Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Testing Multicopy plasmider rolle i utviklingen av antibiotikaresistens

Published: May 2, 2018 doi: 10.3791/57386
Automatic Translation
1,2, 3, 4
1Department of Animal Health, Universidad Complutense de Madrid, 2Visavet Health Surveillance Centre, Universidad Complutense de Madrid, 3Department of Zoology, University of Oxford, 4Department of Microbiology, Hospital Universitario Ramon y Cajal (IRYCIS) and CIBERESP

Summary

Her presenterer vi en eksperimentell metode for å teste multicopy plasmider rolle i utviklingen av antibiotikaresistens.

Abstract

Multicopy plasmider er svært rikelig i prokaryoter, men deres rolle i bakteriell utviklingen fortsatt dårlig forstått. Vi har nylig viste at økningen i genet kopi tall per celle fra multicopy plasmider kunne akselerere utviklingen av plasmider-kodet gener. I dette arbeidet presenterer vi en eksperimentell system for å teste muligheten for multicopy plasmider å fremme genet evolusjon. Bruke enkel molekylærbiologi metoder, bygget vi et modellsystem der en antibiotikaresistens genet kan settes inn i Escherichia coli MG1655, i kromosomet eller på en multicopy plasmider. Vi bruker en eksperimentell utviklingen tilnærming overføres de ulike stammene under økende konsentrasjoner av antibiotika og vi måle overlevelse av bakteriell befolkninger over tid. Valg av antibiotika molekylet og motstand genet er slik at genet kan bare tildele motstand gjennom oppkjøpet av mutasjoner. Denne "evolusjonære redde" gir en enkel metode for å teste potensialet i multicopy plasmider å fremme oppkjøpet av antibiotikaresistens. I neste trinn av eksperimentelle kjennetegnes molekylær baser av antibiotikaresistens. For å identifisere mutasjoner ansvarlig for anskaffelsen av antibiotikaresistens bruker vi dyp DNA sekvensering av prøver innhentet fra hele befolkninger og kloner. Til slutt, for å bekrefte rollen mutasjoner i genet under studien, vi rekonstruere dem i foreldrenes bakgrunnen og teste motstand fenotypen av de resulterende stammene.

Introduction

Antibiotikaresistens i bakterier er store helsemessige problem1. På et grunnleggende nivå er spredning av antibiotikaresistens i patogene bakterier et enkelt eksempel på evolusjon ved naturlig utvalg2,3. Enkelt sagt, genererer bruk av antibiotika valg for resistente bakteriestammer. Et sentralt problem i evolusjonsbiologi, er derfor å forstå faktorene som påvirker evnen til bakteriell bestander å utvikle resistens mot antibiotika. Utvalg eksperimenter har dukket opp som et svært kraftig verktøy for å undersøke evolusjonsbiologi av bakterier, og dette feltet har produsert utrolige innsikt i en rekke evolusjonære problemer4,5,6. I eksperimentelle evolusjon, er bakteriell bestander startet fra en enkelt foreldrenes stamme serielt passaged under definerte og strengt kontrollert. Noen av mutasjoner som oppstår under veksten av disse kulturene øke bakteriell fitness, og disse spres gjennom kulturer ved naturlig utvalg. Under eksperimentet beholdes regelmessig cryogenically prøver av befolkningen for å opprette en ikke-utvikling frosne fossil posten. Et bredt antall tilnærminger kan brukes til å karakterisere utvikling bakteriell befolkninger, men de to vanligste metodene er fitness analyser, som måler evnen av utviklet bakterier for å konkurrere mot deres fjerne forfedre og hele genomet sekvensering, som er brukes til å identifisere genetiske endringer som stasjonen tilpasning. Etter pionerarbeid av Richard Lenski og kolleger7,8, standard tilnærmingen i eksperimentell utvikling har vært å utfordre et relativt lite antall Repliker populasjoner (vanligvis < 10) med å tilpasse seg en ny miljøbestemte utfordringen, som nye karbon kilder, temperatur eller en ROV phage.

Infeksjoner forårsaket av antibiotika resistente bakterier blir et stort problem når motstand er høy nok til at det ikke er mulig å øke antibiotikumet konsentrasjonene dødelige nivåer i pasienten vev. Klinikere er derfor interessert i hva gjør bakterier utvikle seg mot høye doser av antibiotika som er over denne terskelen antibiotika konsentrasjon, klinisk stoppunktet. Hvordan å studere dette eksperimentelt? Hvis et lite antall bakteriell populasjoner er utfordret med en høy dose av antibiotika, som en Lenski-stil er eksperimentet, så mest sannsynlig utfall at antibiotikaet vil drive alle befolkningen til utryddelse. Samtidig, hvis dosen av antibiotika som brukes er lav, under den minimale inhibitoriske konsentrasjonen (MIC) av foreldrenes belastningen, er det usannsynlig at bakteriell befolkningen vil utvikle seg klinisk relevante nivåer av motstand, særlig hvis motstand har en stor kostnad. En kompromiss mellom disse to scenariene er å bruke en «evolusjonære redde» experiment9,10,11. I denne tilnærmingen, et stort antall kulturer (vanligvis > 40) blir utfordret med doser av antibiotika som øker over tid, vanligvis ved å doble antibiotika konsentrasjon hver dag12. Kjennetegnet med dette eksperimentet er at en befolkning som ikke utvikles økt vil bli drevet til utryddelse. De fleste populasjoner som er utfordret på denne måten vil bli drevet utdødd, men en liten minoritet beholdes ved utvikler høye nivåer av motstand. I dette papiret viser vi hvordan denne eksperimentell design kan brukes å undersøke multicopy plasmider bidrag til utviklingen av motstand.

Bakterier erverve resistens mot antibiotika gjennom to viktigste ruter, chromosomal mutasjoner og oppkjøpet av mobile genetiske elementer, hovedsakelig plasmider13. Plasmider spille en nøkkelrolle i utviklingen av antibiotikaresistens fordi de er i stand til å overføre motstand gener mellom bakterier ved Bøyning14,15. Plasmider kan deles inn i to grupper i henhold til deres størrelse og biologi: "små", med høy kopi nummer per bakterielle celler og "stor", med lav kopiere nummer16,17. Rollen til store plasmider i utviklingen av antibiotikumet motstand har blitt grundig dokumentert fordi de inneholder konjugerbart plasmider, som viktige drivere av formidling av motstand og multi motstand blant bakterier15. Små multicopy plasmider er også svært vanlig bakterier17,18, og de koden ofte for antibiotikaresistens gener19. Men har rollen som små multicopy plasmider i utviklingen av antibiotikumet motstand vært studert i mindre grad.

I en nylig arbeid foreslått vi at multicopy plasmider kunne akselerere utviklingen av gener de bærer ved å øke gen mutasjon priser på grunn av høyere genet kopi per celle12. Bruke en eksperimentell modell med E. coli belastning MG1655 og β-lactamase gene blaTEM-1 ble det vist at multicopy plasmider akselerert frekvensen av utseendet på TEM-1 mutasjoner overdragelse motstand mot den tredje generasjonen cephalosporin ceftazidime. Disse resultatene indikerte at multicopy plasmider kan spille en viktig rolle i utviklingen av antibiotikaresistens.

Her presenterer vi en detaljert beskrivelse av metoden vi har utviklet å undersøke multicopy plasmider-mediert utviklingen av antibiotikaresistens. Denne metoden har tre ulike trinn: først, innsetting av genet under studien i en multicopy plasmider eller kromosomet av verten bakterier. Andre bruk av eksperimentelle evolusjon (evolusjonære redning) å vurdere potensialet i forskjellige stammene til å tilpasse seg seleksjonspress. Og tredje, bestemme molekylær grunnlaget underliggende plasmider-mediert utviklingen med DNA sekvensering og rekonstruere mistenkt mutasjoner individuelt i foreldrenes genotype.

Til slutt, selv om protokollen beskrevet her ble utformet å undersøke utviklingen av antibiotikaresistens, man kan hevde at denne metoden kunne vanligvis nyttig å analysere utviklingen av innovasjoner kjøpt av mutasjoner i alle multicopy plasmider-kodet genet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. bygging av eksperimentelle koding antibiotikaresistens genet

Merk: Her E. coli MG1655 ble brukt som mottaker belastningen av plasmider - eller kromosom-kodet antibiotikaresistens genet. Antibiotikaresistens genet er kodet i kromosomet eller en multicopy plasmider i en ellers isogenic belastning (figur 1).

  1. Innsetting av antibiotikaresistens genet i λ phage integrasjon nettsted (attB)20 av kromosom av MG1655.
    1. Forsterke 500 bp lange regioner på begge sider av chromosomal attB siden av PCR. Bruk oligonucleotides YbhC-F (5'-CCTGTACCGTACAGAGTAAT-3 ") og attB-R (5'-GCCCGCCACCCTCCGGGCCGGTATAAAAAAGCAGGCTTCA-3") for venstre homologi regionen og attB-F (5'-AGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTATACTAACTTGAGCGAAA-3 ") og YbhB/R (5'- TGGCGATAATATTTCACCGC-3') etter den rette. Forsterke blaTEM-1 motstand genet bruker primer Tem1-pBAD-F (5'-TGAAGCCTGCTTTTTTATACCGGCCCGGAGGGTGGCGGGC-3 ") og Tem1-pBAD-R (5'-TTTCGCTCAAGTTAGTATAAGGAGCGGGCGCTAGGGCGCT-3"). Utforme primere med ca 20 bp (i 5' slutten) av viser komplementaritet til fragment som skal være del.
    2. Sikring homologi områder på antibiotikaresistens genet PCR produktet (inkludert promoter regionen) bruker isotermiske montering21, ved 50 ° C i 30 min.
    3. Electroporate MG1655 i cellene som inneholder plasmider pKOBEG.
      Merk: pKOBEG er en thermosensitive vektor som inneholder λ røde maskiner, fremme homologi-baserte allel utveksling mellom kromosom og PCR produkter22.
      1. Bruke 1 µL av produktet fra trinn 1.1.223 i 40 µL av electrocompetent celler i 2 mm cuvettes på 4 ° C og 2.5 kV. Resuspend celler i 1 mL av LB kjøttkraft + 0,2% arabinose å opprettholde uttrykk for λ røde maskiner.
      2. Overføre det totale volumet til et microfuge rør og ruge 2t på 30 ° C (ettergivende temperatur for pKOBEG) med intens skjelvende (200 rpm i en orbital shaker) for å tillate fenotypiske uttrykket av motstanden merkene som ble satt i kromosomet.
      3. Plate cellene i LB agar som inneholder det aktuelle antibiotikumet til å velge for antibiotikaresistens genet (ampicillin eller carbenicillin på 100 mg/l for blaTEM-1).
    4. Plate 100 µL på ettall bensin fat, og spinne ned resten av volumet, resuspend det i 100 µL av fersk LB kjøttkraft og plate det på en annen Petriskål. Ruge over natten på 42 ° C.
      Merk: Denne temperaturen er uten tillatelse for replikering av pKOBEG. Koloniene stand til å vokse i disse forholdene vil ha mistet pKOBEG og vil presentere motstand genet integrert i attB området (for enkelhet denne stammen kalles MG1655::resA herfra).
    5. Test for tap av pKOBEG ved å replikere koloniene interesse plater med chloramphenicol (antibiotika mot hvilke pKOBEG inneholder merketråd motstand).
      Merk: Mangel på vekst i chloramphenicol plater på ettergivende temperaturen av 30 ºC er indikativ av fraværet av plasmider.
    6. For å verifisere kloner, PCR forsterke konstruksjonen ved hjelp eksterne primere YbhC-Extern (5'-TTTGTGACCAGAAGACCGCA-3') og YbhB-Extern (5'-CTCATCAGTAACGATCTGCG-3'), kontroller gjennom gel geleelektroforese riktig størrelse amplicon og sekvens av renset produkt for å sikre at sekvensen av innsatte genet er riktig.
  2. Sett antibiotikaresistens genet i en multicopy plasmider.
    Merk: Ettersom plasmider med svært høy kopi nummer tendens til å innføre en stor reduksjon i bakteriell vert fitness, anbefaler vi bruk av multicopy plasmider med et naturlig opprinnelse av replikering, som p3655 (pSU18T-pBADgfp2, ColE1-type opprinnelsen til replikering24). Disse plasmider vanligvis til stede en moderat kopien antall om 15-20 eksemplarer per celle.
    1. PCR forsterke antibiotikaresistens genet valgfrihet (inkludert promoter regionen), phosphorylate PCR produktet og ligate det til PCR-forsterket ryggraden i plasmider:
      1. PCR forsterke antibiotikaresistens genet; blaTEM-1 bruker primer Tem1-pBAD-F (5'-TGAAGCCTGCTTTTTTATACCGGCCCGGAGGGTGGCGGGC-3 ") og Tem1-pBAD-R (5'-TTTCGCTCAAGTTAGTATAAGGAGCGGGCGCTAGGGCGCT-3").
      2. Phosphorylate renset produktet bruker T4 polynucleotide kinase, følg produsentens instruksjoner.
      3. PCR forsterke plasmider ryggraden ved hjelp av et Hi-Fi-utvalg og oligonucleotides pBAD-F (5'-CGTTGATCGGCACGTAAGAG-3 ") og pBAD-R (5'-AAACGACGGCCAGTGCCAAG-3").
      4. Ligate både PCR fragmenter ved hjelp av T4-ligase etter produsentens retningslinjer.
    2. Electroporate, som beskrevet tidligere, 40 µL electrocompetent E. coli DH5-α celler med maksimalt 1 µL ligatur og velg de aktuelle antibiotika for antibiotikaresistens genet (ampicillin eller carbenicillin på 100 mg/L for blaTEM-1) og plasmider ryggraden.
      Merk: Supplere LB med arabinose her er unødvendig.
    3. Pakk plasmider ved hjelp av kommersielle mini prep kit av reader's choice:
      1. Høste 5 mL av en overnatting kultur av sentrifugering 12.000 x g ved romtemperatur. Resuspend cellene i 250 µL rørets løsning og bland godt. Legge til 250 µL lysis løsning og bland godt. Legge til 350 µL av nøytralisering og bland godt.
      2. Overføre nedbryting til kolonnen for DNA-binding med settet, sentrifuge for 1 min og kast flyten gjennom. Vask dobbelt kolonnen med 500 µL av vask løsning, sentrifugering i ett minutt og forkaster flowthrough hver vask. Sentrifuge tomme kolonnen 1 ekstra min fjerne gjenværende vaske bufferen.
      3. Plasser kolonnen i en ren rør og legge til 50 µL ultra rent vann membranen til elute renset DNA. Sentrifuge for 1-2 min og samle flyten gjennom som inneholder den renset plasmider. Sanger sekvens genet av interesse i plasmider bruker primere fra utenfor innsatte sekvensen for å bekrefte at sekvensen er riktig og at det finnes uten mutasjoner i genet motstand før utviklingen eksperimenter.
    4. Når sekvensen kontrolleres, electroporate plasmider i E. coli MG1655 belastningen, som beskrevet ovenfor.
      Merk: Dette gir belastning MG1655/pRESA.

2. evolusjonære redning tilnærming til eksperimentelt utvikle antibiotikaresistens (figur 1)

  1. Strek ut stammene under studien på LB plater: MG1655::resA og MG1655/pRESA pluss utsatt foreldrenes belastningen, MG1655.
    Merk: Plasmider pRESA bør være stabile i MG1655, så det er ikke nødvendig å legge til antibiotika LB platene. Mutasjon priser i E. coli er lav nok så når byggingen er bekreftet det ikke er nødvendig å kontrollere plasmider rekkefølge på hvert trinn.
  2. Forberede 96-brønns plater med 200 µL av LB i hver brønn og vaksinere 48 isolert kolonier av hver stamme i uavhengige brønner (én plate per belastning). Inkuber platene overnatting på 37 ° C og 200 rpm. Holde en frossen lager av populasjonene grunnlegger.
    Merk: For å forebygge og kontrollere for kultur kryssforurensning i 96-brønnen platene, bruke et sjakkbrett plate design av intercalating inokulerte brønner med bakterier-free medium i 96-brønnen platen. Bruk denne platen design i hele eksperimentelle utviklingen.
  3. Start evolusjonære redning eksperimentet ved å vaksinere 2 µL fra hver brønn av platene med grunnlegger befolkningen i nye 96-brønns plater med 198 µL av LB i hver brønn med en sub-inhibitory konsentrasjon av antibiotika under studien. For evolusjonære redning tilnærming starte med ¼ eller 1/8 av minimal inhibitoriske konsentrasjon (MIC, bestemmes tidligere25) av antibiotika i LB for hver av de tre stammene og dobbel konsentrasjonen av antibiotika daglig. Bruk denne fremgangsmåten til å maksimere sjansene for bestander å erverve motstand mutasjoner26. Inkuber platene på 37 ° C og 200 rpm for 20 h.
    Merk: Måle overnatting OD grunnlegger befolkninger. Hvis det er betydelige forskjeller i OD blant stammer korrigere den første inoculum å starte eksperimentet med samme antall celler per brønn.
  4. Hver dag, måle OD hver befolkningen etter overnatting kultur og utføre en overføring av kulturer, som beskrevet i 2.3, til nye 96-brønns plater med dobbelt konsentrasjonen av antibiotikaet enn dagen før. Inkuber platene 20t på 37 ° C og 200 rpm.
    Merk: Fortynningsfaktoren for 1: 100 produserer ca 6-7 generasjoner per dag.
  5. Parallelt, overføres kontroll bestander av hver stamme i samme vilkår som beskrevet i 2.3 og 2,4, men i fravær av antibiotika.
    Merk: Kontroll bestander vil hjelpe forskjellsbehandle mutasjoner som oppstår på grunn av tilstedeværelsen av antibiotika og generell mutasjoner hjelpe bakterier til å tilpasse seg eksperimentelle forhold. Parallell mutasjoner som oppstår i fravær av antibiotika er sannsynlig å hjelpe bakterier til å tilpasse seg eksperimentelle forhold og ikke relatert til antibiotikaresistens.
  6. Spore antall gjenlevende populasjoner hver dag ved å måle absorbans ved en bølgelengde på 600 nm (OD) av kulturer likner en plate.
    Merk: Optisk densitet lavere enn 0,1 angi utryddelse av befolkningen. Se figur 2 et eksempel på overlevelse kurver.
  7. Holde en frossen lager av hele befolkningen regelmessig (hver 3-5 dager).
  8. Bruke Logg-rank tester [pakke "overlevelse" i RStudio (versjon 0.99.486)] for å finne statistiske forskjellen på overlevelse av populasjoner av ulike påkjenninger over tid under øker konsentrasjonen av antibiotika12.
    Merk: Dette eksperimentet vil avgjøre hvis multicopy plasmider forsterke utviklingen av antibiotikaresistens for bestemt antibiotika og gene under studien.

3. molekylær grunnlaget for utviklingen av antibiotikaresistens (figur 1)

  1. Utføre totale DNA utdrag fra nummer av befolkninger og kloner over stammer og behandlinger. Inkluderer de foreldre stammene (MG1655, MG1655::resA og MG1655/pRESA) skal kunne oppdage mutasjoner samler under eksperimentet.
    Merk: Eksempler på DNA utvinning kits se tabellen av materialer. Hver pakke har forskjellige protokoller; Følg produsentens instruksjoner.
  2. Kvantifisere DNA kvalitet og konsentrasjon. Det finnes ulike metoder for å bestemme DNA kvalitet og konsentrasjon. Bestemme kvaliteten måle prosenter av absorbansen 260 nm/280 nm og 260 nm/230 nm. Bruk en fluorescerende, DNA-bindende fargestoff måle DNA konsentrasjon følg produsentens instruksjoner, og agarose gel geleelektroforese å bekrefte at det er ingen degradering av DNA eller RNA forurensning.
  3. Bruk dyp DNA sekvensering fra prøver hele befolkninger og individuelle kloner for å undersøke genetisk grunnlag av antibiotikaresistens.
    Merk: Vi har utført alle sekvenser på Wellcome Trust Centre for Human Genetics, Oxford, Storbritannia. For mer informasjon se San møllen et al. 201612.
  4. Bruk breseq 0.26.1 rørledning27,28 å oppdage mutasjoner, bruke polymorfimodus til å beregne frekvensen av mutasjoner bestander. Sammenligne forskjellige utviklet genomer til foreldrenes genomet å oppdage mutasjoner som har akkumulert under eksperimentet.
  5. Sammenlign mutasjoner akkumulert parallelt kontroll bestander med de av befolkningen utviklet under øker konsentrasjonen av antibiotika for å skille mellom mutasjoner hjelpe bakterier til å tilpasse seg den generelle eksperimentelle forhold ( de fant kontroll bestander) og gjelder antibiotikaresistens (de funnet utelukkende i befolkningen utsatt for antibiotika press).
    Merk: Antall parallelle mutasjoner er vanligvis lav, så forskjellige parallelle mutasjoner mellom behandlingene lett kan vurderes. Bortsett fra mutasjoner i genet antibiotikaresistens studeres det er ganske sannsynlig å finne andre mutasjoner knyttet antibiotikaresistens i kromosomet, slik mutasjoner i porins eller middelklasseinnbyggere systemer12.
  6. Rekonstruere mutasjoner i genet antibiotikaresistens i foreldrenes belastning bruker den samme tilnærmingen i del 1 av denne protokollen. Følg punktene 1.1 og 1.2 av protokollen for å introdusere nye mutasjoner i foreldrenes bakgrunn (med utviklet gener som PCR mal). Analyser av antibiotikaresistens fenotyper av disse nye konstruksjoner å bekrefte rollen av mutasjoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I vår tidligere arbeid, ble utviklingen β-lactamase gene blaTEM-1 mot overdragelse motstand mot den tredje generasjon cephalosporin ceftazidime12 undersøkt. Dette genet ble valgt fordi, selv om TEM-1 privilegerer motstand mot ceftazidime, mutasjoner i blaTEM-1 kan utvide omfanget av aktiviteten til TEM-1 til hydrolyze cefalosporiner som ceftazidime29. Mutasjoner i antibiotikaresistens enzymer som β-lactamases eller aminoglycoside å endre enzymer fører til endringer i deres utvalg av aktivitet er vanlige29,30. Dette eksperimentelle systemet er ideelt for å utforske utviklingen av denne typen enzymer. En detaljert rapport av et vellykket forsøk etter denne protokollen se San møllen et al. 201612.

Her vises et eksempel på mulige utfall av eksperimentelle systemet for å illustrere protokollen (Merk at dataene som brukes i dette eksemplet ikke er ekte). Undersøke den potensielle rollen multicopy plasmider i utviklingen av antibiotikaresistens genet under studere i dette (la oss kalle det resA), vi utvikle eksperimentelle systemet etter § 1 i protokollen beskrevet ovenfor. Eksperimentene produsere tre stammer: MG1655, MG1655::resA og MG1655/pRESA. Utviklingen av resistens mot to forskjellige ß-Laktam antibiotika (ceftazidime og meropenem) ble testet følge fremgangsmåten beskrevet i § 2 i protokollen. Figur 2 viser den overlevelse kurver av befolkningen under studien. I dette eksemplet er det en betydelig økning i overlevelse av befolkningen tilhører MG1655/pRESA utvikling i ceftazidime sammenlignet med de fra MG1655 eller MG1655::resA (Logg-rank test, P< 0,05). Derimot, når det gjelder meropenem, det er ingen betydelige forskjeller i overlevelse av befolkningen tilhører de ulike stammene (Logg-rank test, P> 0,05). Derfor tyder disse resultatene på at tilstedeværelsen av genet resA i en multicopy plasmider potentiates utviklingen av motstand ceftazidime men ikke meropenem.

I det siste trinnet av eksperimentet, er molekylær grunnlag av antibiotikaresistens undersøkt, som beskrevet i del 3 av protokollen. Først vil DNA sekvensering avdekke mutasjoner i resA som kan være ansvarlig for motstand fenotypen. Og andre rekonstruksjon av resA mutasjoner i foreldrenes MG1655 (både i kromosom og plasmider) vil bekrefte eller forkaste sin rolle på antibiotikaresistens fenotypen.

Figure 1
Figur 1 . Skjematisk fremstilling av de ulike fasene av protokollen. Fra venstre til høyre: (i) bygging av eksperimentelle: MG1655, MG1655::resA og MG1655/pRESA. Bakteriell kromosom er representert i brunt, plasmider i blått og resA genet i rødt. (ii) evolusjonære redning tilnærming til eksperimentelt utvikle antibiotikaresistens: flere populasjoner av ulike stammer overføres under øker konsentrasjonen av antibiotikaet. (iii) analyse av molekylære grunnlag av antibiotikaresistens: sekvensering av DNA prøver fra utviklet bestander og kloner, oppdagelsen av mutasjoner antibiotikaresistens og rekonstruksjon av disse mutasjoner i foreldrenes belastningen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2. Overlevelse kurver med økende konsentrasjoner av antibiotika. Representasjon av hvor mange levedyktige bestander tilhører stammer MG1655, MG1655::resAog MG1655/pRESA over tid. 48 bestander av hver stamme ble overført under økende konsentrasjoner av antibiotika ceftazidime og meropenem, med 1/8 av MIC på dag 1 og doble antibiotika konsentrasjonen hver dag. Den rød, stiplet, loddrett linjen representerer MIC av antibiotika under studien. Ved ceftazidime er det betydelige forskjeller i overlevelse av befolkningen tilhører ulike stammer over tid (Logg-rank test, P< 0,05). Avgjørende, er bare bestander bærer plasmider kjøpedyktig overleve opp til høyt nivå konsentrasjoner av antibiotika. Derimot, når det gjelder meropenem, det er ingen betydelige forskjeller i overlevelse av ulike befolkningsgrupper over tid (Logg-rank test, P> 0,05). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi presenterer en ny protokoll kombinerer molekylærbiologi, eksperimentelle evolusjon og dyp DNA sekvensering utformet å undersøke rollen multicopy plasmider i utviklingen av antibiotikaresistens i bakterier. Selv om denne protokollen kombinerer teknikker fra ulike felt, alle metoder å utvikle den er enkel, og kan utføres i en vanlig mikrobiologi. De viktigste trinnene i protokollen er sannsynligvis byggingen av modellen systemet stammer og gjenoppbygging av mutasjoner observert etter eksperimentelle utviklingen (som utføres på nøyaktig samme måte). Men forenkler isotermiske montering system21, betydelig denne protokollen slik at brukere med et middels nivå av erfaring i molekylærbiologi kan implementere det.

En annen avgjørende skritt av protokollen er den eksperimentelle utviklingen under økende konsentrasjoner av antibiotika. Som et eksempel starter denne protokollen eksperimentet med ¼-1/8 på MIC av toner og deretter doblet konsentrasjonen av antibiotika hver dag. Men kan en lavere pris på antibiotika endring øke sjansen for evolusjonære redning fra utryddelse26. Graden av endring av antibiotikumet konsentrasjonene er derfor en av parametrene som kan endres for å fremme utviklingen av antibiotikaresistens.

DNA sekvensering og analyse er også viktige aspekter av eksperimentell design. Resultatene er enklere når sekvensering utføres på DNA-prøver både fra hele befolkninger og personlige kloner, på ulike tidspunkt i eksperimentet. Sekvensering resultater fra populasjoner vil avdekke generelle forskjeller i mutasjon profiler blant behandlinger, i tillegg til selektiv feier av gunstig mutasjoner over tid og potensielle hendelser klonal interferens. Når analysere sekvenser fra populasjoner, er det bedre å filtrere mutasjoner som aldri overgått 10% frekvensen i noen befolkningen. Sekvenser fra personlige kloner å bekrefte resultatene fra populasjoner og, viktigst, avslører de bestemte kombinasjonene mellom ulike mutasjoner observert på befolkningsnivå. Disse bestemte tilknytninger kan bidra til å avdekke epistatic vekselsvirkningene mellom mutasjoner, som spiller en avgjørende rolle i bakteriell tilpasning31.

Bruker denne metoden, har vi nylig vist at multicopy plasmider akselerere utviklingen av antibiotikaresistens, først ved å øke frekvensen av utseendet på romanen mutasjoner og deretter forsterke effekten av mutasjoner på grunn av økt genet dosering12 . Derfor vi utviklet som et verktøy for å undersøke utviklingen av antibiotikaresistens, men det kan ha et mye bredere spekter av programmer. Nemlig, kan dette systemet brukes til å undersøke muligheten for en bakteriell genet å utvikle seg mot nye eller forbedrede funksjon i en mer generell måte. Dette systemet kan for eksempel brukes til å teste muligheten for en metabolsk enzym/sti å bruke nye karbon underlag32. Også det kan brukes i stedet for hypermutators (bakterier med en defekt i cellulær systemer involvert i DNA mismatch reparasjon) å undersøke adaptive genet utviklingen i bakterier, unngå mutational bias introdusert av hypermutators.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av i Instituto de Salud Carlos III (planlegge Estatal de jeg + D + jeg 2013-2016): gir CP15-00012, PI16-00860 og CIBER (CB06/02/0053), delfinansiert av European utvikling regionale Fund '' en måte å oppnå Europa '' (ERDF). JAE støttes av Atracción de talento programmet av regjeringen i regionen Madrid (2016-T1/BIO-1105) og jeg + D Excelencia av den spanske Ministerio de Economía, Industria y Competitividad (BIO2017-85056-P). ASM støttes av et Miguel Servet fellesskap fra Instituto de Salud Carlos III (MS15/00012) co-finansiert av The European Social Fund "Investering i fremtiden" (ESF) og ERDF.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Thermocycler BioRad C1000
Electroporator BiorRad 1652660
Electroporation cuvettes Sigma-Aldrich Z706078
NanoDrop 2000/2000c Thermo Fisher Scientific ND-2000 Determine DNA quality measuring the ratios of absorbance 260nm/280nm and 260nm/230nm
Incubator Memmert UF1060
Incubator (shaker) Cole-Parmer Ltd SI500
Electrophoresis power supply BioRad 1645070 Agarose gel electrophoresis
Electrophoresis chamber BioRad 1704405 Agarose gel electrophoresis
Pippettes Biohit 725020, 725050, 725060, 725070
Multi-channel pippetes Biohit 728220, 728230,
728240
Plate reader Synergy HTX BioTek BTS1LF
Inoculating loops Sigma-Aldrich I8388
96-well plates Falcon 351172
LB BD Difco DF0446-17-3
LB agar Fisher scientific BP1425-500
Phusion Polymerase Thermo Fisher Scientific F533S
Gibson Assembly New England Biolabs E2611S
Resctriction enzymes Fermentas FastDigest
Antibiotics Sigma-Aldrich
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27104 Plasmid extraction kit
Wizard Genomic DNA Purification Kit Promega A1120 gDNA extraction kit
DNeasy Blood & Tissue Kits Qiagen 69506 gDNA extraction kit
Electroporation cuvettes Sigma-Aldrich Z706078
Petri dishes Sigma-Aldrich D9054
Cryotubes ClearLine 390701
96-well plates (-80ºC storage) Thermo Fisher Scientific 249945
QuantiFluor dsDNA System Promega E2670 Quantification of DNA concentartion
Agarose BioRad 1613100 Agarose gel electrophoresis
50x TAE buffer BioRad 1610743 Agarose gel electrophoresis
T4 Polynucleotide Kinase Thermo Fisher Scientific EK0031
T4 DNA Ligase Thermo Fisher Scientific EL0014

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Neill, J. TACKLING DRUG-RESISTANT INFECTIONS GLOBALLY: FINAL REPORT AND RECOMMENDATIONS. Review on Antimicrobal Resistance. , (2016).
  2. Palmer, A. C., Kishony, R. Understanding, predicting and manipulating the genotypic evolution of antibiotic resistance. Nat Rev Genet. 14 (4), 243-248 (2013).
  3. MacLean, R. C., Hall, A. R., Perron, G. G., Buckling, A. The population genetics of antibiotic resistance: integrating molecular mechanisms and treatment contexts. Nat Rev Genet. 11 (6), 405-414 (2010).
  4. Buckling, A., Maclean, R. C., Brockhurst, M. A., Colegrave, N. The Beagle in a bottle. Nature. 457 (7231), 824-829 (2009).
  5. Barrick, J. E., Lenski, R. E. Genome dynamics during experimental evolution. Nature Reviews Genetics. 14 (12), 827-839 (2013).
  6. Elena, S. F., Lenski, R. E. Evolution experiments with microorganisms: The dynamics and genetic bases of adaptation. Nature Reviews Genetics. 4 (6), 457-469 (2003).
  7. Lenski, R. E., Rose, M. R., Simpson, S. C., Tadler, S. C. Long-Term Experimental Evolution in Escherichia coli. I. Adaptation and Divergence During 2,000 Generations. The American Naturalist. 138 (6), 1315-1341 (1991).
  8. Bennett, A. F., Dao, K. M., Lenski, R. E. Rapid evolution in response to high-temperature selection. Nature. 346 (6279), 79-81 (1990).
  9. Bell, G. Evolutionary rescue and the limits of adaptation. Philosophical Transactions of the Royal Society B-Biological Sciences. 368 (1610), (2013).
  10. Bell, G., Gonzalez, A. Adaptation and Evolutionary Rescue in Metapopulations Experiencing Environmental Deterioration. Science. 332 (6035), 1327-1330 (2011).
  11. Bell, G., Gonzalez, A. Evolutionary rescue can prevent extinction following environmental change. Ecology Letters. 12 (9), 942-948 (2009).
  12. San Millan, A., Escudero, J. A., Gifford, D. R., Mazel, D., MacLean, R. C. Multicopy plasmids potentiate the evolution of antibiotic resistance in bacteria. Nature Ecology & Evolution. 1, 0010 (2016).
  13. Alekshun, M. N., Levy, S. B. Molecular mechanisms of antibacterial multidrug resistance. Cell. 128 (6), 1037-1050 (2007).
  14. Ochman, H., Lawrence, J. G., Groisman, E. A. Lateral gene transfer and the nature of bacterial innovation. Nature. 405 (6784), 299-304 (2000).
  15. Carattoli, A. Plasmids and the spread of resistance. Int J Med Microbiol. 303 (6-7), 298-304 (2013).
  16. Smillie, C., Garcillán-Barcia, M. P., Francia, M. V., Rocha, E. P., de la Cruz, F. Mobility of plasmids. Microbiol Mol Biol Rev. 74 (3), 434-452 (2010).
  17. San Millan, A., Heilbron, K., Maclean, R. C. Positive epistasis between co-infecting plasmids promotes plasmid survival in bacterial populations. ISME J. , (2013).
  18. Stoesser, N., et al. Evolutionary History of the Global Emergence of the Escherichia coli Epidemic Clone ST131. MBio. 7 (2), (2016).
  19. San Millan, A., et al. Multiresistance in Pasteurella multocida is mediated by coexistence of small plasmids. Antimicrob Agents Chemother. 53 (8), 3399-3404 (2009).
  20. Escudero, J. A., et al. Unmasking the ancestral activity of integron integrases reveals a smooth evolutionary transition during functional innovation. Nat Commun. 7, 10937 (2016).
  21. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  22. Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (12), 6640-6645 (2000).
  23. Chaveroche, M. K., Ghigo, J. M., d'Enfert, C. A rapid method for efficient gene replacement in the filamentous fungus Aspergillus nidulans. Nucleic Acids Res. 28 (22), 97 (2000).
  24. Le Roux, F., Binesse, J., Saulnier, D., Mazel, D. Construction of a Vibrio splendidus mutant lacking the metalloprotease gene vsm by use of a novel counterselectable suicide vector. Appl Environ Microbiol. 73 (3), 777-784 (2007).
  25. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; 19th ed. Approved standard M100-S19. , Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA, USA. (2009).
  26. Lindsey, H. A., Gallie, J., Taylor, S., Kerr, B. Evolutionary rescue from extinction is contingent on a lower rate of environmental change. Nature. 494 (7438), 463-467 (2013).
  27. Deatherage, D. E., Barrick, J. E. Identification of mutations in laboratory-evolved microbes from next-generation sequencing data using breseq. Methods Mol Biol. 1151, 165-188 (2014).
  28. Barrick, J. E., et al. Identifying structural variation in haploid microbial genomes from short-read resequencing data using breseq. BMC Genomics. 15, 1039 (2014).
  29. Salverda, M. L., De Visser, J. A., Barlow, M. Natural evolution of TEM-1 β-lactamase: experimental reconstruction and clinical relevance. FEMS Microbiol Rev. 34 (6), 1015-1036 (2010).
  30. Ramirez, M. S., Tolmasky, M. E. Aminoglycoside modifying enzymes. Drug Resist Updat. 13 (6), 151-171 (2010).
  31. Jerison, E. R., Desai, M. M. Genomic investigations of evolutionary dynamics and epistasis in microbial evolution experiments. Current Opinion in Genetics & Development. 35, 33-39 (2015).
  32. Toll-Riera, M., San Millan, A., Wagner, A., MacLean, R. C. The Genomic Basis of Evolutionary Innovation in Pseudomonas aeruginosa. PLoS Genet. 12 (5), 1006005 (2016).

Tags

Genetikk problemet 135 plasmider antibiotikaresistens evolusjon evolusjonære redning multicopy plasmider mutasjon eksperimentelle evolusjon
Testing Multicopy plasmider rolle i utviklingen av antibiotikaresistens
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Escudero, J. A., MacLean, R. C., San … More

Escudero, J. A., MacLean, R. C., San Millan, A. Testing the Role of Multicopy Plasmids in the Evolution of Antibiotic Resistance. J. Vis. Exp. (135), e57386, doi:10.3791/57386 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter