Summary
Hier presenteren we een experimentele methode om te testen van de rol van zelfkopiërende plasmiden in de ontwikkeling van resistentie tegen antibiotica.
Abstract
Zelfkopiërende plasmiden zijn zeer overvloedig in prokaryoten, maar hun rol in de bacteriële evolution blijft slecht begrepen. We toonden onlangs dat de toename van de gene exemplaaraantal per cel geboden door zelfkopiërende plasmiden de evolutie van de plasmide-gecodeerde genen kan versnellen. In dit werk presenteren wij een experimenteel systeem om te testen de mogelijkheid voor zelfkopiërende plasmiden ter bevordering van de evolutie van de gene. Met behulp van eenvoudige moleculaire biologiemethodes, we hebben een modelsysteem waar een antibiotica-resistentie gen kan worden ingevoegd in Escherichia coli MG1655, in het chromosoom of op een zelfkopiërende plasmide gebouwd. We gebruik van een experimentele evolutie aanpak te verspreiden van de verschillende stammen onder toenemende concentraties van antibiotica en we meten overleven van bacteriële bevolking na verloop van tijd. De keuze van het antibioticum molecuul en de weerstand-gen is zodat het gen slechts weerstand door de verwerving van mutaties verlenen kan. Deze "evolutionaire rescue"-aanpak biedt een eenvoudige methode om te testen het potentieel voor zelfkopiërende plasmiden ter bevordering van de verwerving van antibiotica-resistentie. In de volgende stap van het experimentele systeem, worden de moleculaire grondslagen van resistentie tegen antibiotica gekenmerkt. Ter identificatie van mutaties verantwoordelijk voor de verwerving van resistentie tegen antibiotica gebruiken we diep DNA sequentiebepaling van monsters die zijn verkregen van hele bevolkingsgroepen en klonen. Ten slotte, om te bevestigen de rol van de mutaties in het gen in onderzoek, we reconstrueren hen in de ouderlijke achtergrond en test het fenotype van de weerstand van de resulterende spanningen.
Introduction
Antibiotica-resistentie bij bacteriën is een belangrijke gezondheid probleem1. Op een fundamenteel niveau is de verspreiding van resistentie tegen antibiotica in pathogene bacteriën een eenvoudig voorbeeld van evolutie door natuurlijke selectie2,3. Simpel gezegd, het gebruik van antibiotica genereert selectie van resistente stammen. Daarom, is een belangrijk probleem in de evolutiebiologie, inzicht in de factoren die invloed hebben op het vermogen van bacteriële populaties te ontwikkelen resistentie tegen antibiotica. Selectie experimenten zijn voortgekomen als een zeer krachtig hulpmiddel voor het onderzoeken van de evolutionaire biologie van bacteriën, en dit veld heeft ongelooflijke inzicht in een breed scala van evolutionaire problemen4,5,6. In experimentele evolutie, zijn de bacteriële populaties die worden geïnitieerd vanaf een single strain van ouderlijke serieel gepasseerd gedefinieerd en streng gecontroleerde omstandigheden. Sommige van de mutaties die tijdens de groei van deze culturen optreden vergroten bacteriële fitness, en dit verspreid via de culturen door natuurlijke selectie. Tijdens het experiment, worden monsters van de bevolking periodiek diepgevroren bewaard als een niet-evoluerende bevroren fossiele record wilt maken. Een groot aantal benaderingen kan worden gebruikt voor het karakteriseren bacteriële populaties in ontwikkeling, maar de twee meest voorkomende methoden zijn fitness testen, die het vermogen van geëvolueerd bacteriën meten te concurreren tegen hun verre voorouders, en hele genoom sequencing, thats gebruikt ter identificatie van de genetische veranderingen die schijf aanpassing. Na pionierswerk door Richard Lenski en collega's7,8, de standaardbenadering in experimentele evolutie geweest om een relatief klein aantal repliceren populaties (meestal < 10) met de aanpassing aan een nieuwe milieu-uitdaging, zoals nieuwe CO2-bronnen, temperatuur of een roofzuchtige phage.
Infecties veroorzaakt door antibiotica resistente bacteriën uitgegroeid tot een groot probleem wanneer weerstand hoog genoeg is dat het niet mogelijk om antibiotica concentraties dodelijk niveaus in geduldige weefsels is. Clinici zijn dus geïnteresseerd in wat bacteriën kunnen ontwikkelen resistentie tegen hoge doses antibiotica die boven deze drempel antibioticum concentratie, de klinische onderbrekingspunt. Hoe kan ik dit experimenteel studeren? Als een klein aantal bacteriële populaties worden uitgedaagd met een hoge dosis van het antibioticum, zoals in een Lenski-stijl experiment, dan de meest waarschijnlijke uitkomst is dat het antibioticum zal rijden alle van de bevolking tot uitsterven. Op hetzelfde moment, als de dosis van het antibioticum dat wordt gebruikt laag, onder de minimale remmende concentratie (MIC) van de ouderlijke stam is, is dan het onwaarschijnlijk dat de bacteriële bevolking klinisch relevante niveaus van weerstand evolueren zal, vooral als weerstand draagt een grote kosten. Een compromis tussen deze twee scenario's is het gebruik van een "evolutionaire rescue" experiment9,10,11. In deze benadering, een zeer groot aantal culturen (meestal > 40) wordt uitgedaagd met doses van antibiotica die in de tijd, meestal toenemen door een verdubbeling van de antibioticum concentratie elke dag12. Het kenmerk van dit experiment is dat iedere bevolking dat niet verhoogde resistentie evolueren zal worden gedreven tot uitsterven. De bevolking van de meeste die op deze manier worden uitgedaagd zal uitgestorven worden gereden, maar een kleine minderheid zullen blijven bestaan door het ontwikkelen van hoge niveaus van weerstand. In dit artikel laten we zien hoe deze proefopzet kan worden gebruikt om te onderzoeken zelfkopiërende plasmide bijdrage aan de ontwikkeling van resistentie.
Bacteriën krijgen resistentie tegen antibiotica door twee belangrijkste routes, chromosomale mutaties en verwerving van mobiele genetische elementen, meestal plasmiden13. Plasmiden spelen een sleutelrol in de ontwikkeling van resistentie tegen antibiotica omdat ze kunnen overzetten van resistentiegenen tussen bacteriën met geconjugeerde14,15. Plasmiden kunnen worden onderverdeeld in twee groepen volgens hun grootte en biologie: "klein", met hoog exemplaaraantal per de bacteriële cel en "grote", met een lage kopiëren nummer16,17. De rol van grote plasmiden in de evolutie van antibiotica-resistentie is uitgebreid gedocumenteerd omdat zij omvatten conjugative plasmiden, die belangrijke motor van de verspreiding van resistentie en multi resistentie bij bacteriën15. Kleine zelfkopiërende plasmiden zijn ook uiterst gemeenschappelijk in bacteriën17,18, en zij vaak code voor antibiotica-resistentie genen19. De rol van kleine zelfkopiërende plasmiden in de ontwikkeling van resistentie tegen antibiotica is echter onderzocht in mindere mate.
In een recente werk voorgesteld wij hebben dat zelfkopiërende plasmiden de evolutie van de genen die zij dragen doordat gen mutatie tarieven als gevolg van de hogere gene exemplaaraantal per cel12kon versnellen. Met behulp van een experimenteel model met E. coli stam MG1655 en de β-lactamase gene blaTEM-1 werd aangetoond dat zelfkopiërende plasmiden versneld het tarief van de verschijning van de TEM-1 mutaties overdracht van resistentie tegen de derde-generatie cefalosporine Ceftazidim. Deze resultaten aangegeven dat zelfkopiërende plasmiden spelen een belangrijke rol in de ontwikkeling van resistentie tegen antibiotica kunnen.
Hier presenteren we een gedetailleerde beschrijving van de methode die we hebben ontwikkeld om te onderzoeken de zelfkopiërende plasmide gemedieerde evolutie van antibiotica-resistentie. Deze methode heeft drie verschillende stappen: eerste, invoeging van het gen in onderzoek in een zelfkopiërende plasmide of het chromosoom van de gastheer-bacterie. Ten tweede, gebruik van experimentele ontwikkeling (evolutionaire rescue) te beoordelen van het potentieel van de verschillende soorten aan te passen aan de selectieve druk. En ten derde, de bepaling van de moleculaire basis ten grondslag liggen aan de plasmide gemedieerde evolutie gebruikend DNA rangschikkend en wederopbouw van de vermoedelijke mutaties individueel in de ouderlijke genotype.
Tot slot, hoewel het protocol hier beschreven is ontworpen om te onderzoeken van de ontwikkeling van resistentie tegen antibiotica, kan men stellen dat deze methode zou kunnen zijn over het algemeen nuttig is voor het analyseren van de evolutie van innovaties verworven door mutaties in elke multicopy plasmide-gecodeerde gen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. bouw van het experimentele systeem codering van antibiotica-resistentie gen
Opmerking: Hier E. coli MG1655 werd gebruikt als de ontvangende stam van de plasmide - of chromosoom gecodeerde antibiotica-resistentie gen. De antibiotica-resistentie gen is gecodeerd in het chromosoom of een zelfkopiërende plasmide in een anders isogene stam (Figuur 1).
-
Toevoeging van de antibiotica-resistentie gen in de lambda phage integratie site (attB)20 van het chromosoom van MG1655.
- Versterken van 500 bp durende regio's aan beide zijden van de chromosomale attB site door PCR. Gebruik oligonucleotides YbhC-F (5'-CCTGTACCGTACAGAGTAAT-3') en attB-R (5'-GCCCGCCACCCTCCGGGCCGGTATAAAAAAGCAGGCTTCA-3') voor de linker homologie regio en attB-F (5'-AGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTATACTAACTTGAGCGAAA-3') en YbhB/R (5'- TGGCGATAATATTTCACCGC-3') voor de juiste is. Versterken van het blaTEM-1 weerstand gen gebruikend inleidingen Tem1-pBAD-F (5'-TGAAGCCTGCTTTTTTATACCGGCCCGGAGGGTGGCGGGC-3') en Tem1-pBAD-R (5'-TTTCGCTCAAGTTAGTATAAGGAGCGGGCGCTAGGGCGCT-3'). Inleidingen met ongeveer 20 ontwerpen bp (in het 5' einde) van sequentie complementariteit naar het fragment dat is gonna worden gesmolten te tonen.
- Zekering homologie regio's aan de antibiotica-resistentie gen PCR-product (met inbegrip van haar promotor regio) met behulp van isothermische vergadering21, bij 50 ° C gedurende 30 minuten.
- Electroporate MG1655 cellen met plasmide pKOBEG.
Opmerking: pKOBEG is een vector van hittegevoelige waarin de λ rode machines, bevordering van de homologie gebaseerde allèlique uitwisseling tussen de chromosomen en PCR producten22.- Gebruik 1 µL van het product van stap 1.1.223 in 40 µL van electrocompetent cellen in 2 mm cuvettes bij 4 ° C en 2,5 kV. Resuspendeer de cellen in 1 mL van de pond-Bouillon + 0,2% arabinose om de uitdrukking van de λ rode machines.
- Het totale volume overbrengen in een microfuge buis en incubeer 2 h bij 30 ° C (tolerante temperatuur voor pKOBEG) met intense schudden (200 rpm in een roteerschudapparaat) zodat de fenotypische expressie van de resistentie-markers ingevoegd in het chromosoom.
- Plaat van de cellen op LB agar met de juiste antibiotica te selecteren voor het gen van de resistentie tegen antibiotica (ampicilline of carbenicillin op 100 mg/l voor blaTEM-1).
- Plaat 100 µL op één petrischaaltje, draai van de rest van het volume, het resuspendeer in 100 µL van vers pond-Bouillon en plaat het op een andere petrischaal. Na een nacht bebroeden bij 42 ° C.
Opmerking: Deze temperatuur is niet-tolerante voor de replicatie van pKOBEG. De kolonies kunnen groeien in deze voorwaarden zal hebben verloren pKOBEG en zal de resistentie gen geïntegreerd in de attB -site (voor eenvoud deze spanning zal worden genoemd MG1655::resA vanaf hier). - Test voor het verlies van pKOBEG door het repliceren van de kolonies van belangstelling voor platen met chlooramfenicol (het antibioticum tegen die pKOBEG bevat een marker van de weerstand).
Opmerking: Gebrek aan groei in chlooramfenicol platen op de tolerante temperatuur van 30 ºC is kenmerkend voor de afwezigheid van de plasmide. - Om na te gaan klonen, PCR versterken de bouw met behulp van externe inleidingen YbhC-Extern (5'-TTTGTGACCAGAAGACCGCA-3') en YbhB-Extern (5'-CTCATCAGTAACGATCTGCG-3'), via Elektroforese van het gel controleert u of de juiste grootte van de amplicon en de volgorde de gezuiverde product om ervoor te zorgen dat de volgorde van de ingevoegde gen correct is.
-
Plaats de antibiotica-resistentie gen in een zelfkopiërende plasmide.
Opmerking: Omdat plasmiden met zeer hoge exemplaaraantal de neiging om het opleggen van een grote daling in bacteriële host fitness, raden we het gebruik van plasmiden met zelfkopiërende, met een natuurlijke oorsprong van replicatie, zoals p3655 (pSU18T-pBADgfp2, ColE1-type oorsprong van replicatie24). Deze plasmiden meestal presenteren een matige exemplaaraantal van ongeveer 15-20 kopieën per cel.- PCR versterken het gen van de resistentie tegen antibiotica van keuze (met inbegrip van de promotor regio), phosphorylate van het PCR-product en het afbinden met de PCR-versterkte backbone van de plasmide:
- PCR versterken de antibiotica-resistentie gen; TEM-1 gebruik voor blainleidingen Tem1-pBAD-F (5'-TGAAGCCTGCTTTTTTATACCGGCCCGGAGGGTGGCGGGC-3') en Tem1-pBAD-R (5'-TTTCGCTCAAGTTAGTATAAGGAGCGGGCGCTAGGGCGCT-3').
- Phosphorylate het gezuiverde product met behulp van T4 polynucleotide kinase, volgens de instructies van de fabrikant.
- PCR versterken de ruggengraat van de plasmide met behulp van een hifi-polymerase en oligonucleotides pBAD-F (5'-CGTTGATCGGCACGTAAGAG-3') en pBAD-R (5'-AAACGACGGCCAGTGCCAAG-3').
- Afbinden van beide PCR fragmenten met behulp van T4-ligase volgens richtlijnen van de fabrikant.
- Electroporate, zoals eerder beschreven 40 µL van het electrocompetent E. coli DH5-α cellen met een maximum van 1 µL van de afbinding product en selecteert u op de juiste antibiotica voor het gen van de resistentie tegen antibiotica (ampicilline of carbenicillin bij 100 mg/L voor blaTEM-1) en de ruggengraat van de plasmide.
Opmerking: LB aan te vullen met arabinose hier is overbodig. - Pak het plasmide met behulp van de commerciële mini prep-kit van de reader's choice:
- Oogst 5 mL van een overnachting cultuur door centrifugatie bij 12.000 x g bij kamertemperatuur. Resuspendeer de cellen in 250 µL van resuspensie oplossing en meng goed. Voeg 250 µL van lysis van de oplossing en meng goed. Voeg 350 µL neutralisatie en meng goed.
- Het supernatant overbrengen in de DNA-bindende kolom voorzien van de kit, centrifuge voor 1 min en gooi de stroom door. Was twee keer de kolom met 500 µL van oplossing van wassen, centrifugeren voor één minuut en teruggooien van de flowthrough bij elke wasbeurt. Centrifugeer de lege kolom voor 1 extra min te verwijderen van de resterende wassen buffer.
- Plaats van de kolom in een schone buis en voeg 50 µL van ultra zuiver water aan het membraan te elueer de gezuiverde DNA. Centrifugeer gedurende 1-2 min en verzamelen de stroom door die het gezuiverde plasmide bevat. Sanger volgorde het gen van belang in het plasmide gebruikend inleidingen van buiten de ingebrachte sequentie om te bevestigen dat de volgorde klopt en dat geen mutaties in het gen weerstand voorafgaand aan de evolutie experimenten aanwezig zijn.
- Als de volgorde is geverifieerd, electroporate de plasmide in de E. coli MG1655 stam, zoals hierboven beschreven.
Opmerking: Dit levert stam MG1655/pRESA.
- PCR versterken het gen van de resistentie tegen antibiotica van keuze (met inbegrip van de promotor regio), phosphorylate van het PCR-product en het afbinden met de PCR-versterkte backbone van de plasmide:
2. evolutionaire Rescue aanpak experimenteel ontwikkelen resistentie tegen antibiotica (Figuur 1)
- Streak uit de stammen onder studie op LB platen: MG1655::resA en MG1655/pRESA plus de gevoelig ouderlijke stam, MG1655.
Opmerking: Plasmide pRESA moet stabiel in MG1655, dus er is geen noodzaak om toe te voegen antibiotica aan de LB-platen. Tarieven van de mutatie bij E. coli zijn laag genoeg, zodat zodra de bouw wordt gecontroleerd is het niet nodig om te controleren of de plasmide volgorde bij elke stap. - Bereiden van 96-wells-platen met 200 µL van LB in elk putje en enten 48 geïsoleerde kolonies van elke stam in onafhankelijke wells (één plaat per stam). Incubeer de platen 's nachts bij 37 ° C en 200 rpm. Houd een bevroren voorraad van de populaties van deze oprichter.
Opmerking: Ter voorkoming en controle voor cultuur kruisbesmetting in de 96-wells-platen, gebruik een dambord plaat ontwerp door intercalating geënte putten met bacteriën vrij medium gedurende de 96-wells-plaat. Gebruik deze plaat ontwerp tijdens de gehele experimentele ontwikkeling. - Start het experiment evolutionaire redding door inoculating 2 µL van elk putje van de platen met de bevolking van de oprichter in nieuwe 96-wells-platen met 198 µL van LB in elk putje met een sub-inhibitory concentratie van het antibioticum bestudeerde. Voor de aanpak van de evolutionaire redding beginnen met ¼ of 1/8 van de minimaal remmende concentratie (MIC, bepaald eerder25) van het antibioticum in LB voor elk van de drie stammen en de concentratie van de antibiotica dagelijkse verdubbelen. Gebruik deze aanpak om te maximaliseren van de kansen van de bevolking te verwerven weerstand mutaties26. Incubeer de platen bij 37 ° C en 200 rpm voor 20u.
Opmerking: Meet de overnachting OD van de populaties van de oprichter. Als er aanzienlijke verschillen in OD tussen stammen zijn corrigeren de eerste entmateriaal om te beginnen met het experiment met hetzelfde aantal cellen per putje. - Elke dag, meten van de OD van elke bevolking na overnachting cultuur en voert u een overdracht van de culturen, zoals beschreven in punt 2.3, naar nieuwe 96-wells-platen met dubbele de concentratie van het antibioticum dan de dag ervoor. Incubeer de platen 20 h bij 37 ° C en 200 rpm.
Opmerking: De verdunningsfactor 1:100 produceert ongeveer 6-7 generaties per dag. - Parallel, propageren controle populaties van elke stam in dezelfde voorwaarden zoals beschreven in 2.3 en 2.4, maar in de afwezigheid van antibiotica.
Opmerking: Controle populaties zal helpen onderscheid te maken tussen de mutaties die voortvloeien als gevolg van de aanwezigheid van de antibiotica en de algemene mutaties helpen bacteriën aan de experimentele omstandigheden aan te passen. Parallelle mutaties ontstaan bij gebrek aan antibiotica zijn waarschijnlijk te helpen bacteriën aan de experimentele omstandigheden aan te passen en niet gerelateerd aan antibioticaresistentie. - Het aantal overlevende bevolking dagelijks bijhouden door het meten van de extinctie bij een golflengte van 600 nm (OD) van de culturen die met behulp van een afleesapparaat.
Opmerking: Optische dichtheid waarden lager dan 0,1 het uitsterven van de bevolking geven. Zie Figuur 2 voor een voorbeeld van overleving curven. - Houd een bevroren voorraad van alle van de bevolking regelmatig (elke 3-5 dagen).
- Het gebruik van log-rank tests [pakket "overleven" in RStudio (versie 0.99.486)] om statistische verschillen in het voortbestaan van de populaties van de verschillende stammen na verloop van tijd onder toenemende concentratie van antibiotica12te bepalen.
Opmerking: Dit experiment zal bepalen als zelfkopiërende plasmiden de evolutie van antibiotica-resistentie voor bepaalde antibiotica en gene bestudeerde versterken.
3. moleculaire Basis van de evolutie van antibiotica-resistentie (Figuur 1)
- Totale DNA extracties uit een representatief aantal populaties en klonen in stammen en behandelingen kunnen laten presteren. De ouderlijke stammen (MG1655, MG1655::resA en MG1655/pRESA) te kunnen detecteren de mutaties accumuleren tijdens het experiment.
Opmerking: Zie de tabel met materialen voor voorbeelden van DNA-extractie-kits. Elke kit heeft verschillende protocollen; Volg de instructies van de fabrikanten. - Kwantificeren DNA kwaliteit en concentratie. Er zijn verschillende methoden om te bepalen kwaliteit van DNA en concentratie. Bepalend voor de kwaliteit meten van de ratio's van absorptie 260 nm/280 nm en 260 nm/230 nm. Een fluorescente, DNA-bindende kleurstof gebruiken voor het meten van de concentratie van de DNA volgens de instructies van de fabrikant, en agarose de Elektroforese van het gel om te bevestigen dat er geen DNA afbraak of RNA besmetting.
- Gebruik diepe DNA rangschikkend van monsters van hele bevolkingsgroepen en de individuele klonen te onderzoeken van de genetische basis van resistentie tegen antibiotica.
Opmerking: We uitgevoerd alle rangschikken op de Wellcome Trust centrum voor menselijke erfelijkheid, Oxford, UK. Voor meer details zie San Millan et al. 201612. - Gebruik de breseq 0.26.1 pijpleiding27,28 te detecteren de mutaties, gebruik van polymorfisme modus voor de raming van de frequentie van mutaties in populaties. Vergelijk de verschillende geëvolueerd genomen aan het ouderlijke genoom te detecteren mutaties die tijdens het experiment hebben opgebouwd.
- Vergelijk de mutaties opgebouwd in parallel in de bevolking controle met die van de bevolking zich ontwikkeld onder toenemende concentratie van antibiotica om te differentiëren tussen mutaties helpen bacteriën aan te passen aan de algemene proefomstandigheden ( die gevonden in de bevolking controle) en die betrokken zijn bij resistentie tegen antibiotica (die gevonden uitsluitend in populaties onderworpen aan antibioticum druk).
Opmerking: Het aantal parallelle mutaties is meestal laag, zodat verschillende parallelle mutaties tussen behandelingen gemakkelijk kunnen worden beoordeeld. Afgezien van de mutaties in het gen van de antibioticaresistentie bestudeerde die het is zeer waarschijnlijk te vinden andere mutaties geassocieerd met resistentie tegen antibiotica in het chromosoom, dergelijke mutaties in porins of efflux systemen12. - Het reconstrueren van de mutaties in het gen van de antibiotica-resistentie in de ouderlijke stam met behulp van dezelfde benadering als in sectie 1 van dit protocol. Volg punten 1.1 en 1.2 van het protocol bij het introduceren van de nieuwe mutaties in de ouderlijke achtergrond (met behulp van de geëvolueerde genen als een PCR-sjabloon). Analyseer de antibioticaresistentie fenotypes van deze nieuwe constructies ter bevestiging van de rol van de mutaties.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In onze eerdere werk, werd de evolutie van de β-lactamase gene blaTEM-1 naar overdracht van resistentie tegen de derde generatie cefalosporine Ceftazidim12 onderzocht. Dit gen werd geselecteerd omdat, hoewel TEM-1 geen weerstand tegen Ceftazidim verleent, mutaties in blaTEM-1 kunnen het bereik van de activiteit van de TEM-1 te hydrolyseren cefalosporines zoals Ceftazidim29. Mutaties in de antibioticaresistentie enzymen zoals β-lactamases of aminoglycoside wijzigen van enzymen die leiden tot wijzigingen in hun verspreidingsgebied van activiteit zijn gemeenschappelijke29,30. Dit experimenteel systeem is ideaal voor het verkennen van de evolutie van dit type van enzymen. Voor een gedetailleerd verslag van een geslaagde experiment volgens dit protocol Zie San Millan et al. 201612.
Hier is een voorbeeld van de mogelijke resultaten van dit experimenteel systeem gepresenteerd ter illustratie van het protocol (merk op dat de gegevens die worden gebruikt voor dit voorbeeld niet echt is). Om te onderzoeken op de mogelijke rol van multicopy plasmiden in de evolutie van de antibiotica-resistentie gen onder studie in dit voorbeeld (laten we noemen het resA), ontwikkelen we de experimenteel systeem na sectie 1 van het protocol zoals hierboven beschreven. De experimenten produceren drie stammen: MG1655, MG1655::resA en MG1655/pRESA. De ontwikkeling van resistentie tegen twee verschillende ß-lactam-antibiotica (Ceftazidim en meropenem) werd getest op de procedure die wordt beschreven in sectie 2 van het protocol. Figuur 2 toont de curven van de overleving van de bevolking onder studie. In dit voorbeeld is er een aanzienlijke toename van het voortbestaan van de populaties die behoren tot de MG1655/pRESA evolueert in Ceftazidim vergeleken met die van MG1655 of MG1655::resA (log-rank test, P< 0,05). Aan de andere kant, in het geval van meropenem, er zijn geen significante verschillen in het overleven van de bevolking die behoren tot de verschillende stammen (log-rank test, P> 0,05). Deze resultaten stellen daarom voor dat de aanwezigheid van gene resA in een zelfkopiërende plasmide potentiates de ontwikkeling van resistentie aan Ceftazidim maar niet aan meropenem.
In de laatste stap van het experiment, wordt de moleculaire basis van resistentie tegen antibiotica onderzocht, zoals uitgelegd in sectie 3 van het protocol. Eerst, zal DNA rangschikkend de mutaties in resA die verantwoordelijk voor de weerstand fenotype zijn kan onthullen. En ten tweede, wederopbouw van resA mutaties in de ouderlijke MG1655 (zowel in het chromosoom en plasmide) zal bevestigen of negeren hun rol op het fenotype van de resistentie tegen antibiotica.
Figuur 1 . Schematische weergave van de verschillende fasen van het protocol. Van links naar rechts: (i) bouw van de experimentele systeem: MG1655, MG1655::resA en MG1655/pRESA. Bacteriële chromosoom is vertegenwoordigd in brown, het plasmide in blauw en het resA -gen in het rood. (ii) de evolutionaire redding aanpak experimenteel ontwikkelen resistentie tegen antibiotica: verschillende bevolkingsgroepen van de verschillende soorten worden verspreid onder toenemende concentratie van het antibioticum. (iii) analyse van de moleculaire basis van antibioticaresistentie: het rangschikken van DNA monsters uit de geëvolueerde populaties en klonen, detectie van de antibiotica-resistentie-mutaties en de wederopbouw van deze mutaties in de ouderlijke stam. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2. Survival krommen met toenemende concentraties van antibiotica. Vertegenwoordiging van het aantal levensvatbare populaties die behoren tot de stammen MG1655, MG1655::resAen MG1655/pRESA na verloop van tijd. 48 populaties van elke stam werden verspreid onder toenemende concentraties van antibiotica Ceftazidim en meropenem, beginnend met 1/8 van de microfoon op dag 1 en een verdubbeling van de antibioticum concentratie elke dag. De rode verticale stippellijn vertegenwoordigt de microfoon van de antibiotica bestudeerde. Opmerking in het geval van Ceftazidim zijn er aanzienlijke verschillen in het overleven van de bevolking die behoren tot verschillende stammen na verloop van tijd (log-rank test, P< 0,05). Alleen de uitvoering van de plasmide populaties zijn cruciaal, kunnen overleven tot hoge concentraties van antibiotica. Aan de andere kant, in het geval van meropenem, er zijn geen significante verschillen in het voortbestaan van de verschillende bevolkingsgroepen na verloop van tijd (log-rank test, P> 0,05). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Presenteren we een nieuw protocol combinatie van moleculaire biologie, experimentele evolutie en diepe DNA rangschikkend ontworpen te onderzoeken van de rol van zelfkopiërende plasmiden in de evolutie van antibiotica-resistentie bij bacteriën. Hoewel dit protocol technieken uit verschillende velden combineert, alle methoden die nodig zijn voor de ontwikkeling ervan zijn eenvoudig, en kunnen worden uitgevoerd in een laboratorium van de regelmatige microbiologie. De belangrijkste stappen in het protocol zijn waarschijnlijk de bouw van het model systeem stammen en de wederopbouw van de mutaties waargenomen na de experimentele ontwikkeling (die worden uitgevoerd met behulp van de exacte dezelfde methode). Echter vereenvoudigt de isothermische montage systeem21, aanzienlijk dit protocol zodat elke gebruiker met een intermediair niveau ervaring in moleculaire biologie het kunt implementeren.
Een andere belangrijke stap van het protocol is de experimentele evolutie onder toenemende concentraties van antibiotica. Als voorbeeld begint dit protocol het experiment met ¼-1/8 van de microfoon van de stammen en vervolgens een verdubbeling van de concentratie van een antibioticum elke dag. Echter kan een lager tarief van antibiotica verandering vergroten de kans op evolutionaire redding van uitsterven26 De mate van verandering van de antibioticum concentratie is daarom een van de parameters die aangepast kunnen worden ter bevordering van de ontwikkeling van resistentie tegen antibiotica.
DNA sequencing en analyse zijn ook belangrijke aspecten van de proefopzet. Resultaten zijn eenvoudiger wanneer sequencing is uitgevoerd op DNA-monsters zowel vanuit de hele bevolking individuele klonen, op verschillende tijdstippen in het experiment. Resultaten van populaties sequencing zal onthullen algemene verschillen in de profielen van de mutatie onder behandelingen, evenals selectieve veegt van gunstige mutaties in de tijd en mogelijke gebeurtenissen van klonen inmenging. Bij het analyseren van sequenties van populaties, is het beter voor het filteren van mutaties die nooit 10% frequentie in iedere bevolking overtroffen. Sequenties van individuele klonen helpen bevestigen de resultaten van de bevolking en, belangrijkst, onthullen de specifieke combinaties tussen de verschillende mutaties waargenomen op het bevolkingsniveau. Deze specifieke verenigingen kunnen helpen ontdekken epistatic interacties tussen mutaties, die een cruciale rol in de bacteriële aanpassing31 spelen.
Met deze methode hebben we onlangs aangetoond dat zelfkopiërende plasmiden de ontwikkeling van resistentie tegen antibiotica, versnellen eerst door het optrekken van het steunpercentage van de verschijning van nieuwe mutaties en vervolgens door het sturen van het effect van mutaties als gevolg van verhoogde gene dosering12 . Daarom ontwikkelden we de methode als een instrument om te onderzoeken van de ontwikkeling van resistentie tegen antibiotica, maar het wellicht een veel breder scala van toepassingen. Namelijk, dit systeem kan worden gebruikt om te onderzoeken van de mogelijkheid van eventuele bacteriële gen evolueren naar een nieuwe of verbeterde functie in een meer algemene zin. Dit systeem kan worden gebruikt, bijvoorbeeld voor het testen van het vermogen van een metabolische enzym/weg te gebruiken nieuwe koolstof substraten32. Ook kan worden gebruikt in plaats van hypermutators (bacteriën met een defect in de cellulaire systemen die betrokken zijn bij DNA mismatch reparatie) te onderzoeken van de evolutie van de adaptieve gen bij bacteriën, het vermijden van het vogelgriepvirus vooroordeel geïntroduceerd door hypermutators.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door het Instituto de Salud Carlos III (Plan Estatal de ik + D + ik 2013-2016): verleent CP15-00012, PI16-00860 en CIBER (CB06/02/0053), medegefinancierd door het Europees Regionaal Ontwikkelingsfonds '' een manier is om Europa '' (EFRO). JAE wordt ondersteund door het Atraccion de talento -programma van de regering van de provincie Madrid (2016-T1/BIO-1105), en de I + D Excelencia van de Spaanse Ministerio de Economía, Industria y Competitividad (BIO2017-85056-P). ASM wordt ondersteund door een Miguel Servet Fellowship van het Instituto de Salud Carlos III (MS15/00012) mede gefinancierd door het Europees Sociaal Fonds "Investeren in je toekomst" (ESF) en het EFRO.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thermocycler | BioRad | C1000 | |
| Electroporator | BiorRad | 1652660 | |
| Electroporation cuvettes | Sigma-Aldrich | Z706078 | |
| NanoDrop 2000/2000c | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | Determine DNA quality measuring the ratios of absorbance 260nm/280nm and 260nm/230nm |
| Incubator | Memmert | UF1060 | |
| Incubator (shaker) | Cole-Parmer Ltd | SI500 | |
| Electrophoresis power supply | BioRad | 1645070 | Agarose gel electrophoresis |
| Electrophoresis chamber | BioRad | 1704405 | Agarose gel electrophoresis |
| Pippettes | Biohit | 725020, 725050, 725060, 725070 | |
| Multi-channel pippetes | Biohit | 728220, 728230, 728240 |
|
| Plate reader Synergy HTX | BioTek | BTS1LF | |
| Inoculating loops | Sigma-Aldrich | I8388 | |
| 96-well plates | Falcon | 351172 | |
| LB | BD Difco | DF0446-17-3 | |
| LB agar | Fisher scientific | BP1425-500 | |
| Phusion Polymerase | Thermo Fisher Scientific | F533S | |
| Gibson Assembly | New England Biolabs | E2611S | |
| Resctriction enzymes | Fermentas FastDigest | ||
| Antibiotics | Sigma-Aldrich | ||
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | Plasmid extraction kit |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | gDNA extraction kit |
| DNeasy Blood & Tissue Kits | Qiagen | 69506 | gDNA extraction kit |
| Electroporation cuvettes | Sigma-Aldrich | Z706078 | |
| Petri dishes | Sigma-Aldrich | D9054 | |
| Cryotubes | ClearLine | 390701 | |
| 96-well plates (-80ºC storage) | Thermo Fisher Scientific | 249945 | |
| QuantiFluor dsDNA System | Promega | E2670 | Quantification of DNA concentartion |
| Agarose | BioRad | 1613100 | Agarose gel electrophoresis |
| 50x TAE buffer | BioRad | 1610743 | Agarose gel electrophoresis |
| T4 Polynucleotide Kinase | Thermo Fisher Scientific | EK0031 | |
| T4 DNA Ligase | Thermo Fisher Scientific | EL0014 |
References
- Neill, J. TACKLING DRUG-RESISTANT INFECTIONS GLOBALLY: FINAL REPORT AND RECOMMENDATIONS. Review on Antimicrobal Resistance. , (2016).
- Palmer, A. C., Kishony, R. Understanding, predicting and manipulating the genotypic evolution of antibiotic resistance. Nat Rev Genet. 14 (4), 243-248 (2013).
- MacLean, R. C., Hall, A. R., Perron, G. G., Buckling, A. The population genetics of antibiotic resistance: integrating molecular mechanisms and treatment contexts. Nat Rev Genet. 11 (6), 405-414 (2010).
- Buckling, A., Maclean, R. C., Brockhurst, M. A., Colegrave, N. The Beagle in a bottle. Nature. 457 (7231), 824-829 (2009).
- Barrick, J. E., Lenski, R. E. Genome dynamics during experimental evolution. Nature Reviews Genetics. 14 (12), 827-839 (2013).
- Elena, S. F., Lenski, R. E. Evolution experiments with microorganisms: The dynamics and genetic bases of adaptation. Nature Reviews Genetics. 4 (6), 457-469 (2003).
- Lenski, R. E., Rose, M. R., Simpson, S. C., Tadler, S. C. Long-Term Experimental Evolution in Escherichia coli. I. Adaptation and Divergence During 2,000 Generations. The American Naturalist. 138 (6), 1315-1341 (1991).
- Bennett, A. F., Dao, K. M., Lenski, R. E. Rapid evolution in response to high-temperature selection. Nature. 346 (6279), 79-81 (1990).
- Bell, G. Evolutionary rescue and the limits of adaptation. Philosophical Transactions of the Royal Society B-Biological Sciences. 368 (1610), (2013).
- Bell, G., Gonzalez, A. Adaptation and Evolutionary Rescue in Metapopulations Experiencing Environmental Deterioration. Science. 332 (6035), 1327-1330 (2011).
- Bell, G., Gonzalez, A. Evolutionary rescue can prevent extinction following environmental change. Ecology Letters. 12 (9), 942-948 (2009).
- San Millan, A., Escudero, J. A., Gifford, D. R., Mazel, D., MacLean, R. C. Multicopy plasmids potentiate the evolution of antibiotic resistance in bacteria. Nature Ecology & Evolution. 1, 0010 (2016).
- Alekshun, M. N., Levy, S. B. Molecular mechanisms of antibacterial multidrug resistance. Cell. 128 (6), 1037-1050 (2007).
- Ochman, H., Lawrence, J. G., Groisman, E. A. Lateral gene transfer and the nature of bacterial innovation. Nature. 405 (6784), 299-304 (2000).
- Carattoli, A. Plasmids and the spread of resistance. Int J Med Microbiol. 303 (6-7), 298-304 (2013).
- Smillie, C., Garcillán-Barcia, M. P., Francia, M. V., Rocha, E. P., de la Cruz, F. Mobility of plasmids. Microbiol Mol Biol Rev. 74 (3), 434-452 (2010).
- San Millan, A., Heilbron, K., Maclean, R. C. Positive epistasis between co-infecting plasmids promotes plasmid survival in bacterial populations. ISME J. , (2013).
- Stoesser, N., et al. Evolutionary History of the Global Emergence of the Escherichia coli Epidemic Clone ST131. MBio. 7 (2), (2016).
- San Millan, A., et al. Multiresistance in Pasteurella multocida is mediated by coexistence of small plasmids. Antimicrob Agents Chemother. 53 (8), 3399-3404 (2009).
- Escudero, J. A., et al. Unmasking the ancestral activity of integron integrases reveals a smooth evolutionary transition during functional innovation. Nat Commun. 7, 10937 (2016).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (12), 6640-6645 (2000).
- Chaveroche, M. K., Ghigo, J. M., d'Enfert, C. A rapid method for efficient gene replacement in the filamentous fungus Aspergillus nidulans. Nucleic Acids Res. 28 (22), 97 (2000).
- Le Roux, F., Binesse, J., Saulnier, D., Mazel, D. Construction of a Vibrio splendidus mutant lacking the metalloprotease gene vsm by use of a novel counterselectable suicide vector. Appl Environ Microbiol. 73 (3), 777-784 (2007).
- Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; 19th ed. Approved standard M100-S19. , Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA, USA. (2009).
- Lindsey, H. A., Gallie, J., Taylor, S., Kerr, B. Evolutionary rescue from extinction is contingent on a lower rate of environmental change. Nature. 494 (7438), 463-467 (2013).
- Deatherage, D. E., Barrick, J. E. Identification of mutations in laboratory-evolved microbes from next-generation sequencing data using breseq. Methods Mol Biol. 1151, 165-188 (2014).
- Barrick, J. E., et al. Identifying structural variation in haploid microbial genomes from short-read resequencing data using breseq. BMC Genomics. 15, 1039 (2014).
- Salverda, M. L., De Visser, J. A., Barlow, M. Natural evolution of TEM-1 β-lactamase: experimental reconstruction and clinical relevance. FEMS Microbiol Rev. 34 (6), 1015-1036 (2010).
- Ramirez, M. S., Tolmasky, M. E. Aminoglycoside modifying enzymes. Drug Resist Updat. 13 (6), 151-171 (2010).
- Jerison, E. R., Desai, M. M. Genomic investigations of evolutionary dynamics and epistasis in microbial evolution experiments. Current Opinion in Genetics & Development. 35, 33-39 (2015).
- Toll-Riera, M., San Millan, A., Wagner, A., MacLean, R. C. The Genomic Basis of Evolutionary Innovation in Pseudomonas aeruginosa. PLoS Genet. 12 (5), 1006005 (2016).
