Summary
Vi presenterar byggandet av en 3D-printable hyperdrive med arton självständigt justerbar tetrodes. Hyperdrift är utformad för att registrera hjärnans aktivitet i fritt bete råtta under en period av flera veckor.
Abstract
Övervaka aktivitetsmönster i en stor population av nervceller över många dagar i vaket djur är en värdefull teknik inom system neurovetenskap. En viktig del av denna teknik består av exakt placering av flera elektroder in önskad hjärnregioner och underhåll av deras stabilitet. Här beskriver vi ett protokoll för byggandet av en 3D-printable hyperdrive, vilket inkluderar arton självständigt justerbar tetrodes, och är särskilt utformad för in vivo extracellulära neurala inspelning i fritt bete råtta. De tetrodes som bifogats den Microdrive-kort kan antingen vara individuellt avancerade i flera hjärnregioner längs spåret, eller kan användas för att placera en array av elektroder i ett mindre område. De flera tetrodes möjliggör samtidig undersökning av action potentials från dussintals enskilda nervceller, liksom lokala fältet potentialer från populationer av nervceller i hjärnan under aktiva beteende. Dessutom ger designen för enklare 3D drafting programvara som kan lätt ändras för olika experimentella behov.
Introduction
I fältet för system neurovetenskap studerar forskare de neurala korrelat underliggande kognitiva processer såsom spatial navigering, minne och beslutsfattande. För dessa typer av studier är det viktigt att övervaka aktiviteten hos många enskilda nervceller under djurens beteende. Under de senaste decennierna, har två viktiga framsteg gjorts för de experimentella behov för extracellulära neurala inspelning i smådjur1,2,3. Först var utvecklingen av tetrode, en bunt av fyra microwires som används för att registrera neurala aktiviteten hos nervceller samtidigt1,2,4. De Differentiella signaler amplituderna för verksamhet i de fyra kanalerna av en tetrod tillåter för isolering av individuella neuron aktivitet från många samtidigt inspelade celler5. Flexibiliteten i microwires kan dessutom större stabilitet av den tetrod minimera relativa förskjutningen mellan tetrod och cell målpopulationen. Tetrodes används nu allmänt i stället för en enda elektrod för många hjärnan studier i olika arter, inklusive gnagare1,2,6, primater7och insekter8. Det andra var utvecklingen av en hyperdrive redovisade flera självständigt rörliga tetrodes, vilket möjliggör samtidig övervakning av neural aktivitet från större populationer av nervceller från flera inspelning platser3, 9,10,11,12.
Tillgången på pålitlig och prisvärd multi tetrod registreringsanordning för små djur är begränsad. Den klassiska hyperdrive, ursprungligen utvecklat av Bruce McNaughton13, har använts framgångsrikt för neurala inspelningar i fritt bete råtta i många laboratorier i de förgångna två årtiondena9,10,14, 15. men av tekniska skäl, de ursprungliga komponenter som behövs för att bygga McNaughton enheten är nu mycket svårt att få och är inte kompatibla med nyligen förbättrad datagränssnitt förvärv. Andra väl accepterade utformningen av hyperdrive kräver den Microdrive-kort att vara individuellt handgjorda, som kunde ge motsägande resultat och konsumera avsevärd tid12. För att registrera neural aktivitet från olika regioner i hjärnan i beter sig råttor, utvecklat vi en ny hyperdrive med stereolithographic teknik. Vi försökte uppfylla följande krav: (1) det nya hyperdrift måste exakt förskjutning av tetrodes i hjärnan och ge stabil inspelning från flera mål regioner; (2) nya hyperdrive måste vara kompatibel med magnetiska quickclip systemet nyligen utvecklats för att tillåta enkel anslutning; och (3) det nya hyperdrift kan återskapas korrekt med material som är lätt tillgängliga. Här ger vi en teknik för att bygga upp de 3D-printable hyperdrive som innehåller arton självständigt rörliga tetrodes, baserat på McNaughton utformningen. I protokollet, vi beskriva detaljerna i tillverkningsprocessen av den nya hyperdrive, som vi har använt framgångsrikt att spela singel-neuron handlingspänningar och lokala fältet potentialer från de postrhinal och mediala entorhinal cortices under veckorna i ett fritt beter sig råtta under naturliga födosökande uppgifter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Stereolithography av 3D-modeller
- Använda stereolithographic tekniker för att skriva ut hyperdrive delar och tillbehör. Varje hyperdrive består av arton skyttlar, arton transferservice bultar, och en vardera av alla andra plast bitar (figur 1).
Obs: Tillbehör ingår inte i hyperdrift men är nödvändiga för hyperdrive konstruktion.
2. beredning av tillbehör (figur 2).
-
Beredning av microdrive racket (Figur 2 c).
- Rengör och utöka de mindre genomgående hål och större blind-hålen i rack med en ø 0.71 mm (0,028 ”) borr och en ø 0.84 mm (0,033”) borr lite, respektive.
- Skär en smälttråd för ø-0,89 mm (0,035-tums) i 17 mm långt segment, runda båda ändar och sätt in varje guide stav i ø 0.84 mm (0,033 ”) hål på sträckbänken, lämnar 11.5 mm utanför (jäms med de gängade stavarna).
- Fullt sätt sex 0-80 gängade, 15,88 mm (5/8 tum) lång platt huvud skruvar ner i skårorna i rack. Säkerställa att guidestängerna och gängade stavar är raka och parallella med varandra. Fylla återstående utrymme i spåren med utspädd dentala cement. Lufttorka på en bänkmonterade för 15 min.
- Limma i svetstrådar och skruvar i racket med tunna super lim och låt lufttorka i 15 min.
-
Beredning av core stationen (Figur 2E).
- Trä de fyra hålen med en 2-56 tryck och använda 2-56, 4,76 mm (3/16 ”) lång nylon skruvar för att säkra kärnan i stationen, om det behövs.
-
Beredning av verktyget svarvning (Figur 2F).
- Gänga hålet på handtaget med ett 4-40 tryck. Infoga den maskinbearbetade spetsen på kortplatsen i handtaget och säkert med en 4-40, 4,76 mm (3/16 ”) lång cup skruv.
-
Förberedelse av innehavaren av hyperdrive (Figur 2 g).
- Gänga skruvhålet med en 8-32-tryck. Använda en 8-32, 9,52 mm (3/8 tum) lång nylon tumme skruv för att säkra hyperdrift under användning.
-
Beredning av staven positionering komplexa (Figur 2 H).
- Gänga stammen från sidan med större hål (överst) med en 8-32 tryck till ett djup på ca 7 mm. tråden de mindre hålen (sex i topp, arton i botten) med ett 0-80 tryck. Expandera centrala hålet i toppen med en ø 4,76 mm (3/16 ”) borr, om nödvändigt.
- Montera stammen till toppen, med en 8-32, ø 4,76 mm (3/16 ”), 6,35 mm (1/4”) lång axel skruv. Säkra botten till toppen med 0-80, 6.35 mm (1/4 tum) långa skruvar under användning.
3. beredning av Hyperdrive komponenterna (figur 3).
- Beredning av hyperdrive muttern (Figur 3A).
- Använda hållaren muttern (figur 2D), gänga muttern med en 3/8-24 bottoming tryck tills slät.
- Montering av hyperdrive kärnan (Figur 3B).
- Rengör och expandera hålen i kärnan med hjälp av olika storlek borr (tolv marken tråd genom-hål (inre ringen): ø 0,61 mm (0,024 ”); de arton tetrod genomgångshål (mellersta ringen): ø 0,66 mm (0,026”) först och sedan ø 0.71 mm (0,028 ”); de arton guide rod blind-hål (yttre ringen): ø 0.84 mm (0.033 ”)).
- Trä de två genomgångshål ovanpå kärnan och de återstående åtta blinda-hålen (fyra på sida, fyra nära botten) med ett 0-80 tryck. Använda en bottoming kran för blind-hålen.
- Skapa externa trådar vid basen av kärnan med hjälp av en 3/8-24 dö. Justera die ordentligt så hyperdrive muttern passar över de nya trådarna.
- Beroende på antalet marken ledningar önskas, infoga flera 6 mm långt segment av 23-gauge metall slangar (kanyler) i marken tråd hålen i kärnan, limma dem vid behov. Fil ändarna av de marken tråd kanyler tills jäms med utsidan av kärnan och rengör kanyler med en ø 0.30 mm (0,012 ”) stål tråd.
- Fullt sätt arton 0-80, 15,88 mm (5/8 tum) lång platt huvud skruvar huvudet ner i skåror i kärnan. Böj skruvarna eller inte skada trådarna under denna process.
- Använda staven positionering komplex och core station, placera arton 17 mm segment av ø 0,89 mm (0,035-tums) smälttråd över guide rod hålen i kärnan och hammare dem ner till vara jäms med skruvarna (ca 5 mm).
- Korrigera positionerna för svetstrådar och skruvar om det behövs, dra sedan åt centrala axeln skruven och omgivande sex skruvarna i staven positionering komplexa att säkra passiv riktningarna av stängerna i kärnan. Skruva muttern på kärnan (med staven positionering komplexa) och passa in kärnan i hyperdrive innehavaren att tillåta enklare positionering under ett stereoskop.
- I kortplatserna med utspädd dentala cement att skruvarna till kärnan och låta lufttorkning för 15 min. Fyll 2-3 platser i taget innan dentala cement blir för tjock. Skrapa bort tandvård överskottscement på kärnan att upprätthålla en korrekt passform med sköld.
- Limma skruvar och stavar i kärnan med tunn superlim, tillåta lufttorkning för 15 min.
- Montering av microdrive (Figur 3 c).
- Rengör och expandera de två yttersta hålen i skytteltrafik med borr (mindre hål: ø 0,61 mm (0,024 ”) borr bit; större hål: ø 0,89 mm (0.035”) borr).
- Sätt transfer bulten i bult hållaren bas. Uppmärksamma orientering. Nära bult innehavaren locket, Håll tätt och tråd långsamt genom hålet i locket med ett 0-80 tryck. Tryck på 2 - 3 gånger tills slät.
- Infoga transfer bulten i shuttle från sidan med den mindre öppningen. Plats shuttle-bussen bult komplexa uppochner i microdrive montering station bas.
- Skär ett 15 mm segment av 23 gauge metall slangar och slät båda ändarna och sedan placera slangen över ø 0,61 mm (0,024 ”) hålet, vägledas av kortplatsen på stationen locket. Hammer kanylen i hålet tills den övre änden är i linje med station locket.
- Ta bort den yttre halvan av den övre spetsen av kanylen med slipning hjul. Ren kanylen med en metalltråd för ø-0.30 mm (0,012 ”). Limma kanylen på skytteln använder tunna superlim, se till att inte limma transfer bulten till skytteln och luft torka i 15 min.
- Förbereda minst arton Microdrive-kort, testa microdrive på microdrive racket. Kontrollera att shuttle bulten kan rotera smidigt i skytteltrafik och att den hela microdrive rör sig fritt längs längden av den gängade stången.
- Beredning av den centrala kolumnen (Figur 3D).
- Sand i toppen och botten av den centrala kolumnen tills platt, om det behövs. Trä de två hålen i den centrala kolumnen med ett 0-80 tryck. Infoga en 0-80 hex mutter (3,18 mm (1/8 tum) breda, 1,19 mm (3/64 ”) hög) i varje fack.
- Beredning av hyperdrive locket (Figur 3E).
- Använda icke-magnetiska pincetter, limma fyra magneter (3 mm i diameter, 1 mm tjock) i fyra brunnar, matcha dem till N och S stolpar på elektroden gränssnittskortet.
- Montering av de guide kanyler i en bunt (Figur 3F).
- Plats arton 30 gauge, tunnväggiga kanyler (ID 0,19 mm, 0,0075 ”) till ø 2,29 mm (0,09”)-Värmekrympande rör (3-5 mm lång, fördelade sönder längs bunten av 5-10 mm). Göra alla kanyler i ena änden av bunt i jämnhöjd med varandra.
- Krympa de krympslangar med en värmepistol tills bunten tryter. Pressa bunten försiktigt för att forma det som önskas (runda eller ovala). Bekräfta att alla kanyler är i rätt läge med ingen vridning, korsning eller böjning.
- Markera områden för lödning på kanyler. Unsoldered portion bör 26 mm i längd, medan lödde portion bör vara 5-10 mm. flytta krympningen rör med lödning märkena att förhindra spridning.
- Gälla en lödning området flux och löda samtidigt vrida bunten. Svalna i rumstemperatur i minst 1 min. Upprepa detta steg att löda samma område två gånger. Jämna ut lödde portion genom lödning utan att använda flux och filler material. Svalna i rumstemperatur i minst 1 minut.
- Skär bunten till rätt längd med en diamant hjul med högsta hastighet, polska båda slutar för att justera längd (unsoldered del: 26 mm, lödda del: 5-10 mm som önskas). Ren de guide kanyler med en metalltråd för ø 0,18 mm (0,007 ”) under ett stereoskop.
- Förbereder tetrodes. Liknande procedurer har beskrivits8,16,17 .
- Justera höjden på den horisontella T bar och placeringen av magnetomröraren, så att den horisontella armen på argt av T bar är direkt ovanför mitten av magnetomröraren. Koppla ena änden av en S-krok till mitten av en liten magnetiska rör bar och sedan limma ihop dem tillsammans. Ren den tetrod att göra utrymme med tryckluft och etanol våtservetter.
- Cirkla två ändarna av en bit av inre tetrod tråd runt 40 cm i längd tillsammans, sedan fäst med en bit koppar tejp.
- Lyft tråd cirkeln genom att hålla koppar bandet. Placera änden motsatt koppar bandet till den horisontella armen av T bar. Sänka koppar tejpen försiktigt (medan andra änden ligger fortfarande på T bar), vrida en gång och placera koppar bandet till den T bar. Tetrod cirkeln är nu i en konfiguration för siffran åtta (”∞”) med koppar tejpen sitter på toppen av det vågräta fältet kors.
- Håll koppar bandet på T bar med ena handen försiktigt. Med andra handen, krok den fria änden av S-kroken (med magnetiska uppståndelse fästs den andra änden) genom botten av tetrod tråd cirkeln, släppa S-kroken försiktigt och låt den räta ut de fyra ledarna av väga av de S-kroken.
- Justera höjden på det horisontella fältet tills botten av S-kroken är ca 1 cm ovanför centrum av magnetomrörare plattan.
- Böja kanten av koppar bandet ner för att säkra det till det vågräta fältet. Undersöka de fyra raka tetrod ledarna genom ögat och tar bort eventuellt skräp.
- Slå på den omrörare som vrida de fyra ledarna vid en hastighet omkring 60 rpm, tills vinkeln mellan de två motsatta otvinnat kablarna är ca 60°.
- Ange värmepistol till 210 ° C och värma de tvinnade kablarna genom svepande pistolen längs kablarna från olika vinklar för 2 min att smälta dem samman av smältande VG bond pälsen rak längd.
- Lyft den S-kroken med rör om försiktigt och skär den nedre änden av tetrod med fina sax.
- Håll koppar bandet på det horisontella fältet med ett finger, skär trådarna från båda kanterna av koppar bandet med en sax och ta bort koppar tejpen. Skär resterande tråd på det horisontella fältet att släppa tetrod.
- Placera den färdiga tetrod i en dammfri låda för förvaring. Bered minst tjugofem tetrodes.
4. montering av hyperdrift (figur 4).
- Infoga de guide kanyler i hyperdrive kärnan (figur 4A).
- Ta bort krympslangar och skjut ett 4 mm segment av silicon slangar (ID 1,02 mm (0,04 ”), OD 2,16 mm (0,085”)) längs bunten till lödde/unsoldered gränsen. Wedge skåran i hyperdrive mellanlägget att bredda hål i mitten, så att distansen att glida runt kisel röret. Ta bort kilen när distansringen sitter i mitten av kisel röret.
- Organisera de guide kanyler positioner i bunten genom att placera långa segment (10 cm) av ø 0,18 mm (0,007 ”) metall tråd genom varje kanyl i en specifik tetrod hål i hyperdrive kärnan, förebygga eventuella crossover av ledningar eller kanyler i processen. Böj i ändarna av ledningarna att hålla dem på plats.
- Tryck på kanyler genom sina respektive hål i kärnan, vara noga med att undvika bockning eller passage mellan dem, tills den fria änden av varje kanyl är minst 2 mm utanför den övre änden av tetrod hålet. Säkra avståndsbilden genom att skruva muttern till kärnan, är noga med att förhindra distansringen från roterande. Applicera en droppe av mycket utspädda dentala cement från toppen av kärnan på korsningen av kanyler att säkra deras relativa lägen.
- Skär guiden ledningar från lödde slutet av bunt, och ta bort dem från kanyler av tillbakadragande från den fria änden.
- Montering av den Microdrive-kort på hyperdrift Core (figur 4B). En detaljerad rumsliga ordningen av den Microdrive-kort i hyperdrift har funnits tidigare beskrivna11,13.
- Lasta den Microdrive-kort långsamt och försiktigt på varje gängstång av kärnan. Bekräfta att (1) 23 gauge microdrive kanyl går i tetrod hålet smidigt, (2) 30 gauge kanyl guide går in 23 gauge microdrive kanyl smidigt, och (3) Transfer bulten girar jämnt längs den gängade stången. Skruva den Microdrive-kort ned till 1,0-1,5 mm ovanför den nedre änden av gängade stängerna.
- Skär arton bitar av polyimid slangar (ID 0,11 mm (0.0045 ”), OD 0,14 mm (0.0055”)) i 38-43 mm segment (längd guide kanyl bunt plus 7 mm). Ren varje tub med en ø 0,08 mm (0,003 ”) stål tråd.
- Invertera kärnan, infoga polyimid rören försiktigt i de guide kanyler från lödde slutet och driva dem alla långt in under ett stereoskop. Vänd kärnan upprätt och limma den övre änden av polyimid röret på microdrive kanylen med tjocka superlim. Placera kärnan uppochner och låt limmet torka i 15 min.
- Skär den extra polyimid snowtubing i den övre delen, lämnar 0,5-1,0 mm utanför microdrive kanylen.
-
Montering av marken trådarna (Figur 4 c).
- Minska antalet marken ledningar behöver 25-30 mm längd från belagd ståltråd (belagd ø 0.20 mm (0,008 ”), bare ø 0,13 mm (0,005”)). Band 2 mm plast isolering från båda tips av trådarna och stick in ena änden av varje i ändarna på 6-8 mm lång 30 gauge-kanyler. Platta till ändarna på de kanyler att säkra anslutningen till deras respektive sladdar.
- Använd en Dremel verktyg för att skära kanyler i hälften att skapa två kompletta marken trådar från varje.
- Sätt runt slutet av 30 gauge kanylen i den övre delen av marken tråd kanylen i kärnan och tryck för att göra insättningspunkten tight.
-
Montering av elektroden gränssnittskortet (Figur 4 d).
- Infoga den centrala kolumnen i kärnan och säkert med två 0-80, 7,94 mm (5/16 ”) lång socket skruvar. Limma om nödvändigt att göra den centrala kolumnen stadig i kärnan.
- Expandera portionr av skåror i EIB-72-QC-Large styrelsen som motsvarar till två gängade hål i den centrala kolumnen med ett ø 1,2 mm tryck. Fäst elektroden gränssnittskortet centrala kolumnen med två 0-80, 3.97 mm (5/32 tum) lång pan skruvar. Se till att styrelsen ligger i centrum och är säkert.
-
Anslutning av kablarna i marken (Figur 4E).
- LED varje jordledning runt den centrala kolumnen och Anslut den exponerade fria änden till elektroden gränssnittskortet med en guldnål på utsedda marken hålet.
-
Laddar tetrodes in i hyperdrift, som tidigare beskrivits 16 , 17 .
- Fyll varje tetrod noggrant i polyimid rören av den Microdrive-kort, var noga med att inte böja dem under processen.
- Försiktigt använda foder fria änden trådarna i deras utsedda hålen i gränssnittet elektrod ombord och elektriskt ansluta dem guld stift.
- Skär tetrodes individuellt till en ordentlig längd. Bekräfta att portion av tetrodes sticker ut från de nedre ändarna av polyimid rören efter styckning är rak, annars byta ut de hela tetrod och recut.
-
Fästa sköld.
- Fäst skölden till kärnan med fyra 0-80, 3.97 mm (5/32 tum) pan skruvar. Siffrorna på skölden ska matcha med nummer på elektroden gränssnittskortet.
-
Plätering tetrod tips.
- Tallrik tips av de tetrodes som använder NanoZ plätering enheten utrustad med en ADPT-NZ-EIB-36-koppling och en ADPT-EIB-72-QC-HS-36 adapter17. Alternativt, tallrik dem manuellt en efter en som beskrivs på annan plats16. Tallrik tetrod tips före användning (t.ex., en dag före implantation), som impedans gradvis ökar med tiden efter bordläggningen. Ersätta de tetrodes som är kortsluten eller blockeras under processen för plätering, skär dem till rätt längd, och åter tallrik.
-
Slutbehandling av hyperdrive (Figur 4F).
- Limma tetrodes till deras polyimid rör som tidigare beskrivits16. Dra tillbaka dem alla tillbaka till deras guide kanyler så guldpläterade tips inte exponeras.
- Skruva fyra 0-80, 6.35 mm (1/4 tum) lång socket skruvar i de fyra hålen nära botten av hyperdrive kärnan.
- Använder ett stereoskop, lägre varje tetrod långsamt tills spetsen på tetrod är strax ovanför kanten av guide kanylen. Under tiden, lokalisera positionen av varje tetrod guide kanyl huvudvara. Karta över den tetrods position är avgörande för återuppbyggnaden av inspelning webbplatser.
- Montera locket till enheten och lagra hyperdrift ordentligt för implantation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En nybyggd hyperdrive använde vi för att få prov resultaten. Enheten var utrustad med tetrodes tillverkad av ø 17 µm (0.0007 ”), polyimid-belagd platina-iridium (90% - 10%) tråd. Tips av tetrodes var klädd i platina svart lösning att minska elektrod impedanser till mellan 100 och 200 kΩ vid 1 kHz. Hyperdrift var implanteras 4.6 mm vänster om mittlinjen och 0,5 mm främre tvärgående sinus på skallen av en 550 g, manliga lång-Evans råtta. Ytterligare marken ledningar var anslutna till skallen skruvar över lillhjärnan. Alla förfaranden utfördes som godkänts av den institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) av Baylor College of Medicine och liknade de tidigare beskrivna18. Omedelbart efter kirurgisk implantation, var tetrodes avancerade 1 mm in i hjärnan. På senare dagar användes mindre avancerade steg om inte mer än 80 µm. Tetrodes tilläts stabiliseras efter varje avancemang för minst 20 h innan neurala inspelningar utfördes.
För att registrera neural aktivitet, hyperdrift var ansluten till en headstage förförstärkare (Neuralynx, HS-72-QC), och den senare var ansluten till ett system för datainsamling med programmerbar förstärkare (Neuralynx, Digital Lynx SX). Lokala fältet potentials var refereras till en jordledning, provtas vid 2 kHz, och band-passera filtreras på 0,1 – 500 Hz. enheten aktivitet var refererade till en tetrod utan observerbara aktivitet ligger 500 µm från hjärnans yta, provtas på 32 kHz och band-passera filtreras vid 600 Hz - 6 kHz. Endast spike vågformer ovan ett tröskelvärde på 50 µV registrerades.
Figur 5A illustrerar neural aktivitet registreras från en tetrod ligger i postrhinal cortex (2,1 mm nedanför hjärnan ytan), medan djuret fritt födosök inuti en 1,5 m öppen låda tre veckor efter implantationen. Inspelningen varade i ca 30 min och de enheter som registreras förblev stabil över hela sessionen (framgår av små variationen i spike vågformer). Figur 5B visar lokala fältet potentialer inspelade samtidigt från fyra olika tetrodes som ligger i den mediala entorhinal cortexen (3.4-3.7 mm djup) medan samma djur aktivt utforska den öppna arenan sju veckor efter implantationen. Rensa fältet potentiell aktivitet i frekvensområdet theta (6-10 Hz) var närvarande. Individuella neuron spike data var isolerade med programvaran sortering MClust (A.D. Redish) och potentiella lokala fältdata var visualiserat av custom skrivna Matlab skript. Exempel på låg kvalitet tetrod inspelningar, eventuellt följd av en dåligt förberedd enhet, har visat tidigare17.
Figur 1: Hyperdrive komponenter skapad av stereolithographic teknik. Bild av 3D-printable hyperdrive komponenter (1¢ mynt för Storleksjämförelse). (A), hyperdrive kärnan; (B) skyddande sköld; (C), skyddslocket; (D), den centrala kolumnen; (E), muttern; (F), mellanlägget; (G), fjäderbollen; (H) Transfer bulten. Skalstapeln: 1 cm. Dessa komponenter har skapats av en UnionTech RSPro450 skrivare med hjälp av plast material Somos utvecklas 128. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: skräddarsydda tillbehör för hyperdrive konstruktion. Dessa tillbehör var designat speciellt till stöd vid utarbetandet av hyperdrift. Dess huvudkomponenter skapades stereolithographic utskrift. (A) innehavaren av bult transfer, som säkrar transfer bulten medan knacka trådar. (B), microdrive församlingen station, som vägleder kanyl insättningspunkten till skytteln. (C) microdrive rack, vilket hjälper till att testa den monterade Microdrive-kort och håller dem på plats medan limning av kanyler. 1: en microdrive rack bas; 2: en microdrive rack med skruvarna ordentligt i spåren; 3: en microdrive rack klar för användning. (D) innehavaren, som innehar hyperdrive muttern när gängning hålet i muttern. (E), hyperdrive kärnan station, som säkrar kärnan medan hamring guidestängerna. (F) den roterande verktyg, som driver transfer bulten att rotera i skytteltrafik. (G) innehavaren av hyperdrive, som hjälper till att placera hyperdrift under ett stereoskop. Innehavaren skyddar även tetrodes när de har lästs in i hyperdrift. (H) staven positionering komplex, som hjälper till att placera gängade stängerna och vägleda stavar i hyperdrive kärna. 1: stora delar av komplexet; 2: den övre delen av anläggningen efter församling; 3: en rod positionering komplex i användning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: förberedelse av hyperdrift delar före montering. Bilder visar förberedelseprocessen av hyperdrive kärnan och microdrive, samt andra beredda hyperdrive delar. (A) A gängad hyperdrive mutter. (B) beredning av hyperdrive kärnan. 1: kärna med yttre trådar som skapas för muttern; 2: kärnan placeras i en core station med skruvar ordentligt i spåren; 3: guide stavar placerad med stav positionering komplex, redo att vara hamrade in kärnan; 4: fylla återstående utrymme i spåren med utspädd dentala cement; 5: den övre delen av en beredd hyperdrive kärna. (C) beredning av microdrive. 1: en shuttle bult placeras i en shuttle bult innehavaren, basnot mindre öppningen är vänd bort från experimenter; 2: gängning trådar inuti transfer bulten; 3: införande av skytteln bult till fjäderbollen; 4: en microdrive placeras i microdrive montering station bas med kanylen styrs av station locket, redo att införas; 5: en microdrive med yttre hälften av övre kanyl spetsen bort (indikeras av pilen); 6: monterade Microdrive-kort testade på microdrive racket. (D) ett centrala kolumnen med gängade hål och infogade muttrar. (E) A hyperdrive cap med fyra magneter limmade i brunnarna. (F), A 36 mm lång guide kanyl bundle, med lödda del till vänster. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: montering av hyperdrift. Bilder visar stadier av hyperdrive församlingen. (A) införandet av de guide kanyler i kärnan. 1: guide kanyl bunten gled i silicon röret och distansringen; 2: en guide kanylen placeras i dess utsedda hål i kärnan. Hand handstilen visar organisationen av guiden kanyler; 3: vägleda kanyler som skjuts in i kärnan; 4: kärna med de guide kanyler isatt och säkrade genom muttern. (B) montering av den Microdrive-kort till kärnan. 1: kärna med Microdrive-kort laddad; 2: den Microdrive-kort med polyimid rör insatt i kanyler. (C) införande av marken trådarna i kärnan. (D) fastsättning av elektroden gränssnittskortet. 1: hyperdrift med den centrala kolumnen infogas; 2: hyperdrift med elektrod gränssnittskortet bifogas med den centrala kolumnen. (E) anslutning av en jordledning till utsedda hålet i elektroden gränssnittskortet. (F), A slutbehandlad hyperdrive redo för implantation (total vikt 20 g). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: neurala signaler inspelad av hyperdrift. Representativa inspelningar visar enheten neural aktivitet och lokala fältet potentiella i en beter sig råttas hjärna. (A) tvådimensionella kluster diagram som illustrerar individuella spikar från samtidigt inspelade nervceller av en tetrod ligger i postrhinal cortex (djup: 2,1 mm). Vänster: spridningsdiagram visar förhållandet mellan peak-to-peak amplituderna för spikar inspelade från två elektroder av tetrod. Varje prick motsvarar en spike. Kluster av spikar sannolikt härstammar från samma cell. Fyra kluster är färgkodade. Skalstapeln: 20 µV. Höger: spike vågformer (medel ± S.D.) färgkodade celler visas till vänster. Observera små variationen av vågformer. Skalstapeln: 200 µs. (B) spår av lokala fältet potentiella i frekvensområdet theta inspelade samtidigt från fyra olika tetrodes som ligger i den mediala entorhinal cortexen (djup: 3.4-3.7 mm) När råttan fritt födosök. Skala bar längst vänster: 500 µV; skalstapeln på längst ned till höger: 100 ms. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Kompletterande filer: Kompletterande filer inkluderar 20 filer i formatet .stl detailing hyperdrive komponenter och tillbehör redo för stereolithographic utskrift (enheter i mm) och 1 fil i .pdf-format som är en ritning av verktyget roterande spets redo för bearbetning. De ursprungliga 3D-modellfilerna skapades med programvaran AutoCAD-DWG-format, som kommer att vara tillgängliga på begäran. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här beskriver vi processen för att bygga en nyutvecklad hyperdrive består av arton självständigt rörliga tetrodes. Enheten kan konstrueras från prisvärda delar köpt på många tillgängliga järnaffärer, kombinerat med komponenter som skapats av stereolithographic utskrift. Hyperdrift kroniskt kan implanteras på en råttas skalle använder standard kirurgiska ingrepp och är skicklig av inspelningen extracellulära neural aktivitet medan djuret utför olika beteendemässiga uppgifter.
Hyperdrift behåller många önskvärda funktioner i den ursprungliga McNaughton hyperdrive, inklusive de stativ Microdrive-kort som är orienterade utåt med 30 grader från drive center13, som ger tillförlitlig stöd för tetrodes. När implanteras, ger hyperdrift utförandet av små rörelser av tetrodes i hjärnan av ett vaket djur med stor precision. Ett fullt varv transfer på den gängade stången motsvarar en linjär förskjutning av 317.5 µm. Med lämplig utbildning, kan en försöksledaren avancera transfer i 1/16 tur steg (20 µm). Vi utformade hyperdrift för användning hos vuxna råttor, men enheten kan enkelt användas på djur med en kroppsstorlek av 350 g eller större (begränsad av huvudet storlek). En begränsning av enheten kan noteras i begränsade djupet av inspelning, som maximal resor distansera av tetrodes längs gängade stängerna är ca 7 mm, vilket inte kunde når djupare strukturer i vissa djurens hjärnor.
Stereolithographic utskrift föreskriver tillräcklig upplösning för att skapa plastkomponenter i detalj med HiFi och har använts tidigare i hyperdrive fabrication12,19,20. I detta fall användes en industriell skrivare som är allmänt tillgängliga genom tredje part produktionsanläggningar. Det trycktes alla hyperdrive komponenter exakt, inklusive hyperdrive kärnan, trots dess komplexa geometri och de små strukturerna såsom ø 0,6 mm genom hål och 0,3 mm tunna väggarna. Denna precision gör stereolithography ett idealiskt val för tillverkning av hyperdrive komponenter. Baserat på tidigare erfarenhet, är billigare, stationära 3D-skrivare mindre benägna att ha noggrannheten som krävs för tillförlitlig reproduktion av hyperdrive komponenter behövs. Fortfarande, stereolithographic-tekniken har sina begränsningar. Först, den har ett begränsat urval av material. Den plast som vi valde för hyperdrift var den mest hållbara av dem vi har testat, men det är fortfarande inte optimal för tillverkning av mycket små bitar. Shuttle och transfer bultarna måste hanteras med extra försiktighet som de kan bryta under beredning. Plastkomponenter är inte autoklaverbara, eftersom värme nedböjning temperatur materialet är cirka 50 ° C. Dessutom tål skriva ut materialet inte aceton. Dessa frågor kan lösas när nya stereolithography material utvecklas och testas. Ändå, med tanke på den relativt låg kostnaden för Stereolitografi, fördelarna med tekniken och kostnaden överstiger vida defekterna. Det andra på grund av Stereolitografi, under vilken polymerer är photochemically stelnat av en UV-laser för att bilda ett enda lager av önskad 3D modell21, är de objekt som skapas av stereolithographic utskrift utsatta för UV-ljus. Följaktligen, utsätta dem för starka UV (t.ex., direkt solljus) för många timmar kommer att oåterkalleligt minska sin fysiska styrka (baserat på personlig kommunikation med tryckeriet). Med tanke på miljön UV i laboratoriet utrymme (t.ex., från fluorescerande ljus), är det bäst att förvara de stereolithographic komponenterna i en mörk låda när inte i använda behåller som komponenter fysisk styrka i år. Dessutom är det viktigt att använda andra metoder bortsett från UV-ljus för att desinficera hyperdrive ytan före operation. Detta test hyperdrive förblivit implanterade på råtta i bra skick i en vanlig laboratoriemiljö under loppet av fyra månader, utan någon indikation på en minskning av fysisk styrka eller prestanda.
3D utskrivbara arten av denna hyperdrive kan också snabba ändringar och flexibla redesign. Till exempel hyperdrift kan enkelt ändras till målet separerade flera hjärnan regioner11. Denna enhet kunde dessutom justeras för att tillåta samtidig övervakning av neural aktivitet och lokala hjärnan manipulation. Införlivandet av en mikrodialys sond med utbudet av tetrodes möjliggör farmakologiska aktivering och avaktivering av nervceller genom infusion av olika droger under neurala inspelning22. Dessutom kan nervceller konstruerad till express ljuskänsliga kanaler aktiveras eller avaktiveras genom att införliva en optisk fiber i tetrod bunt och optogenetic teknik19. Dessutom enheten enkelt kan skalas om med ett färre antal tetrodes för djur med mindre huvudstorlekar, till exempel möss eller juvenila råttor.
Sammanfattningsvis, den lätt föränderlighet i kombination med enklare, mer prisvärda metoden för att konstruera ett effektivt neurala inspelning implantat som tillförlitligt och korrekt kan reproduceras, gör denna hyperdrive ett kraftfullt verktyg i fältet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Moser labbet på Kavli Institutet för system neurovetenskap och centrum för Neural uträkning, norska universitetet för vetenskap och teknik, för den kroniska neurala inspelning förfaranden hos råttor. Detta arbete stöds av NIH grant R21 NS098146 och Human Frontier Science Program långsiktiga gemenskap LT000211/2016-L till L. Lu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Welding rod | Blue Demon | ER308L-035-01T | Stainless steel, 0.035" in diameter |
| Screw | McMaster | 91771A060 | Stainless steel, flat head, 0-80 thread, 5/8" in length |
| Screw | McMaster | 91772A051 | Stainless steel, pan head, 0-80 thread, 5/32" in length |
| Screw | McMaster | 92196A056 | Stainless steel, socket head, 0-80 thread, 5/16" in length |
| Screw | McMaster | 92196A055 | Stainless steel, socket head, 0-80 thread, 1/4" in length |
| Screw | McMaster | 95868A131 | Nylon, socket head, 2-56 thread, 3/16" in length, black |
| Screw nut | McMaster | 90730A001 | Stainless steel, narrow hex, 0-80 thread |
| Shoulder screw | McMaster | 90298A213 | Stainless steel, 8-32 thread, 3/16" in diameter, 1/4" in length |
| Cup screw | McMaster | 92313A105 | Stainless steel, 4-40 thread, 3/16" in length |
| Thumb screw | McMaster | 94323A592 | Nylon, 8-32 thread, 3/8" in length, black |
| Magnet | Apex | M3X1MMDI | Neodymium, 3 mm X 1 mm disc |
| Metal tubing | Small Parts | B00137QHNS | Stainless steel, 23 gauge, 0.0253" OD, 0.013" ID, 0.006" wall |
| Metal tubing | New England Small Tube | Custom-made | Stainless steel, 30 gauge, 0.012/0.0125" OD, 0.007/0.008" ID, full hard |
| Heat-shrink tubing | McMaster | 7856K72 | 0.09" ID before shrinking, blue |
| Silicone tubing | A-M Systems | 807300 | 0.040" ID, 0.085" OD |
| Polyimide tubing | A-M Systems | 823400 | 0.0045" ID, 0.0005" wall |
| Ground wire | A-M Systems | 791500 | 0.005" bare, 0.008" coated, half hard |
| Tetrode wire | California Fine Wire | Custom-made | 0.0007" in diameter, platinum-iridium (90%-10%), HML and VG coating |
| EIB | Neuralynx | EIB-72-QC-Large | |
| Gold pins | Neuralynx | large EIB pins | |
| Tap | Balax | 01302-000 | M1.2 thread size |
| Tap | McMaster | 2522A811 | 0-80 thread size, bottoming |
| Tap | McMaster | 2522A771 | 0-80 thread size, plug |
| Tap | McMaster | 26955A94 | 3/8"-24 thread size, bottoming |
| Tap | McMaster | 2522A713 | 2-56 thread size |
| Tap | McMaster | 2522A715 | 4-40 thread size |
| Tap | McMaster | 2522A718 | 8-32 thread size |
| Die | McMaster | 2576A457 | 3/8"-24 thread size, 1" OD |
| Drill bit | McMaster | 30585A82 | Wire gauge 65, 0.035" in diameter |
| Drill bit | McMaster | 30585A83 | Wire gauge 66, 0.033" in diameter |
| Drill bit | McMaster | 30585A87 | Wire gauge 70, 0.028" in diameter |
| Drill bit | McMaster | 30585A88 | Wire gauge 71, 0.026" in diameter |
| Drill bit | McMaster | 30585A91 | Wire gauge 73, 0.024" in diameter |
| Drill bit | McMaster | 8870A23 | 3/16" in diameter |
| Dremel disc | Wagner | 31M | Diamond coated, 22 mm in diameter, 0.17 mm in thickness |
| Steel wire | Precision Brand | 21212 | 0.012" in diameter, full hard |
| Steel wire | Precision Brand | 21007 | 0.007" in diameter, full hard |
| Steel wire | A-M Systems | 792700 | 0.003" in diameter, half hard |
| Super glue | Loctite | LT-40640 | # 406 |
| Super glue | Loctite | LT-41550 | # 415 |
| Dental acrylic powder | Teets | 223-3773 | Coral |
| Dental acrylic liquid | Teets | 223-4003 |
References
- O'Keefe, J., Recce, M. L. Phase relationship between hippocampal place units and the EEG theta rhythm. Hippocampus. 3 (3), 317-330 (1993).
- Wilson, M. A., McNaughton, B. L. Dynamics of the hippocampal ensemble code for space. Science. 261 (5124), 1055-1058 (1993).
- Gothard, K. M., Skaggs, W. E., Moore, K. M., McNaughton, B. L. Binding of hippocampal CA1 neural activity to multiple reference frames in a landmark-based navigation task. J Neurosci. 16 (2), 823-835 (1996).
- Gray, C. M., Maldonado, P. E., Wilson, M., McNaughton, B. Tetrodes markedly improve the reliability and yield of multiple single-unit isolation from multi-unit recordings in cat striate cortex. J Neurosci Methods. 63 (1-2), 43-54 (1995).
- Buzsaki, G. Large-scale recording of neuronal ensembles. Nat Neurosci. 7 (5), 446-451 (2004).
- Fyhn, M., Hafting, T., Witter, M. P., Moser, E. I., Moser, M. B. Grid cells in mice. Hippocampus. 18 (12), 1230-1238 (2008).
- Skaggs, W. E., et al. EEG sharp waves and sparse ensemble unit activity in the macaque hippocampus. J Neurophysiol. 98 (2), 898-910 (2007).
- Guo, P., Pollack, A. J., Varga, A. G., Martin, J. P., Ritzmann, R. E. Extracellular wire tetrode recording in brain of freely walking insects. J Vis Exp. (86), (2014).
- Knierim, J. J., McNaughton, B. L., Poe, G. R. Three-dimensional spatial selectivity of hippocampal neurons during space flight. Nat Neurosci. 3 (3), 209-210 (2000).
- Leutgeb, S., et al. Independent codes for spatial and episodic memory in hippocampal neuronal ensembles. Science. 309 (5734), 619-623 (2005).
- Lansink, C. S., et al. A split microdrive for simultaneous multi-electrode recordings from two brain areas in awake small animals. J Neurosci Methods. 162 (1-2), 129-138 (2007).
- Kloosterman, F., et al. Micro-drive array for chronic in vivo recording: drive fabrication. J Vis Exp. (26), (2009).
- McNaughton, B. L. Google Patents. , Available from: https://www.google.com/patents/US5928143 (1999).
- Redish, A. D., et al. Independence of firing correlates of anatomically proximate hippocampal pyramidal cells. J Neurosci. 21 (5), RC134 (2001).
- Schmitzer-Torbert, N., Redish, A. D. Neuronal activity in the rodent dorsal striatum in sequential navigation: separation of spatial and reward responses on the multiple T task. J Neurophysiol. 91 (5), 2259-2272 (2004).
- Nguyen, D. P., et al. Micro-drive array for chronic in vivo recording: tetrode assembly. J Vis Exp. (26), (2009).
- Chang, E. H., Frattini, S. A., Robbiati, S., Huerta, P. T. Construction of microdrive arrays for chronic neural recordings in awake behaving mice. J Vis Exp. (77), e50470 (2013).
- Vandecasteele, M., et al. Large-scale recording of neurons by movable silicon probes in behaving rodents. J Vis Exp. (61), e3568 (2012).
- Siegle, J. H., et al. Chronically implanted hyperdrive for cortical recording and optogenetic control in behaving mice. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 2011, 7529-7532 (2011).
- Brunetti, P. M., et al. Design and fabrication of ultralight weight, adjustable multi-electrode probes for electrophysiological recordings in mice. J Vis Exp. (91), e51675 (2014).
- Hull, C. W. Google Patents. , Available from: https://www.google.com/patents/US4575330 (1986).
- Ludvig, N., Potter, P. E., Fox, S. E. Simultaneous single-cell recording and microdialysis within the same brain site in freely behaving rats: a novel neurobiological method. J Neurosci Methods. 55 (1), 31-40 (1994).
