסה בתוך פלסמיד multicopy potentiates את האבולוציה של עמידות ceftazidime אך לא meropenem.

בשלב הסופי של הניסוי, ייחקר הבסיס המולקולרי של עמידות לאנטיביוטיקה, כפי שהוסבר בסעיף 3 של הפרוטוקול. ראשית, רצפי DNA תחשוף את מוטציות רסה . זה יכול להיות אחראי פנוטיפ ההתנגדות. שנית, שחזור של ריסה מוטציות MG1655 הורים (הן כרומוזום, פלסמיד) לאשר או למחוק את תפקידם על פנוטיפ עמידות לאנטיביוטיקה.

Figure 1
איור 1 . ייצוג סכמטי של השלבים השונים של הפרוטוקול. משמאל לימין: (i) בנייה של מערכת ניסויית: MG1655, MG1655::רסה , MG1655/pRESA. כרומוזום חיידקי מיוצג בראון, את פלסמיד בכחול, הגן רסה באדום. (ii) חילוץ אבולוציונית הגישה להתפתח השפעול עמידות לאנטיביוטיקה: מספר אוכלוסיות של זנים שונים מופצים תחת הגדלת ריכוז של האנטיביוטיקה. (iii) ניתוח של הבסיס המולקולרי של עמידות לאנטיביוטיקה: רצף ה-DNA דגימות מן האוכלוסיות מפותחת, שיבוטים, זיהוי של מוטציות עמידות לאנטיביוטיקה ושיחזור של מוטציות אלו בנימה זו הורים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
באיור 2. עקומות הישרדות עם הגדלת ריכוזים של אנטיביוטיקה. ייצוג מספר אוכלוסיות קיימא השייכים זנים MG1655, MG1655::רסה, ו MG1655/pRESA לאורך זמן. 48 אוכלוסיות של כל זן היו מופצות תחת הגדלת ריכוזים של אנטיביוטיקה ceftazidime ו meropenem, החל 1/8 של המיקרופון ביום 1 ולהכפיל את הריכוז אנטיביוטיקה כל יום. קו אנכי מקווקו אדום מייצג את המיקרופון של אנטיביוטיקה שנבחנה. שימו לב כי במקרה של ceftazidime ישנם הבדלים משמעותיים ההישרדות של האוכלוסיות השייכים זנים שונים לאורך זמן (בדיקת יומן-דרגה, P< 0.05). ויותר חשוב, רק אוכלוסיות נושאת את פלסמיד מסוגלים לשרוד עד ריכוזים גבוהים של אנטיביוטיקה. מצד שני, במקרה של meropenem, אין הבדלים משמעותיים ההישרדות של אוכלוסיות שונות לאורך זמן (בדיקת יומן-דרגה, P> 0.05). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

אנו מציגים פרוטוקול חדש המשלב ביולוגיה מולקולרית, האבולוציה ניסיוני and רצפי DNA עמוק שנועד לחקור את התפקיד של פלסמידים multicopy באבולוציה של עמידות לאנטיביוטיקה בחיידקים. למרות פרוטוקול זה משלב טכניקות מתחומים שונים, כל השיטות נדרש לפתח אותו פשוטים, ניתן לבצע במעבדה למיקרוביולוגיה רגיל. השלבים הקריטיים ביותר בפרוטוקול כנראה הם הבנייה של זנים מערכת מודל ובנייה מחדש של מוטציות נצפתה לאחר ההתפתחות ניסיוני (אשר מבוצעות באמצעות אותה שיטה בדיוק). עם זאת, מערכת הרכבה איזותרמי21, מפשט באופן משמעותי פרוטוקול זה כך כל משתמש בעל רמת ביניים של ניסיון בתחום הביולוגיה המולקולרית ניתן ליישם את זה.

עוד צעד קריטי של הפרוטוקול הוא האבולוציה ניסויית תחת הגדלת ריכוזים של אנטיביוטיקה. לדוגמה, פרוטוקול זה מתחיל את הניסוי עם ¼-1/8 של המיקרופון של הזנים, ואז להכפיל את הריכוז של אנטיביוטיקה כל יום. עם זאת, שיעור נמוך יותר של שינוי אנטיביוטי יכול להגדיל את הסיכוי של חילוץ אבולוציונית של הכחדה26. לכן, קצב השינוי של ריכוזים לאנטיביוטיקה הוא אחד הפרמטרים שניתן לשנותם כדי לקדם את התפתחות עמידות לאנטיביוטיקה.

רצפי DNA וניתוח הם גם היבטים מרכזיים של הנבחנים. התוצאות הן יותר ישירה כאשר רצף מבוצע על דגימות DNA באוכלוסיות שלמות, והן מן שיבוטים בודדים, בנקודות זמן שונות בניסוי. רצף תוצאות של אוכלוסיות תחשוף כללי הבדלים הפרופילים מוטציה בין טיפולים, כמו גם מטאטא סלקטיבי של מוטציות מועילות מעל הזמן ואירועים פוטנציאליים של הפרעה המשובטים. בעת ניתוח רצפים של אוכלוסיות, עדיף לסנן מוטציות שעלתה לא התדירות 10% מכל האוכלוסייה. רצפים של שיבוטים בודדים לסייע לאשר את התוצאות שהתקבלו אוכלוסיות ולחשוף, והכי חשוב, השילובים מסוים בין מוטציות שונות נצפו ברמת האוכלוסייה. שיוכים אלה מסוים עשוי לעזור לחשוף epistatic אינטראקציות בין מוטציות, אשר לשחק תפקיד קריטי הסתגלות חיידקי31.

באמצעות שיטה זו, לאחרונה הראינו כי פלסמידים multicopy להאיץ את האבולוציה של עמידות לאנטיביוטיקה, תחילה על-ידי הגברת קצב הופעת הרומן מוטציות ולאחר מכן לפי מגביר את האפקט של מוטציות עקב מינון מוגבר ג'ין12 . לכן, פיתחנו את שיטת ככלי לחקור את התפתחות עמידות לאנטיביוטיקה, אבל זה יכול להיות מגוון רחב בהרבה של יישומים. כלומר, מערכת זו יכול לשמש כדי לחקור את היכולת של גנים חיידקיים כל להתפתח לכיוון פונקציה חדשה או משופרת באופן כללי יותר. מערכת זו ניתן להשתמש, לדוגמה, כדי לבחון את היכולת של אנזים/מסלול מטבולי להשתמש פחמן חדש מצעים32. בנוסף, זה יכול לשמש במקום hypermutators (חיידקים עם פגם במערכות הסלולר מעורב תיקון אי התאמה של דנ א) לחקור את ג'ין מסתגלת אבולוציה של חיידקים, הימנעות הטיה mutational לראשונה על ידי hypermutators.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי דה אינסטיטוטו סאלוד Carlos III (תוכנית Estatal דה אני + D + אני 2013-2016): מעניק CP15-00012 PI16-00860, CIBER (CB06/02/0053), שיתוף מימנה הקרן אזורי אירופה פיתוח ' דרך להשיג אירופה"(ERDF). ג'אי נתמך על-ידי התוכנית Atracción דה talento של ממשלת האזור של מדריד (2016-T1/ביו-1105) ואני + D Excelencia של הספרדים Ministerio דה Economía, תעשייה y Competitividad (BIO2017-85056-P). ASM נתמך על-ידי מלגת Servet מיגל דה אינסטיטוטו סאלוד Carlos III (MS15/00012) שיתוף הממומן על ידי הקרן החברתית האירופאית "השקעה בעתיד שלך" (ESF) ו ERDF.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Thermocycler BioRad C1000
Electroporator BiorRad 1652660
Electroporation cuvettes Sigma-Aldrich Z706078
NanoDrop 2000/2000c Thermo Fisher Scientific ND-2000 Determine DNA quality measuring the ratios of absorbance 260nm/280nm and 260nm/230nm
Incubator Memmert UF1060
Incubator (shaker) Cole-Parmer Ltd SI500
Electrophoresis power supply BioRad 1645070 Agarose gel electrophoresis
Electrophoresis chamber BioRad 1704405 Agarose gel electrophoresis
Pippettes Biohit 725020, 725050, 725060, 725070
Multi-channel pippetes Biohit 728220, 728230,
728240
Plate reader Synergy HTX BioTek BTS1LF
Inoculating loops Sigma-Aldrich I8388
96-well plates Falcon 351172
LB BD Difco DF0446-17-3
LB agar Fisher scientific BP1425-500
Phusion Polymerase Thermo Fisher Scientific F533S
Gibson Assembly New England Biolabs E2611S
Resctriction enzymes Fermentas FastDigest
Antibiotics Sigma-Aldrich
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27104 Plasmid extraction kit
Wizard Genomic DNA Purification Kit Promega A1120 gDNA extraction kit
DNeasy Blood & Tissue Kits Qiagen 69506 gDNA extraction kit
Electroporation cuvettes Sigma-Aldrich Z706078
Petri dishes Sigma-Aldrich D9054
Cryotubes ClearLine 390701
96-well plates (-80ºC storage) Thermo Fisher Scientific 249945
QuantiFluor dsDNA System Promega E2670 Quantification of DNA concentartion
Agarose BioRad 1613100 Agarose gel electrophoresis
50x TAE buffer BioRad 1610743 Agarose gel electrophoresis
T4 Polynucleotide Kinase Thermo Fisher Scientific EK0031
T4 DNA Ligase Thermo Fisher Scientific EL0014

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Neill, J. TACKLING DRUG-RESISTANT INFECTIONS GLOBALLY: FINAL REPORT AND RECOMMENDATIONS. Review on Antimicrobal Resistance. , (2016).
  2. Palmer, A. C., Kishony, R. Understanding, predicting and manipulating the genotypic evolution of antibiotic resistance. Nat Rev Genet. 14 (4), 243-248 (2013).
  3. MacLean, R. C., Hall, A. R., Perron, G. G., Buckling, A. The population genetics of antibiotic resistance: integrating molecular mechanisms and treatment contexts. Nat Rev Genet. 11 (6), 405-414 (2010).
  4. Buckling, A., Maclean, R. C., Brockhurst, M. A., Colegrave, N. The Beagle in a bottle. Nature. 457 (7231), 824-829 (2009).
  5. Barrick, J. E., Lenski, R. E. Genome dynamics during experimental evolution. Nature Reviews Genetics. 14 (12), 827-839 (2013).
  6. Elena, S. F., Lenski, R. E. Evolution experiments with microorganisms: The dynamics and genetic bases of adaptation. Nature Reviews Genetics. 4 (6), 457-469 (2003).
  7. Lenski, R. E., Rose, M. R., Simpson, S. C., Tadler, S. C. Long-Term Experimental Evolution in Escherichia coli. I. Adaptation and Divergence During 2,000 Generations. The American Naturalist. 138 (6), 1315-1341 (1991).
  8. Bennett, A. F., Dao, K. M., Lenski, R. E. Rapid evolution in response to high-temperature selection. Nature. 346 (6279), 79-81 (1990).
  9. Bell, G. Evolutionary rescue and the limits of adaptation. Philosophical Transactions of the Royal Society B-Biological Sciences. 368 (1610), (2013).
  10. Bell, G., Gonzalez, A. Adaptation and Evolutionary Rescue in Metapopulations Experiencing Environmental Deterioration. Science. 332 (6035), 1327-1330 (2011).
  11. Bell, G., Gonzalez, A. Evolutionary rescue can prevent extinction following environmental change. Ecology Letters. 12 (9), 942-948 (2009).
  12. San Millan, A., Escudero, J. A., Gifford, D. R., Mazel, D., MacLean, R. C. Multicopy plasmids potentiate the evolution of antibiotic resistance in bacteria. Nature Ecology & Evolution. 1, 0010 (2016).
  13. Alekshun, M. N., Levy, S. B. Molecular mechanisms of antibacterial multidrug resistance. Cell. 128 (6), 1037-1050 (2007).
  14. Ochman, H., Lawrence, J. G., Groisman, E. A. Lateral gene transfer and the nature of bacterial innovation. Nature. 405 (6784), 299-304 (2000).
  15. Carattoli, A. Plasmids and the spread of resistance. Int J Med Microbiol. 303 (6-7), 298-304 (2013).
  16. Smillie, C., Garcillán-Barcia, M. P., Francia, M. V., Rocha, E. P., de la Cruz, F. Mobility of plasmids. Microbiol Mol Biol Rev. 74 (3), 434-452 (2010).
  17. San Millan, A., Heilbron, K., Maclean, R. C. Positive epistasis between co-infecting plasmids promotes plasmid survival in bacterial populations. ISME J. , (2013).
  18. Stoesser, N., et al. Evolutionary History of the Global Emergence of the Escherichia coli Epidemic Clone ST131. MBio. 7 (2), (2016).
  19. San Millan, A., et al. Multiresistance in Pasteurella multocida is mediated by coexistence of small plasmids. Antimicrob Agents Chemother. 53 (8), 3399-3404 (2009).
  20. Escudero, J. A., et al. Unmasking the ancestral activity of integron integrases reveals a smooth evolutionary transition during functional innovation. Nat Commun. 7, 10937 (2016).
  21. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  22. Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (12), 6640-6645 (2000).
  23. Chaveroche, M. K., Ghigo, J. M., d'Enfert, C. A rapid method for efficient gene replacement in the filamentous fungus Aspergillus nidulans. Nucleic Acids Res. 28 (22), 97 (2000).
  24. Le Roux, F., Binesse, J., Saulnier, D., Mazel, D. Construction of a Vibrio splendidus mutant lacking the metalloprotease gene vsm by use of a novel counterselectable suicide vector. Appl Environ Microbiol. 73 (3), 777-784 (2007).
  25. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; 19th ed. Approved standard M100-S19. , Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA, USA. (2009).
  26. Lindsey, H. A., Gallie, J., Taylor, S., Kerr, B. Evolutionary rescue from extinction is contingent on a lower rate of environmental change. Nature. 494 (7438), 463-467 (2013).
  27. Deatherage, D. E., Barrick, J. E. Identification of mutations in laboratory-evolved microbes from next-generation sequencing data using breseq. Methods Mol Biol. 1151, 165-188 (2014).
  28. Barrick, J. E., et al. Identifying structural variation in haploid microbial genomes from short-read resequencing data using breseq. BMC Genomics. 15, 1039 (2014).
  29. Salverda, M. L., De Visser, J. A., Barlow, M. Natural evolution of TEM-1 β-lactamase: experimental reconstruction and clinical relevance. FEMS Microbiol Rev. 34 (6), 1015-1036 (2010).
  30. Ramirez, M. S., Tolmasky, M. E. Aminoglycoside modifying enzymes. Drug Resist Updat. 13 (6), 151-171 (2010).
  31. Jerison, E. R., Desai, M. M. Genomic investigations of evolutionary dynamics and epistasis in microbial evolution experiments. Current Opinion in Genetics & Development. 35, 33-39 (2015).
  32. Toll-Riera, M., San Millan, A., Wagner, A., MacLean, R. C. The Genomic Basis of Evolutionary Innovation in Pseudomonas aeruginosa. PLoS Genet. 12 (5), 1006005 (2016).

Tags

גנטיקה גיליון 135 פלסמיד עמידות לאנטיביוטיקה אבולוציה חילוץ אבולוציונית פלסמידים multicopy מוטציה האבולוציה ניסיוני
בוחן את התפקיד של פלסמידים Multicopy באבולוציה של עמידות לאנטיביוטיקה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Escudero, J. A., MacLean, R. C., San … More

Escudero, J. A., MacLean, R. C., San Millan, A. Testing the Role of Multicopy Plasmids in the Evolution of Antibiotic Resistance. J. Vis. Exp. (135), e57386, doi:10.3791/57386 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter