Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Konstruktion af en forbedret multi triode Hyperdrive for storstilet neurale optagelse i opfører sig rotter

Published: May 9, 2018 doi: 10.3791/57388
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Neuroscience, Baylor College of Medicine

Summary

Vi præsenterer opbygningen af en 3D-printable hyperdrive med atten uafhængigt justerbare Tetroder. Hyperdrive er designet til at registrere hjerneaktivitet i frit opfører rotter over en periode på flere uger.

Abstract

Overvåge aktivitet mønstre af en stor population af neuroner over mange dage i vågen dyr er en værdifuld teknik inden for systemer neurovidenskab. Et nøgleelement i denne teknik består af den præcise placering af flere elektroder ind i ønskede hjerneregioner og vedligeholdelse af deres stabilitet. Her, beskriver vi en protokol til opførelse af en 3D-printable hyperdrive, som omfatter atten uafhængigt justerbare Tetroder, og er specielt designet til in vivo ekstracellulære neurale optagelse i frit opfører rotter. Tetroder knyttet til microdrives kan enten individuelt rykkede ind i flere områder af hjernen langs sporet, eller kan bruges til at placere en række elektroder ind i et mindre område. Flere Tetroder tillader samtidig behandling af action potentials fra snesevis af individuelle neuroner, samt lokale felt potentialer fra populationer af neuroner i hjernen under aktiv adfærd. Designet indeholder desuden for enklere 3D udarbejdelse software, der kan let ændres til forskellige eksperimentelle behov.

Introduction

Inden for systemer neurovidenskab studere forskerne de neurale korrelerer underliggende kognitive processer såsom rumlige navigation, hukommelse og beslutningstagning. For disse typer af undersøgelser er det kritisk at overvåge aktiviteten af mange individuelle neuroner i dyrs adfærd. I de seneste årtier, er der sket to vigtige fremskridt til at imødekomme de eksperimenterende i ekstracellulær neurale optagelse i små dyr1,2,3. Først var udviklingen af triode, et bundt af fire microwires bruges til at registrere neurale aktivitet af neuroner samtidig1,2,4. Differenssignalkorrektioner amplituder af aktivitet på tværs af de fire kanaler i en triode tillader til isolering af enkelte neuron aktivitet fra mange samtidig indspillede celler5. Desuden giver den fleksible karakter af microwires større stabilitet af triode minimere den relative forskydning mellem triode og celle målpopulationen. Tetroder er nu almindeligt anvendt i stedet for en enkelt elektrode for mange hjerne undersøgelser i forskellige arter, herunder gnavere1,2,6, primater7og insekter8. Andet var udviklingen af et hyperdrive transporterer flere uafhængigt bevægelig Tetroder, som giver mulighed for samtidig overvågning af neurale aktivitet fra større populationer af neuroner fra flere optagelse steder3, 9,10,11,12.

Tilgængeligheden af en pålidelig og overkommelig flere triode optageenhed til små dyr er begrænset. Den klassiske hyperdrive, oprindeligt udviklet af Bruce McNaughton13, held har været anvendt til neurale optagelser i frit opfører rotter i mange laboratorier i sidste to årtier9,10,14, 15. men af tekniske årsager, de originale komponenter skulle bygge McNaughton drev er nu meget vanskeligt at opnå og er ikke kompatible med for nylig forbedret data erhvervelse grænseflader. Andre godt accepteret udformningen af hyperdrive kræver microdrives at være individuelt håndlavede, som kunne give inkonsistente resultater og forbruge betydelig tid12. For at registrere neurale aktivitet fra forskellige områder af hjernen i opfører rotter, udviklede vi en ny hyperdrive ved hjælp af stereolithographic teknologi. Vi har søgt at opfylde følgende krav: (1) de nye hyperdrive skal give præcise forskydning af Tetroder i hjernen og give stabil optagelse fra flere destinationsområderne; (2) de nye hyperdrive skal være forenelig med den magnetiske quickclip system for nylig udviklet giver mulighed for nem tilslutning; og (3) den nye hyperdrive kan gengives præcist med let tilgængelige materialer. Her give vi en teknik til at opbygge 3D-printable hyperdrive indeholdende atten uafhængigt bevægelige Tetroder, baseret på McNaughton design. I protokollen, vi beskrive detaljerne i opdigte oparbejde af den nye hyperdrive, som vi har anvendt med succes til at optage single-neuron handling potentialer og lokale felt potentialer fra postrhinal og mediale entorhinal cortex over uger i et frit opfører sig rotte under naturlige fouragering opgaver.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Stereolithography af 3D-modeller

  1. Bruge stereolithographic teknikker til at udskrive den hyperdrive dele og tilbehør. Hver hyperdrive består af atten pendulkørsler, atten shuttle bolte, og en af hver af alle andre plast stykker (figur 1).
    Bemærk: Tilbehør er ikke en del af hyperdrive men er nødvendige for hyperdrive konstruktion.

2. forberedelse af tilbehør (figur 2).

  1. Forberedelse af microdrive rack (Figur 2 c).
    1. Ren og udvide de mindre gennem huller og de større blind-huller i rack med en ø 0.71 mm (0,028") bore bit og en ø 0.84 mm (0.033") bore bit, henholdsvis.
    2. Skær en ø 0,89 mm (0,035") svejsning stang i 17 mm lang segmenter, runde begge ender, og sæt hver guide stangen i ø 0.84 mm (0.033") huller på rack, forlader 11,5 mm uden for (flush med de gevindstænger).
    3. Fuldt sæt seks 0-80 gevind, 15.88 mm (5/8") længe fladt hoved skruer ned i slots i rack. Sikre, at guide stænger og gevindstænger er lige og parallelt med hinanden. Udfylde den resterende plads i slots med fortyndet dental cement. Luft tørre på en benchtop i 15 min.
    4. Lim de svejsning stænger og skruer ind i rack med tynde super lim og lad lufttørre i 15 min.
  2. Forberedelse af den centrale station (Figur 2E).
    1. Tråd de fire huller med en 2-56 tap, og bruge 2-56, 4.76 mm (3/16") lange nylon skruer til at sikre core på stationen, hvis nødvendigt.
  3. Forberedelse af værktøjet drejning (Figur 2F).
    1. Gevind hul på håndtaget med en 4-40 tryk. Indsæt den bearbejdet tip i slot i håndtaget og sikkert med en 4-40, 4.76 mm (3/16") lange cup skrue.
  4. Forberedelse af hyperdrive indehaveren (Fig. 2 g).
    1. Gevind skrue hul med en 8-32 tryk. Bruge en 8-32, 9.52 mm (3/8") lange nylon tommelfingeren skruen til at sikre hyperdrive når i brug.
  5. Forberedelse af stangen positionering komplekse (Figur 2 H).
    1. Tråd stammer fra siden med den større hul (øverst) med en 8-32 tryk til en dybde på ca 7 mm. tråd de mindre huller (seks i toppen, atten i bunden) med en 0-80 tryk. Udvide den centrale hul i toppen med en ø 4.76 mm (3/16") borehoved, hvis nødvendigt.
    2. Samle stilken til toppen, ved hjælp af en 8-32, ø 4.76 mm (3/16"), 6,35 mm (1/4") lang skulder skrue. Sikre bund til top med 0-80, 6,35 mm (1/4") lange skruer når den er i brug.

3. forberedelse af Hyperdrive komponenter (figur 3).

  1. Forberedelse af hyperdrive møtrik (Figur 3A).
    1. Brug af møtrik indehaveren (figur 2D), tråd møtrikken med en 3/8-24 bunden tryk indtil glat.
  2. Montering af hyperdrive core (Figur 3B).
    1. Ren og udvide huller i kernen ved hjælp af forskellige størrelse borehoveder (tolv jorden wire gennem-huller (indre ring): ø 0,61 mm (0,024"); de atten triode gennem-huller (midterste ring): ø 0,66 mm (0.026") først, og derefter ø 0.71 mm (0.028 "); den atten guide stang blind-huller (ydre ring): ø 0.84 mm (0,033")).
    2. Tråd de to gennem-huller på toppen af kernen og de resterende otte blind-huller, (fire på siden, fire nær bunden) med en 0-80 tryk. Brug en bunden Tryk for blind-huller.
    3. Oprette eksterne tråde ved foden af kernen bruger en 3/8-24 dør. Justere dø ordentligt, så hyperdrive møtrikken passer over de nye tråde.
    4. Afhængigt af antallet af jorden ledninger ønske, indsætte flere 6 mm lang segmenter af 23-gauge metal slange (cannulas) i jorden wire hullerne i kernen, limning dem om nødvendigt. Fil enderne af jorden wire cannulas indtil flush med ydersiden af kernen, og rengør cannulas med en ø 0,30 mm (0.012") stål wire.
    5. Fuldt sæt 18 0-80, 15.88 mm (5/8") længe fladt hoved skruer hovedet ned i slots i kernen. Ikke bøje skruerne eller beskadige trådene under denne proces.
    6. Brug stangen positionering kompleks og den centrale station, Placer 18 17 mm segmenter af ø 0,89 mm (0,035") svejsning stang over guide stang huller i kernen og hammer dem ned til at være på niveau med skruer (ca. 5 mm).
    7. Rette positioner af svejsning stænger og skruer hvis nødvendigt, så spænd centrale skulder skruen og de omgivende seks skruer i stangen positionering komplekse til at sikre de ydre retninger af stænger i kernen. Skru møtrikken på kernen (med stangen positionering komplekse) og passe kernen i hyperdrive indehaveren til at tillade lettere positionering under en Stereoskopet.
    8. Udfylde hullerne med fortyndet dental cement til at sikre skruer til kernen og tillade lufttørring i 15 min. Fyld 2-3 slots på et tidspunkt før dental cementen bliver for tyk. Skrabe væk eventuelle overskydende dental cement på core til at opretholde en ordentlig pasform med skjold.
    9. Lim skruer og stænger i kernen med tynde super lim, tillade lufttørring i 15 min.
  3. Montering af microdrive (Figur 3 c).
    1. Ren og udvide de to ydre huller i shuttle med borehoveder (mindre hul: ø 0,61 mm (0,024") bore bit; større hul: ø 0,89 mm (0,035") bore bit).
    2. Indsæt shuttle bolt i bolt holderen base. Være opmærksom på orientering. Tæt bolt holder låget, hold tæt, og tråd langsomt gennem hullet i låget med en 0-80 tryk. Tryk på 2 - 3 gange indtil glat.
    3. Indsæt shuttle bolt i shuttle fra siden med mindre åbning. Sted shuttle-transport bolt komplekse hovedet i microdrive mønstringssted base.
    4. Skær en 15 mm segment af 23 gauge metal slanger og glat begge ender, så Placer slangen over ø 0,61 mm (0,024") hul, styret af slidsen på station låg. Hammer kanylen i hullet, indtil den øvre ende er flugter med station låg.
    5. Fjerne den ydre halvdel af den øverste spids af kanylen med en slibning hjulet. Ren kanyle med en ø 0,30 mm (0.012") metaltråd. Lim kanyle ind på shuttle ved hjælp af tynde super lim, og sørg for ikke at lime shuttle bolt til shuttle, og luft tørre for 15 min.
    6. Forbered mindst atten microdrives, teste microdrive på microdrive rack. Sørg for at shuttle bolt kan dreje gnidningsløst i shuttle og at den hele microdrive bevæger sig frit langs længden af gevind stangen.
  4. Forberedelse af kolonnen centrale (Figur 3D).
    1. Sand toppen og bunden af kolonnen centrale indtil flad, hvis nødvendigt. Tråd de to huller i den centrale kolonne med et 0-80 tryk. Indsæt en 0-80 hex møtrik (3,18 mm (1/8") bred, 1.19 mm (3/64") høj) i hvert stik.
  5. Forberedelse af hyperdrive cap (Figur 3).
    1. Brug af ikke-magnetiske pincet, lim fire magneter (3 mm i diameter, 1 mm tyk) i de fire brønde, matchende dem til N og S poler på elektrode interface bord.
  6. Montering af guide cannulas i et bundt (Figur 3F).
    1. Sted 18 30 gauge, tynd væg cannulas (ID 0,19 mm, 0,0075") i ø 2,29 mm (0,09") varme-shrink rør (3-5 mm lange, lange mellemrum langs bundtet af 5-10 mm). Gøre alle cannulas flugter med hinanden den ene ende af bundtet.
    2. Krybe de varme-shrink rør ved hjælp af en varmepistol, indtil pakken er stram. Klem bundt forsigtigt for at forme det som ønsket (runde eller ovale). Bekræft, at alle cannulas er i de korrekte positioner med ingen vrid, passage, eller bøjes.
    3. Markere områder til lodning på cannulas. Den unsoldered del bør være 26 mm i længden, mens den loddede del bør være 5-10 mm. Flyt miniaturisering rør til de lodning varemærker til at forhindre spredning.
    4. Anvende flux til en lodning område og lodde mens roterende bundtet. Afkøles ved stuetemperatur i mindst 1 min. Gentag dette trin til at lodde det samme område to gange mere. Jævn ud den loddede del af lodning uden at anvende flux og fyldstof materiale. Afkøles ved stuetemperatur i mindst 1 minut.
    5. Skære pakken til den korrekte længde med en diamant hjulet med den højeste hastighed, polsk begge ender for at justere længden (unsoldered del: 26 mm, loddet del: 5-10 mm som ønsket). Ren guide cannulas med en ø 0.18 mm (0.007") metaltråd under en Stereoskopet.
  7. Forbereder Tetroder. Lignende procedurer er blevet beskrevet8,16,17 .
    1. Juster højden af den vandrette T bar og placeringen af magnetomrører, så den vandrette arm på tværs af T bar er direkte over midten af magnetomrøreren. Krog ene ende af en S-krog til centrum af en lille magnetiske rør bar, derefter lim dem sammen. Ren triode gør plads med trykluft og ethanol klude.
    2. Kreds to ender af et stykke af enkelt triode wire ca 40 cm i længden sammen, så sikker med et stykke kobber tape.
    3. Løft wire cirkel ved at holde den kobber tape. Placer ende modsat den kobber tape på den vandrette arm med T bar. Sænke den kobber tape forsigtigt (mens anden enden er stadig på baren T), vride en gang, og placere den kobber tape på T bar. Triode cirklen er nu i et ottetal ("∞") konfiguration med kobber båndet sidder oven på tværs af den vandrette linje.
    4. Hold den kobber tape på linjen T med den ene hånd forsigtigt. Med anden hånden, krog den frie ende af S-krog (med magnetisk røre knyttet til anden enden) gennem bunden af triode wire cirkel, frigive S-krog forsigtigt og lad det glatte de fire ledninger af vægten af S-krog.
    5. Justere højden af den vandrette linje, indtil bunden af S-krog er omkring 1 cm over midten af magnetomrører plade.
    6. Bøj kanten af kobber tape ned til at fastgøre den til den vandrette linje. Undersøge fire straight triode ledningerne ved øjet, derefter fjerne eventuelle rester.
    7. Drej på omrøreren vride de fire ledninger med en hastighed omkring 60 rpm, indtil vinklen mellem to modsatte ikke snoet ledningerne er omkring 60°.
    8. Sæt varmepistol til 210 ° C, og varme de twisted ledninger ved at feje pistol langs den lige længde af ledningerne fra forskellige vinkler for 2 min til at smelte dem sammen ved smeltning VG bond frakke.
    9. Løft S-krog med rør forsigtigt og skær den nederste ende af triode med fine sakse.
    10. Hold den kobber tape på den vandrette linje med en finger, skære ledninger fra begge kanter af kobber båndet med en saks, og fjerne den kobber tape. Skære de resterende wire på den vandrette linje til at frigive triode.
    11. Placer de færdige triode i et støvfrit box til opbevaring. Forbered mindst tyve-fem Tetroder.

4. montering af hyperdrive (figur 4).

  1. Indsætte guide cannulas i hyperdrive core (figur 4A).
    1. Fjerne den varme-shrink rør og skub en 4 mm segment af silicium slangen (ID 1.02 mm (0,04"), OD 2,16 mm (0.085")) langs bundle til grænsen loddet/unsoldered. Kile spalten i hyperdrive spacer til at udvide den centrale hul, så spacer at glide omkring silicium tube. Fjerne kile, når spacer sidder på midten af silicium røret.
    2. Organisere guide cannulas holdninger i bundtet af anbringelse lang segmenter (10 cm) ø 0.18mm (0.007") metaltråd gennem hver kanyle i en specifik triode hul i hyperdrive kerne, forhindrer enhver crossover kabler eller cannulas i processen. Bøje ender af ledninger at holde dem på plads.
    3. Skub cannulas gennem deres respektive huller i den kerne, være omhyggelig med at undgå bøjning eller passage mellem dem, indtil den frie ende af hver kanyle er mindst 2 mm uden for den øverste ende af triode hul. Sikre spacer ved at skrue møtrikken på den kerne, være omhyggelig med at forhindre spacer fra roterende. Påfør en dråbe af meget fortyndet dental cement fra toppen af core på krydset af cannulas til at sikre deres relative positioner.
    4. Skære guiden ledninger fra loddes slutningen af bundtet, og fjerne dem fra cannulas af tilbagetrækningskraften fra den frie ende.
  2. Montering af microdrives på hyperdrive Core (figur 4B). En detaljeret rumlige arrangement af microdrives i hyperdrive har været tidligere beskrevet11,13.
    1. Indlæse microdrives langsomt og forsigtigt på hver gevind stang af kernen. Bekræfte, at (1) 23 måle microdrive kanylen går ind i hullet for triode glat, (2) 30 gauge guide kanylen går ind 23 måle microdrive kanyle glat, og (3) shuttle bolten slår jævnt langs den gevind stang. Skrue microdrives ned til 1,0-1,5 mm over den nederste ende af de gevindstænger.
    2. Skåret 18 stykker af polyimid slangen (ID 0,11 mm (0.0045"), OD 0,14 mm (0.0055")) i 38-43 mm segmenter (længde guide kanyle bundt plus 7 mm). Ren alle rør med en ø 0,08 mm (0,003") stål wire.
    3. Vend kernen, indsætte polyimid rør omhyggeligt i guide cannulas fra loddes slutningen og skubbe dem alle måde i henhold til en Stereoskopet. Vend kernen oprejst og lim den øvre ende af polyimid røret på microdrive kanyle med tykke superlim. Placer core hovedet og lad limen tørre i 15 min.
    4. Skær den ekstra polyimid slanger i den øvre ende, forlader 0,5-1,0 mm uden for microdrive kanyle.
  3. Montering af jorden ledninger (Figur 4 c).
    1. Reducere antallet af jorden ledninger nødvendigt at længder af 25-30 mm fra coated stålwire (belagt ø 0,20 mm (0,008"), nøgne ø 0,13 mm (0.005")). Strip 2 mm af plast isolering fra begge tips af ledninger og sæt den ene ende af hver i enderne af 6-8 mm lang 30 gauge cannulas. Flade ender af cannulas til sikring af dets tilslutning til deres respektive ledninger.
    2. Bruge en Dremel værktøj til at skære cannulas i halvdelen til at oprette to komplette jorden ledninger fra hver.
    3. Indsæt den runde ende af 30 gauge kanyle ind i den øverste ende af jorden wire kanylen i kernen og tryk på for at gøre indsættelsen stram.
  4. Montering af elektrode grænsefladen bestyrelsen (Figur 4D).
    1. Indsæt den centrale kolonne i kernen og sikkert med to 0-80, 7,94 mm (5/16") lange socket skruer. Lim hvis det er nødvendigt at gøre den centrale kolonne støt i kernen.
    2. Udvide dele af slots i EIB-72-QC-store bord, der svarer til de to tappet huller i den centrale kolonne med et ø 1,2 mm tryk. Tillægge den centrale kolonne med to 0-80, 3,97 mm (5/32") lange rundhovedede skruer elektrode interface bord. Sørg for bestyrelsen er beliggende i centrum og er sikker.
  5. Forbinder jorden ledninger (Figur 4E).
    1. Rute hver jordledningen omkring den centrale kolonne og Tilslut den udsatte frie ende til elektrode grænsefladen bestyrelsen med en guldnål på udpegede jorden hul.
  6. Indlæser Tetroder til hyperdrive, som tidligere beskrevet 16 , 17 .
    1. Læg hver triode omhyggeligt i polyimid rør af microdrives, være omhyggelig med ikke at bøje dem i løbet af processen.
    2. Forsigtigt feed frie ende ledningerne i deres udpegede huller i elektrode interface bord og elektrisk forbinde dem ved hjælp af guld pins.
    3. Skær Tetroder individuelt til en passende længde. Bekræfte, at del af Tetroder fremspringende fra de nedre ende af polyimid rør efter opskæring er lige, ellers erstatter den hele triode og recut.
  7. Montering af skjoldet.
    1. Tillægge core med fire 0-80, 3,97 mm (5/32") rundhovedede skruer skjoldet. Numrene på skjoldet skal matche med numre på elektrode interface bord.
  8. Plating triode tips.
    1. Plade tips af Tetroder ved hjælp af NanoZ plating enhed udstyret med en ADPTAT-NZ-EIB-36 stik og en ADPT-EIB-72-QC-HS-36 adapter17. Alternativt, plade dem manuelt én efter én som beskrevet andetsteds16. Plade til triode tips før anvendelse (f.eks.én dag før implantation), som impedans øges gradvist over tid efter plating. Udskift de Tetroder, der er kortsluttet eller blokeret i løbet af processen af plating, skære dem til en korrekt længde og re plade.
  9. Færdiggør hyperdrive (Figur 4F).
    1. Lim Tetroder til deres polyimid rør som tidligere beskrevet16. Trække dem alle tilbage til deres guide cannulas så belagt spidserne ikke er udsat.
    2. Skru fire 0-80, 6,35 mm (1/4") længe socket skruer i de fire huller i bunden af hyperdrive kernen.
    3. Bruger en Stereoskopet, sænke hver triode langsomt indtil spidsen af triode er lige over kanten af guide kanyle. I mellemtiden, Find placeringen af hvert triode i guide kanyle bundt. Kort over triodes holdning er afgørende for genopbygning af optagelse websteder.
    4. Vedhæfte fælles landbrugspolitik på drevet og gemme hyperdrive korrekt til implantation.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi brugte en nybygget hyperdrive retssag resultater. Drevet var udstyret med Tetroder konstrueret fra ø 17 µm (0.0007"), polyimid-belagte platinum-iridium (90% - 10%) wire. Spidsen af Tetroder var belagt i platin sort løsning til at reducere elektrode impedances til mellem 100 og 200 kΩ på 1 kHz. Hyperdrive blev implanteret 4,6 mm venstre for midterlinjen og 0,5 mm foran den tværgående sinus på kraniet af en 550 g, mandlige Long-Evans rotte. Yderligere jorden ledninger forbundet kraniet skruer over lillehjernen. Alle procedurer blev udført som godkendt af den institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) af Baylor College of Medicine og var magen til de tidligere beskrevne18. Umiddelbart efter kirurgisk implantation, var Tetroder avanceret 1 mm ind i hjernen. På efterfølgende dage, blev mindre avancerede trin på ikke mere end 80 µm brugt. Tetroder fik lov til at stabilisere efter hver avancement i mindst 20 timer før neurale optagelser blev udført.

For at registrere neurale aktivitet, hyperdrive blev forbundet til en headstage forforstærker (Neuralynx, HS-72-QC), og sidstnævnte var forbundet til en dataoptegningssystem med programmerbare forstærkere (Neuralynx, Digital Lynx SX). Lokale felt potentialer var refereres til jordledningen, stikprøven ved 2 kHz, og sporgruppe-pass filtreret på 0,1-500 Hz. enhed aktivitet blev refereret til en triode med ingen observerbare aktivitet beliggende 500 µm fra hjernen overflade, stikprøven på 32 kHz og sporgruppe-pass filtreret på 600 Hz - 6 kHz. Kun spike bølgeformer over en tærskel på 50 µV blev registreret.

Fig. 5A viser neurale aktivitet registreret fra en triode placeret i den postrhinal cortex (2,1 mm under hjernen overflade), mens dyret frit fouragering inde en 1,5 m åbner for tre uger efter implantation. Optagelse session varede ca. 30 min. og enheder registreret forblev stabil på tværs af hele sessionen (fremgår af den lille variation i spike bølgeformer). Figur 5B viser lokale felt potentialer registreres samtidigt fra fire forskellige Tetroder beliggende i den mediale entorhinal cortex (3.4-3.7 mm dyb) mens de samme dyr aktivt undersøger den åbne arena syv uger efter implantation. Klart felt potentielle aktivitet i theta frekvensområde (6-10 Hz) var til stede. Enkelte neuron spike data blev isoleret ved hjælp af sortering software MClust (A.D. rødlig), og lokale potentielle feltdata blev visualiseret af brugerdefinerede-skrevet Matlab scripts. Eksempler på lav kvalitet triode optagelser, muligvis som følge af et dårligt forberedt drev, har været vist tidligere17.

Figure 1
Figur 1: Hyperdrive komponenter lavet af stereolithographic teknologi. Billede af 3D-printable hyperdrive komponenter (1¢ mønt for størrelse sammenligning). (A) hyperdrive kernen; (B) det beskyttende skjold; (C) beskyttelseshætten; (D) den centrale kolonne; (E) møtrik; (F) spacer; (G) transport; (H) shuttle bolt. Skalalinjen: 1 cm. Disse komponenter blev lavet af en UnionTech RSPro450 printer ved hjælp af plastmateriale Somos udvikle 128. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Custom-designet tilbehør til hyperdrive konstruktion. Disse tilbehør er designet specielt til at støtte i forberedelsen af hyperdrive. Deres vigtigste komponenter blev skabt af stereolithographic udskrivning. (A) transport bolt indehaveren, som sikrer shuttle bolten mens trykke tråde. (B) microdrive forsamlingen station, som guider kanyle indsættelse i shuttle. (C) microdrive rack, som hjælper med at teste den forsamlede microdrives og holder dem på plads under limning af cannulas. 1: en microdrive rack base; 2: en microdrive rack med skruer fuldt indsat i slots; 3: en microdrive rack klar til brug. (D) indehaveren af møtrik, der holder hyperdrive møtrikken, når gevindskæring hullet. (E) hyperdrive kernen station, som sikrer kernen mens hamrede guide stænger. (F) værktøjet drejning, som drev shuttle bolt til at rotere i shuttle. (G) indehaveren af hyperdrive, som hjælper med at placere hyperdrive under en Stereoskopet. Indehaveren beskytter også Tetroder, efter de er blevet indlæst i hyperdrive. (H) stangen positionering kompleks, som hjælper med at placere de gevindstænger og guide stænger i hyperdrive kerne. 1: store komponenter af kompleks; 2: den øverste del af komplekset efter forsamling; 3: en stang positionering kompleks i brug. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: forberedelse af hyperdrive dele før forsamlingen. Billeder viser forberedelsesprocessen af hyperdrive kernen og microdrive, såvel som andre forberedt hyperdrive dele. (A) A gevind hyperdrive møtrik. (B) forberedelsen af hyperdrive kernen. 1: core med eksterne tråde lavet for møtrik; 2: kernen placeret i en kerne station med skruer fuldt indsat i slots; 3: guide stænger placeret ved stangen positionering kompleks, klar til at blive hamret ind i kernen; 4: udfylde den resterende plads i slots med fortyndet dental cement; 5: den øverste del af en forberedt hyperdrive kerne. (C) udarbejdelse af microdrive. 1: en shuttle bolt placeret i en shuttle bolt indehaveren base, Bemærk den mindre åbning vender væk fra eksperimentatoren; 2: threading tråde inde shuttle bolt; 3: indsættelse af rumfærgen bolt til shuttle; 4: en microdrive placeret i microdrive mønstringssted base med kanylen styret af station låg, klar til at blive indsat; 5: en microdrive med den ydre halvdelen af den øverste kanyle spids fjernet (angivet med pil); 6: samlet microdrives testet på microdrive rack. (D) A centrale kolonne med gevindhuller og indsatte skrue nødder. (E) A hyperdrive cap med fire magneter limet i brøndene. (F) A 36 mm lang guide kanyle bundt, med den loddede del til venstre. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Fig. 4: montage af hyperdrive. Billeder viser stadier af hyperdrive forsamlingen. (A) indsættelse af guide cannulas ind i kernen. 1: guide kanyle bundt gled ind silicium tube og spacer; 2: én guide kanylen lægges i dets udpegede hul i kernen. Hånden skriver viser organisation af guide cannulas; 3: guide cannulas skubbet ind i kernen; 4: core med guide cannulas indsat og sikret af møtrikken. (B) forsamling af microdrives til kernen. 1: core med microdrives indlæst; 2: microdrives med polyimid rør indsat i cannulas. (C) indsættelse af jorden ledninger ind i kernen. (D) fastgørelse af elektrode interface bord. 1: hyperdrive med den centrale kolonne indsat; 2: hyperdrive med elektrode grænsefladen bestyrelsen knyttet til den centrale kolonne. (E) tilslutning af jordledning i udpegede hullet i elektrode interface bord. (F) A afsluttet hyperdrive klar til implantation (samlede vægt 20 g). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: neurale signaler registreret af hyperdrive. Repræsentative optagelser viser enhed neurale aktivitet og lokale felt potentiale i en opfører rotten hjerne. (A) to-dimensionelle cluster-diagrammer illustrerer individuelle pigge fra samtidig indspillede neuroner ved en triode placeret i den postrhinal cortex (dybde: 2,1 mm). Venstre: scatter plot viser forholdet mellem top til top amplituder af pigge optaget fra to elektroder af triode. Hver prik svarer til en spike. Klynger af spikes vil sandsynligvis stammer fra den samme celle. Fire klynger er farvekodede. Skalalinjen: 20 µV. Højre: spike bølgeformer (middel ± SD) af de farvekodede celler vises til venstre. Bemærk den lille variation af kurveformer. Skalalinjen: 200 µs. (B) spor af lokale felt potentielle i frekvensområdet theta optaget samtidigt fra fire forskellige Tetroder beliggende i den mediale entorhinal cortex (dybde: 3.4-3.7 mm) når rotten frit fouragering. Skalalinjen nederst til venstre: 500 µV; skalalinjen nederst til højre: 100 ms. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende filer: De supplerende filer omfatter 20 filer i formatet .stl beskriver hyperdrive komponenterne og tilbehør klar til stereolithographic udskrivning (enheder i mm), og 1 fil i .pdf-format, som er blueprint af værktøjet drejning tip klar til bearbejdning. De oprindelige 3D modelfiler blev skabt med software AutoCAD i .dwg-formatet, som vil være til rådighed på anmodning. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her, beskriver vi processen med at konstruere en nyudviklet hyperdrive består af atten uafhængigt bevægelige Tetroder. Drevet kan være fremstillet af overkommelige dele købt på mange tilgængelige isenkræmmere, kombineret med komponenter lavet af stereolithographic udskrivning. Hyperdrive kan implanteres kronisk på en rotte kraniet ved hjælp af standard kirurgiske procedurer og er i stand til at optage ekstracellulære neurale aktivitet, mens dyret udfører forskellige adfærdsmæssige opgaver.

Hyperdrive har bevaret mange af de ønskelige funktioner af den oprindelige McNaughton hyperdrive, herunder stativ microdrives, der er orienteret udad ved 30 grader fra den drive center13, som giver pålidelig støtte til Tetroder. Når implanteret, giver hyperdrive udførelsen af små bevægelser af Tetroder i hjernen af en vågen dyr med stor præcision. En hel omgang af transport på den gevindstang svarer til en lineær forskydning af 317.5 µm. Med en passende uddannelse, kan en eksperimentatoren videre transport i 1/16 tur trin (20 µm). Vi designet hyperdrive til brug hos voksne rotter, men drevet kunne nemt kan bruges i ethvert dyr med en kropsstørrelse af 350 g eller større (begrænset af hoved størrelse). En begrænsning af enheden kan noteres i begrænset dybden af optagelse, som den maksimale rejseafstand af Tetroder langs de gevindstænger er omkring 7 mm, som kan falde kort dybere strukturer i nogle dyrenes hjerner.

Stereolithographic udskrivning giver nok opløsning til at oprette komponenter af plast i stor detalje med high fidelity og har tidligere været anvendt i hyperdrive fabrikation12,19,20. I dette tilfælde blev en industriel printer almindeligt tilgængelige gennem tredjepart produktionsfaciliteter brugt. Der var alle hyperdrive komponenter udskrevet netop, herunder hyperdrive kerne, trods dens komplekse geometri, og de små strukturer såsom ø 0,6 mm gennem huller og 0,3 mm tynde vægge. Denne præcision gør stereolithography et ideelt valg til fremstilling af hyperdrive komponenter. Baseret på tidligere erfaring, er billigere, desktop 3D printere mindre tilbøjelige til at have den nødvendige for pålidelig reproduktion af hyperdrive komponenter behov for præcision. Stadig, stereolithographic teknologi har sine begrænsninger. Først, den har et begrænset udvalg af materialer. Plast vi valgte for hyperdrive blev den mest holdbare af dem, vi har testet, men det er stadig ikke optimal til fremstilling af meget små stykker. Pendulfart og shuttle bolte skal håndteres med ekstra forsigtighed, da de kan briste under forberedelse. Plast-komponenter er ikke autoklaverbart, da varme afbøjning temperatur af materialet er omkring 50 ° C. Desuden, er det anvendte udskrivning materiale ikke acetone resistente. Disse spørgsmål kunne løses, når nye stereolithography materialer er udviklet og testet. Endnu, i betragtning af den relativt lave omkostninger af stereolithography, fordelene ved teknik og omkostningerne langt overstiger defekterne. For det andet på grund af stereolithography, hvorunder polymerer trykområdet er photochemically størknede af en UV laser til at danne en enkelt lag af det ønskede 3D model21, er objekter oprettet ved stereolithographic udskrivning sårbare over for UV-lys. Derfor vil udsætter dem for stærk UV (fx, direkte sollys) i mange timer uigenkaldeligt reducere deres fysiske styrke (baseret på personlig kommunikation med print shop). I betragtning af den miljømæssige UV i laboratorium plads (f.eks.fra lysstoflamper), er det bedst at gemme stereolithographic komponenter i en mørk kasse når den ikke er i brug, som bevarer komponenter fysiske styrke i år. Derudover er det vigtigt at bruge andre metoder bortset fra UV-lys til at desinficere hyperdrive overfladen før operationen. Denne test hyperdrive forblevet implanterede på rotten i god stand i en almindelig laboratoriemiljø i løbet af fire måneder, uden angivelse af en reduktion i fysisk styrke eller ydeevne.

3D printable arten af denne hyperdrive tillader også hurtige ændringer og fleksible redesign. For eksempel hyperdrive kan let modificeret til at målrette adskilt flere hjernen regioner11. Desuden kunne dette drev justeres for at give mulighed for samtidig overvågning af neurale aktivitet og lokale hjerne manipulation. Indarbejdelsen af en mikrodalyse sonde med vifte af Tetroder giver mulighed for farmakologiske aktivering og deaktivering af neuroner ved infusion af forskellige stoffer under neurale optagelse22. Derudover kan neuroner manipuleret til at udtrykke lysfølsomme kanaler aktiveres eller deaktiveres ved indarbejdelse af en optisk fiber i den triode-bundle og optogenetic teknik-19. Derudover drevet kan være let reskaleres med et færre antal Tetroder til dyr med mindre hoved størrelser, såsom mus eller unge rotter.

I sammendrag, den let Foranderligheden kombineret med metoden enklere, mere overkommelige at konstruere en effektiv neurale optagelse implantat, der kan være pålideligt og korrekt gengivet, gør denne hyperdrive et kraftfuldt værktøj i feltet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Vi takker Moser Lab på Kavli Institute for systemer neurovidenskab og Center for Neural Computation, norsk University of Science and Technology, for den kroniske neurale optagelse procedurer i rotter. Dette arbejde blev støttet af NIH grant R21 NS098146, Human Frontier Science Program langsigtede Fellowship LT000211/2016-L L. sk.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Welding rod Blue Demon ER308L-035-01T Stainless steel, 0.035" in diameter
Screw McMaster 91771A060 Stainless steel, flat head, 0-80 thread, 5/8" in length
Screw McMaster 91772A051 Stainless steel, pan head, 0-80 thread, 5/32" in length
Screw McMaster 92196A056 Stainless steel, socket head, 0-80 thread, 5/16" in length
Screw McMaster 92196A055 Stainless steel, socket head, 0-80 thread, 1/4" in length
Screw McMaster 95868A131 Nylon,  socket head, 2-56 thread, 3/16" in length, black
Screw nut McMaster 90730A001 Stainless steel, narrow hex,  0-80 thread
Shoulder screw McMaster 90298A213 Stainless steel, 8-32 thread, 3/16" in diameter, 1/4" in length
Cup screw McMaster 92313A105 Stainless steel, 4-40 thread, 3/16" in length
Thumb screw McMaster 94323A592 Nylon, 8-32 thread, 3/8" in length, black
Magnet Apex M3X1MMDI Neodymium, 3 mm X 1 mm disc
Metal tubing Small Parts B00137QHNS Stainless steel, 23 gauge, 0.0253" OD, 0.013" ID, 0.006" wall
Metal tubing New England Small Tube Custom-made Stainless steel, 30 gauge, 0.012/0.0125" OD, 0.007/0.008" ID, full hard
Heat-shrink tubing McMaster 7856K72 0.09" ID before shrinking, blue
Silicone tubing A-M Systems 807300 0.040" ID, 0.085" OD
Polyimide tubing A-M Systems 823400 0.0045" ID, 0.0005" wall
Ground wire A-M Systems 791500 0.005" bare, 0.008" coated, half hard
Tetrode wire California Fine Wire Custom-made 0.0007" in diameter, platinum-iridium (90%-10%), HML and VG coating
EIB Neuralynx EIB-72-QC-Large
Gold pins Neuralynx large EIB pins
Tap Balax 01302-000 M1.2 thread size
Tap McMaster 2522A811 0-80 thread size, bottoming
Tap McMaster 2522A771 0-80 thread size, plug
Tap McMaster 26955A94 3/8"-24 thread size, bottoming
Tap McMaster 2522A713 2-56 thread size
Tap McMaster 2522A715 4-40 thread size
Tap McMaster 2522A718 8-32 thread size
Die McMaster 2576A457 3/8"-24 thread size, 1" OD
Drill bit McMaster 30585A82 Wire gauge 65, 0.035" in diameter
Drill bit McMaster 30585A83 Wire gauge 66, 0.033" in diameter
Drill bit McMaster 30585A87 Wire gauge 70, 0.028" in diameter
Drill bit McMaster 30585A88 Wire gauge 71, 0.026" in diameter
Drill bit McMaster 30585A91 Wire gauge 73, 0.024" in diameter
Drill bit McMaster 8870A23 3/16" in diameter
Dremel disc Wagner 31M Diamond coated, 22 mm in diameter, 0.17 mm in thickness
Steel wire Precision Brand 21212 0.012" in diameter, full hard
Steel wire Precision Brand 21007 0.007" in diameter, full hard
Steel wire A-M Systems 792700 0.003" in diameter, half hard
Super glue Loctite LT-40640 # 406
Super glue Loctite LT-41550 # 415
Dental acrylic powder  Teets 223-3773 Coral
Dental acrylic liquid Teets 223-4003

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. O'Keefe, J., Recce, M. L. Phase relationship between hippocampal place units and the EEG theta rhythm. Hippocampus. 3 (3), 317-330 (1993).
  2. Wilson, M. A., McNaughton, B. L. Dynamics of the hippocampal ensemble code for space. Science. 261 (5124), 1055-1058 (1993).
  3. Gothard, K. M., Skaggs, W. E., Moore, K. M., McNaughton, B. L. Binding of hippocampal CA1 neural activity to multiple reference frames in a landmark-based navigation task. J Neurosci. 16 (2), 823-835 (1996).
  4. Gray, C. M., Maldonado, P. E., Wilson, M., McNaughton, B. Tetrodes markedly improve the reliability and yield of multiple single-unit isolation from multi-unit recordings in cat striate cortex. J Neurosci Methods. 63 (1-2), 43-54 (1995).
  5. Buzsaki, G. Large-scale recording of neuronal ensembles. Nat Neurosci. 7 (5), 446-451 (2004).
  6. Fyhn, M., Hafting, T., Witter, M. P., Moser, E. I., Moser, M. B. Grid cells in mice. Hippocampus. 18 (12), 1230-1238 (2008).
  7. Skaggs, W. E., et al. EEG sharp waves and sparse ensemble unit activity in the macaque hippocampus. J Neurophysiol. 98 (2), 898-910 (2007).
  8. Guo, P., Pollack, A. J., Varga, A. G., Martin, J. P., Ritzmann, R. E. Extracellular wire tetrode recording in brain of freely walking insects. J Vis Exp. (86), (2014).
  9. Knierim, J. J., McNaughton, B. L., Poe, G. R. Three-dimensional spatial selectivity of hippocampal neurons during space flight. Nat Neurosci. 3 (3), 209-210 (2000).
  10. Leutgeb, S., et al. Independent codes for spatial and episodic memory in hippocampal neuronal ensembles. Science. 309 (5734), 619-623 (2005).
  11. Lansink, C. S., et al. A split microdrive for simultaneous multi-electrode recordings from two brain areas in awake small animals. J Neurosci Methods. 162 (1-2), 129-138 (2007).
  12. Kloosterman, F., et al. Micro-drive array for chronic in vivo recording: drive fabrication. J Vis Exp. (26), (2009).
  13. McNaughton, B. L. Google Patents. , Available from: https://www.google.com/patents/US5928143 (1999).
  14. Redish, A. D., et al. Independence of firing correlates of anatomically proximate hippocampal pyramidal cells. J Neurosci. 21 (5), RC134 (2001).
  15. Schmitzer-Torbert, N., Redish, A. D. Neuronal activity in the rodent dorsal striatum in sequential navigation: separation of spatial and reward responses on the multiple T task. J Neurophysiol. 91 (5), 2259-2272 (2004).
  16. Nguyen, D. P., et al. Micro-drive array for chronic in vivo recording: tetrode assembly. J Vis Exp. (26), (2009).
  17. Chang, E. H., Frattini, S. A., Robbiati, S., Huerta, P. T. Construction of microdrive arrays for chronic neural recordings in awake behaving mice. J Vis Exp. (77), e50470 (2013).
  18. Vandecasteele, M., et al. Large-scale recording of neurons by movable silicon probes in behaving rodents. J Vis Exp. (61), e3568 (2012).
  19. Siegle, J. H., et al. Chronically implanted hyperdrive for cortical recording and optogenetic control in behaving mice. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 2011, 7529-7532 (2011).
  20. Brunetti, P. M., et al. Design and fabrication of ultralight weight, adjustable multi-electrode probes for electrophysiological recordings in mice. J Vis Exp. (91), e51675 (2014).
  21. Hull, C. W. Google Patents. , Available from: https://www.google.com/patents/US4575330 (1986).
  22. Ludvig, N., Potter, P. E., Fox, S. E. Simultaneous single-cell recording and microdialysis within the same brain site in freely behaving rats: a novel neurobiological method. J Neurosci Methods. 55 (1), 31-40 (1994).

Tags

Neurovidenskab spørgsmålet 135 Hyperdrive flere triode i vivo Elektrofysiologi ekstracellulære optagelse neurale aktivitet opfører sig rotter
Konstruktion af en forbedret multi triode Hyperdrive for storstilet neurale optagelse i opfører sig rotter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lu, L., Popeney, B., Dickman, J. D., … More

Lu, L., Popeney, B., Dickman, J. D., Angelaki, D. E. Construction of an Improved Multi-Tetrode Hyperdrive for Large-Scale Neural Recording in Behaving Rats. J. Vis. Exp. (135), e57388, doi:10.3791/57388 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter