Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Test af flerkopiværktøj plasmider rolle i udviklingen af antibiotikaresistens

Published: May 2, 2018 doi: 10.3791/57386
Automatic Translation
1,2, 3, 4
1Department of Animal Health, Universidad Complutense de Madrid, 2Visavet Health Surveillance Centre, Universidad Complutense de Madrid, 3Department of Zoology, University of Oxford, 4Department of Microbiology, Hospital Universitario Ramon y Cajal (IRYCIS) and CIBERESP

Summary

Her præsenterer vi en eksperimentel metode til at teste flerkopiværktøj plasmider rolle i udviklingen af antibiotikaresistens.

Abstract

Flerkopiværktøj plasmider er meget rigelige i prokaryoter, men deres rolle i bakteriel evolution forbliver dårligt forstået. Vi viste for nylig, at stigningen i gen kopi antallet pr. celle leveres af flerkopiværktøj plasmider kunne fremskynde udviklingen af plasmid-kodede gener. I dette arbejde præsenterer vi en eksperimentel system for at teste flerkopiværktøj plasmider evne til at fremme gen evolution. Ved hjælp af simple molekylærbiologiske metoder, konstrueret vi en modelsystem hvor en antibiotisk resistens gen kan indsættes i Escherichia coli MG1655, enten i kromosom eller på en flerkopiværktøj plasmid. Vi bruger en eksperimentel udvikling tilgang til at udbrede de forskellige stammer under stigende koncentrationer af antibiotika og vi måle overlevelse af bakteriel befolkning over tid. Valget af antibiotikum molekylet og resistens-genet er således at genet kan kun giver resistens gennem erhvervelse af mutationer. Denne "evolutionære rescue" tilgang giver en enkel metode til at teste flerkopiværktøj plasmider potentiale til at fremme erhvervelse af antibiotikaresistens. I det næste trin i den eksperimentelle system, er det molekylære grundlag af antibiotikaresistens karakteriseret. For at identificere mutationer ansvarlig for erhvervelse af antibiotikaresistens bruger vi dybe DNA-sekventering af prøver fra hele befolkninger og kloner. Endelig, for at bekræfte rollen af mutationer i gen under undersøgelsen, vi rekonstruere dem i forældrenes baggrunden og teste resistens Fænotypen af de resulterende stammer.

Introduction

Antibiotikaresistens i bakterier er en større sundhed problem1. På et grundlæggende niveau er udbredelsen af antibiotisk resistens i patogene bakterier et simpelt eksempel på evolution ved naturlig udvælgelse2,3. Put blot, genererer brugen af antibiotika udvalg for resistente bakteriestammer. Et centralt problem i evolutionær biologi, er derfor at forstå de faktorer, der påvirker evnen af bakteriel befolkning at udvikle resistens over for antibiotika. Udvalg eksperimenter er dukket op som en meget kraftfuldt værktøj til at undersøge den evolutionære biologi af bakterier, og feltet har produceret utrolig indsigt i en bred vifte af evolutionære problemer4,5,6. I eksperimentel udvikling, er bakteriel populationer startet fra en enkelt forældrenes stamme seriefremstillede passaged defineret og stramt kontrollerede betingelser. Nogle af de mutationer, der opstår under væksten af disse kulturer øge bakteriel fitness, og disse spredes gennem kulturer ved naturlig udvælgelse. Under eksperimentet, er prøver af befolkningerne periodisk cryogenically bevaret for at skabe en ikke-udviklende frosne levesteder. En lang række metoder kan bruges til at karakterisere udvikler sig bakteriel befolkninger, men de to mest almindelige metoder er fitness assays, der måler udviklet bakterier evne til at konkurrere mod deres fjerne forfædre, og hele genome sequencing, der er bruges til at identificere de genetiske ændringer at drive tilpasning. Efter banebrydende arbejde Richard Lenski og kolleger7,8, standardmetoden i eksperimentel udvikling har været at udfordre et relativt lille antal Repliker populationer (typisk < 10) med tilpasning til en ny miljømæssige udfordringer, såsom nye CO2-kilder, temperatur eller en aggressiv phage.

Infektioner forårsaget af antibiotika-resistente bakterier blive et stort problem, når modstand er høj nok, at det ikke er muligt at øge antibiotikum koncentrationen til dødelige niveauer i patient væv. Klinikere er derfor interesseret i hvad gør det muligt for bakterier til at udvikle resistens over for høje doser af antibiotika, der ligger over denne tærskel antibiotikum koncentration, den kliniske pausepunkt. Hvordan man studerer dette eksperimentelt? Hvis et lille antal af bakteriel befolkning er udfordret med en høj dosis af antibiotika, som i en Lenski-stil er eksperimentet, så det mest sandsynlige resultat at antibiotika vil drive alle befolkningerne til at uddø. På samme tid, hvis dosis af antibiotika, der anvendes er lav, under den minimale hæmmende koncentration (MIC) af forældrenes stammen, er det usandsynligt, at de bakterielle befolkninger vil udvikle sig klinisk relevante niveauer af modstand, især hvis modstand bærer en store omkostninger. Et kompromis mellem disse to scenarier er at bruge en "evolutionære rescue" eksperiment9,10,11. I denne tilgang, et meget stort antal kulturer (typisk > 40) udfordres med doser af antibiotika, der stige over tid, typisk ved at fordoble antibiotikum koncentration hver dag12. Kendetegnende for dette eksperiment er, at en befolkning, der ikke udvikles øget modstand vil være tvunget til at uddø. De fleste populationer, der bliver udfordret på denne måde vil blive drevet uddød, men et lille mindretal bliver stadig af udvikler sig høje niveauer af resistens. I dette papir viser vi, hvordan denne eksperimentelle design kan bruges til at undersøge flerkopiværktøj plasmid bidrag til udviklingen af resistens.

Bakterier erhverve antibiotikaresistens gennem to vigtigste ruter, kromosomale mutationer og erhvervelse af mobile genetiske elementer, for det meste plasmider13. Plasmider spiller en central rolle i udviklingen af antibiotikaresistens, fordi de er i stand til at overføre resistensgener mellem bakterier af konjugation14,15. Plasmider kan opdeles i to grupper efter deres størrelse og Biologi: "små", med høj kopi nummer pr. bakteriel celle og "store", med lav kopier nummer16,17. Rollen som store plasmider i udviklingen af antibiotikaresistens er dokumenteret grundigt, fordi de omfatter konjugering plasmider, som er de vigtigste drivkræfter for formidling af modstand og multi modstand blandt bakterier15. Lille flerkopiværktøj plasmider er også meget udbredt i bakterier17,18, og de kode ofte for antibiotisk resistens gener19. Men rollen som små flerkopiværktøj plasmider i udviklingen af antibiotikaresistens er blevet undersøgt i et mindre omfang.

I en nylig arbejde, vi har foreslået at flerkopiværktøj plasmider kunne fremskynde udviklingen af de gener, de bærer ved at øge gene mutation satser på grund af højere gen kopi antallet pr. celle12. Ved hjælp af en eksperimentel model med E. coli stamme MG1655 og β-lactamase-gen blaTEM-1 blev det vist, at flerkopiværktøj plasmider accelereret satsen for udseendet af TEM-1 mutationer giver resistens over for den tredje generations cephalosporin ceftazidime. Disse resultater viste, at flerkopiværktøj plasmider kan spille en vigtig rolle i udviklingen af antibiotikaresistens.

Vi præsenterer her, en detaljeret beskrivelse af den metode, vi har udviklet sig til at undersøge den flerkopiværktøj plasmid-medieret evolution af antibiotikaresistens. Denne metode har tre forskellige trin: første, indsættelse af gen under undersøgelse enten i en flerkopiværktøj plasmid eller kromosom af vært bakterierne. Andet, brug af eksperimentelle evolution (evolutionære rescue) til at vurdere de forskellige stammer til at tilpasse sig til det selektive pres. Og tredjedel, fastlægge det molekylære grundlag underliggende plasmid-medieret evolution ved hjælp af DNA sekvensering og rekonstruere de formodede mutationer individuelt i forældrenes genotype.

Endelig, selv om protokollen beskrevet her var designet til at undersøge udviklingen af antibiotikaresistens, kan man hævde, at denne metode kunne være generelt nyttige til at analysere udviklingen af innovationer erhvervet af mutationer i et udskriftsjob plasmid-kodede genet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. opførelse af eksperimenterende systemet kodning antibiotisk resistens gen

Bemærk: Her E. coli MG1655 blev brugt som det modtagende stamme af antibiotisk resistens-genet plasmid - eller kromosom-kodet. Antibiotisk resistens-genet er kodet i kromosom eller et flerkopiværktøj plasmid i en ellers isogene stamme (figur 1).

  1. Indsættelse af antibiotisk resistens-genet i λ phage integration websted (attB)20 af kromosom af MG1655.
    1. Forstærke 500 bp-lange regioner på begge sider af den kromosomale attB websted ved PCR. Bruge oligonukleotider YbhC-F (5'-CCTGTACCGTACAGAGTAAT-3') og attB-R (5'-GCCCGCCACCCTCCGGGCCGGTATAAAAAAGCAGGCTTCA-3') til venstre homologi region og attB-F (5'-AGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTATACTAACTTGAGCGAAA-3') og YbhB/R (5'- TGGCGATAATATTTCACCGC-3') for rigtig. Forstærke blaTEM-1 resistens-genet ved hjælp af primere Tem1-pBAD-F (5'-TGAAGCCTGCTTTTTTATACCGGCCCGGAGGGTGGCGGGC-3') og Tem1-pBAD-R (5'-TTTCGCTCAAGTTAGTATAAGGAGCGGGCGCTAGGGCGCT-3'). Design primere med ca 20 bp (i 5' ende) af sekvens viser komplementaritet til det fragment, der gonna være smeltet til.
    2. Fuse homologi regioner på antibiotisk resistens gen PCR produktet (herunder dens promotor-regionen) ved hjælp af isotermisk forsamling21, ved 50 ° C i 30 min.
    3. Electroporate MG1655 celler indeholdende plasmidet pKOBEG.
      Bemærk: pKOBEG er en thermosensitive vektor, der indeholder λ røde maskiner, fremme homologi-baserede allel udvekslinger mellem kromosom og PCR produkter22.
      1. Brug 1 µL af produktet fra trin 1.1.223 40 µL electrocompetent celler i 2 mm kuvetter ved 4 ° C og 2,5 kV. Resuspend celler i 1 mL af LB bouillon + 0,2% arabinose at opretholde udtryk for λ røde maskiner.
      2. Overføre de samlede til et mikrofuge rør og inkuberes 2 h ved 30 ° C (eftergivende temperatur for pKOBEG) med intens ryster (200 rpm i en orbitalryster) for at muliggøre den fænotypiske udtryk for modstand markører indsat i kromosom.
      3. Plade celler på LB-agar indeholdende den passende antibiotikaet vælge for antibiotisk resistens-genet (ampicillin eller carbenicillin på 100 mg/l for blaTEM-1).
    4. Plade 100 µL på en petriskål, og spin-ned resten af volumen, resuspend det i 100 µL af frisk LB bouillon og plade det på en anden petriskål. Der inkuberes natten over ved 42 ° C.
      Bemærk: Denne temperatur er ikke-eftergivende for replikering af pKOBEG. Kolonier kunne vokse i disse betingelser vil have mistet pKOBEG og vil præsentere resistens gen integreret i attB site (for enkelhed denne stamme vil blive kaldt MG1655::resA herfra).
    5. Test for tab af pKOBEG ved at gentage kolonierne af interesse i plader med chloramphenicol (antibiotikum mod hvilke pKOBEG indeholder en modstand markør).
      Bemærk: Manglende vækst i chloramphenicol plader på den eftergivende temperatur af 30 ºC er vejledende af fravær af plasmidet.
    6. For at kontrollere kloner, PCR forstærke konstruktionen ved hjælp af eksterne primere YbhC-Extern (5'-TTTGTGACCAGAAGACCGCA-3') og YbhB-Extern (5'-CTCATCAGTAACGATCTGCG-3'), kontrollere gennem gelelektroforese den korrekte størrelse af amplikon og rækkefølgen de renset produkt for at sikre, at rækkefølgen af det indsatte gen er korrekte.
  2. Indsæt antibiotisk resistens-genet i en flerkopiværktøj plasmid.
    Bemærk: Fordi plasmider med meget høj kopi nummer har tendens til at indføre en stor reduktion i bakteriel vært fitness, anbefaler vi brug af flerkopiværktøj plasmider med en naturlig oprindelse af replikering, såsom p3655 (pSU18T-pBADgfp2, ColE1-type oprindelse af replikering24). Disse plasmider normalt præsentere en moderat kopi nummer på omkring 15-20 kopier pr. celle.
    1. PCR forstærke antibiotisk resistens-genet valg (herunder promotor-regionen), phosphorylate PCR produkt og ligate det til PCR-forstærket rygraden af plasmidet:
      1. PCR forstærke antibiotisk resistens gen; for blaTEM-1 bruger primere Tem1-pBAD-F (5'-TGAAGCCTGCTTTTTTATACCGGCCCGGAGGGTGGCGGGC-3') og Tem1-pBAD-R (5'-TTTCGCTCAAGTTAGTATAAGGAGCGGGCGCTAGGGCGCT-3').
      2. Phosphorylate renset produktet ved hjælp af T4 polynucleotide kinase, efter fabrikantens anvisninger.
      3. PCR forstærke plasmid rygraden ved hjælp af en high-fidelity polymerase og oligonukleotider pBAD-F (5'-CGTTGATCGGCACGTAAGAG-3') og pBAD-R (5'-AAACGACGGCCAGTGCCAAG-3').
      4. Ligate begge PCR fragmenter med T4-ligase efter producentens retningslinjer.
    2. Electroporate, som beskrevet tidligere, 40 µL af electrocompetent E. coli DH5-α celler med et maksimum på 1 µL af ligatur produkt og vælg på de relevante antibiotika for antibiotisk resistens-genet (ampicillin eller carbenicillin på 100 mg/L for blaTEM-1) og plasmid rygraden.
      Bemærk: Supplere LB med arabinose her er unødvendige.
    3. Uddrag plasmid ved hjælp af kommercielle mini prep kit af reader's choice:
      1. Høste 5 mL af en overnight kultur ved centrifugering på 12.000 x g ved stuetemperatur. Resuspend celler i 250 µL af resuspension løsning og bland godt. Tilsæt 250 µL af lysis løsning og bland godt. Tilføje 350 µL af neutralisering og bland godt.
      2. Overføre supernatanten til kolonnen DNA bindende forsynet med kit, centrifugeres i 1 min og kassér flow gennem. Vaskes to gange kolonnen med 500 µL af vask løsning, centrifugering i et minut og kassere flowthrough ved hver vask. Der centrifugeres den tomme kolonne for 1 ekstra min at fjerne resterende vask buffer.
      3. Placere kolonnen i en ren rør og tilsæt 50 µL af ultra rent vand til membranen at eluere oprenset DNA. Der centrifugeres i 1-2 min og indsamle flow igennem, der indeholder den renset plasmid. Sanger sekvens gen af interesse i plasmid ved hjælp af primere fra uden for den indsatte sekvens til at bekræfte at sekvensen er korrekt og at ingen mutationer er til stede i resistens-genet før evolution eksperimenter.
    4. Når sekvensen er kontrolleret, electroporate plasmid i E. coli MG1655 stamme, som beskrevet ovenfor.
      Bemærk: Dette giver stamme MG1655/pRESA.

2. evolutionære Rescue tilgang til eksperimentelt udvikler resistens over for antibiotika (figur 1)

  1. Streak ud stammer under undersøgelse på LB plader: MG1655::resA og MG1655/pRESA plus den modtagelige forældrenes stamme, MG1655.
    Bemærk: Plasmid pRESA bør være stabil i MG1655, så der er ingen grund til at tilføje antibiotika til LB-plader. Mutation priser i E. coli er lav nok, så når konstruktionen er bekræftet ikke er det nødvendigt at kontrollere plasmid sekvens på hvert trin.
  2. Forberede 96-brønd plader med 200 µL af LB i hver brønd og podes 48 isolerede kolonier af hver stamme i uafhængige wells (én plade pr. stamme). Der inkuberes natten over ved 37 ° C og 200 rpm plader. Holde en frossen bestand af disse grundlægger populationer.
    Bemærk: For at forebygge og kontrollere for kultur krydskontaminering i 96-brønd plader, bruge et skakternet plade design af intercalating podede brønde med bakterier-fri medium hele 96-brønd plade. Brug denne plade design i løbet hele eksperimentel udvikling.
  3. Start den evolutionære rescue eksperiment ved at vaccinere 2 µL fra hvert hul i pladerne med grundlægger populationer i nye 96-brønd plader med 198 µL af LB i hver brønd med en sub-hæmmende koncentration af antibiotika under undersøgelsen. For den evolutionære rescue tilgang starter med ¼ eller 1/8 af de minimale hæmmende koncentration (MIC, bestemmes tidligere25) af antibiotika i LB for hver af de tre stammer og dobbelt koncentrationen af antibiotika dagligt. Brug denne fremgangsmåde til at maksimere chancerne for befolkningen at erhverve modstand mutationer26. Inkuber plader ved 37 ° C og 200 rpm for 20 h.
    Bemærk: Måle overnight OD befolkningernes grundlægger. Hvis der er betydelige forskelle i OD blandt stammer korrigere den oprindelige inokulum for at starte eksperimentet med det samme antal celler pr. brønd.
  4. Hver dag, måle OD af hver befolkning efter natten kultur og udføre en overførsel af kulturerne, som beskrevet i punkt 2.3, at nye 96-brønd plader med dobbelt koncentration af antibiotika end dagen før. Inkuber plader 20 h ved 37 ° C og 200 rpm.
    Bemærk: 1: 100 fortyndingsfaktoren producerer ca 6-7 generationer pr. dag.
  5. Parallelt, udbrede kontrol populationer af hver stamme i de samme betingelser som beskrevet i 2.3 og 2.4, men i mangel af antibiotika.
    Bemærk: Kontrol befolkninger vil hjælpe forskelsbehandle mutationer opstår på grund af tilstedeværelsen af antibiotika og almindelige mutationer hjælper bakterier til at tilpasse sig de eksperimentelle betingelser. Parallelle mutationer opstår i fravær af antibiotika er tilbøjelige til at være med bakterier til at tilpasse sig de eksperimentelle betingelser og ikke relateret til antibiotikaresistens.
  6. Spore antallet af overlevende populationer hver dag ved måling af absorbans ved en bølgelængde på 600 nm (OD) kulturer ved hjælp af en Pladelæser.
    Bemærk: Ekstinktionen værdier lavere end 0,1 viser udryddelsen af befolkningen. Se figur 2 et eksempel på overlevelse kurver.
  7. Holde en frossen bestand af alle befolkninger med jævne mellemrum (hver 3-5 dage).
  8. Bruge log-rank test [pakke "overlevelse" i RStudio (Version 0.99.486)] til at bestemme statistiske forskelle i overlevelse af populationer af de forskellige stammer over tid under stigende koncentration af antibiotika12.
    Bemærk: Dette eksperiment vil bestemme hvis flerkopiværktøj plasmider forstærke udviklingen af antibiotikaresistens for bestemt antibiotika og gen under undersøgelsen.

3. molekylære grundlag for udviklingen af antibiotikaresistens (figur 1)

  1. Udføre samlede DNA-ekstraktion fra et repræsentativt antal befolkninger og kloner på tværs stammer og behandlinger. Omfatter de parental stammer (MG1655, MG1655::resA og MG1655/pRESA) at være i stand til at påvise mutationer akkumulere under eksperimentet.
    Bemærk: Eksempler på DNA udvinding kits i tabellen af materialer. Hvert sæt har forskellige protokoller; Følg producentens instruktioner.
  2. Kvantificere DNA kvalitet og koncentration. Der er forskellige metoder til at bestemme DNA kvalitet og koncentration. Bestemme kvaliteten måle forholdet mellem absorbans 260 nm/280 nm og 260 nm/230 nm. Bruge en fluorescerende, DNA-bindende farvestof til at måle DNA koncentration efter producentens anvisninger, og Agarosen gelelektroforese at bekræfte, at der er ingen forringelse af DNA eller RNA forurening.
  3. Brug dyb DNA-sekventering fra prøver af hele befolkninger og enkelte kloner til at undersøge det genetiske grundlag for resistens over for antibiotika.
    Bemærk: Vi har gennemført alle sekventering i Wellcome Trust Center for humangenetik, Oxford, UK. For flere detaljer se San Millan et al. 201612.
  4. Brug breseq 0.26.1 pipeline27,28 til at påvise mutationer, ved hjælp af polymorfi tilstand til at anslå hyppigheden af mutationer i populationer. Sammenlign de forskellige udviklet genomer til forældrenes genomet at påvise mutationer, der har akkumuleret under eksperimentet.
  5. Sammenlign mutationerne akkumuleret parallelt i kontrol befolkninger med dem af befolkningen udviklet sig under stigende koncentration af antibiotika for at skelne mellem mutationer hjælper bakterier til at tilpasse sig den generelle forsøgsbetingelser ( dem fundet i kontrol populationer) og involverede i antibiotikaresistens, (der findes udelukkende i populationer udsat for antibiotika pres).
    Bemærk: Antallet af parallelle mutationer er normalt lav, så forskellige parallelle mutationer mellem behandlinger kan vurderes nemt. Ud over mutationer i antibiotisk resistens-genet under undersøgelse det er meget sandsynligt at finde andre mutationer i forbindelse med antibiotikaresistens i kromosom, sådanne mutationer i porins eller efflux systemer12.
  6. Rekonstruere mutationer i antibiotisk resistens-genet i forældrenes stammen ved hjælp af den samme fremgangsmåde som i afsnit 1 i denne protokol. Følg punkt 1.1 og 1.2 protokol til at indføre de nye mutationer i forældrenes baggrunden (ved hjælp af de gener, der er udviklet som en PCR skabelon). Analysere antibiotikaresistens fænotyper af disse nye konstruktioner til at bekræfte rollen, mutationerne.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I vores tidligere arbejde, blev evolution β-lactamase-gen blaTEM-1 mod giver resistens over for den tredje generations cephalosporin ceftazidime12 undersøgt. Dette gen var udvalgt fordi, selv om TEM-1 ikke tillægger modstand mod ceftazidime, mutationer i blaTEM-1 kan udvide rækken af aktiviteten af TEM-1 at hydrolysere cefalosporiner såsom ceftazidime29. Mutationer i antibiotikaresistens enzymer såsom β-lactamaser eller aminoglycosid ændre enzymer medfører ændringer i deres sortiment af aktivitet er fælles29,30. Denne eksperimentelle system er ideelt til at udforske udviklingen af denne type af enzymer. For en detaljeret rapport over en vellykket eksperiment efter denne protokol Se San Millan mfl. 201612.

Her præsenteres et eksempel på de mulige resultater af dette eksperimentelle system Illustrer protokol (Bemærk at de data, der bruges i dette eksempel ikke er reelle). For at undersøge den potentielle rolle af udskriftsjob plasmider i udviklingen af antibiotikaresistens gen under undersøgelse i dette eksempel (Lad os kalde det resA), vi udvikle den eksperimentelle system efter § 1 i den protokol, der er beskrevet ovenfor. Forsøgene producere tre stammer: MG1655, MG1655::resA og MG1655/pRESA. Udviklingen af resistens over for to forskellige β-lactam antibiotika (ceftazidime og meropenem) blev testet efter trinene beskrevet i punkt 2 i protokollen. Figur 2 viser overlevelse kurver af befolkninger under undersøgelsen. I dette eksempel er der en betydelig stigning i overlevelse af befolkningen tilhører MG1655/pRESA udvikler sig i ceftazidime sammenlignet med dem fra MG1655 eller MG1655::resA (log-rank test, P< 0,05). På den anden side for meropenem, der er ingen væsentlige forskelle i overlevelse af befolkningen tilhører de forskellige stammer (log-rank test, P> 0,05). Derfor, disse resultater tyder på, at tilstedeværelsen af genet resA i en flerkopiværktøj plasmidet potentiates udviklingen af resistens ceftazidime men ikke meropenem.

I det sidste trin af eksperimentet undersøges det molekylære grundlag af antibiotikaresistens, som forklaret i punkt 3 i protokollen. Først, DNA-sekventering vil afsløre mutationer i resA , der kunne være ansvarlig for modstand fænotype. Og det andet genopbygningen af resA mutationer i den parental MG1655 (både i kromosom og plasmid) vil bekræfte eller kassere deres rolle på antibiotikaresistens fænotype.

Figure 1
Figur 1 . Skematisk fremstilling af de forskellige faser af protokollen. Fra venstre mod højre: (i) opbygningen af de eksperimentelle system: MG1655, MG1655::resA og MG1655/pRESA. Bakteriel kromosom er repræsenteret i brown, plasmid i blå og resA genet i rød. (ii) evolutionære rescue tilgang til eksperimentelt udvikler resistens over for antibiotika: flere bestande af de forskellige stammer er opformerede under stigende koncentration af antibiotika. (iii) analyser af det molekylære grundlag af antibiotikaresistens: sekventering af DNA prøver fra udviklet populationer og kloner, påvisning af antibiotikaresistens mutationer og genopbygning af disse mutationer i forældrenes stammen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2. Overlevelse kurver med stigende koncentrationer af antibiotika. Repræsentation af antallet af levedygtige populationer tilhører stammer MG1655, MG1655::resA, og MG1655/pRESA over tid. 48 populationer af hver stamme blev formeret under stigende koncentrationer af antibiotika ceftazidime og meropenem, startende med 1/8 af MIC på dag 1 og en fordobling af antibiotikum koncentration hver dag. En rød stiplet lodret linje repræsenterer MIC af antibiotika under undersøgelsen. Bemærk, at i tilfælde af ceftazidime betydelige forskelle i overlevelse af befolkningen tilhører forskellige stammer over tid (log-rank test, P< 0,05). Afgørende, er kun populationer transporterer plasmidet købedygtig overleve op til høje koncentrationer af antibiotikum. På den anden side for meropenem, der er ingen væsentlige forskelle i de forskellige befolkningers overlevelse over tid (log-rank test, P> 0,05). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi præsenterer en ny protokol kombinerer Molekylærbiologi, eksperimentel udvikling og dyb DNA-sekventering designet til at undersøge rollen af flerkopiværktøj plasmider i udviklingen af antibiotikaresistens i bakterier. Selv om denne protokol kombinerer teknikker fra forskellige felter, alle de metoder, der er nødvendige for at udvikle det er simpelt, og kan udføres i en regelmæssig Mikrobiologi laboratorium. De mest kritiske trin i protokollen er sandsynligvis opførelsen af model system stammer og genopbygningen af mutationer observeret efter eksperimentel udvikling (der udføres ved hjælp af den nøjagtige samme metode). Isotermisk forsamling system21, forenkler dog betydeligt denne protokol så enhver bruger med en mellemliggende niveau af erfaring i Molekylærbiologi kan gennemføre den.

En anden kritisk trin i protokollen er den eksperimentelle udvikling under stigende koncentrationer af antibiotika. Som et eksempel starter denne protokol eksperimentet med ¼-1/8 af MIC stammer og derefter fordobling af koncentrationen af antibiotika hver dag. Imidlertid kunne en lavere sats af antibiotika forandringer øge chancen for evolutionær redde fra udslettelse26. Ændring af antibiotika koncentrationer er derfor en af de parametre, der kan redigeres for at fremme udviklingen af antibiotikaresistens.

DNA-sekventering og analyse er også centrale aspekter af den eksperimentelle design. Resultaterne er mere ligetil, når sekventering udføres på DNA-prøver fra hele befolkninger og enkelte kloner, på forskellige tidspunkter i eksperimentet. Sekventering resultater fra befolkninger vil afsløre generelle forskelle i mutation profilerne blandt behandlinger samt selektiv fejer af gavnlige mutationer, som over tid og potentielle begivenheder af klonede indblanding. Når du analyserer sekvenser fra befolkningen, er det bedre at filtrere mutationer, der aldrig overgået 10% frekvens i en befolkning. Sekvenser fra enkelte kloner hjælpe bekræfte resultaterne fra populationer og, vigtigst, afslører de specifikke kombinationer mellem de forskellige mutationer observeret på befolkningsniveau. Disse særlige foreninger kan hjælpe afsløre epistatic interaktioner mellem mutationer, som spiller en afgørende rolle i bakteriel tilpasning31.

Brug denne metode, har vi for nylig vist at flerkopiværktøj plasmider fremskynde udviklingen af antibiotikaresistens, først ved at øge satsen for fremkomsten af nye mutationer og derefter ved at forstærke effekten af mutationer på grund af øget gen dosering12 . Derfor, vi udviklet metoden som et redskab til at undersøge udviklingen af resistens over for antibiotika, men det kan have en meget bredere vifte af applikationer. Nemlig, dette system kan anvendes til at undersøge enhver bakterielt gen evne til at udvikle sig hen imod en ny eller forbedret funktion i en mere generel måde. Dette system kunne for eksempel bruges til at teste en stofskiftevej enzym/evne til at bruge nye carbon substrater32. Også, det kan bruges i stedet for hypermutators (bakterier med en defekt i de cellulære systemer involveret i DNA uoverensstemmelse reparation) at undersøge adaptive gen evolution i bakterier, undgå mutationsmønstre bias indført ved hypermutators.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af Instituto de Salud Carlos III (planlægger Estatal de jeg + D + jeg 2013-2016): tilskud CP15-00012, PI16-00860 og CIBER (CB06/02/0053), medfinansieres af den europæiske regionale Udviklingsfond '' en måde at opnå Europa '' (EFRU). JAE understøttes af programmet Atracción de talento af regeringen i regionen Madrid (2016-T1/BIO-1105) og I + D Excelencia af den spanske Ministerio de Economía, Industria y Competitividad (BIO2017-85056-P). ASM understøttes af en Miguel Servet stipendium fra Instituto de Salud Carlos III (MS15/00012) medfinansieres af den Europæiske Socialfond "Investerer i din fremtid" (ESF) og EFRU.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Thermocycler BioRad C1000
Electroporator BiorRad 1652660
Electroporation cuvettes Sigma-Aldrich Z706078
NanoDrop 2000/2000c Thermo Fisher Scientific ND-2000 Determine DNA quality measuring the ratios of absorbance 260nm/280nm and 260nm/230nm
Incubator Memmert UF1060
Incubator (shaker) Cole-Parmer Ltd SI500
Electrophoresis power supply BioRad 1645070 Agarose gel electrophoresis
Electrophoresis chamber BioRad 1704405 Agarose gel electrophoresis
Pippettes Biohit 725020, 725050, 725060, 725070
Multi-channel pippetes Biohit 728220, 728230,
728240
Plate reader Synergy HTX BioTek BTS1LF
Inoculating loops Sigma-Aldrich I8388
96-well plates Falcon 351172
LB BD Difco DF0446-17-3
LB agar Fisher scientific BP1425-500
Phusion Polymerase Thermo Fisher Scientific F533S
Gibson Assembly New England Biolabs E2611S
Resctriction enzymes Fermentas FastDigest
Antibiotics Sigma-Aldrich
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27104 Plasmid extraction kit
Wizard Genomic DNA Purification Kit Promega A1120 gDNA extraction kit
DNeasy Blood & Tissue Kits Qiagen 69506 gDNA extraction kit
Electroporation cuvettes Sigma-Aldrich Z706078
Petri dishes Sigma-Aldrich D9054
Cryotubes ClearLine 390701
96-well plates (-80ºC storage) Thermo Fisher Scientific 249945
QuantiFluor dsDNA System Promega E2670 Quantification of DNA concentartion
Agarose BioRad 1613100 Agarose gel electrophoresis
50x TAE buffer BioRad 1610743 Agarose gel electrophoresis
T4 Polynucleotide Kinase Thermo Fisher Scientific EK0031
T4 DNA Ligase Thermo Fisher Scientific EL0014

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Neill, J. TACKLING DRUG-RESISTANT INFECTIONS GLOBALLY: FINAL REPORT AND RECOMMENDATIONS. Review on Antimicrobal Resistance. , (2016).
  2. Palmer, A. C., Kishony, R. Understanding, predicting and manipulating the genotypic evolution of antibiotic resistance. Nat Rev Genet. 14 (4), 243-248 (2013).
  3. MacLean, R. C., Hall, A. R., Perron, G. G., Buckling, A. The population genetics of antibiotic resistance: integrating molecular mechanisms and treatment contexts. Nat Rev Genet. 11 (6), 405-414 (2010).
  4. Buckling, A., Maclean, R. C., Brockhurst, M. A., Colegrave, N. The Beagle in a bottle. Nature. 457 (7231), 824-829 (2009).
  5. Barrick, J. E., Lenski, R. E. Genome dynamics during experimental evolution. Nature Reviews Genetics. 14 (12), 827-839 (2013).
  6. Elena, S. F., Lenski, R. E. Evolution experiments with microorganisms: The dynamics and genetic bases of adaptation. Nature Reviews Genetics. 4 (6), 457-469 (2003).
  7. Lenski, R. E., Rose, M. R., Simpson, S. C., Tadler, S. C. Long-Term Experimental Evolution in Escherichia coli. I. Adaptation and Divergence During 2,000 Generations. The American Naturalist. 138 (6), 1315-1341 (1991).
  8. Bennett, A. F., Dao, K. M., Lenski, R. E. Rapid evolution in response to high-temperature selection. Nature. 346 (6279), 79-81 (1990).
  9. Bell, G. Evolutionary rescue and the limits of adaptation. Philosophical Transactions of the Royal Society B-Biological Sciences. 368 (1610), (2013).
  10. Bell, G., Gonzalez, A. Adaptation and Evolutionary Rescue in Metapopulations Experiencing Environmental Deterioration. Science. 332 (6035), 1327-1330 (2011).
  11. Bell, G., Gonzalez, A. Evolutionary rescue can prevent extinction following environmental change. Ecology Letters. 12 (9), 942-948 (2009).
  12. San Millan, A., Escudero, J. A., Gifford, D. R., Mazel, D., MacLean, R. C. Multicopy plasmids potentiate the evolution of antibiotic resistance in bacteria. Nature Ecology & Evolution. 1, 0010 (2016).
  13. Alekshun, M. N., Levy, S. B. Molecular mechanisms of antibacterial multidrug resistance. Cell. 128 (6), 1037-1050 (2007).
  14. Ochman, H., Lawrence, J. G., Groisman, E. A. Lateral gene transfer and the nature of bacterial innovation. Nature. 405 (6784), 299-304 (2000).
  15. Carattoli, A. Plasmids and the spread of resistance. Int J Med Microbiol. 303 (6-7), 298-304 (2013).
  16. Smillie, C., Garcillán-Barcia, M. P., Francia, M. V., Rocha, E. P., de la Cruz, F. Mobility of plasmids. Microbiol Mol Biol Rev. 74 (3), 434-452 (2010).
  17. San Millan, A., Heilbron, K., Maclean, R. C. Positive epistasis between co-infecting plasmids promotes plasmid survival in bacterial populations. ISME J. , (2013).
  18. Stoesser, N., et al. Evolutionary History of the Global Emergence of the Escherichia coli Epidemic Clone ST131. MBio. 7 (2), (2016).
  19. San Millan, A., et al. Multiresistance in Pasteurella multocida is mediated by coexistence of small plasmids. Antimicrob Agents Chemother. 53 (8), 3399-3404 (2009).
  20. Escudero, J. A., et al. Unmasking the ancestral activity of integron integrases reveals a smooth evolutionary transition during functional innovation. Nat Commun. 7, 10937 (2016).
  21. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  22. Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (12), 6640-6645 (2000).
  23. Chaveroche, M. K., Ghigo, J. M., d'Enfert, C. A rapid method for efficient gene replacement in the filamentous fungus Aspergillus nidulans. Nucleic Acids Res. 28 (22), 97 (2000).
  24. Le Roux, F., Binesse, J., Saulnier, D., Mazel, D. Construction of a Vibrio splendidus mutant lacking the metalloprotease gene vsm by use of a novel counterselectable suicide vector. Appl Environ Microbiol. 73 (3), 777-784 (2007).
  25. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; 19th ed. Approved standard M100-S19. , Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA, USA. (2009).
  26. Lindsey, H. A., Gallie, J., Taylor, S., Kerr, B. Evolutionary rescue from extinction is contingent on a lower rate of environmental change. Nature. 494 (7438), 463-467 (2013).
  27. Deatherage, D. E., Barrick, J. E. Identification of mutations in laboratory-evolved microbes from next-generation sequencing data using breseq. Methods Mol Biol. 1151, 165-188 (2014).
  28. Barrick, J. E., et al. Identifying structural variation in haploid microbial genomes from short-read resequencing data using breseq. BMC Genomics. 15, 1039 (2014).
  29. Salverda, M. L., De Visser, J. A., Barlow, M. Natural evolution of TEM-1 β-lactamase: experimental reconstruction and clinical relevance. FEMS Microbiol Rev. 34 (6), 1015-1036 (2010).
  30. Ramirez, M. S., Tolmasky, M. E. Aminoglycoside modifying enzymes. Drug Resist Updat. 13 (6), 151-171 (2010).
  31. Jerison, E. R., Desai, M. M. Genomic investigations of evolutionary dynamics and epistasis in microbial evolution experiments. Current Opinion in Genetics & Development. 35, 33-39 (2015).
  32. Toll-Riera, M., San Millan, A., Wagner, A., MacLean, R. C. The Genomic Basis of Evolutionary Innovation in Pseudomonas aeruginosa. PLoS Genet. 12 (5), 1006005 (2016).

Tags

Genetik spørgsmålet 135 Plasmid antibiotikaresistens evolution evolutionær redning flerkopiværktøj plasmider mutation eksperimentel udvikling
Test af flerkopiværktøj plasmider rolle i udviklingen af antibiotikaresistens
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Escudero, J. A., MacLean, R. C., San … More

Escudero, J. A., MacLean, R. C., San Millan, A. Testing the Role of Multicopy Plasmids in the Evolution of Antibiotic Resistance. J. Vis. Exp. (135), e57386, doi:10.3791/57386 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter