Summary
Мы представляем строительство 3D-печати hyperdrive восемнадцать независимо регулируемый tetrodes. Hyperdrive предназначен для записи активности мозга в свободно себя крыс в течение нескольких недель.
Abstract
Мониторинг активности модели большое количество нейронов в течение многих дней в спать животных весьма полезен в области нейробиологии систем. Одним из ключевых компонентов этой техники состоит из точного размещения нескольких электродов в желаемой мозга и поддержания их стабильности. Здесь мы описываем протокол для строительства 3D-печати hyperdrive, которая включает в себя восемнадцать независимо регулируемый tetrodes и разработан специально для в vivo внеклеточного нейронных записи в свободно себя крыс. Tetrodes, придает диски Microdrive либо индивидуально расширенный на несколько областей мозга, вдоль дорожки, или может использоваться для размещения массива электродов в меньшей площади. Несколько tetrodes позволяют одновременное рассмотрение action potentials из десятков отдельных нейронов, а также местных потенциалов поля из популяций нейронов в мозгу во время активного поведения. Кроме того конструкция предусматривает простой 3D разработки программного обеспечения, которые могут быть легко изменены для различных экспериментальных потребностей.
Introduction
В области систем нейробиологии ученые изучают нейронные корреляты, лежащие в основе когнитивных процессов, таких как пространственной навигации, память и принятия решений. Для этих типов исследований важно отслеживать деятельность многих отдельных нейронов во время поведение животных. За последние десятилетия два важных достигнуты для нужд экспериментальной внеклеточного нейронных записи в мелких животных1,2,3. Сначала было развитие тетрод, пучок четыре микропроводов, используемый для записи нейронной активности нейронов одновременно1,2,4. Дифференциальный сигнал амплитуд деятельности по четырем каналам тетрод позволяет для изоляции отдельных нейрон активности от многих одновременно зарегистрированных клетки5. Кроме того гибкий характер микропроводов позволяет большей стабильности тетрод, минимизации относительное смещение между тетрод и целевой популяции клеток. Tetrodes в настоящее время широко используются вместо одного электрода для многих исследования мозга в различных видов, включая грызунов1,2,6, приматы7и8насекомых. Во-вторых развития hyperdrive перевозил несколько независимо движимого tetrodes, который позволяет одновременный мониторинг нейронной активности от больших популяций нейронов из нескольких записи расположения3, 910,,,1112.
Наличие надежных и доступных мульти тетрод записывающее устройство для мелких животных ограничен. Классический hyperdrive, первоначально разработанный Брюс McNaughton13, успешно используется для нейронных записей в свободно себя крыс в многих лабораториях в последние два десятилетия9,10,14, 15. Однако, по техническим причинам, оригинальные компоненты, необходимые для построения МакНотон диск в настоящее время очень трудно получить и не совместимы с интерфейсами приобретение недавно улучшенных данных. Другой хорошо признанных дизайн hyperdrive требует диски Microdrive, чтобы быть индивидуально ручной работы, которая может выдать противоречивые результаты и потребляют значительное время12. Для записи нейронной активности из различных регионов мозга в поведения крыс, мы разработали новый hyperdrive с использованием stereolithographic технологии. Мы стремились удовлетворять следующим требованиям: (1) новый hyperdrive должны позволяют точное перемещение tetrodes в мозге и стабильная запись из нескольких целевых регионов; (2 новый hyperdrive должны быть совместимы с системой магнитного quickclip, недавно разработанных позволяют легко подключения; и (3) новые hyperdrive могут быть точно воспроизведены с материалами легко доступны. Здесь мы предоставляем технику для создания 3D-печати hyperdrive, содержащие восемнадцать самостоятельно движимого tetrodes, основанный на МакНотон дизайн. В протоколе, мы описываем подробности процесса изготовления новых hyperdrive, который мы использовали успешно записывать потенциалы действия одного нейрона и местных потенциалов поля от postrhinal и медиальный entorhinal коре недель в свободно поведение крыс во время естественных нагула задач.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Лазерная стереолитография 3D моделей
- Используйте методы stereolithographic для печати hyperdrive частей и аксессуаров. Каждый hyperdrive состоит из восемнадцати челноков, восемнадцать трансфер, болты и по одному из всех других пластиковых частей (рис. 1).
Примечание: Аксессуары не являются частью hyperdrive, но являются необходимыми для строительства hyperdrive.
2. Подготовка аксессуары (рис. 2).
-
Подготовка microdrive стойки (Рис. 2 c).
- Очистить и расширению небольших через отверстия и больших слепых отверстия в стойке с сверло ø 0,71 мм (0,028") и ø мм 0,84 (0,033») сверлом, соответственно.
- Нарезать сварки стержень ø 0,89 мм (0,035") 17 мм длинные отрезки, раунд обоих концах и вставьте каждый направляющий стержень ø мм 0,84 (0,033») отверстия на стойку, оставляя 11,5 мм вне (заподлицо с резьбовых стержней).
- Полностью вставьте шесть 0-80 резьбовые, 15,88 мм (5/8 ") длиной плоской головкой вниз в пазы в стойке. Убедитесь, что направляющие стержни и стержни резьбовые являются прямыми и параллельными друг другу. Заполните оставшееся пространство в слоты с разбавленной стоматологического цемента. Воздух сухой на benchtop за 15 мин.
- Приклейте сварочных электродов и винты в стойку с тонкой супер клей и дать высохнуть в течение 15 мин.
-
Подготовка основных станции (Рисунок 2E).
- Поток четыре отверстия с краном 2-56, 2-56, 4,76 мм (3/16") длиной нейлон винты для защиты и ядро на станции, при необходимости.
-
Подготовка инструмента поворота (Рисунок 2F).
- Поток отверстие на ручку с краником 4-40. Вставьте кончик смоделированной в слот в ручку и безопасной с винтом длиной Кубок 4,76 мм (3/16") 4-40.
-
Подготовка hyperdrive держателя (Рисунок 2 g).
- Поток отверстие для винта с краном 8-32. Используйте 8-32, 9,52 мм (3/8 ") длиной нейлон пальца винта для защиты hyperdrive в процессе эксплуатации.
-
Подготовка позиционирования комплекс стержня (Рисунок 2 H).
- Нить ствола со стороны с большей отверстие (вверху) с 8-32 крана на глубину от около 7 мм. поток меньшие отверстия (шесть в верхней, восемнадцать внизу) с краном 0-80. Разверните в центральное отверстие в верхней сверлом ø 4,76 мм (3/16"), в случае необходимости.
- Соберите ствола на вершину, с помощью 8-32, ø 4,76 мм (3/16"), 6.35 мм (1/4») долго плечо винт. Закрепите снизу вверх с 0-80, 6,35 мм (1/4") при использовании длинных винтов.
3. Подготовка Hyperdrive компонентов (рис. 3).
- Подготовка hyperdrive гайка (Рис. 3A).
- С помощью гайки держателя (Рисунок 2D), резьба гайки одним касанием дна 3/8-24 до гладкой.
- Ассамблея hyperdrive ядра (Рис. 3B).
- Чистота и расширить отверстия в ядро, с помощью различных размеров сверла (двенадцать землю провода через отверстия (внутреннее кольцо): ø 0,61 мм (0,024"); Восемнадцать тетрод сквозных отверстий (Среднее кольцо): ø 0,66 мм (0,026»), а затем ø 0,71 мм (0,028»); Восемнадцать руководство стержня слепой отверстия (внешнее кольцо): ø мм 0,84 (0,033")).
- Нить две сквозные отверстия поверх ядра и оставшиеся восемь слепых отверстия (четыре на четыре в нижней стороне) с краном 0-80. Используйте меняться крана для слепых отверстий.
- Создание внешних потоков на базе ядра с помощью матрицы 3/8-24. Правильно настройте умереть, так, чтобы гайку hyperdrive поместится более новые потоки.
- В зависимости от количества земли, провода желаемого, вставить несколько сегментов длиной 6 мм 23-калибруйте металлических труб (канюли) в землю провод отверстия в ядре склеивания их в случае необходимости. Файл концы провода канюли земли до заподлицо с вне ядра и очистить канюли с ø 0,30 мм (0.012") стальной проволокой.
- Полностью вставьте восемнадцать 0-80, 15,88 мм (5/8 ") длиной плоской головкой вниз головой слотов в ядре. Не сгибайте винты или повредить потоки во время этого процесса.
- С помощью стержня, позиционирование комплекс и основные станции, позиция восемнадцати сегментов 17 мм ø 0,89 мм (0,035") Электроды над отверстиями стержня руководство в ядре и забивают их вниз, чтобы быть заподлицо с винтами (около 5 мм).
- Скорректировать позиции сварки стержней и винты, при необходимости, а затем затяните винт Центральной плеча и окружающие шесть винтов в стержне позиционирования комплекс для обеспечения вывоза направления стержней в ядре. Винт гайку на ядро (с жезлом, позиционирование комплекс) и соответствовать ядро в hyperdrive держатель позволяет легче позиционирования под стереоскоп.
- Заполните слоты с разбавленной стоматологического цемента винты в ядро и позволить воздушной сушки на 15 мин заполнения слотов 2-3 в то время, прежде чем стоматологического цемента получает слишком толстая. Отчищать любые излишки стоматологического цемента на ядро для поддержания надлежащего нужным с щитом.
- Клей винтов и стержней в ядро с тонкой супер клей, позволяют воздушной сушки на 15 мин.
- Ассамблея microdrive (Рис. 3 c).
- Чистота и разверните два внешних отверстия в автобус с сверла (меньше отверстие: сверло ø 0,61 мм (0,024") бит; больше отверстие: ø 0,89 мм (0,035») сверлом).
- Вставьте болт Трансфер в базовый держатель болт. Обратите внимание на ориентацию. Закрыть крышку держателя болт держать плотно и медленно потока через отверстие в крышке с краном 0-80. Нажмите 2 - 3 раза до получения однородной массы.
- Вставьте болт Трансфер трансфер со стороны небольших открытия. Место Трансфер автобус болт комплекса вверх вниз в базовой станции Ассамблеи microdrive.
- Вырезать 15 мм сегмент 23 калибровочных металлических труб и гладкой обоих концах, а затем расположите трубы над отверстием ø 0,61 мм (0,024"), руководствуясь слот на станции крышкой. Молот канюли в отверстие, пока верхний конец заподлицо с крышкой станции.
- Удалите внешние половине верхней оконечности канюля с колесом шлифовальный. Очистите канюля с металлической проволоки ø 0,30 мм (0.012"). Клей канюля на автобус с помощью тонкой супер клей, убедившись, что не клей болт Трансфер с шаттл, а воздух сухой за 15 мин.
- Подготовить по крайней мере восемнадцать диски Microdrive, тест microdrive на стойку microdrive. Убедитесь, что болт Трансфер может вращаться плавно в автобус и что весь microdrive свободно перемещается по длине резьбовой стержень.
- Подготовка центральной колонны (Рис. 3D).
- Песок верхней и нижней части центральной колонны до квартиру, при необходимости. Нить два отверстия в центральной колонке с краном 0-80. Вставить 0-80 шестигранную гайку (3,18 мм (1/8"), 1.19 мм (3/64») высокий) в каждый слот.
- Подготовка hyperdrive Кап (Рисунок 3E).
- С использованием немагнитного щипцы, клей четыре магнита (диаметром 3 мм, толщиной 1 мм) в четырех скважин, сопоставления их N и S поляков на плате интерфейса электрода.
- Сборка руководство канюли в пучок (Рисунок 3F).
- Место восемнадцать 30 калибровочных, тонкие стены канюли (ID) 0,19 мм, 0,0075" в ø 2,29 мм (0,09») Термоусадочные трубки (3-5 мм длиной, расположенными друг от друга расслоение на 5-10 мм). Сделайте все канюли флеш друг с другом на одном конце расслоение.
- Термоусадочные трубки термоусадочные, с помощью тепловой пушки, до тех пор, пока пакет плотно. Сожмите комплекта аккуратно формировать его нужным (круглые или овальные). Убедитесь, что все канюли в правильной позиции с без скручивания, пересечение, или изгиб.
- Марк район (ы) для пайки на канюли. Unsoldered часть должна быть 26 мм в длину, в то время как пайка часть должна быть 5-10 мм. Перемещение сжатие трубки на Паяльники знаки для предотвращения распространения.
- Применить потока для одной области пайки и пайки при вращении расслоение. Охладить при комнатной температуре по крайней мере 1 мин повторить этот шаг, чтобы припаять той же области еще два раза. Зачищают паяных часть путем пайки без применения флюса и наполнителя материал. Охладить при комнатной температуре по крайней мере 1 мин.
- Вырезать расслоение надлежащей длины с алмазные на максимальной скорости, польский оба заканчивается для регулировки длины (этом часть: 26 мм, под пайку часть: 5-10 мм, по желанию). Очистите руководство канюли с металлической проволоки ø 0,18 мм (0,007") под стереоскоп.
- Подготовка tetrodes. Аналогичные процедуры были описаны8,16,17 .
- Отрегулируйте высоту горизонтальной бар T и положение магнитной мешалкой, так что горизонтальной руку на кресте T бар находится прямо над центром магнитной мешалкой. Подключите один конец S-крючок в центр бар малых магнитных перемешать, а затем склеить их вместе. Очистите тетрод, делая пространства с сжатым воздухом и этанола салфетки.
- Круг два концы кусок один тетрод проволоки длиной около 40 см вместе, а затем закрепите кусок медной ленты.
- Поднимите круг проволока, удерживая медной ленты. Поместите конец напротив медной лентой на горизонтальной руку T бар. Опустите медной лентой мягко (в то время как на другом конце находится все еще на Т-образный), крутить один раз и место медной ленты на панели T. Тетрод круг теперь находится в конфигурации восьмерка («∞») с медной лентой, сидя на вершине крест турник.
- Аккуратно возьмите медной ленты на панели T, с одной стороны. С другой стороны крючок свободный конец S-крюк (с магнитной перемешать, прикреплены к другому концу) через нижнюю часть круга проволока тетрод, осторожно отпустите S-крюк и дайте ему выпрямить четыре провода, вес S крючок.
- Отрегулируйте высоту горизонтальной панели до тех пор, пока в нижней части S-крючок находится около 1 см выше центр Плиты магнитные мешалки.
- Наклониться краю медной ленты для обеспечения его на турнике. Изучить четыре провода прямо тетрод, глаз, а затем удалите любые инородные тела.
- Включите мешалкой, скручивание четыре провода со скоростью около 60 об/мин, до тех пор, пока угол между двух противоположных раскрученные провода составляет около 60°.
- Установите тепловой пушки до 210 ° C и тепла скрученных проводов, потрясающим пистолет прямо вдоль провода под разными углами за 2 мин до сливаются их переплавкой VG Бонд пальто.
- Аккуратно поднимите S-крюк с перемешать и сократить нижний конец тетрод с тонкой ножницами.
- Держите медной лентой на турнике с пальцем, Перережьте провода от обоих краев медной лентой с ножницами и удалите медной ленты. Вырежьте оставшиеся провода на турнике выпустить тетрод.
- Место завершенных тетрод в пыли ящик для хранения. Подготовка по меньшей мере двадцать пять tetrodes.
4. Ассамблея hyperdrive (рис. 4).
- Вставка руководство канюли в hyperdrive ядро (рис. 4A).
- Удаление Термоусадочные трубки и слайд 4 мм сегмент силиконовой трубки (ID 1.02 мм (0,04"), мм OD 2.16 (0,085»)) вдоль комплекта пайка/этом границы. Клин щели в hyperdrive распорку расширить центральное отверстие, позволяя Распорка для скольжения вокруг силиконовой трубки. Удаление клина, когда распорку сидит в центре силиконовой трубки.
- Организовать позиции руководства канюли в пакете путем размещения длинных отрезков (10 см) от проволока ø 0,18 мм (0,007") через каждый канюли в конкретных тетрод дыру в ядре hyperdrive, предотвращая любой кроссовер проводов или канюли в процессе. Согните концы провода к держать их на месте.
- Нажмите канюли через их соответствующие отверстия в ядре, стараясь избежать изгиба или пересечения между ними, пока свободный конец каждого канюля по меньшей мере 2 мм вне верхний конец тетрод отверстие. Закрепите распорку завинчивания гайку на ядро, стараясь предотвратить распорку от вращения. Нанесите каплю очень разбавленных стоматологического цемента из верхней части ядра на стыке канюли для обеспечения их относительные позиции.
- Вырезать руководство провода припаяны конца пачки и удалите их из канюли, отзыв от свободного конца.
- Ассамблея диски Microdrive на hyperdrive Core (рис. 4В). Подробные пространственное расположение диски Microdrive в hyperdrive был ранее описанных11,13.
- Загрузите диски Microdrive медленно и тщательно каждый резьбовой стержень ядра. Подтвердите, что (1 23 калибровочных microdrive канюля плавно переходит в Тетроде отверстие, (2 30 калибровочных руководство канюля переходит в 23 калибровочных microdrive канюля гладко, и (3) Трансфер болт поворачивается плавно вдоль стержень с резьбой. Завинтите диски Microdrive вплоть до 1,0-1,5 мм выше нижнего конца стержни резьбовые.
- Вырезать куски восемнадцать полиимида труб (ID 0,11 мм (0.0045"), ОД 0,14 мм (0,0055»)) на сегменты, 38-43 мм (длина руководство канюля комплект плюс 7 мм). Очистите каждую пробирку с 0,08 мм (0.003") стальной проволоки ø.
- Инвертировать ядро, тщательно вставьте трубки полиимида канюли руководство от конца паяных и подтолкнуть их все пути в рамках стереоскоп. Отразить вертикально ядро и Приклейте верхний конец полиимида трубу на microdrive канюля с толстым супер клей. Место основных вверх вниз и дать клею высохнуть в течение 15 мин.
- Вырежьте дополнительных полиимида трубки в верхнем конце, оставляя 0,5-1,0 мм за пределами канюля microdrive.
-
Монтаж провода заземления (Рис. 4 c).
- Сократить количество необходимых для длиной 25-30 мм из стальной проволоки с покрытием провода заземления (покрытием ø 0,20 мм (0,008"), голые ø 0,13 мм (0,005»)). Полоса 2 мм пластиковой изоляции от обоих советов провода и вставьте один конец каждого в концы 6-8 мм длиной 30 калибровочных канюли. Свести концы канюли для безопасного подключения к их соответствующих проводов.
- Используйте инструмент Dremel для пополам канюли для создания двух проводов полной земли от каждого.
- Вставьте конец раунда 30 калибровочных канюли в верхний конец канюли проволока земли в ядре и нажмите, чтобы сделать вставки туго.
-
Ассамблеи Совета интерфейс электрод (Рис. 4 d).
- Вставьте центральный столбец в ядро и безопасной с двумя 0-80, 7.94 мм (5/16") длиной винта. Клей, при необходимости сделать центральной колонке устойчивый в ядре.
- Разверните части слотов в ЕИБ-72-QC-большой совет, которые соответствуют два резьбовых отверстия в центральной колонке с краном ø 1,2 мм. Прикрепите электрода интерфейсная плата в центральный столбец с двумя 0-80, 3,97 мм (5/32") длинные Пан головкой. Убедитесь в том, что Совет находится в центре и является безопасной.
-
Соединительные провода заземления (Рисунок 4E).
- Маршрут каждого заземляющий провод вокруг центральной колонны и подключите подвергаются свободный конец к интерфейсной плате электрод с золото pin в назначенных местах отверстие.
-
Загрузка tetrodes в hyperdrive, как ранее описанные 16 , 17 .
- Загрузите каждый тетрод тщательно полиимида трубы диски Microdrive, соблюдая осторожность, чтобы не согнуть их во время процесса.
- Аккуратно корма свободный конец провода в их места для отверстий в интерфейсе электрода борту и электрически соединить их с помощью золотой булавки.
- Вырежьте tetrodes индивидуально к надлежащей длины. Убедитесь, что часть tetrodes, торчащий из нижние концы трубок полиимида после резки прямой, в противном случае заменить весь тетрод и срезайте.
-
Установка щита.
- Прикрепите щита к корпусу, используя четыре 0-80, 3,97 мм (5/32") Пан головкой. Цифры на щите должны совпадать с номерами на плате интерфейса электрода.
-
Хромирование тетрод советы.
- Плита Советы tetrodes, с помощью NanoZ обшивка устройства с разъемом АДПТ-NZ-EIB-36 и адаптер ADPT-EIB-72-QC-HS-3617. Кроме того плиты их вручную по одному, как описано в других разделах16. Пластина тетрод советы до использования (например, за один день до имплантации), как сопротивление будет постепенно увеличиваться с течением времени после покрытия. Замените tetrodes, которые соединены или препятствия в процессе обшивки, вырезать их в надлежащей длины и повторно пластины.
-
Завершает hyperdrive (Рисунок 4F).
- Клей tetrodes для их полиимида трубы как описано16. Убрать все из них обратно в их руководстве канюли, так покрытием советы не подвергаются.
- Винт четыре 0-80, 6,35 мм (1/4 ") длиной винта в четыре отверстия в нижней части hyperdrive ядра.
- С помощью стереоскоп, Нижняя каждый тетрод медленно до кончика тетрод — чуть выше края руководство канюли. Тем временем найдите позицию каждого тетрод в пакете канюля руководство. Карта положения тетрод имеет решающее значение для восстановления записи сайтов.
- Прикрепите крышку на диск и хранить hyperdrive должным образом для имплантации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мы использовали недавно построенный hyperdrive для получения результатов испытаний. Привод был оборудован tetrodes, построенный от ø 17 мкм (0.0007"), провод полиимидно покрытием платины Иридиум (90% - 10%). Советы tetrodes были покрытием платины черный решения для уменьшения сопротивления электрода для между 100 и 200 kΩ на частоте 1 кГц. Hyperdrive был имплантирован 4,6 мм, слева от средней линии и 0,5 мм впереди поперечной синуса на череп 550г, мужчина крыса Лонг-Эванс. Дополнительное основание провода были подключены к череп винты над мозжечка. Все процедуры были исполнены, утвержденных институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) колледж Бейлор и были похожи на те ранее описанных18. Сразу же после хирургической имплантации tetrodes были дополнительно 1 мм в мозг. В последующие дни были использованы меньше передовых с шагом не более чем 80 мкм. Tetrodes было позволено стабилизации после каждого улучшения для по крайней мере 20 h до нейронных записи были выполнены.
Для записи нейронной активности, hyperdrive был подключен к предварительный усилитель headstage (Neuralynx, HS-72-КК), и последний был подключен к системе сбора данных с программируемой усилители (Neuralynx, цифровой рысь SX). Местных потенциалов поля были привязаны к заземляющий провод, отведать в 2 кГц, и полосовой фильтрации в 0,1 — 500 Гц. деятельность была сделана ссылка в Тетроде не наблюдаемой активности расположен 500 мкм с поверхности мозга, отведать в 32 кГц и полосовой фильтрации в 600 Гц - 6 кГц. Были записаны только всплеск волны выше порога 50 мкВ.
Рисунок 5A показывает нейронной активности, записанные с тетрод, расположенный в postrhinal кору (2,1 мм ниже поверхности мозга), в то время как животное свободно нагула внутри 1,5 м открыть через три недели после имплантации. Сессии записи продолжалось около 30 минут и Записанная единиц оставались стабильными во всей сессии (свидетельствуют небольшие вариации в Спайк сигналов). Рисунок 5B шоу местных потенциалов поля записаны одновременно с четырех различных tetrodes, расположенный в медиальной entorhinal коры (3.4-3.7 мм в глубину) а то же самое животное активно изучает открытой арене через семь недель после имплантации. Потенциальной деятельности ясно поля в диапазоне частот тета (6-10 Гц) присутствовал. Индивидуальные нейрон Спайк данных был изолирован с помощью сортировки программного обеспечения MClust (а.д. красноватой), и потенциальные местные поля данных был визуализирован на заказ сценариев Matlab. Примеры записей низкого качества тетрод, возможно в результате плохо подготовленный диск, было показано ранее17.
Рисунок 1: Hyperdrive компоненты, созданные по технологии stereolithographic. Изображение компонентов 3D-печати hyperdrive (1¢ монета для сравнения размеров). (A) hyperdrive ядро; (B) защитный щит; (C) защитный колпачок; (D) центральной колонны; (E) гайку; (F) прокладка; (G) Трансфер; (H) Болт трансфер. Линейки: 1 см. UnionTech RSPro450 принтер, используя пластиковый материал Somos развиваться 128 были созданы эти компоненты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: специально Аксессуары для строительства hyperdrive. Эти аксессуары были разработаны специально для оказания помощи в подготовке hyperdrive. Их основные компоненты были созданы stereolithographic печати. (A) Трансфер болт держателя, который обеспечивает болт Трансфер во время нарезки резьбы. (B) Ассамблея microdrive станция, которая направляет канюля вставки в автобус. (C) microdrive стойку, которая помогает проверить собранные диски Microdrive и удерживает их на месте во время склеивания канюли. 1: база стойку microdrive; 2: microdrive стойку с винтами, полностью вставлены в гнезда; 3: шкаф microdrive, готова к использованию. (D) гайка держателя, который держит гайку hyperdrive когда резьбы отверстия. (E) ядро hyperdrive станция, которая обеспечивает ядро во время забивая направляющие стержни. (F) поворачивая инструмент, который управляет Трансфер болт для поворота в автобус. (G) hyperdrive держатель, который помогает поставить hyperdrive под стереоскоп. Владелец также защищает tetrodes, после того, как они были загружены в hyperdrive. (H) стержня позиционирования комплекс, который позволяет позиционировать стержни резьбовые и направлять стержней в ядре hyperdrive. 1: основные компоненты комплекса; 2: Верхняя часть комплекса после сборки; 3: стержень позиционирования сложным в использовании. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: подготовка hyperdrive частей до Ассамблеи. Изображения, показывающие процесс подготовки hyperdrive ядро и microdrive, а также другие подготовленные hyperdrive частей. (A) A резьбовые hyperdrive гайка. (B) подготовка hyperdrive ядра. 1: ядро с внешних потоков, созданных для гайки; 2: ядро помещены в основные станции с винтами, полностью вставлены в гнезда; 3: руководство стержни позиционируется стержень позиционирования комплекс, готовый к вбитым в ядре; 4: заполнение оставшееся пространство в слоты с разбавленной стоматологического цемента; 5: Верхняя часть подготовленных hyperdrive ядра. (C) подготовка microdrive. 1: Трансфер болт помещены в Трансфер болт держателя базы, заметку меньше открытие стоящие вдали от экспериментатора; 2: резьбы потоков внутри болт Трансфер; 3: вставки шаттл болт в автобус; 4: microdrive помещены в microdrive монтажные станции базы с канюля, руководствуясь крышку станции, быть вставлены; 5: microdrive с внешней половина кончика верхней канюли удаляются (указано стрелкой); 6: собрал диски Microdrive, протестировано на стойку microdrive. (D) A центральный столбец с резьбовыми отверстиями и вставленных гайки. (E) A hyperdrive колпачок с четырьмя магнитами, склеены в скважинах. (F) 36 мм длиной руководство канюля расслоение, с паяных часть слева. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: Ассамблея hyperdrive. Изображения показаны этапы hyperdrive Ассамблеи. (A) включить руководство канюли в ядро. 1: руководство канюля расслоение скользнул в силиконовой трубки и прокладку; 2: один гид канюли в его назначенное отверстие в ядре. Почерк показывает организацию руководства канюли; 3: руководство канюли, толкнул ядро; 4: ядро с руководство канюли вставлены и обеспеченные гайку. (B) Ассамблея диски Microdrive в ядро. 1: ядро с диски Microdrive загружен; 2: диски Microdrive с полиимида трубки вставляется в канюли. (C) вкладывание провода заземления в ядро. Крепление (D) электрода интерфейсная плата. 1: hyperdrive с центрального столбца вставляется; 2: hyperdrive с электродом интерфейсная плата придает центральной колонны. (E) подключение провода в назначенное отверстие в интерфейсной плате электрода. (F) A завершена hyperdrive готова для имплантации (общий вес 20 g). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: нервные сигналы записаны hyperdrive. Представитель записи показаны единицы нейронной активности и местах потенциал в мозге поведения крыс. (A) кластеров и двумерные схемы иллюстрирующие отдельных спайков от одновременно зарегистрированных нейронов по тетрод, расположенный в postrhinal коры (глубина: 2.1 мм). Слева: точечная показаны отношения между амплитудами пик пик шипов, записанные с двумя электродами тетрод. Каждая точка соответствует один шип. Кластеры шипов, скорее всего, происходят из той же клетке. Четыре группы имеют цветовую кодировку. Линейки: 20 мкВ. Справа: Спайк сигналов (средства ± с.д.) цветом ячеек, показано на левой стороне. Обратите внимание на небольшие различия сигналов. Линейки: 200 МКС. (B) следы местных полей в диапазоне частот тета записаны одновременно с четырех различных tetrodes, расположенный в медиальной entorhinal коры (глубина: 3.4-3.7 мм) когда крыса свободно нагула. Шкалы бар внизу слева: 500 мкВ; линейки в правом нижнем углу: 100 г-жа пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Дополнительные файлы: Дополнительные файлы включают в себя 20 файлов в формате .stl подробно hyperdrive компоненты и аксессуары готовы для stereolithographic печати (единиц в мм), 1 файл в формате .pdf, который является основой механизма поворота Совет готов для обработки. Исходные файлы 3D модели были созданы с программным обеспечением AutoCAD в формате .dwg, который будет доступен по запросу. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы описываем процесс построения недавно разработанных hyperdrive состоит из восемнадцати самостоятельно движимого tetrodes. Привода могут быть построены из доступных частей, приобрести во многих магазинах доступны оборудования, в сочетании с компонентами, созданные stereolithographic печати. Hyperdrive может быть хронически имплантирован на крыса черепа с помощью стандартных хирургических процедур и способен записывать внеклеточного нейронной активности, в то время как животное выполняет различные задачи, поведенческие.
Hyperdrive сохраняет многие из желательных особенностей оригинального hyperdrive МакНотон, включая штатив диски Microdrive, что ориентированы наружу на 30 градусов от привода центр13, который обеспечивает надежную поддержку для tetrodes. После имплантации, hyperdrive обеспечивает выполнение небольших движений tetrodes внутри мозг животного просыпаются со значительной точностью. Один полный оборот Трансфер на резьбовой стержень соответствует линейных перемещений 317.5 мкм. При надлежащей подготовки, экспериментатора может заранее Трансфер в 1/16 очередь шаги (20 мкм). Мы разработали hyperdrive для использования в взрослых крыс, но диск легко могут быть использованы в любых животных с размером тела 350 g или более (ограничено размером головы). Следует отметить одно ограничение устройства в ограниченные глубины записи, как максимальное расстояние tetrodes вдоль стержни резьбовые составляет около 7 мм, которая может не отвечают более глубоких структур в некоторых животных мозги.
Stereolithographic печать обеспечивает достаточные разрешения для создания пластиковых компонентов подробно с высокой точностью и ранее не использовался в hyperdrive изготовление12,19,20. В этом случае был использован промышленный принтер, обычно доступны через сторонние производственных мощностей. Там все компоненты hyperdrive были напечатаны точно, включая hyperdrive ядро, несмотря на его сложной геометрии и мелких структур, таких как ø 0,6 мм через отверстия и тонкие стены 0,3 мм. Эта точность делает стереолитографии идеальным выбором для изготовления hyperdrive компонентов. Исходя из предыдущего опыта, менее дорогие, обои 3D принтеры имеют меньше шансов иметь точность, необходимые для надежного воспроизведения hyperdrive компонентов, необходимых. Тем не менее stereolithographic технология имеет свои ограничения. Во-первых он имеет ограниченный выбор материалов. Пластик, которые мы выбрали для hyperdrive был самый прочный из тех, которые мы тестировали, однако это до сих пор не оптимально для изготовления очень мелкие кусочки. Челноков и трансфер болты должны обрабатываться с осторожность, поскольку они могут сломаться во время подготовки. Пластиковые компоненты не автоклавируемый, как температура тепловой деформации материала составляет около 50 ° C. Кроме того используемый материал печати не ацетона устойчивостью. Эти вопросы могут быть решены при разрабатываются и испытываются новые стереолитографии материалы. Тем не менее учитывая сравнительно низким стоимость стереолитографии, преимущества техники и стоимость намного превышают дефектов. Во-вторых из-за природы стереолитографии, во время которого Фотополимеры воздухе затвердевает УФ лазер сформировать один слой желаемой 3D модели21, объекты, созданные stereolithographic печать уязвимы для УФ-излучения. Следовательно подвергая их воздействию сильного УФ (например, прямых солнечных лучей) для многих часов необратимо сократить их физической силы (на основе личного общения с типографии). Учитывая экологические УФ в лаборатории пространстве (например, от флуоресцентных ламп), лучше всего хранить stereolithographic компоненты в темной коробке когда не в пользе, которая сохранит компонентов физической силы для лет. Кроме того важно использовать другие методы, помимо ультрафиолетовый свет для дезинфекции поверхности hyperdrive до операции. Этот тест hyperdrive оставалась имплантированных на крысу в хорошем состоянии в среде обычных лаборатории в течение четырех месяцев, без каких-либо признаков сокращения физической силой или производительности.
3D печати характер этой hyperdrive также позволяет быстрого изменения и гибкие редизайн. К примеру, hyperdrive могут быть легко изменены для целевой отделены несколько регионов мозга11. Кроме того этот диск может корректироваться разрешить одновременный мониторинг нейронной активности и местные мозга манипуляции. Включение микродиализом зонд с массивом tetrodes позволяет фармакологических активации и деактивации нейронов, настой различных препаратов во время записи нейронной22. Кроме того нейроны, спроектирован, чтобы выразить светочувствительный каналах можно необходимо активировать или выключенным путем включения в нее оптического волокна в Тетроде расслоение и optogenetic техника19. Кроме того, диск может быть легко ремасштабирована с меньшее количество tetrodes для животных с меньших размеров головы, например несовершеннолетних крыс или мышей.
Таким образом легко изменяемость в сочетании с более простыми, более доступным метод построения эффективной нейронных записи имплантат, что может быть надежно и точно воспроизведены, делает этот hyperdrive мощным инструментом в области.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Мы благодарим Moser лаборатории в институте Кавли систем неврологии и центр для нейронных вычислений, Норвежский университет науки и техники, для хронической нейронных записи процедуры в крыс. Эта работа была поддержана гранта NIH R21 NS098146 и человека пограничной науки программы долгосрочных стипендий LT000211/2016-L для L. Lu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Welding rod | Blue Demon | ER308L-035-01T | Stainless steel, 0.035" in diameter |
| Screw | McMaster | 91771A060 | Stainless steel, flat head, 0-80 thread, 5/8" in length |
| Screw | McMaster | 91772A051 | Stainless steel, pan head, 0-80 thread, 5/32" in length |
| Screw | McMaster | 92196A056 | Stainless steel, socket head, 0-80 thread, 5/16" in length |
| Screw | McMaster | 92196A055 | Stainless steel, socket head, 0-80 thread, 1/4" in length |
| Screw | McMaster | 95868A131 | Nylon, socket head, 2-56 thread, 3/16" in length, black |
| Screw nut | McMaster | 90730A001 | Stainless steel, narrow hex, 0-80 thread |
| Shoulder screw | McMaster | 90298A213 | Stainless steel, 8-32 thread, 3/16" in diameter, 1/4" in length |
| Cup screw | McMaster | 92313A105 | Stainless steel, 4-40 thread, 3/16" in length |
| Thumb screw | McMaster | 94323A592 | Nylon, 8-32 thread, 3/8" in length, black |
| Magnet | Apex | M3X1MMDI | Neodymium, 3 mm X 1 mm disc |
| Metal tubing | Small Parts | B00137QHNS | Stainless steel, 23 gauge, 0.0253" OD, 0.013" ID, 0.006" wall |
| Metal tubing | New England Small Tube | Custom-made | Stainless steel, 30 gauge, 0.012/0.0125" OD, 0.007/0.008" ID, full hard |
| Heat-shrink tubing | McMaster | 7856K72 | 0.09" ID before shrinking, blue |
| Silicone tubing | A-M Systems | 807300 | 0.040" ID, 0.085" OD |
| Polyimide tubing | A-M Systems | 823400 | 0.0045" ID, 0.0005" wall |
| Ground wire | A-M Systems | 791500 | 0.005" bare, 0.008" coated, half hard |
| Tetrode wire | California Fine Wire | Custom-made | 0.0007" in diameter, platinum-iridium (90%-10%), HML and VG coating |
| EIB | Neuralynx | EIB-72-QC-Large | |
| Gold pins | Neuralynx | large EIB pins | |
| Tap | Balax | 01302-000 | M1.2 thread size |
| Tap | McMaster | 2522A811 | 0-80 thread size, bottoming |
| Tap | McMaster | 2522A771 | 0-80 thread size, plug |
| Tap | McMaster | 26955A94 | 3/8"-24 thread size, bottoming |
| Tap | McMaster | 2522A713 | 2-56 thread size |
| Tap | McMaster | 2522A715 | 4-40 thread size |
| Tap | McMaster | 2522A718 | 8-32 thread size |
| Die | McMaster | 2576A457 | 3/8"-24 thread size, 1" OD |
| Drill bit | McMaster | 30585A82 | Wire gauge 65, 0.035" in diameter |
| Drill bit | McMaster | 30585A83 | Wire gauge 66, 0.033" in diameter |
| Drill bit | McMaster | 30585A87 | Wire gauge 70, 0.028" in diameter |
| Drill bit | McMaster | 30585A88 | Wire gauge 71, 0.026" in diameter |
| Drill bit | McMaster | 30585A91 | Wire gauge 73, 0.024" in diameter |
| Drill bit | McMaster | 8870A23 | 3/16" in diameter |
| Dremel disc | Wagner | 31M | Diamond coated, 22 mm in diameter, 0.17 mm in thickness |
| Steel wire | Precision Brand | 21212 | 0.012" in diameter, full hard |
| Steel wire | Precision Brand | 21007 | 0.007" in diameter, full hard |
| Steel wire | A-M Systems | 792700 | 0.003" in diameter, half hard |
| Super glue | Loctite | LT-40640 | # 406 |
| Super glue | Loctite | LT-41550 | # 415 |
| Dental acrylic powder | Teets | 223-3773 | Coral |
| Dental acrylic liquid | Teets | 223-4003 |
References
- O'Keefe, J., Recce, M. L. Phase relationship between hippocampal place units and the EEG theta rhythm. Hippocampus. 3 (3), 317-330 (1993).
- Wilson, M. A., McNaughton, B. L. Dynamics of the hippocampal ensemble code for space. Science. 261 (5124), 1055-1058 (1993).
- Gothard, K. M., Skaggs, W. E., Moore, K. M., McNaughton, B. L. Binding of hippocampal CA1 neural activity to multiple reference frames in a landmark-based navigation task. J Neurosci. 16 (2), 823-835 (1996).
- Gray, C. M., Maldonado, P. E., Wilson, M., McNaughton, B. Tetrodes markedly improve the reliability and yield of multiple single-unit isolation from multi-unit recordings in cat striate cortex. J Neurosci Methods. 63 (1-2), 43-54 (1995).
- Buzsaki, G. Large-scale recording of neuronal ensembles. Nat Neurosci. 7 (5), 446-451 (2004).
- Fyhn, M., Hafting, T., Witter, M. P., Moser, E. I., Moser, M. B. Grid cells in mice. Hippocampus. 18 (12), 1230-1238 (2008).
- Skaggs, W. E., et al. EEG sharp waves and sparse ensemble unit activity in the macaque hippocampus. J Neurophysiol. 98 (2), 898-910 (2007).
- Guo, P., Pollack, A. J., Varga, A. G., Martin, J. P., Ritzmann, R. E. Extracellular wire tetrode recording in brain of freely walking insects. J Vis Exp. (86), (2014).
- Knierim, J. J., McNaughton, B. L., Poe, G. R. Three-dimensional spatial selectivity of hippocampal neurons during space flight. Nat Neurosci. 3 (3), 209-210 (2000).
- Leutgeb, S., et al. Independent codes for spatial and episodic memory in hippocampal neuronal ensembles. Science. 309 (5734), 619-623 (2005).
- Lansink, C. S., et al. A split microdrive for simultaneous multi-electrode recordings from two brain areas in awake small animals. J Neurosci Methods. 162 (1-2), 129-138 (2007).
- Kloosterman, F., et al. Micro-drive array for chronic in vivo recording: drive fabrication. J Vis Exp. (26), (2009).
- McNaughton, B. L. Google Patents. , Available from: https://www.google.com/patents/US5928143 (1999).
- Redish, A. D., et al. Independence of firing correlates of anatomically proximate hippocampal pyramidal cells. J Neurosci. 21 (5), RC134 (2001).
- Schmitzer-Torbert, N., Redish, A. D. Neuronal activity in the rodent dorsal striatum in sequential navigation: separation of spatial and reward responses on the multiple T task. J Neurophysiol. 91 (5), 2259-2272 (2004).
- Nguyen, D. P., et al. Micro-drive array for chronic in vivo recording: tetrode assembly. J Vis Exp. (26), (2009).
- Chang, E. H., Frattini, S. A., Robbiati, S., Huerta, P. T. Construction of microdrive arrays for chronic neural recordings in awake behaving mice. J Vis Exp. (77), e50470 (2013).
- Vandecasteele, M., et al. Large-scale recording of neurons by movable silicon probes in behaving rodents. J Vis Exp. (61), e3568 (2012).
- Siegle, J. H., et al. Chronically implanted hyperdrive for cortical recording and optogenetic control in behaving mice. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 2011, 7529-7532 (2011).
- Brunetti, P. M., et al. Design and fabrication of ultralight weight, adjustable multi-electrode probes for electrophysiological recordings in mice. J Vis Exp. (91), e51675 (2014).
- Hull, C. W. Google Patents. , Available from: https://www.google.com/patents/US4575330 (1986).
- Ludvig, N., Potter, P. E., Fox, S. E. Simultaneous single-cell recording and microdialysis within the same brain site in freely behaving rats: a novel neurobiological method. J Neurosci Methods. 55 (1), 31-40 (1994).
