Summary
De bouw van een 3D-printbaar hyperdrive presenteren wij met achttien onafhankelijk regelbare schutterijofficieren. De hyperdrive is ontworpen om hersenactiviteit in vrij ratten gedragen over een periode van enkele weken.
Abstract
Toezicht op de patronen van de activiteit van een grote populatie van neuronen over vele dagen in wakker dieren is een waardevolle techniek op het gebied van systemen neurowetenschappen. Een belangrijk onderdeel van deze techniek bestaat uit de nauwkeurige plaatsing van meerdere elektroden in gewenste hersengebieden en het behoud van hun stabiliteit. Hier beschrijven we een protocol voor de bouw van een 3D-printbaar hyperdrive, dat bestaat uit achttien onafhankelijk regelbare schutterijofficieren, en is speciaal ontworpen voor in vivo extracellulaire neurale opname in ratten vrij te gedragen. De schutterijofficieren gekoppeld aan de microdrives ofwel individueel kunnen worden gevorderd in meerdere hersengebieden langs het spoor, of kunnen worden gebruikt om een matrix van elektroden plaats in een kleiner gebied. De meerdere schutterijofficieren toestaan voor gelijktijdige behandeling van de action potentials uit tientallen individuele neuronen, evenals lokale veld potentieel van populaties van neuronen in de hersenen tijdens actieve gedrag. Bovendien voorziet het ontwerp in eenvoudigere 3D software die gemakkelijk kan worden gewijzigd voor de behoeften van de experimentele opstelling.
Introduction
Op het gebied van systemen neurowetenschappen bestuderen wetenschappers de neurale correlaten onderliggende cognitieve processen zoals ruimtelijke navigatie, geheugen en besluitvorming. Voor deze soorten studies is het cruciaal voor de activiteiten van veel individuele neuronen controleren tijdens een dierlijk gedrag. In de afgelopen decennia, twee belangrijke vooruitgang geboekt aan de experimentele behoeften voor extracellulaire neurale opname in kleine dieren1,2,3. Eerst was de ontwikkeling van de tetrode, een bundel van vier microwires gebruikt tegelijk opnemen van neurale activiteit van neuronen1,2,4. De differentiële signaal amplitudes van activiteit over de vier kanalen van een tetrode zorgt voor de isolatie van individuele neuron activiteit van veel tegelijk opgenomen cellen5. Verder staat de flexibele aard van de microwires grotere stabiliteit van de tetrode minimaliseren van de relatieve verplaatsing tussen de tetrode en de doelgroep van de cel. Schutterijofficieren worden nu veel gebruikt in plaats van een één-elektrode voor vele studies van de hersenen in verschillende soorten, waaronder knaagdieren1,2,6, primaten7en8van de insecten. Ten tweede de ontwikkeling van een hyperdrive droeg meerdere onafhankelijk van elkaar beweegbare schutterijofficieren, die zorgt voor de gelijktijdige bewaking van neurale activiteit van grotere populaties van neuronen van meerdere opname locaties3, 9,10,11,12.
De beschikbaarheid van een betrouwbare en betaalbare multi tetrode-opnameapparaat voor kleine dieren is beperkt. De klassieke hyperdrive, oorspronkelijk is ontwikkeld door Bruce McNaughton13, is met succes gebruikt voor neurale opnamen in vrij gedragen ratten in veel laboratoria in de afgelopen twee decennia9,10,14, 15. om technische redenen de originele onderdelen die nodig zijn om te bouwen van het station McNaughton zijn echter nu zeer moeilijk te verkrijgen en zijn niet compatibel met de onlangs verbeterde data-acquisitie-interfaces. Het andere goed aanvaarde ontwerp van hyperdrive vereist de microdrives tot individueel worden handgemaakt, die kon inconsistente resultaten opleveren en flink wat tijd12consumeren. Om te registreren neurale activiteit van verschillende hersengebieden bij gedragend ratten, ontwikkelden we een nieuwe hyperdrive met behulp van stereolithographic technologie. Wij willen aan de volgende eisen voldoen: (1) de nieuwe hyperdrive moet nauwkeurige verplaatsing van schutterijofficieren in de hersenen verlenen en stabiele opnemen van meerdere doelregio's; (2) de nieuwe hyperdrive moet verenigbaar zijn met de magnetische quickclip systeem onlangs ontwikkeld om gemakkelijk verbinding; en (3) de nieuwe hyperdrive kan nauwkeurig worden gereproduceerd met materialen die gemakkelijk beschikbaar zijn. Hier bieden we een techniek voor het bouwen van de 3D-printbaar hyperdrive met achttien onafhankelijk beweegbare schutterijofficieren, gebaseerd op het ontwerp McNaughton. In het protocol, beschrijven we de details van het fabricageproces van de nieuwe hyperdrive, waarmee we hebben met succes record single-neuron actie potentieel en lokale veld potentiëlen van de postrhinal en mediale Entorinale cortices weken in een vrij rat gedragen tijdens natuurlijke foerageren taken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Stereolithography van 3D-modellen
- Stereolithographic technieken gebruiken om af te drukken de hyperdrive onderdelen en accessoires. Elke hyperdrive bestaat uit achttien van/naar vliegveld, achttien shuttle bouten, en een voor elk van alle andere plastic stukken (Figuur 1).
Opmerking: De accessoires maken geen deel uit van de hyperdrive maar noodzakelijk zijn voor hyperdrive bouw.
2. voorbereiding van accessoires (Figuur 2).
-
Voorbereiding van het microdrive-rack (Figuur 2C).
- Schoon en uit te breiden van de kleinere via-gaten en de grotere blind-gaten in het rek met een boor van ø 0.71 mm (0.028") en een ø 0.84 mm (0.033") boor bits, respectievelijk.
- Snijd een ø 0,89 mm (0,035") lassen staaf in 17 mm lange segmenten, ronde van beide uiteinden en breng elke gids roerstaafje in de ø 0.84 mm (0.033") gaten op het rek, verlaten van 11,5 mm buiten (flush met de draadstangen).
- Volledig steek zes 0-80 schroefdraad, 15.88 mm (5/8") lange platte kop bouten naar beneden in de" slots "in het rek. Zorg ervoor dat de gids staven en draadstangen recht en evenwijdig aan elkaar. Vul de resterende ruimte in de sleuven met verdunde tandheelkundige cement. Lucht droog op een benchtop gedurende 15 minuten.
- Lijm de lassen staven en schroeven in het rack met dunne super lijm en in de lucht droog gedurende 15 minuten.
-
Voorbereiding van de kern-station (Figuur 2E).
- Rijg de vier gaten met een 2-56-kraan, en gebruik van 2-56, 4.76 mm (3/16") lange nylon schroeven aan het beveiligen van de kern in het station, indien nodig.
-
Voorbereiding van het hulpprogramma draaien (Figuur 2F).
- Rijg het gat op het handvat met een 4-40-kraan. Plaats de machinaal tip in de sleuf in het handvat en veilig met een 4-40, schroef voor de lange kop van de 4.76 mm (3/16").
-
Voorbereiding van de hyperdrive houder (Figuur 2 g).
- Rijg het schroefgat met een 8-32-kraan. Het gebruiken van een 8-32, 9.52 mm (3/8") lange nylon duim schroef ter beveiliging van de hyperdrive wanneer in gebruik.
-
Voorbereiding van de staaf positionering complex (Figuur 2 H).
- Rijg de vloeien voort uit de kant met het grotere gat (boven) met een 8-32-kraan tot een diepte van ongeveer 7 mm. draad de kleinere gaten (zes in de top, achttien in de bodem) met een tik 0-80. Vouw het centrale gat in de top met een boor ø 4.76 mm (3/16"), indien nodig.
- Monteren van de stam naar de top, met behulp van een 8-32, ø 4.76 mm (3/16"), 6.35 mm (1/4") lang schouder schroef. Beveilig de bodem naar de top met 0-80, 6.35 mm (1/4") lange schroeven wanneer in gebruik.
3. bereiding van de Hyperdrive onderdelen (Figuur 3).
- Voorbereiding van de hyperdrive moer (Figuur 3A).
- Draad met behulp van de houder van de moer (figuur 2D), de moer met een 3/8-24 dieptepunt kraan tot glad.
- Vergadering van de hyperdrive kern (Figuur 3B).
- Schoon en de gaten in de kern met behulp van verschillende grootte boor bits uit te breiden (twaalf grond draad door-holes (binnenring): ø 0.61 mm (0.024"); de achttien tetrode via-holes (middelste ring): ø 0,66 mm (0.026") eerst, en dan ø 0.71 mm (0.028 "); de achttien gids staaf blind-holes (buitenring): ø 0.84 mm (0.033")).
- Rijg de twee via-holes op de top van de kern en de resterende acht blind-holes (vier aan de kant, vier in de buurt van de onderkant) met één tikje 0-80. Gebruik een dieptepunt kraan voor de blinden-holes.
- Maken externe draden aan de voet van de kern met behulp van een 3/8-24 sterven. Het sterven wordt goed aanpassen zodat de hyperdrive moer over de nieuwe draden past.
- Afhankelijk van het aantal draden gewenst, invoegen van meerdere 6 mm lange segmenten van 23-gauge metalen buis (cannulas) in de grond draad gaten in de kern, grond lijmen ze indien nodig. Bestand van de uiteinden van de draad-cannulas van grond tot flush met de buitenkant van de kern, en reinig de cannulas met een ø 0.30 mm (0.012") stalen draad.
- Volledig invoegen achttien 0-80, 15.88 mm (5/8") lange platte kop schroeven hoofd naar beneden in de groeven in de kern. Buig de schroeven niet of beschadigen van de draden tijdens dit proces.
- Met behulp van de staaf positionering complex en het core-station, plaats van achttien 17 mm segmenten van ø 0,89 mm (0,035") lassen van stok over de gids staaf gaten in de kern en hamer hen af te spoelen met de schroeven (ongeveer 5 mm).
- Corrigeren van de posities van de lassen staven en schroeven, indien nodig, dan draai de schroef van de centrale schouder en de omliggende zes schroeven in de staaf positionering complexe teneinde de uiterlijke aanwijzingen van de staafjes in de kern. Schroef de moer op de kern (met de staaf positionering complexe) en de kern past de hyperdrive houder om gemakkelijker positionering onder een stereoscoop.
- Vul de sleuven met verdunde tandheelkundige cement voor de beveiliging van de schroeven aan de core en toestaan lucht drogen voor 15 min. vulling 2-3 "slots" op een moment voordat de tandheelkundige cement te dik wordt. Schaaf weg overtollige tandheelkundige cement op de kern te handhaven van een goede pasvorm met het schild.
- Lijm de schroeven en de stangen in de kern met dunne superlijm, toestaan lucht drogen gedurende 15 minuten.
- Vergadering van de microdrive (Figuur 3 c).
- Schoon en vouw de twee buitenste gaten in de shuttle met boor bits (kleiner gat: ø 0.61 mm (0.024") boor bits; groter gat: ø 0,89 mm (0,035") boor bits).
- Plaats de shuttle bout in de bout kaarthouder basis. Aandacht besteden aan de oriëntatie. Dicht de bout houder deksel, strak houdt en draad langzaam door het gat in het deksel met een tik 0-80. Tik op 2 - 3 keer tot glad.
- De shuttle bout invoegen de shuttle vanaf de kant met de kleinere opening. Plaats de shuttle-shuttle bout complexe ondersteboven in de microdrive verzamelplaats basis.
- Knip een 15 mm segment van 23 meter metalen buis en glad van beide uiteinden, dan plaatst u de buis op het gat ø 0.61 mm (0.024"), geleid door de sleuf op het station deksel. Hamer de canule in het gat, totdat de bovenkant uitgelijnd met het station deksel is.
- Verwijder de buitenste helft van het bovenste uiteinde van de canule met een schuren wiel. Reinig de canule met een metalen draad van ø 0.30 mm (0.012"). Lijm de canule op de shuttle met behulp van dunne superlijm, om ervoor te zorgen niet te lijmen van de bout van de shuttle naar de shuttle, en lucht droog gedurende 15 minuten.
- Bereiden van ten minste achttien microdrives, test de microdrive op het rek microdrive. Zorg ervoor dat de bout van de shuttle in de shuttle soepel draaien kan en dat de gehele microdrive vrij langs de lengte van de ankerstang beweegt.
- Voorbereiding van de centrale kolom (Afbeelding 3D).
- Zand de boven- en onderkant van de centrale kolom tot flat, indien nodig. Rijg de twee gaten in de centrale kolom met een tik 0-80. Invoegen van een 0-80 hex moer (3,18 mm (1/8") breed, 1.19 mm (3/64") hoge) in elke sleuf.
- Voorbereiding van het GLB hyperdrive (De 3E figuur).
- Met behulp van niet-magnetische pincet, lijm vier magneten (diameter 3 mm, 1 mm dik) in de vier putten, hen te vergelijken met de N en S stokken op de elektrode-interfacekaart.
- Vergadering van de cannulas van de gids in een bundel (Figuur 3F).
- Plaats achttien 30 steken per inch, dunne wand cannulas (ID 0,19 mm, 0.0075") in ø 2,29 mm (0.09") warmte-shrink buizen (3-5 mm lang, verdeeld uit elkaar langs de bundel door 5-10 mm). Controleer alle cannulas met elkaar aan de ene kant van de bundel spoelen.
- De heat-shrink buizen met behulp van een warmte-pistool totdat de bundel strak is krimpen. Knijp de bundel zachtjes om het gewenste (ronde of ovale) vorm te geven. Bevestigen dat alle cannulas in de juiste posities met geen draaien, kruising, of buigen.
- Mark van de (de) gebied(en) voor het solderen op de cannulas. Het unsoldered gedeelte moet 26 mm in lengte, terwijl het gesoldeerd gedeelte moet 5-10 mm. Zet de krimpende buizen solderen merken ter voorkoming van de verspreiding.
- Flux van toepassing op één solderen gebied en soldeer terwijl het draaien van de bundel. Koel bij kamertemperatuur voor ten minste 1 min. Herhaal deze stap om te solderen hetzelfde gebied twee keer. Glad het gesoldeerd gedeelte door solderen zonder toepassing van flux en vuller materiaal. Koel bij kamertemperatuur gedurende ten minste 1 min..
- Snijd de bundel op de juiste lengte met een diamant wiel op de hoogste snelheid, Pools beide eindigt de duur instellen (deel unsoldered: 26 mm, gesoldeerde onderdeel: 5-10 mm zoals gewenst). Reinig de gids cannulas met een metalen draad van ø 0.18 mm (0.007") onder een stereoscoop.
- Voorbereiding van de schutterijofficieren. Soortgelijke procedures zijn beschreven8,16,17 .
- De hoogte van de horizontale T-balk en de positie van de magnetische roerder, zodanig aanpassen dat de horizontale arm aan het Kruis van de T-bar direct boven het midden van de magneetroerder is. Sluit één uiteinde van een S-haak naar het midden van een kleine magnetische roer bar, waarna ze aan elkaar worden gelijmd. Reinig de tetrode ruimte met gecomprimeerde lucht en ethanol doekjes maken.
- Cirkel de twee uiteinden van een stuk van één tetrode samen draad van ongeveer 40 cm in lengte, dan beveiligen met een stukje koperen tape.
- Til de draad cirkel door het ingedrukt houden van de koperen tape. Plaats het uiteinde tegenover de koper tape op de horizontale arm van de T-bar. Verlagen van de koperen tape zachtjes (terwijl het andere uiteinde nog steeds op de T-balk is), draai eens en de koperen tape naar de T-balk te plaatsen. De cirkel van tetrode is nu in een cijfer acht ("∞")-configuratie met de koperen tape zit op de top van het Kruis van de horizontale balk.
- Houd de koper tape op de T-balk met de ene hand zachtjes. Met je andere hand, haak het vrije uiteinde van de S-haak (met een magnetische roer gekoppeld aan het andere uiteinde) via de onderkant van de cirkel van tetrode draad, zachtjes vrijlating van de S-haak en laat het rechttrekken van de vier draden door het gewicht van de S-haak.
- Pas de hoogte van de horizontale balk totdat de onderkant van de S-haak ongeveer 1 cm boven het midden van de plaat magneetroerder is.
- De rand van de koperen tape bukken om het veilig aan de rekstok. Onderzoeken van de vier rechte tetrode draden door oog en deze vervolgens verwijdert elke puin.
- Zet de roerder draaien van de vier draden met een snelheid van ongeveer 60 rpm, totdat de hoek tussen de twee tegenovergestelde niet getwist draden ongeveer 60 bedraagt °.
- De warmte-pistool ingesteld op 210 ° C, en warmte van de getwiste draden door het vegen van het pistool langs de rechte lengte van de draden vanuit verschillende invalshoeken voor 2 minuten om te smelten ze samen door het smelten van de VG bond vacht.
- Til de S-haak met roer voorzichtig en snijd het onderste uiteinde van de tetrode met fijne schaar.
- Houd de koper tape op de horizontale balk met een vinger, snijd de draden van beide randen van de koperen tape met een schaar en verwijder de koperen tape. Snijd de resterende draad op de horizontale balk om de tetrode vrij te geven.
- Plaats de voltooide tetrode in een Stuifdichte doos voor opslag. Bereiden ten minste vijfentwintig schutterijofficieren.
4. vergadering van de hyperdrive (Figuur 4).
- De gids cannulas invoegen in de hyperdrive kern (figuur 4A).
- Verwijderen van de heat-shrink buizen en schuif een segment 4 mm van Silicone slangen (ID 1,02 mm (0,04"), OD 2,16 mm (0.085")) langs de bundel naar de grens gesoldeerd/unsoldered. Wig de gleuf in de hyperdrive spacer om te verbreden het centrale gat, waardoor de spacer om uit te glijden rond de silicium-buis. Verwijder de wig wanneer het tussenstuk in het midden van de silicium-buis zit.
- Organiseren de posities van de cannulas van de gids in de bundel door het plaatsen van lange segmenten (10 cm) van de metalen draad van ø 0.18mm (0.007") door middel van elke canule in een specifieke tetrode gat in de kern van de hyperdrive, voorkomen van een cross-over van de draden of cannulas in het proces. Buig de uiteinden van de draden om hen te houden in de plaats.
- Duw de cannulas via hun respectieve gaten in de kern, voorzichtig om te voorkomen dat buigen of kruising tussen hen, totdat het vrije uiteinde van elke canule ten minste 2 mm buiten de bovenkant van het gat van tetrode is. Beveilig de spacer door de moer op de kern, voorzichtig om te voorkomen dat de spacer roterende schroeven. Een daling van zeer verdunde tandheelkundige cement van toepassing vanaf de bovenkant van de kern op de kruising van de cannulas teneinde hun relatieve positie.
- Knip de gids draden gesoldeerd na van de bundel, en hen uit de cannulas verwijderen door het intrekken van het vrije uiteinde.
- Vergadering van de microdrives op de hyperdrive Core (figuur 4B). Een gedetailleerde ruimtelijke rangschikking van de microdrives in de hyperdrive geweest eerder beschreven11,,13.
- Het laden van de microdrives langzaam en zorgvuldig op elke ankerstang van de kern. Bevestigen dat (1) de 23 microdrive meten canule verloopt in het gat van tetrode, (2) de 30 meten gids canule gaat in de 23 gauge microdrive canule soepel, en (3) de shuttle bout draait soepel langs de ankerstang. Schroef de microdrives tot 1.0-1.5 mm boven de onderkant van de draadstangen.
- Knip achttien stukken van polyimide buis (ID 0.11 mm (0.0045"), OD 0,14 mm (0.0055")) in segmenten van 38-43 mm (lengte van de gids canule bundel plus 7 mm). Reinig elke buis met een ø 0,08 mm (0.003") stalen draad.
- Omkeren van de kern, schuif de buizen van polyimide zorgvuldig in de gids cannulas gesoldeerd na, en duw ze allemaal de wijze onder een stereoscoop. Flip de kern rechtop en lijm het bovenste uiteinde van de buis van polyimide op de microdrive canule met dikke superlijm. Plaats de kern ondersteboven en laat de lijm drogen gedurende 15 minuten.
- Knip de extra polyimide buizen aan de bovenkant, het verlaten van 0.5-1.0 mm buiten de microdrive canule.
-
Vergadering van de draden (Figuur 4C).
- Snijd het aantal draden nodig om lengtes van 25-30 mm gecoat staaldraad (ø 0,20 mm (0.008"), kale ø gecoat 0.13 mm (0.005")). 2 mm van de kunststof isolatie van beide uiteinden van de draden strippen en steek het ene uiteinde van elk in de uiteinden van 6-8 mm lang 30 meter cannulas. De uiteinden van de cannulas teneinde de verbinding met hun respectieve draden afvlakken.
- Gebruik een Dremel gereedschap te snijden de cannulas in twee volledige draden maken vanuit elk de helft.
- Steek het ronde uiteinde van de canule 30 meter in het bovenste uiteinde van de canule draad grond in de kern en druk op om de invoeging strak.
-
Vergadering van de elektrode-interfacekaart (Figuur 4 d).
- Voeg de centrale kolom in de kern en veilig met twee 0-80, 7,94 mm (5/16") lange binnenzeskantbouten. Lijm indien nodig om de centrale kolom gestage in de kern.
- Vouw de delen van de "slots" in de EIB-72-QC-Large bestuur die overeenkomen met om de twee tikte gaten in de centrale kolom met een tik van de 1.2 mm ø. De elektrode-interfacekaart hechten aan de centrale kolom met twee 0-80, 3.97 mm (5/32") lange pan hoofd schroeven. Zorg ervoor dat het bord is gelegen in het centrum en is veilig.
-
Aansluiten van de draden (Figuur 4E).
- Route van elke draad van de grond rond de centrale kolom en sluit de blootgestelde vrije uiteinde aan op de elektrode-interfacekaart met een gouden speld op de aangewezen grond hole.
-
Laden van de schutterijofficieren in de hyperdrive, zoals eerder beschreven 16 , 17 .
- Elke tetrode zorgvuldig in de polyimide buizen van de microdrives, voorzichtig om niet te buigen ze tijdens het laden.
- Zachtjes feed het vrije uiteinde draden in hun aangewezen gaten in de elektrode-interface aan boord en ze elektrisch te verbinden met behulp van gouden spelden.
- Snijd de schutterijofficieren individueel tot een behoorlijke lengte. Bevestigen dat het gedeelte van schutterijofficieren uitsteken van de onderste uiteinden van de buizen van polyimide, na het uitsnijden rechte is, anders vervangen van de gehele tetrode en wegging.
-
Het koppelen van het schild.
- Bevestig het schild aan de kern met behulp van vier 0-80, 3.97 mm (5/32") pan hoofd schroeven. De nummers op het schild moet overeenkomen met de nummers op de elektrode-interfacekaart.
-
De tips van tetrode plating.
- Plaat van de toppen van de schutterijofficieren met behulp van het NanoZ plating apparaat uitgerust met een ADPT-NZ-EIB-36-connector en een ADPT-EIB-72-QC-HS-36 adapter17. U kunt ook plaat ze handmatig één voor één zoals elders beschreven16. Plaat de tetrode tips vóór gebruik (b.v., één dag vóór de implantatie), zoals impedantie geleidelijk in de tijd na de beplating toenemen zal. Vervang de schutterijofficieren die worden kortgesloten of belemmerd tijdens het proces van plating, snij ze aan een goede lengte, en opnieuw plaat.
-
Het finaliseren van de hyperdrive (Figuur 4F).
- Lijm de schutterijofficieren hun polyimide buizen als eerder beschreven16. Trekken ze allemaal terug in hun gids cannulas zodat de vergulde tips niet blootstaan.
- Schroef vier 0-80, 6.35 mm (1/4") lang binnenzeskantbouten in de vier gaten in de buurt van de onderkant van de hyperdrive kern.
- Met behulp van een stereoscoop, lagere elke tetrode langzaam totdat de punt van de tetrode net boven de rand van de canule gids is. Ondertussen, zoek de positie van elke tetrode in de bundel van de canule gids. De kaart van de tetrode van standpunt is essentieel voor de wederopbouw van sites opnemen.
- Hechten van het GLB aan het station en sla de hyperdrive goed voor de innesteling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We gebruikten een nieuwgebouwde hyperdrive om testresultaten te verkrijgen. De drive is uitgerust met schutterijofficieren opgebouwd uit ø 17 µm (0.0007"), polyimide beklede platina-iridium (90% - 10%) draad. De toppen van de schutterijofficieren werden verguld in platinazwart oplossing voor het verminderen van de impedances van de elektrode te tussen 100 en 200 kΩ op 1 kHz. De hyperdrive werd ingeplant 4.6 mm links van de middellijn en 0,5 mm anterior to de dwarse sinus op de schedel van een 550 g, mannelijke Long-Evans rat. Extra draden werden via het cerebellum verbonden met de schedel schroeven. Alle procedures werden uitgevoerd zoals goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van Baylor College of Medicine en leken op die eerder beschreven18. Onmiddellijk na de chirurgische implantatie, waren de schutterijofficieren 1 mm gevorderd in de hersenen. Op de daaropvolgende dagen, werden kleinere geavanceerde stappen van niet meer dan 80 µm gebruikt. De schutterijofficieren mochten om te stabiliseren na elke vooruitgang gedurende ten minste 20 uur voordat neurale opnames werden uitgevoerd.
Als u het opnemen van neurale activiteit, de hyperdrive was aangesloten op een voorversterker headstage (Neuralynx, HS-72-QC), en de laatste was verbonden met een data-acquisitiesysteem met programmeerbare versterkers (Neuralynx, digitale Lynx SX). Lokale veld mogelijkheden werden verwezen naar de grond draad, bemonsterd op 2 kHz, en band-pass gefilterd op 0.1 — 500 Hz. de eenheid activiteit werd verwezen naar een tetrode zonder waarneembare activiteit 500 µm van het oppervlak van de hersenen gelegen, bemonsterd op 32 kHz en band-pass gefilterd op 600 Hz - 6 kHz. Alleen spike golfvormen boven een drempel van 50 µV werden geregistreerd.
Figuur 5A illustreert neurale activiteit opgenomen van een tetrode gelegen in de postrhinal cortex (2.1 mm onder het oppervlak van de hersenen), terwijl het dier was vrij foerageren binnen een 1.5 m het openen drie weken na implantatie. De opnamesessie duurde ongeveer 30 minuten en de eenheden die zijn opgenomen in de hele sessie (gedemonstreerd door de kleine variatie in spike golfvormen) stabiel gebleven. Figuur 5B toont lokale veld potentieel opgenomen gelijktijdig van vier verschillende schutterijofficieren gelegen in de cortex (3.4-3.7 mm diep) van de mediale Entorinale terwijl hetzelfde dier was actief het verkennen van de open arena zeven weken na implantatie. Duidelijke veld potentiële activiteit in het frequentiebereik van de theta (6-10 Hz) was aanwezig. Individuele neuron spike gegevens was geïsoleerd met behulp van de sorteren software MClust (A.D. Redish), en lokale potentiële veldgegevens werd gevisualiseerd door aangepaste-geschreven Matlab scripts. Voorbeelden van lage kwaliteit tetrode opnamen, eventueel als gevolg van een slecht voorbereid drive, is gebleken dat eerder17.
Figuur 1: Hyperdrive onderdelen gecreëerd door stereolithographic technology. Afbeelding van de 3D-printbaar hyperdrive onderdelen (1¢ munt voor de vergelijking van de grootte). (A) de hyperdrive kernpopulatie; (B) het beschermend schild; (C) de beschermkap; (D) de centrale kolom; (E) de moer; (F) de spacer; (G) de shuttle; (H) de bout van de shuttle. Schaal bar: 1 cm. Deze onderdelen zijn gemaakt door een UnionTech RSPro450 printer met behulp van de kunststof Somos evolueren 128. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: douane-ontworpen accessoires voor hyperdrive bouw. Deze accessoires zijn speciaal ontworpen voor steun bij de voorbereiding van de hyperdrive. Hun belangrijkste onderdelen zijn gemaakt door stereolithographic afdrukken. (A) de shuttle bout houder, die de shuttle bout beveiligt tijdens het tikken van de draden. (B) de microdrive vergadering station, die het inbrengen van de canule in de shuttle begeleidt. (C) de microdrive rek, die helpt om te testen van de gemonteerde microdrives en houdt hen op zijn plaats tijdens het verlijmen van de cannulas. 1: een microdrive rek basis; 2: een microdrive rack met schroeven volledig ingevoegd in de "slots"; 3: een microdrive rack klaar voor gebruik. (D) de moer houder, waarin de hyperdrive moer wanneer threading van het gat. (E) de kern hyperdrive station, dat de kern terwijl de gids staven hameren beveiligt. (F) het draaien tool, die rijdt de shuttle bout om te draaien in de shuttle. (G) de hyperdrive houder, die helpt om de hyperdrive onder een stereoscoop. De houder beschermt ook de schutterijofficieren nadat zij zijn geweest in de hyperdrive geladen. (H) de staaf positionering complex, die helpt om de draadstangen en begeleiden van staven in de hyperdrive kern. 1: belangrijke onderdelen van het complex; 2: het bovenste gedeelte van het complex na montage; 3: een staaf positionering complex in gebruik. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: voorbereiding van de hyperdrive delen vóór montage. Afbeeldingen tonen het voorbereidingsproces van de hyperdrive kern en de microdrive, evenals andere bereid hyperdrive delen. (A) A threaded hyperdrive moer. (B)-voorbereiding van de hyperdrive kern. 1: de kern met externe draden gemaakt voor de moer; 2: de kern geplaatst in een kern-station met schroeven volledig ingevoegd in de "slots"; 3: gids staven geplaatst door de staaf positionering complex, klaar om te worden gehamerd in de kern; 4: vullen van de resterende ruimte in de sleuven met verdunde tandheelkundige cement; 5: het bovenste deel van een voorbereide hyperdrive kern. (C) voorbereiding van de microdrive. 1: een shuttle bout geplaatst in een shuttle bout houder base, opmerking de kleinere opening is geconfronteerd weg van de experimentator; 2: threading van de draden in de shuttle bout; 3: invoeging van de shuttle bout in de shuttle; 4: een microdrive geplaatst in de verzamelplaats van de microdrive basis met de canule geleid door het station deksel, klaar om te worden ingevoegd; 5: een microdrive met de buitenste helft van de bovenste canule tip verwijderd (aangegeven door de pijl); 6: microdrives getest op de microdrive rek gemonteerd. (D) een centrale kolom met schroefgaten en ingevoegde schroef noten. (E) A hyperdrive cap met vier magneten gelijmd in de putjes. (F) A 36 mm lange gids canule bundel, met de gesoldeerd gedeelte aan de linkerkant. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: vergadering van de hyperdrive. Afbeeldingen tonen stadia van de hyperdrive-vergadering. (A) het invoegen van de gids cannulas in de kern. 1: de gids canule bundel gleed in de buis silicium en het tussenstuk; 2: een gids canule in haar aangewezen gat in de kern wordt geplaatst. Hand schrijven toont de organisatie van de gids cannulas; 3: begeleiden van cannulas geduwd in de kern; 4: de kern met de gids cannulas ingevoegd en beveiligd door de moer. (B) vergadering van de microdrives tot de kern. 1: de kern met microdrives geladen; 2: de microdrives met polyimide buizen ingevoegd in de cannulas. (C) toevoeging van de draden in de kern. (D) beslag op de elektrode-interfacekaart. 1: de hyperdrive met de centrale kolom ingevoegd; 2: de hyperdrive met de elektrode-interfacekaart aangesloten op de centrale kolom. (E) aansluiting van de draad van de grond tot de aangewezen gat in de elektrode-interfacekaart. (F) A gefinaliseerd hyperdrive klaar voor implantatie (totale gewicht van 20 g). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: neurale signalen opgenomen door de hyperdrive. Representatieve opnames eenheid neurale activiteit en lokale veld potentiële in tonen een gedragend rat hersenen. (A) twee-dimensionale cluster diagrammen ter illustratie individuele pieken van gelijktijdig opgenomen neuronen door een tetrode gelegen in de postrhinal cortex (diepte: 2.1 mm). Links: scatterplot tonen de relatie tussen piek-tot-piek amplitudes van pieken opgenomen van twee elektroden voor de tetrode. Elke stip correspondeert met één spike. Clusters van pieken zijn waarschijnlijk afkomstig zijn van dezelfde cel. Vier clusters zijn kleur gecodeerd. Schaal bar: 20 µV. Rechts: spike golfvormen (middelen ± S.D.) van de gekleurde cellen getoond aan de linkerkant. Opmerking de kleine variatie van de golfvormen. Schaal bar: 200 µs. (B) sporen van lokale veld potentieel in het frequentiebereik van theta opgenomen gelijktijdig van vier verschillende schutterijofficieren gelegen in de mediale Entorinale cortex (diepte: 3.4-3.7 mm) wanneer de rat was vrij foerageren. Schaal balk onderaan links: 500 µV; schaal balk rechts onderaan: 100 ms. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Aanvullende bestanden: De aanvullende bestanden bevatten 20 bestanden in de indeling van de .stl detaillerend de hyperdrive onderdelen en accessoires klaar voor stereolithographic afdrukken (eenheden in mm) en 1 bestand in .pdf formaat die de blauwdruk voor het draaien tool tip klaar voor machinale bewerking. De oorspronkelijke 3D-model-bestanden zijn gemaakt met AutoCAD software in .dwg formaat, die op verzoek beschikbaar zal zijn. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier beschrijven we het proces van de bouw van een nieuw ontwikkelde hyperdrive bestaat uit achttien onafhankelijk beweegbare schutterijofficieren. Het station kan worden geconstrueerd uit betaalbare delen gekocht bij vele beschikbare hardware winkels, gecombineerd met onderdelen gemaakt door stereolithographic afdrukken. De hyperdrive chronisch kan worden geïmplanteerd op een rat's schedel met behulp van standaard chirurgische ingrepen en is geschikt voor het opnemen van extracellulaire neurale activiteit terwijl het dier verschillende gedrags taken voert.
De hyperdrive behoudt veel van de wenselijke functies van de originele McNaughton hyperdrive, met inbegrip van de statief microdrives die zijn gericht naar buiten door 30 graden vanaf het station centrum13, die betrouwbare ondersteuning voor de schutterijofficieren biedt. Zodra geïmplanteerd, biedt de hyperdrive de uitvoering van kleine bewegingen van de schutterijofficieren in de hersenen van een wakker dier met grote precisie. Een volledige draai van een shuttle op de ankerstang komt overeen met een lineaire verplaatsing 317.5 µm. Met een goede opleiding, kan een experimentator verder een shuttle in 1/16 beurt stappen (20 µm). We ontwierpen de hyperdrive voor gebruik bij volwassen ratten, maar het station kan gemakkelijk worden gebruikt bij een dier met een lichaamsgrootte van 350 g of meer (beperkt door de grootte van het hoofd). Een beperking van het apparaat kan worden opgemerkt in de beperkte scherptediepte opname, zoals de maximale reisafstand van de schutterijofficieren langs de draadstangen is ongeveer 7 mm, die diepere structuren in de hersenen van enkele dieren kan achterblijven.
Stereolithographic afdrukken voorziet in voldoende resolutie maken kunststofonderdelen uitvoerig met high-fidelity, en is eerder gebruikt in hyperdrive fabricage12,19,20. In dit geval werd een industriële printer die algemeen toegankelijk is door derden productiefaciliteiten gebruikt. Er werden alle hyperdrive onderdelen juist, gedrukt met inbegrip van de hyperdrive kern, ondanks de complexe geometrie, en de kleine structuren zoals de ø 0,6 mm via gaten en de dunne muren van 0.3 mm. Deze nauwkeurigheid maakt stereolithography een ideale keuze voor het vervaardigen van hyperdrive onderdelen. Gebaseerd op ervaring, zijn minder duur, desktop 3D-printers minder waarschijnlijk dat de precisie nodig voor betrouwbare reproductie van de hyperdrive-onderdelen die nodig zijn. Stereolithographic technologie heeft echter zijn beperkingen. Ten eerste, het heeft een beperkte selectie van materialen. De plastic die wij hebben gekozen voor de hyperdrive was het meest duurzame van die we hebben getest, maar het is nog steeds niet optimaal is voor de vervaardiging van zeer kleine stukjes. Van/naar het vliegveld en de shuttle bouten nodig extra voorzichtigheid behandeld worden als ze tijdens de bereiding kunnen breken. De kunststof onderdelen zijn niet autoclaaf, als de temperatuur van de doorbuiging warmte van het materiaal ongeveer 50 ° C. is Bovendien, is het afdrukken gebruikte materiaal niet resistent aceton. Deze problemen kunnen worden opgelost wanneer nieuwe stereolithography materialen zijn ontwikkeld en getest. Nog, gezien de relatief lage kosten van Stereolithografie, de voordelen van de techniek en de kosten zijn veel groter dan de gebreken. Ten tweede, vanwege de aard van Stereolithografie, gedurende welke fotopolymeren delen bevinden zijn fotochemisch verhard door een UV-laser om te vormen van één laag van de gewenste 3D-model21, de objecten die zijn gemaakt door stereolithographic drukkerij blootstaan aan UV-licht. Bijgevolg, zij worden blootgesteld aan sterke UV (b.v., direct zonlicht) voor vele uren onherroepelijk vermindert hun fysieke kracht (gebaseerd op persoonlijke communicatie met de drukkerij). Gezien de milieu UV in de laboratorium-ruimte (bijvoorbeeldvan de TL-verlichting), het is het beste voor het opslaan van de stereolithographic componenten in een donkere kast wanneer niet in gebruik, blijft die jarenlang onderdelen fysieke kracht. Bovendien, is het belangrijk dat het gebruik van andere methoden afgezien van UV-licht desinfecteren van het oppervlak van de hyperdrive voor de operatie. Deze test hyperdrive gebleven geïmplanteerde op de rat in goede staat in een gewone labo-omgeving in de loop van vier maanden, zonder vermelding van een afname van fysieke kracht of prestaties.
De 3D printbare aard van deze hyperdrive kunt ook snelle wijzigingen en flexibele redesign. Bijvoorbeeld, de hyperdrive kan eenvoudig worden aangepast aan target gescheiden meerdere hersenen regio's11. Bovendien, dit station kan worden aangepast om gelijktijdige bewaking van neurale activiteit en lokale hersenen manipulatie. Integratie van een microdialysis-sonde met de matrix van schutterijofficieren voorziet door de infusie van verschillende drugs tijdens neuraal opname22farmacologische activering en deactivering van neuronen. Bovendien kunnen neuronen ontworpen om uitdrukkelijke lichtgevoelig kanalen worden geactiveerd of gedeactiveerd door de opneming van een optische vezel in de tetrode bundel en optogenetic techniek19. Bovendien, het station kan worden gemakkelijk schaal gebracht weglating met een kleiner aantal schutterijofficieren voor dieren met hoofd kleinere, zoals muizen of jonge ratten.
Kortom, de gemakkelijke veranderlijkheid in combinatie met de eenvoudiger, meer betaalbare methode van de bouw van een effectieve neurale opname implantaat dat kan worden betrouwbaar en nauwkeurig gereproduceerd, maakt deze hyperdrive een krachtig hulpmiddel in het veld.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken de Moser-Lab aan het Kavli Institute voor systemen neurowetenschappen en centrum voor neurale Computation, Noorse Universiteit voor wetenschap en technologie, voor de chronische neurale opname procedures bij ratten. Dit werk werd gesteund door de NIH grant R21 NS098146 en menselijke Frontier Science programma Long-Term Fellowship LT000211/2016-L aan L. GVE.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Welding rod | Blue Demon | ER308L-035-01T | Stainless steel, 0.035" in diameter |
| Screw | McMaster | 91771A060 | Stainless steel, flat head, 0-80 thread, 5/8" in length |
| Screw | McMaster | 91772A051 | Stainless steel, pan head, 0-80 thread, 5/32" in length |
| Screw | McMaster | 92196A056 | Stainless steel, socket head, 0-80 thread, 5/16" in length |
| Screw | McMaster | 92196A055 | Stainless steel, socket head, 0-80 thread, 1/4" in length |
| Screw | McMaster | 95868A131 | Nylon, socket head, 2-56 thread, 3/16" in length, black |
| Screw nut | McMaster | 90730A001 | Stainless steel, narrow hex, 0-80 thread |
| Shoulder screw | McMaster | 90298A213 | Stainless steel, 8-32 thread, 3/16" in diameter, 1/4" in length |
| Cup screw | McMaster | 92313A105 | Stainless steel, 4-40 thread, 3/16" in length |
| Thumb screw | McMaster | 94323A592 | Nylon, 8-32 thread, 3/8" in length, black |
| Magnet | Apex | M3X1MMDI | Neodymium, 3 mm X 1 mm disc |
| Metal tubing | Small Parts | B00137QHNS | Stainless steel, 23 gauge, 0.0253" OD, 0.013" ID, 0.006" wall |
| Metal tubing | New England Small Tube | Custom-made | Stainless steel, 30 gauge, 0.012/0.0125" OD, 0.007/0.008" ID, full hard |
| Heat-shrink tubing | McMaster | 7856K72 | 0.09" ID before shrinking, blue |
| Silicone tubing | A-M Systems | 807300 | 0.040" ID, 0.085" OD |
| Polyimide tubing | A-M Systems | 823400 | 0.0045" ID, 0.0005" wall |
| Ground wire | A-M Systems | 791500 | 0.005" bare, 0.008" coated, half hard |
| Tetrode wire | California Fine Wire | Custom-made | 0.0007" in diameter, platinum-iridium (90%-10%), HML and VG coating |
| EIB | Neuralynx | EIB-72-QC-Large | |
| Gold pins | Neuralynx | large EIB pins | |
| Tap | Balax | 01302-000 | M1.2 thread size |
| Tap | McMaster | 2522A811 | 0-80 thread size, bottoming |
| Tap | McMaster | 2522A771 | 0-80 thread size, plug |
| Tap | McMaster | 26955A94 | 3/8"-24 thread size, bottoming |
| Tap | McMaster | 2522A713 | 2-56 thread size |
| Tap | McMaster | 2522A715 | 4-40 thread size |
| Tap | McMaster | 2522A718 | 8-32 thread size |
| Die | McMaster | 2576A457 | 3/8"-24 thread size, 1" OD |
| Drill bit | McMaster | 30585A82 | Wire gauge 65, 0.035" in diameter |
| Drill bit | McMaster | 30585A83 | Wire gauge 66, 0.033" in diameter |
| Drill bit | McMaster | 30585A87 | Wire gauge 70, 0.028" in diameter |
| Drill bit | McMaster | 30585A88 | Wire gauge 71, 0.026" in diameter |
| Drill bit | McMaster | 30585A91 | Wire gauge 73, 0.024" in diameter |
| Drill bit | McMaster | 8870A23 | 3/16" in diameter |
| Dremel disc | Wagner | 31M | Diamond coated, 22 mm in diameter, 0.17 mm in thickness |
| Steel wire | Precision Brand | 21212 | 0.012" in diameter, full hard |
| Steel wire | Precision Brand | 21007 | 0.007" in diameter, full hard |
| Steel wire | A-M Systems | 792700 | 0.003" in diameter, half hard |
| Super glue | Loctite | LT-40640 | # 406 |
| Super glue | Loctite | LT-41550 | # 415 |
| Dental acrylic powder | Teets | 223-3773 | Coral |
| Dental acrylic liquid | Teets | 223-4003 |
References
- O'Keefe, J., Recce, M. L. Phase relationship between hippocampal place units and the EEG theta rhythm. Hippocampus. 3 (3), 317-330 (1993).
- Wilson, M. A., McNaughton, B. L. Dynamics of the hippocampal ensemble code for space. Science. 261 (5124), 1055-1058 (1993).
- Gothard, K. M., Skaggs, W. E., Moore, K. M., McNaughton, B. L. Binding of hippocampal CA1 neural activity to multiple reference frames in a landmark-based navigation task. J Neurosci. 16 (2), 823-835 (1996).
- Gray, C. M., Maldonado, P. E., Wilson, M., McNaughton, B. Tetrodes markedly improve the reliability and yield of multiple single-unit isolation from multi-unit recordings in cat striate cortex. J Neurosci Methods. 63 (1-2), 43-54 (1995).
- Buzsaki, G. Large-scale recording of neuronal ensembles. Nat Neurosci. 7 (5), 446-451 (2004).
- Fyhn, M., Hafting, T., Witter, M. P., Moser, E. I., Moser, M. B. Grid cells in mice. Hippocampus. 18 (12), 1230-1238 (2008).
- Skaggs, W. E., et al. EEG sharp waves and sparse ensemble unit activity in the macaque hippocampus. J Neurophysiol. 98 (2), 898-910 (2007).
- Guo, P., Pollack, A. J., Varga, A. G., Martin, J. P., Ritzmann, R. E. Extracellular wire tetrode recording in brain of freely walking insects. J Vis Exp. (86), (2014).
- Knierim, J. J., McNaughton, B. L., Poe, G. R. Three-dimensional spatial selectivity of hippocampal neurons during space flight. Nat Neurosci. 3 (3), 209-210 (2000).
- Leutgeb, S., et al. Independent codes for spatial and episodic memory in hippocampal neuronal ensembles. Science. 309 (5734), 619-623 (2005).
- Lansink, C. S., et al. A split microdrive for simultaneous multi-electrode recordings from two brain areas in awake small animals. J Neurosci Methods. 162 (1-2), 129-138 (2007).
- Kloosterman, F., et al. Micro-drive array for chronic in vivo recording: drive fabrication. J Vis Exp. (26), (2009).
- McNaughton, B. L. Google Patents. , Available from: https://www.google.com/patents/US5928143 (1999).
- Redish, A. D., et al. Independence of firing correlates of anatomically proximate hippocampal pyramidal cells. J Neurosci. 21 (5), RC134 (2001).
- Schmitzer-Torbert, N., Redish, A. D. Neuronal activity in the rodent dorsal striatum in sequential navigation: separation of spatial and reward responses on the multiple T task. J Neurophysiol. 91 (5), 2259-2272 (2004).
- Nguyen, D. P., et al. Micro-drive array for chronic in vivo recording: tetrode assembly. J Vis Exp. (26), (2009).
- Chang, E. H., Frattini, S. A., Robbiati, S., Huerta, P. T. Construction of microdrive arrays for chronic neural recordings in awake behaving mice. J Vis Exp. (77), e50470 (2013).
- Vandecasteele, M., et al. Large-scale recording of neurons by movable silicon probes in behaving rodents. J Vis Exp. (61), e3568 (2012).
- Siegle, J. H., et al. Chronically implanted hyperdrive for cortical recording and optogenetic control in behaving mice. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 2011, 7529-7532 (2011).
- Brunetti, P. M., et al. Design and fabrication of ultralight weight, adjustable multi-electrode probes for electrophysiological recordings in mice. J Vis Exp. (91), e51675 (2014).
- Hull, C. W. Google Patents. , Available from: https://www.google.com/patents/US4575330 (1986).
- Ludvig, N., Potter, P. E., Fox, S. E. Simultaneous single-cell recording and microdialysis within the same brain site in freely behaving rats: a novel neurobiological method. J Neurosci Methods. 55 (1), 31-40 (1994).
