Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

طرق التسليم الشفوي الحمض النووي الريبي مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل للحث على تدخل الجيش الملكي النيبالي في لحاء وتغذية النبات-ساب الحشرات هيميبتيران

Published: May 4, 2018 doi: 10.3791/57390
Automatic Translation
1, 2, 1, 1
1Invasive Insect Biocontrol and Behavior Laboratory, Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture, 2Horticultural Research Laboratory, Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture

Summary

يوضح هذا المقال رواية التقنيات المتقدمة للتسليم الشفوي من الحمض النووي الريبي مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل (dsRNA) عن طريق الأنسجة الوعائية النباتات لتدخل الجيش الملكي النيبالي ([رني]) في ساب لحاء تغذية الحشرات.

Abstract

لحاء ومصنع ساب تغذية الحشرات تغزو سلامة المحاصيل والفواكه لاسترداد المواد الغذائية، في عملية إتلاف المحاصيل الغذائية. الحشرات هيميبتيران حساب لعدد من الآفات اقتصاديا كبيرا للنباتات التي تسبب أضرارا للمحاصيل التي تتغذى على لحاء sap. علة نتن مارموراتيد براون (بمسب)، حليس هاليومورفا (هيتيروبتيرا: بينتاتوميداي) وبسيليد الحمضيات الآسيوية (ACP)، سيتري ديافورينا كوياما (هيميبتيرا: ليفييداي) هي الآفات الحشرية هيميبتيران وعرض في أمريكا الشمالية، حيث أنها عند الآفات زراعية الغازية ذات قيمة عالية التخصص، والصف، والمحاصيل والحمضيات، فضلا عن الآفات إزعاج أنهم التجميعية في الداخل. مقاومة المبيدات الحشرية في كثير من الأنواع قد أدى إلى تطوير أساليب بديلة لاستراتيجيات إدارة الآفات. مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي الريبي (dsRNA)-تدخل الجيش الملكي النيبالي وساطة ([رني]) هو جين إسكات إليه للدراسات الجينومية الوظيفية التي لها تطبيقات محتملة كأداة لإدارة الآفات الحشرية. دسرنا مناشئ المركبة أو الحمض النووي الريبي التدخل الصغيرة (siRNA) يمكن أن تؤدي إلى إسكات الجينات ذات كفاءة عالية من خلال تدهور الذاتية الجيش الملكي النيبالي، الذي مثلى لأنه قدم. يتطلب استخدام فعالة والبيئية من [رني] كالمبيدات البيولوجية الجزيئية لذالك الحشرات هيميبتيران إيصال في فيفو دسرناس من خلال التغذية. هنا نظهر الأساليب لإيصال دسرنا للحشرات: تحميل من دسرنا إلى الفاصوليا الخضراء بالغمر، واستيعاب من دسرنا الخاصة بالجينات مع التسليم الشفوي عن طريق الابتلاع. وقد اوجزنا أيضا نهج التسليم النباتات غير المعدلة وراثيا باستخدام الرش ورقي، جرعة الجذر، والجذع الحقن، فضلا عن حبيبات الطين، والتي قد تكون ضرورية لإطلاق سراح المطرد دسرنا. وأكدت كفاءة تسليم دسرنا بلعها شفويا جرعة فعالة للحث على حدوث انخفاض كبير في التعبير عن الجينات المستهدفة، مثل حمض هرمون الأحداث يا methyltransferase (جهامت) وتغيرات (جيد جداً). وتمثل هذه الأساليب المبتكرة استراتيجيات من أجل إيصال دسرنا استخدامها في حماية المحاصيل، والتغلب على التحديات البيئية لإدارة الآفات.

Introduction

وتشمل الحشرات هيميبتيران بعض الآفات الأكثر اقتصاديا كبيرا من أجريكولتوريبيكاوسي قدرتها تحقيق النمو السكاني المرتفعة، وانتشار الأمراض في النباتات. بمسب، Stål H. حليس ، هو الآفات الدخيلة التي أدخلت بطريق الخطأ في نصف الكرة الغربي في الينتاون، بنسلفانيا من آسيا (الصين وتايوان، وكوريا، واليابان) مع رؤية أول المبلغ عنها في عام 19961. منذ إطلاقها، بمسب وقد اكتشفت في 43 دولة، مع السكان أعلى في منتصف المحيط الأطلسي (دي، دكتوراه في الطب، السلطة الفلسطينية، نيو جيرسي، خامسا، وبخار الماء)، وكذلك في كندا وأوروبا، وتمثل تهديدا محتملاً للزراعة2. يمكن أن تحرض بمسب كالآفات الحشرة، الأضرار بحوالي 300 مضيفي النباتات المحددة بما في ذلك المحاصيل ذات القيمة العالية مثل التفاح والعنب ونباتات الزينة، والبذور للمحاصيل، وفول الصويا والذرة. بسبب الأضرار المقام الأول الواجب وضع التغذية المعروف لاسيراتي وتدفق حيث يثقب الحيوان المحصول المضيف مع ستيليت إبرة تشبه به للوصول إلى المواد الغذائية من الأنسجة الوعائية2،3. بمسب هو أيضا الآفات داخلي كما قد وجدوا الإقامة في مناطق المعيشة مثل المدارس والمنازل خلال فصل الخريف من خلال فصل الشتاء2. المواد الكيميائية وصدر عن بمسب أيرواليرجينس أفيد الارتكاس التحسسي غير المشروعة في عمال محاصيل الفاكهة. بمسب قد يسهم أيضا في أمراض الحساسية مما يؤدي إلى أكزيما، والتهاب الملتحمة، والأنف في الأفراد الحساسة4،5. حشرة هيميبتيران آخر، الكاريبي والمحيط الهادئ، سيتري دال- كوياما (هيميبتيرا: ليفييداي)، وآفة خطيرة من الحمضيات، وينقل البكتيريا لحاء المحدودة (Candidatus ليبيريباكتير آسيوي) مما تسبب في هوانجلونجبينج (HLB)، المعروف تخضير الحمضيات المرض6،7. HLB ذكر أولاً من جنوب الصين وانتشر إلى 40 مختلفة آسيا وأفريقيا، وأوقيانوسيا، وجنوب وشمال أمريكا البلدان7. تخضير الحمضيات مشكلة في جميع أنحاء العالم مع تهديد خسائر اقتصادية ومالية بسبب فقدان الحمضيات؛ ومن ثم، تعتبر الإدارة من الكاريبي والمحيط الهادئ أهمية قصوى لمنع ومراقبة HLB.

عادة ما يتطلب اتخاذ تدابير لمكافحة فعالة لهذه الآفات الحشرية عاش تطبيق مبيدات الآفات الكيميائية التي تعتبر قصيرة نسبيا. استراتيجيات مكافحة مبيدات الحشرات الكيميائية كثيرا ما تفتقر إلى استراتيجيات الإدارة البيئية الآمنة أو قد تناقصت قابلية بسبب مقاومة المبيدات الحشرية في مكافحة الآفات السكان8،9. ومن ثم، المكافحة البيولوجية للآفات بالمبيدات البيولوجية الجزيئية بديل محتمل، ولكن استخدامها على الصعيد العالمي ما زال متواضعا، والأنواع المختلفة من الطفيليات (مثلاً، تريسولكوس japonicus) يمكن أيضا أن تكون فعالة البيولوجية الطبيعية عناصر التحكم. [رني] احتمال ظهور التكنولوجيا لإدارة الآفات الحشرية الغازية مع المبيدات الحيوية الجزيئية10. [رني] هو عبارة عن إليه تنظيمية جينات وصفاً جيدا أن ييسر إسكات الجينات بوسترانسكريبشونال فعالة من الذاتية فضلا عن غزو دسرناس بطريقة خاصة بالتسلسل، الذي يؤدي في نهاية المطاف إلى تنظيم التعبير الجيني في مرناً مستوى11،12. باختصار، عندما دسرنا خارجية متغللة في خلية تتم معالجتها في سيرناس بواسطة عضو فوق عائلة "الثالث رناسي" نوكلاس bidentate، يسمى ديسير، الذي هو المصانة تقحم في الديدان والذباب، والنباتات، والفطريات، والثدييات13، 14 , 15-ثم تفكيك هذه الدوبلكس siRNA النوكليوتيدات 21-25 والمتكاملة في مجمع إسكات المستحثة بالحمض النووي الريبي (RISC) دليل الكشف. يسمح هذا المجمع RISC-الجيش الملكي النيبالي واتسون-كريك قاعدة الاقتران لتكمل الهدف مرناً؛ وهذا يؤدي في النهاية إلى الانقسام بالبروتين أرجوناوتي، بروتين مجال متعددة تحتوي على مجال مثل ح رناسي، مما يحط من قدر مرناً المقابلة ويقلل من ترجمة البروتين، مما يؤدي إلى بوسترانسكريبشونال الجينات إسكات16 , 17 , 18.

[رني] لإدارة الآفات يتطلب إدخال دسرنا في فيفو لإسكات الجينات للفائدة، وبالتالي تفعيل المسار siRNA. وتشمل مختلف الأساليب التي استخدمت لإيصال دسرنا إلى خلايا الحشرات والحشرات للحث على المنهجية [رني] تغذية10،19، مغطس20،21، microinjection22، شركات مثل الدهنية 23، و تقنيات أخرى24. [رني] كان الأولى أظهر في ايليجانس كاينورهابديتيس لإسكات التعبير الجيني unc-22 برصاص وميلو25، متبوعاً بضربه قاضية في التعبير عن الجينات فريزليد melanogaster المورفولوجية26. تستخدم الدراسات الفنية الأولية microinjection لتسليم دسرنا في الحشرات، مثل Apis mellifera22،27، و بسام أسيرثوسيفون28،29من جرمنيك بلاتيلا، حليس H.30، والحشرات ليبيدوبتيران (استعرضها ترينوس et al. 31)-microinjection مفيد لتقديم جرعة صحيحة ودقيقة لموقع اهتمام بالحشرات. أن كان ذلك قد تثير هذه ثقوب التعفين محصنة الجينات ذات الصلة بسبب الصدمة32، ومن ثم استبعاد التطبيق العملي لها في التنمية الزراعية المبيدات الحيوية.

أسلوب آخر لإيصال دسرنا في فيفو مغطس، الذي ينطوي على ابتلاع أو امتصاص دسرنا بتعليق الحيوانات أو الخلايا عموما في المتوسط خارج الخلية التي تحتوي على دسرنا. مغطس قد استخدمت للحث على كفاءة [رني] في خلايا استنبات الأنسجة S2 المورفولوجية تمنع دوونستريم من Raf1 (DSOR1) mitogen تنشيط بروتين كيناز كيناز (مابك)20، وكذلك في C. ايليجانس الصمت 1-نقاط البيع الجينات33. بيد أن دسرنا تسليمها باستخدام مغطس أقل كفاءة للحث على [رني] مقارنة microinjection20. أولاً أبدى [رني] وساطة إسكات بحشرة مضغ روتوورم الذرة الغربية (فكر) (ظهرت فيرجيفيرا فيرجيفيرا) عن طريق غرس في دسرنا إلى النظام غذائي أجار اصطناعية10. موجز تقارير سابقة لها أساليب لتسليم دسرنا غرست في الوجبات الغذائية الطبيعية محددة المفصليات34. طرق التسليم هذه حددت كذلك فعالة نسبيا بوسائل اصطناعية للتسليم؛ مثل قضية ذبابة التسي تسي (مورسيتانس مورسيتانس اللواسن)، حيث لوحظ متساوية ضربة قاضية من المورثات المتصلة بجهاز المناعة عندما تم تسليم دسرنا أما من خلال وجبة الدم أو ميكروينجيكتيد35. وبالمثل، تسليم دسرنا من خلال قطرات في أبل البنى الخفيفة العثة (بوستفيتانا ابيفياس)36، يرقات العثة diamondback (إكسيلوستيلا بلوتيلا)37، فضلا عن عسل النحل38،39 الناجمين عن كفاءة [رني]. واستخدمت تجارب [رني] الأكثر فعالية في هيميبتيران حقن دسرنا40 لأن التسليم الشفوي من دسرنا في الحشرات هيميبتيران شاقة نظراً لأنه يجب أن يتم تسليم من خلال الأنسجة الوعائية للنبات المضيف. كما لوحظ فعالة [رني] في الكاريبي والمحيط الهادئ وقناص زجاجي مجنح leafhopper (جوس)، فيتريبينيس هومالوديسكا: دسرنا تم تسليمها عن طريق أشجار الحمضيات والكرمه قد استوعبت دسرنا في الأنسجة الوعائية من خلال جرعة الجذر، ورقي بخاخ أو حقن الجذع أو الاستيعاب بلفتات41،42،43،44،،من4546. كما أسفر هذا أول براءة دسرنا ضد ACP (2016، A1 20170211082 لنا). تسليم siRNA ودسرنا استخدام شركات النقل مثل جسيمات نانوية والدهنية يضفي الاستقرار، وزيادة في فعالية دسرنا تم تسليمها سريعاً الناشئة23،،من4748،49 ،50. فئة جديدة من المركبات المستندة إلى نانوحبيبات التسليم للأحماض النووية في المختبر و في فيفو التي تم تلخيصها خصيصا للتطبيقات العلاجية قد نقلها إمكانات هائلة بمناسبة تسليم ناقلات51. جسيمات نانوية كوسيلة إيصال دسرنا قد العيوب بما في ذلك القابلية للذوبان، هيدروفوبيسيتي، أو التراكم الأحيائي محدودة52، ولكن عملية تسليم مساعدة مناسبة بوليمر قد تعوض هذه العيوب. وظهرت أيضا التنمية والاستخدام الذاتي إيصال النيوكليوتيدات يسمى 'النوكليوتيد العقاقير'، وهي واحد الذين تقطعت بهم السبل الدوبلكس الحمض الريبي/46.

فيتيلوجينيسيس في المفصليات مفتاح عملية التحكم في الإنجاب وينظم هرمون الأحداث (جون) أو اكديسوني، وهي مستحثات رئيسية لتوليف جيد جداً من الدهون في الجسم؛ يتم أخذ جيد جداً في نهاية المطاف بالبويضات النامية عبر Vg مستقبلات وساطة الالتقام53. Vg هو تجميع مجموعة من البروتينية اكستراوفاريالي، الذي لا غنى عنه لتنمية البروتين صفار البيض الرئيسية،54،فيتيلين55، وذلك، من المهم في الإنجاب والشيخوخة56. Vg قد تم إسكاته بنجاح في الديدان الخيطية57 ، فضلا عن عسل النحل (Apis mellifera) حيث توسط [رني] استنفاد Vg لوحظ في البالغين والبيض22. [رني] إسكات الجينات بوسترانسكريبشونال وساطة Vg تم اختباره لأنه كان يعتقد استنفاد سيؤدي إلى تأثير المظهرية يمكن ملاحظتها مثل انخفاض الخصوبة وخصوبتها، يحتمل أن تكون المساعدة في مراقبة بمسب. جهامت الجين الذي يشفر S-adenosyl-L--الميثيونين (SAM)-تعتمد جابر حمض س-ميثيلترانسفيراسي، يحفز الخطوة الأخيرة في الطريق الحيوي جابر58. في هذا المسار farnesyl تسلسلياً تتحول بيروفوسفات (FPP) من فارنيسول، لحمض فارنيسويك متبوعاً بتحويل فارنيسواتي الميثيل إلى جابر من جهامت. هذا المسار هو المصانة في الحشرات والمفصليات خصيصا للمسخ، عملية تنمويا وينظم الهرمونات59،،من6061. في موري (ب)، التعبير الجيني جهامت ونشاط جابر السكروز في كلام المجاميع تشير إلى أن قمع النسخي الجينات جهامت حاسمة لإنهاء جابر الحيوي58. ولذلك، اختير الجينات جهامت و جيد جداً لاستنفاد المستهدفة باستخدام [رني]. كما تم اختبار [رني] في أشجار الحمضيات للتحكم في الكاريبي والمحيط الهادئ وجوس. تعامل أشجار الحمضيات مع دسرنا عن طريق جرعة الجذر، ووقف الصنبور (حقن الجذع)، فضلا عن الرش ورقي مع دسرناس ضد الحشرات ارجينين محددة كيناز (حزب العدالة والتنمية) النصوص42،44. تم الكشف عن تطبيق موضعي دسرنا جميع أنحاء أديم أشجار الحمضيات، التي تشير إلى تقديم بكفاءة من خلال الأنسجة الوعائية في النباتات، وأسفرت عن زيادة في معدل الوفيات في الكاريبي والمحيط الهادئ وجوس41،42، 45.

في الدراسة الحالية، وقمنا بتحديد طريقة تسليم النظام غذائي طبيعي لعلاجات مثل دسرنا. بعد ذلك استخدمت هذه التقنية المطورة حديثا لإسكات جهامت و Vg أظهرت مرناً باستخدام الجينات محددة دسرناس في الحوريات بمسب ك سابق62. هذه البروتوكولات التسليم الجديدة أظهرت هنا تحل محل نظم إيصال الحمض النووي الريبي التقليدية التي تستخدم في الرش الموضعي أو ميكروينجيكشنز. قد تستخدم الخضروات والفواكه وصنبور الجذعية، التنقيع التربة والطين الماصة في تسليم دسرنا، وبالغ الأهمية للتطوير المستمر لإدارة الآفات والممرضات المبيدات الحشرية الحيوية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-بمسب تربية

  1. الخلفية الحشرات بمسب وفقا للممارسة مختبر قياسي و هو موضح سابقا63.
  2. رفع الحشرات ACP (دال-سيتري) في ماكروفيلا الحمضيات في glasshouse (22 درجة مئوية) والضوء الطبيعي. استخدام ACP الكبار، في حوالي 5-7 أيام بعد اكلوسيون.

2-اختيار مناطق الجينات وتوليفها في المختبر دسرنا

  1. تحديد جينات محددة إلى بمسب من الترنسكربيتوم تم نشرها مسبقاً ملفات32.
  2. تأمين المناطق ذات الاهتمام المحدد تتراوح بين 200 إلى 500 قاعدة أزواج.
  3. إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) باستخدام الشروط الموضحة أدناه لإنشاء الأجزاء المرتبطة بالجين المحدد للفائدة من الحمض النووي. انظر الجدول 1 النوكليوتيد الخاصة بالجينات.
    1. تفاعل PCR: في أنبوب PCR 0.25 مل، الجمع بين 5 ميليلتر من 10 X PCR المخزن المؤقت, 4 ميليلتر من دنتب الخليط (2.5 ملم في كل), 2 ميليلتر من قالب الحمض النووي (50 نانوغرام/ميليلتر)، ميليلتر 2.5 كل كبسولة تفجير 1 و 2 (10 ميكرومتر)، ميليلتر 0.25 من بوليميريز الحمض النووي (يو 5/ميليلتر) ، والدناز/رناسي مجانية المياه تصل إلى 50 ميليلتر.
    2. حالة بكر: دورة تفاعل PCR لتضخيم منطقة الفائدة عند 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق تليها دورات 30 98 درجة مئوية لمدة 10 s، 55 درجة مئوية لمدة 30 ق، 72 درجة مئوية للحد الأدنى 1 إينكوباتي أن رد الفعل عند 72 درجة مئوية للحد أدنى 10 إضافية باستخدام تفاعل PCR نق طقم تنقية.
  4. تضخيم الشظايا بكر حصل على المزيد مع الجينات محددة يحف بتسلسل المروج بوليميريز الحمض النووي الريبي T7 كبسولة تفجير (5 '-جا نقل واكتساب التكنولوجيا آتا CGA لجنة مكافحة الإرهاب قانون عطا عبدالله أغا-3') كما ذكر سابقا62.
  5. استخدام الجينات لاكز كعنصر سلبي (موك) [رني].
    ملاحظة: لاكز هو جين الذي يشفر β-جالاكتوسيداسي تضخيم من اشيريتشياكولي المجينية الحمض الخلوي الصبغي (يتم سرد أجهزة الإشعال المستخدمة في الجدول 1).
  6. إجراء النسخ في المختبر تسفر عن دسرنا ك سابقة وصف62.
  7. حل ريسوسبيند دسرنا الناتجة في 150 ميليلتر الدناز/رناسي المياه مجاناً، وقياس التركيز وتخزين في-80 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل.

3-تسليم دسرنا استخدام الفاصوليا الخضراء

  1. حدد وقت مبكر 4th الطور بمسب الحوريات فقست من نفس البيض الجماهيري وتجويع لهم عن 24 ساعة قبل تغذية دسرنا.
  2. حدد مرهف مصدقة العضوية الفاصوليا الخضراء (الشائع فاصولياء L.) وتغسل بمحلول هيبوكلوريت الصوديوم 0.2% لمدة 5 دقائق.
    ملاحظة: تم اختيار مرهف الفاصوليا الخضراء حيث أن الفول يمكن استيعابها بسهولة في الأنابيب ميكروسينتريفوجي 2 مل.
  3. أغسل 3 مرات مع ddH2س والسماح للهواء الجاف.
  4. تقليم الفاصوليا الخضراء من نهاية كاليكس ليصل إجمالي طوله إلى 7.5 سم باستخدام شفرة حلاقة نظيفة.
  5. تزج الفاصوليا الخضراء المشذبة وغسلها في أنبوب ميكروسينتريفوجي كاب-أقل 2 مل تحتوي على 300 ميليلتر من حل السيطرة (01:10 إضعاف لتلوين الأغذية الخضراء (المكونات: المياه، البروبيلين غليكول، فد & ج 5 صفراء، فد & ج 1 الأزرق، وبروبيلبارابين ك حافظة)).
  6. وتوليفها جعل تخفيف في المختبر دسرناس لاكز أو جهامت Vg تمييع 5 ميكروغرام أو 20 ميكروغرام في 300 ميليلتر رناسي/الدناز المياه مجاناً تسفر عن تركيزات النهائي 0.017 ميكروغرام/ميليلتر أو 0.067 ميكروغرام/ميليلتر، على التوالي.
  7. تزج الفاصوليا الخضراء المشذبة وغسلها في أنبوب ميكروسينتريفوجي كاب-أقل 2 مل تحتوي على 300 ميليلتر لحل دسرنا (من الخطوة 3، 6).
  8. التفاف وختم حواف الأنابيب ميكروسينتريفوجي أرفق الفول مغمورة لتجنب تبخر المحلول دسرنا ومنع الحيوانات من دخول أنبوب ميكروسينتريفوجي.
  9. ضع هذه الأنابيب بطريقة تستقيم في درجة حرارة الغرفة ح 3 للسماح بحل دسرنا يمكن تحميله في جميع أنحاء الفاصوليا الخضراء بعمل شعري.
  10. ضع هذه الأنابيب في الثقافة النظيفة السفن (بولي بروبلين). مكان ثلاثة المتعطشةال 4 الطور بمسب الحوريات في الأوعية الثقافة.
  11. علاج الحيوانات الثلاثة كل سفينة الثقافة كل منها يحتوي على ثلاثة من الفاصوليا الخضراء مع الحل التلوين أو دسرنا المواد الغذائية الخضراء. الحفاظ على الحشرات في 25 درجة مئوية و 72% رطوبة نسبية، تحت كبيرة ل 16:8 في حاضنة.
  12. السماح للحشرات لتتغذى على الفاصوليا الخضراء (مغمورة وامتصاصها مع دسرنا) لمدة 5 أيام ولكن تجديد مع الوجبات الغذائية الطازجة من حبات العلاج الأخضر دسرنا بعد 3 أيام.

4. في الوقت الحقيقي الكمي (qPCR) "تحليل للجينات التعبير التالي [رني] وساطة إسكات" في بمسب

  1. قياس الأثر [رني] في مستويات التعبير نسخة من قبكر.
  2. عزل الجيش الملكي النيبالي إجمالي من دسرنا معاملة الحيوانات وتوليف كدنا62.
  3. إعداد ردود فعل قبكر باستخدام نظام PCR الوقت الحقيقي والإشعال المدرجة في الجدول 1. استخدام الشرط التالي ركوب qPCR: 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق تليها دورات 40 من 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، 60 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، جنبا إلى جنب مع خطوة الانفصال بما في ذلك 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، 60 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، 95 درجة مئوية لمدة 15 s ، و 60 درجة مئوية لمدة 15 ثانية.
  4. تحديد معايير قبكر: استخدام المسلسل تمييع كدنا إعداد من الجيش الملكي النيبالي إجمالي معزولة عن حيوان عادي كمعيار مرجعي للقياس الكمي.
  5. استخدام "الحمض النووي الريبي 18s بمسب" كمعيار داخلية لتصحيح الاختلافات في الحمض النووي الريبي الانتعاش من الأنسجة32.

5. تطبيق الرش ورقي في أشجار الحمضيات أصيص كبير والشتلات.

ملاحظة: تم الاحتفاظ بالنباتات من الأصناف المستنبطة الحمضيات 'كاريزو' سيترانجي (الحمضيات سينينسيس تريفولياتا إكسبونسيروس، سذابيه)، في glasshouse تحت الضوء الطبيعي، ودرجة الحرارة، ونمت في حاويات ل 1.2. تم تشذيبه النباتات باستمرار لتعزيز النمو من جديد يطلق النار على ورقي، تسمى 'تدفق'. الكاريبي والمحيط الهادئ يفضل تغذية وأوفيبوسيشن على نمو جديدة من الحمضيات64.

  1. تحديد النباتات أو الشتلات ولا مياه لهم لمدة 2-3 أيام قبل استخدامها للسماح للتربة تجف الرطوبة ولكن لم يجف تماما.
  2. زجاجة رذاذ مضخة يدوية باستخدام تطبيق 200 مل دسرنا الحل (0.5 ملغ/مل) إلى مظلة السفلي (الشكل 4 أ).
    ملاحظة: إعداد ما سبق ذكر الحلول دسرنا الدناز/رناسي الماء مجاناً.
  3. بعد رش التطبيق، تسمح بحل دسرنا التطبيقية لاستيعابها تماما بالأوراق.
    ملاحظة: أشجار الحمضيات استوعبت دسرنا التطبيقية، وثم تم استخراج الأوراق من أي نمو جديدة أو من الفروع التي تغطي قبل التطبيق،؛ دسرنا يمكن كشفها باستخدام قبكر وأظهرت الحركة النظمية في أوراق الستارة أعلى شجرة في 3-4 ح44،،من4546.
  4. نموذج نمو جديدة من الأشجار وتصدرت سابقا بعد 25-40 يوما بجمع ما يقرب من 10 أوراق من النصائح من أربعة فروع. استخراج مجموع الجيش الملكي النيبالي ونحللها بالنسخ العكسي بكر (RT-PCR) وقبكر من المشغل دسرنا التطبيقية باستخدام كبسولة تفجير وجود المدرجة في الجدول 1 وسبق وصف أساليب46.
    ملاحظة: أجريت جمع العينات ومجموع عزل الحمض النووي الريبي، الرايت-بكر و qPCR كما هو موضح سابقا46.
  5. وبالمثل، رش موضعياً دسرنا 10 مل في المنطقة السفلي للشتلات أو أوراق الشجر شجرة وعاء صغير.
    ملاحظة: قدمت الحشرات هيميبتيران (ACP وجوس) وصول التغذية عادة في 24 ساعة، آخر العلاجات على النمو الجديد (أوراق) التي قد لا يتم مباشرة رش، أو التي نمت بعد ذلك بأسابيع، أو النباتات كلها. وهذا ينتج الحشرات التي تم اختبارها إيجابية دسرنا في 3 و 6 و 10 أيام، وظيفة التغذية.

6-التربة/جذر تطبيق جرعة في الكبيرة أو الصغيرة محفوظ بوعاء أشجار الحمضيات والشتلات.

  1. تحديد النباتات أو الشتلات ولا مياه لهم لمدة 2-3 أيام قبل استخدامها للسماح للتربة تجف لرطبة لكن ليس يجف تماما (وهذا يخلق الفضاء الجوي لإجراء الحل السائل ليتم تطبيقها).
  2. إضافة 1 لتر من دسرنا الحل (0.2 مغ/مل) لتربة نباتات أصيص كبير (حوالي 2.5 م) وإضافة 1 لتر الماء (المطارد) بعد ح 1.
  3. تطبيق 100 مل حل دسرنا (1.33 mg/mL) للتربة من طوله 1 م محفوظ بوعاء الأشجار في التربة الجافة جزئيا.
  4. لشتلات صغيرة، تطبيق 10 مل من محلول دسرنا (1 ملغ/مل) للتربة في المخاريط أو الجذور العارية (الشكل 4 باء، ج).
  5. السماح للنباتات التي تلقي الحل دسرنا تطبيقها كتربة جرعة نقع لمدة 30 دقيقة. ثم تطبيق العلاج الماء العادي فقط للمساعدة في امتصاص الجذور (20 مل للنباتات في حاويات صفراء)، أو 100 مل إذا أكبر مصنع الأواني > 1 غالون.
    ملاحظة: دسرنا المطبقة موضعياً لأوراق الشجر أدت إلى الكشف عن نصائح القاصي في معظم فروع داخل العلاجات وظيفة ح 3-6، تظهر الحركة النظمية من خلال الأشجار. فروع جديدة في النمو اختبار إيجابي دسرنا في العلاج بعد 60-90 يوما. وترد قصاصات للحشرات (ACP وجوس) في دسرنا تغذية الحشري44.

7-وقف تطبيق برنامج المشورة التقنية (حقن جذع شجرة) في أشجار الحمضيات أصيص كبير وشتلات

  1. حدد شتلات الحمضيات، جديد، أو ما يقرب من 3.5 سنوات المحطات القديمة للحقن دسرنا استخدام الجذع اضغط على طريقة (الحقن الجذع).
  2. حفر ثقوب في مصانع الحمضيات باستخدام حفر وقليلاً حفر 10 ملم، مع الحرص على لا تتجاوز 2 سم، أو حوالي نصف قطر الجذع.
  3. التفاف غيض النحاس من كل حاقن 4-6 مرات مع قطاع واسع 0.6 سم (¼ بوصة) لختم الفيلم لمنع تسرب قرب الحافة.
  4. ملء محاقن جذع شجرة مع 6 مل (1.7 مغ/مل) لحل دسرنا المخفف في الماء مجاناً الدناز/رناسي (تتم الإشارة إليها هنا كحل ملون).
  5. حقن الحل إلى جذع الشجرة وترك محقن في الجذع ح 6-10 للسماح باستيعاب الحل دسرنا. السماح للحشرات لتتغذى على القصاصات من الأشجار المعالجة في 3 و 10 و 30 يوما بعد العلاج.
    ملاحظة: استمرت دسرنا حقن استخدام أسلوب الحقن الجذع في الأشجار لمدة 30-60 يوما41،،من4244. وكان يؤديها [رني] للتحقق من صحة qPCR استخدام كبسولة تفجير المدرجة في الجدول 1.

8-دسرنا حبيبات الطين المعالجة لتسليمها "الحشرات من خلال التربة"

  1. صب الطين ماصة في أنبوب 50 مل مخروطية إلى علامة 35 مل (حوالي 30 جرام طين ماصة) في الأنبوب.
  2. صب 20 مل من محلول دسرنا المخفف في الماء مجاناً الدناز/رناسي (100 ميكروغرام/مل) في أنبوب الرطب ماصة كافة. كاب الأنبوبة المخروطية وتلميح الأنبوب للمساعدة على إزالة الهواء وكاب الأنبوب.
  3. ضع الأنبوب مستقيم والسماح لها الوقوف لمدة 1-2 دقيقة لجزيئات الطين ﻻستيعاب الحل.
  4. إضافة ما يكفي من طين دسرنا غارقة في مزيج التربة لملء وعاء 1 غالون.
  5. خلط وتحويل التربة من جهة مزيج دقيق طين دسرنا بالدماء في التربة.
  6. استخدام هذه الأراضي ريبوت الشتلات المختارة لعلاج دسرنا.
  7. المياه التربة مع 200 مل الماء العادي دون دسرنا. وبعد 30 دقيقة إلى ح 1، اتبع مع 100 مل الماء العادي. بعد 24 ساعة، وضع المصنع على جدولة الري عادي.
  8. اختبار 4-6 أوراق النباتات أصيص تعامل مع الماصة الطين ودسرنا كل شهر بعد العلاج دسرنا بجمع أوراق قمي أكثر من نمو النبات الجديد.
    ملاحظة: النباتات أو الشتلات من هذه النباتات المعالجة تتغذى على الحشرات أي وقت بعد 24 ساعة بعد العلاج وقد تمكنت من إيصال [رني] لتصل إلى سنة للحشرات (بيانات غير منشورة).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تم اختبار التسليم دسرنا وساطة الخضر من خلال تغذية في 4 بمسبال الطور الحوريات لتطوير المبيدات البيولوجية الجزيئية باستخدام [رني] للآفات الحشرية الغازية. تغذية بمسبس استخدام ستيليتس إبرة تشبه بهم عن طريق إليه تعرف باسم لاسيراتي، واستواء، مما يسبب خسائر كبيرة للمحاصيل. مرهف الفاصوليا الخضراء العضوية، الشائع P. L.، استخدمت لاختبار ما إذا كانت المواد الغذائية أو دسرنا يمكن تسليمها في فيفو إلى بمسب عن طريق التغذية3. شرائح من الفاصوليا الخضراء كانت مغمورة في المياه الحرة الدناز/رناسي أو حل من المياه والمواد الغذائية الخضراء التلوين لاختبار التسليم في بمسب (الشكل 1A). تلوين المواد الغذائية الخضراء كإشارة مرئية لتقليد دسرنا. كانت مشبعة الأنسجة الوعائية من الفاصوليا الخضراء مع تلوين الأغذية الخضراء بسبب تدفق الحل الملونة الخضراء من خلال لحاء بعمل شعري62. واعتبرت الحوريات بمسب التغذية على شرائح الفاصوليا الخضراء بإدراج ما ستيليتس في الأنسجة الوعائية من الفاصوليا الخضراء (الشكل 1B). ولوحظت قطرات الإفرازات الملونة الخضراء بعد أيام 2 و 3 في الحشرات التي كانت تتغذى على حبوب مشبعة بالمواد الغذائية الخضراء التلوين يشير إلى المواد التي تم تسليمها قد بلعها شفويا وتمريرها من خلال القناة الهضمية قبل الإفراز (الشكل 1، د ).

بعد ذلك قمنا باختبار إذا كان إنجاز استنزاف كبير لتعبير الجينات المستهدفة باستخدام إيصال الفاصوليا الخضراء بوساطة بمسب دسرنا محددة عن طريق ابتلاع في بمسب. شرائح الفاصوليا الخضراء كانت مغمورة واستوعبت حلاً 0.067 ميكروغرام/ميليلتر (20 ميكروغرام في 300 ميليلتر من الماء مجاناً الدناز/رناسي) أو 0.017 ميكروغرام/ميليلتر (5 ميكروغرام في 300 ميليلتر من الماء مجاناً الدناز/رناسي) المختبر في توليف دسرنا الخاصة جهامت بمسب وجيد جداً ، على التوالي. كانت مغمورة الفاصوليا الخضراء أيضا في المياه وحدها أو ميكروغرام/ميليلتر 0.067 0.017 دسرنا لاكز ميكروغرام/ميليلتر (موك) كعناصر التحكم الخاصة بكل منها. مستويات نسخة تم تقييمها باستخدام قبكر التي تشير إلى أن التعبير عن جهامت وكان مرناً Vg انخفاضا كبيرا في فيفو تقريبا 4.5--و 2.2-fold، على التوالي (الشكل 2 أ، ب). ونتيجة لذلك، تبين النتائج أن دسرنا قد يتم تسليم عن طريق الأنسجة الوعائية من الفاصوليا الخضراء للحث على نجاح [رني].

الآفات هيميبتيران آخر، توسط المهرج الخطأ (غبطة) (هيستريونيكا مورجانتيا)، الذي يسبب الضرر إلى كول المحاصيل اختبرت أيضا إذا كان النجاح في إيصال المواد الغذائية أو علاجات دسرنا يمكن تسليمها باستخدام الخضار التسليم. وسمح الحوريات غبطة الطورال 4 لتغذية الرضيع الكرنب الخضر (كرنب حمقاء var. viridis) مغمورة بالمياه أو حل من المياه مع تلوين الأغذية الخضراء. أشارت النتائج إلى أن غبطة تغذية وبلعها تلوين الأغذية الخضراء، التي كان من الواضح من هذه الإفرازات الملونة الخضراء، مقارنة بغبطة بلعها الخضر مغمورة في الماء، والذي كان واضحا الفضلات (الشكل 3).

تقنيات إضافية لإيصال عابر دسرنا الرش أو الجذر/التربة امتصاص النتائج في امتصاص دسرنا كل من،من65الأنسجة النباتية66. سبرايابل المنتجات المستندة إلى [رني] في التنمية، وقد تكون متاحة قريبا في انتظار الموافقة. تسليم دسرنا في مجالات استخدام الرش أو جذر جرعة قد تساعد في إدارة الحشرات الغازية42،67. أشجار الحمضيات كاملة الحجم وشتلات تعرضوا دسرنا الرش ورقي، أو التربة أو جذر العارية التنقيع، على التوالي (الشكل 4). أشارت النتائج إلى أن دسرناس ألقاه أما بخاخ أو التربة/عارية جرعة الجذر يمكن أن يمكن الكشف عنها في مصانع الحمضيات (طوله 2.5 م) 7 أسابيع بعد تعرض لفترة واحدة من ز 2 دسرنا42. التسليم وابتلاع بسيليد دسرنا--حزب العدالة والتنمية (20 نانوغرام/ميليلتر) زادت وفيات بسيليد بنسبة 30-45% (الشكل 4)42.

في المختبر نسخها يمكن تسليمها دسرنا كفاءة لأكلات الحشرات استخدام الصنبور الجذعية (جذع الحقن) من جينات محددة دسرنا مباشرة في الأنسجة الوعائية للنبات، التي يمكن اكتسابها من خلال الحشرات عندما يتغذى على هذه النباتات44 (الشكل 5). لأشجار الحمضيات التي تعرضت إلى دسرنا واسطة حقن الجذع، يمكن اكتشاف دسرنا في مصانع الحمضيات الذين تتراوح أعمارهم بين (حوالي 1 م طويل القامة) ل 7 أسابيع بعد تعرض مرة واحدة استخدام 6 مل من 1.7 مغ/مل دسرنا في حل من الدناز/رناسي المياه مجاناً (الشكل 5A ، ب). ثم سمح تغذية لحاء هيميبتيران الحشرات لتتغذى على هذه النباتات المضيفة تعامل مع دسرنا. ويفترض أن دسرنا غرست بنجاح وانتقلت من خلال نظام الأوعية الدموية من مصانع الحمضيات للابتلاع بالكاريبي والمحيط الهادئ، التي أظهرت معدلات الوفيات عند تغذية على بنادق دسرنا42.

المقايسة المتقدمة من 2008 إلى 2012، وتم فحص عبر تشكيلة واسعة من النباتات محفوظ بوعاء وسيظهر لتوفير دسرنا بطريقة التي يمكن أن تستوعب النباتات وترانسلوكاتي دسرنا للمنهجية دسرنا نشر41،42 . يستخدم أسلوب واحد مكون ماصة طين مع دسرنا الامتزاز في مصفوفة الطين؛ وهذا يشمل طائفة واسعة من الطين وفولر في الأرض، زيوليت، وغيرهم، كمواد ماصة، السليلوز، أجارس، بيوبلاستيكس، وغيرها إلخ طين جسيمات من الغبار الناقلين مجاناً الحمض النووي التي يمكن أن تستخدم لتوصيل المكونات النشطة مثل دسرنا للتربة لامتصاص النبات، وفي نهاية المطاف التسليم للحشرات (الشكل 6). يمكن أيضا تكوين الطين المعقدة كيميائيا لإطلاق سراح دسرنا تحت الرقم الهيدروجيني محددة أو ظروف الأيونية. أظهرت طرق التسليم الطين من دسرنا إلى النباتات لتوفير دسرنا في أصيص من أشجار الحمضيات، وغيرها من النباتات لما يزيد على 14 شهرا (البيانات لا تظهر). يمكن استخدام هذا النظام التسليم لتغيير الصفات النباتية، مثل ألوان الزهور، وارتفاع النبات (يتعدى)، أو غيرها. حاليا، الاستخدام الأساسي لهذا الأسلوب للتنمية الفعالة للآفات الحشرية ومراقبة الممرض (الفيروس) أو الإدارة. هذا النهج يمكن أن تكون فعالة من حيث التكلفة للحضانات والمنازل، وهو أسلوب غير المعدلة وراثيا.

Figure 1
الشكل 1 . تسليم المواد الغذائية أو دسرنا عن طريق الفاصوليا الخضراء- شرائح (A) من الفاصوليا الخضراء العضوية نحيلة كانت مغمورة واستوعبت الحل في أنبوب ميكروسينتريفوجي 2 مل تحتوي على 300 ميليلتر ddH2س وحدها أو ddH2س مع تلوين الأغذية الخضراء، ح 3. ثلاثة المتعطشة ح 24th 4 الطور بمسب الحوريات ووضعها في السفن الثقافة جنبا إلى جنب مع الفاصوليا الخضراء 3 كل سفينة. (ب) بمسب تتغذى على شرائح من الفاصوليا الخضراء مغمورة في الماء من ثقب من خلال الفاصوليا الخضراء للوصول إلى المواد الغذائية مع ما ستيليتس. (ج) يوم 2 من بمسب تغذية الحشري، أسهم تدل الإفرازات. (د) اليوم 3؛ لاحظ زيادة الإفرازات بمسب (النطاق المرمز إليه بالسهم) وظيفة ابتلاع حل ddH2س والأخضر الغذاء التلوين عن طريق الفاصوليا الخضراء. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 . RT-PCR التحليل الكمي لقياس مستوى نسخة بعد استنفاد [رني] بوساطة من جهامت وجيد جداً في بمسب. "رنا الإجمالية" من 4 بمسبth الفردية 3 الطور الحوريات بنك الاحتياطي الفيدرالي على جهامت (A) 20 ميكروغرام (0.067 ميكروغرام/ميليلتر)، ودسرناس 5 ميكروغرام (0.017 ميكروغرام/ميليلتر) جيد جداً (ب) في 300 ميليلتر من ddH2س تسليمها من خلال قطاعات من الفاصوليا الخضراء، وكانت معزولة تم قياس مستويات نسخة من قبكر. لاكز دسرنا (وهمية) بمثابة عنصر تحكم سلبية. رنا 18s بمسب كمعيار داخلية لتصحيح الاختلافات في الحمض النووي الريبي الانتعاش من الأنسجة. النتائج المبلغ بها من ثلاثة replicates البيولوجية، وأشرطة الخطأ تشير إلى sem. وأجرى تحليل تباين أحادي اتجاه (ANOVA) لاختبار دلالة إحصائية للبيانات، ف < 0.0001. نتائج مستنسخة من غوش et al. 62 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3 . التسليم الشفوي للعلاج في علة المهرج (M. هيستريونيكا ) باستخدام بيبي الكرنب الخضر- بيبي العضوية الكرنب الخضر تم غسلها مع هيبوكلوريت الصوديوم 0.2% وقلص ومنغمسين في أنبوب ميكروسينتريفوجي كاب-أقل 2 مل تحتوي على 300 ميليلتر للحل (A) الدناز/رناسي ddH الحرة2س، أو (ب) الدناز/رناسي ddH الحرة2 س الحل مع تلوين الأغذية الخضراء، لمدة 3 ساعات. الطور الرابع ثلاث غبطة الحوريات كانت تفتقر ح 24 وثم وضعها في السفن الثقافة ويسمح لتتغذى على هذه الخضر الكرنب لمدة 3 أيام. تشير الأسهم البيضاء إلى الفضلات يحتفل به في يوم 3 وظيفة التغذية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4 . جرعة الرش ورقي وجذر التطبيق في أشجار الحمضيات والشتلات. لا تسقي النباتات المحددة أو الشتلات مسبقة لاستخدام لمدة 2-3 أيام للسماح للتربة تجف الرطوبة ولكن لم يجف تماما. (أ) أولاً وقد تصدرت الأشجار و 200 مل من محلول دسرنا (0.5 ملغ/مل) في الدناز/رناسي المياه مجانية وكان يطبق باليد مضخة رش زجاجة إلى مظلة أقل. (ب) 100 مل دسرنا الحل (1 ملغ/مل) في المياه الحرة الدناز/رناسي طبق على تربة الشتلات في التربة الجافة جزئيا. ACP (ج) 100 مل من محلول دسرنا (1 ملغ/مل) في الدناز/رناسي المياه مجاناً تم تطبيقها على جذور الشتلات لحوالي 3 حاء (د) عارية تتغذى من الشتلات قد استوعبت دسرنا من جذورها العارية، أظهرت زيادة في معدل الوفيات الكاريبي والمحيط الهادئ. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الشكل 5 . حقن جذع شجرة الشتلات الحمضيات. تم حقن شتلات الحمضيات طوله حوالي 1 م 1.7 مغ/مل دسرنا. (A) حفر ثقوب في شتلات الحمضيات باستخدام مثقاب قطرها 10 مم لإدراج محقن تنبع المصنع. كانت ملفوفة تلميح النحاس يتعرض لكل حاقن مع قطاع واسع 0.6 سم (¼ بوصة) لختم الفيلم لمنع التسرب. (ب) عن طريق الحقن مليئة 6 مل من محلول ملون طبقت على الساق (جذع) الشتلات. وتركت الحقن في المكان لحوالي 6-10 ح لامتصاص كامل للحل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 6
الرقم 6 . التربة طين التعديل التسليم من دسرنا إلى النباتات عن طريق التربة- خط جديد لتقديم المواد: الطين الذي ناقل غبار حمض النووي مجاناً للاستخدام في توصيل المكونات النشطة مثل دسرنا للتربة لامتصاص في النباتات، وفي نهاية المطاف إلى الحشرات. طين [اونبكد] (أ) و (ب) خبز طين تصف التسامح/الاحتفاظ بالماء. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

حاء – المحتملة حليس الهدف الجينات
الانضمام الحجم اسم الجين/التماثل
XP_014293026.1 491 تغيرات-A1-مثل (جيد جداً) (Isoforms الممكنة: تغيرات-2-مثل isoform X1 XP_014291483.1؛ 2-شبيهة بتغيرات isoform X2 XP_014291484.1).
XP_014290953.1 545 حمض هرمون الأحداث س-ميثيلترانسفيراسي-مثل (جهامت) (ممكن هومولوج: الأحداث هرمون حمض XP_014283772.1 س-ميثيلترانسفيراسي).
كبسولة تفجير
بكر
اسم الجين/التماثل اسم الدليل التسلسل
جيد جداً و P2 فيتيلوج بمسب كاتتجاتككاككجاكتجت
جيد جداً بمسب آر فيتيلوج P2 ككجكاتجاتكتاكتكتجا
جهامت و P1 جابر بمسب جاتجكتاتجاتاتككاج
جهامت بمسب آر P1 جابر جتاتاجاتجككاتتتج
T7 بكر
جيد جداً T7 و 4263 P2 فيتيلوج بمسب جاتاتاكجاكتكاكتاتاججاجاككااجتتجاججاتجا
جيد جداً T7 بمسب فيتيلوج P2 4753 R جاتاتاكجاكتكاكتاتاججاجاككجكاتجاتكتاكتكتجا
جهامت و P1 T7 جابر بمسب جاتاتاكجاكتكاكتاتاججاجاجاتجكتاتجاتاتككاج
جهامت بمسب جابر T7 P1 R جاتاتاكجاكتكاكتاتاججاجاجتاتاجاتجككاتتتج
لاكز T7 لاكز [رني] و جاتاتاكجاكتكاكتاتاججاجاتجااجكتجكتاكاجا
لاكز T7 لاكز [رني] R جاتاتاكجاكتكاكتاتاججاجاجكاجكتكتجكتكات
حزب العدالة والتنمية دساك-F تاتاكجاكتكاكتاتاججاجتجكاتكتجتاتجكجتا
حزب العدالة والتنمية دساك-R تاتاكجاكتكاكتاتاججاجككتجكاجاتكتجتكتكك
حزب العدالة والتنمية دساك و 50 تاتاكجاكتكاكتاتاججاجتجكاتكتجتاتجكجتا
حزب العدالة والتنمية دساك 50-R تاتاكجاكتكاكتاتاججاجتجاجكككتجتجتاجتك
حزب العدالة والتنمية دساك 30-F تاتاكجاكتكاكتاتاججاجاكككجاكتكتجاجتاج
حزب العدالة والتنمية دساك 30-R تاتاكجاكتكاكتاتاججاجككتجكاجاتكتجتكتكك
بروتينات فلورية خضراء دسجفب إف تاتاكجاكتكاكتاتاججاجككاكاكتجتكاكتاكتتكتكت
بروتينات فلورية خضراء دسجفب-R تاتاكجاكتكاكتاتاججاجتاتجتجتكتجتاااجا
قبكر
جيد جداً و P2 RT فيتيلوج تجاتاجتجتتتجاتتتتجاغت
جيد جداً فيتيلوج RT P2 R تكتاكتجاتكاجكجكتكاجا
جهامت بمسب جابر RT P1 و أجاااكككاااتجكات
جهامت بمسب آر RT P1 جابر أتجتاتكتكتتتجاتكتتتكتجاج
18S F3 بمسب 18S أتجكككككجككتجتككتات
18S R3 بمسب 18S تجااجكاجككتجاتاجتج
بروتينات فلورية خضراء بروتينات فلورية خضراء-F جتاااجاكاججككاتك
بروتينات فلورية خضراء بروتينات فلورية خضراء-R تكاجاجاكجااكاتك
حزب العدالة والتنمية حزب العدالة والتنمية ضليع في الرياضيات-F كجاكتجاججاجاكتجا
حزب العدالة والتنمية حزب العدالة والتنمية ضليع في الرياضيات-R جتجتاجاتاككجكجاككاج
الحوض -الحوض-F جكجتكتكتكجتتجاكج
الحوض -الحوض-R كاكتكاككاتكتجتجك

الجدول 1. اليغنوكليوتيد تسلسل [رني]. قائمة بالجينات والنوكليوتيد المستخدمة لتوليد PCR الشظايا، دسرنا، والإشعال qPCR لتحليل مستويات نسخة.

التكميلي فيديو 1: أجارس والمواد الهلامية الماصة للتسليم والمطرد الإفراج عن دسرنا. أجارس المائية الطبيعية أو الاصطناعية والمواد الهلامية مع دسرنا الحل التي يمكن استخدامها كالطعم أو الوجبات الغذائية المفصليات المختلفة. الرجاء انقر هنا لتحميل هذا الفيديو

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

[رني] وقد ثبت أن تكون أداة هامة لاستكشاف الجينات الوظيفة البيولوجية والتنظيم، مع إمكانية كبيرة لاستخدامها لإدارة الآفات الحشرية19،،من6869،70، 71-تصميم واختيار gene(s) المناسبة لإسكات في أنواع الحشرات معين وطريقة تسليم dsRNA(s) المقابلة للحشرة على حد سواء أهمية قصوى. يجب تحديد الأسلوب الأمثل لتقديم دسرنا إلى حشرة تجريبيا، جنبا إلى جنب مع اختيار الجرعة النسبية للتسليم، بعض الأساليب قد توفر مزايا وقيود أخرى. لتطوير المبيدات الحشرية الحيوية الجزيئية التي قد تكون مناسبة للإطلاق في البيئة في نهاية المطاف، مطلوب أسلوب تسليم مجدية وفعالة ومفيدة. على سبيل المثال، دسرنا المطبقة موضعياً قد أظهرت أن تكون فعالة لإيصال دسرنا لمكافحة الحشرات على الحمضيات والكرمه42،44. استراتيجيات مبتكرة مثل استخدام الطعوم، وحلول السكروز، الخميرة أو إنتاج دسرنا الجرثومي للتناول المباشر، تطبيق موضعي دسرنا على النباتات، أو إنتاج دسرناس محددة من النباتات المحورة وراثيا، حققت تقدما في تطوير ضوابط فعالة على أساس [رني]19،72.

ويتضح مثال جيد هنا باستخدام الفاصوليا الخضراء لتسليم دسرنا (الشكل 1 و الشكل 2) تهدف إلى على وجه التحديد أثر وتقليل مكافحة الآفات الحشرية ذات أهمية عالمية. قد استخدمت الخضار المطورة حديثا دسرنا وساطة البروتوكول التسليم باستخدام شرائح من الفاصوليا الخضراء مغمورة ومشبعة دسرنا لفعالية الهدف جينات محددة للتنمية اليرقات في بمسب. الفاصوليا الخضراء هي واحدة من العديد من الخضار التي هي تلتهمها بمسب وحتى هذه كانت تستخدم كوسيلة لتسليم دسرنا. وسائل أخرى لإيصال دسرنا تم اختبارها (البيانات لا تظهر) ولكنها باءت بالفشل في توفير التغذية بمسب ربما بسبب الاختلافات في نسيج الأوعية الدموية. ولذلك، استخدمنا قطاعات من الفاصوليا الخضراء لتسليم في المختبر توليفها دسرنا إلى الحوريات بمسب. الأحماض النووية تسليمها عن طريق النبات أو أسلوب الوساطة الخضر قد يحتمل أن تكون قادرة على حمل [رني] في الحشرة الاختيار كما لاحظ هنا مع نضوب الجينات جهامت و جيد جداً في بمسب (الشكل 2)62.

هذا البروتوكول التسليم دسرنا وساطة الخضر استخدمت بنجاح للحث على [رني] ليس فقط في بمسب ولكن أيضا في غبطة استخدام الكرنب الخضر (الشكل 3)، على الرغم من إنجاز الاستراتيجيات والأساليب يجب أن يكون الأمثل لكل الجينات والحشرات. ومن ثم، يوصي بأن اختبار الأساليب المختلفة للتسليم، وكذلك فيما يتعلق باستهداف جينات متعددة تهم فردياً أو عن طريق التراص دسرناس اثنين على الأقل من أجل الحصول على أفضل penetrance المظهرية. ويرد موجز لعدة أساليب لتسليم دسرنا للحشرات والحشرات الخلايا بما في ذلك التغذية13،22، مغطس73،74، microinjection75، وغيرها من التقنيات المستخدمة76 دسرنا امتصاص للحث على المنهجية [رني]. أحدث الأساليب للتسليم الشفوي من دسرنا لحمل [رني] في الحشرات الأخرى بابتلاع في معالجة النباتات غير المعدلة وراثيا أيضا قداستكشفت (الرقم 4 الرقم 5و الرقم 6). لقد ثبت أشجار الحمضيات ﻻستيعاب دسرناس أما عن طريق الجذور، ووقف برنامج المشورة التقنية (حقن الجذع)، أو الرش ورقي42،44. سابقا، قد تم التعامل مع الحشرات دسرنا محددة المقابلة للجينات حزب العدالة والتنمية في الكاريبي والمحيط الهادئ وجوس أشجار الحمضيات والكرمه ناضجة. هذه النباتات المعالجة تسبب زيادة في معدل الوفيات لكل من الكاريبي والمحيط الهادئ وجوس لتصل إلى أطوال مختلفة للوقت41،45. معا هذه النتائج تثبت أن دسرنا يمكن أن يعوق التعبير عن جينات محددة في دراسة الحشرات.

وتشمل التحديات التي تؤثر على إسكات ناجحة للتعبير الجيني مجموعات فريدة من نوعها دسرنا nucleases (دسرناسيس) أساسا في أنسجة القناة الهضمية للحشرات والإفرازات اللعابية، أو درجة الحموضة القناة الهضمية التي قد تكون مسؤولة عن تدهور دسرنا47، وأعرب عن ،،من7778. ومع ذلك، للتغلب على مثل هذا التدهور، المنهجية [رني] قد تكون الناجم عن كفاءة في الحشرات استخدام تركيزات أعلى من دسرنا و/أو استخدام شماعة في النظام الغذائي للتسليم الشفوي من دسرنا الخاصة بالجينات للتغلب على مثل هذا التدهور62، 79-التسليم والإقبال على دسرنا يجوز أيضا أن تستقر مع مساعدة جزيئات الناقل، مثل جسيمات نانوية80 مثل الشيتوزان48، الدهنية مثل 2000 ليبوفيكتاميني وميتافيكتيني76،79من البولي إيثيلين غليكول، طين نانوشيتس81، والكربون الكم دوت50. البحث في التقدم لتحسين الإنجاز الفعال لاستخدام قطع أجار وجل يملؤه الجينات محددة دسرنا دسرنا (البيانات لا تظهر، راجع التكميلي فيديو 4). يمكن استخدام هذا الأسلوب لإيصال جرعة فعالة من دسرنا للنمل يمكن أن تحمل دسرنا غرست الراتنج أو أجار للعش كغذاء.

بالإضافة إلى استقرار دسرنا، استمرار طويل الأجل دسرنا في الأنسجة النباتية ذات أهمية خاصة بالنسبة للمحاصيل الزراعية. قد تتراكم دسرنا توزع عن طريق الأنسجة الوعائية في النباتات، الفواكه أو الخضروات في الخشب ولحاء مع نشاط إنزيم انخفاض قبل بلعها من الحشرات للحث على الآلية [رني]. قد يكون من الضروري لبعض التطبيقات أن يكون دسرنا تستمر لفترة قصيرة، كما هو الحال لمدة 6 أيام في الفاصوليا الخضراء أو أطول، ح 36 في62،التربة82 حتى يصبح من غير المحتمل تراكم الأحماض النووية في البيئة. بيد عبد الرحمن et al. أثبتت أن نانوشيتس يمكن أن تحمي دسرناس كبيرة من تدهور سابق لأوانه فضلا عن التوسط الإفراج عنهم مستمرة على أسطح أوراق على مدى فترة على الأقل 30 يوما81.

عموما يمكن استخدام استراتيجيات تسليم دسرنا مناقشتها هنا لإسكات الحشرات جينات محددة لإدارة الآفات. توريد دسرنا للنباتات عن طريق مياه الري، وجرعة الجذر، أو حقن الجذع يمكن أن يكون استراتيجية فعالة لحشرات الآفات، مثل مغذيات الجذرية، التي تتوافر حاليا أي أسلوب مراقبة فعالة. يمكن إضافة تسليم دسرنا استخدام ناقل أو تستقر المتوسطة مثل الطين أو أجار مباشرة إلى التربة لامتصاص النباتات. واحد من الأسباب الرئيسية لبطء التقدم في تطوير المبيدات البيولوجية الجزيئية [رني] وساطة كان الافتقار إلى تقنيات كفاءة التسليم الشفوي لبدء فعالية [رني] والاستقرار تحت الظروف البيئية83. التسليم الشفوي قد في المستقبل استخدام الأساليب المذكورة هنا لإيصال الحمض النووي الجينات وساطة إسكات العلاجات النباتية ساب التغذية فضلا عن مضغ الحشرات الحد من أضرار الحشرات في الإنتاج الغذائي العالمي، وتطوير الآفات البيئية المستدامة الإدارة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

الكتاب الاعتراف بامتنان فيبر دونالد وميغان هيرلي (وزارة الزراعة، جمعية الإغاثة اﻷرمنية بلتسفيل، دكتوراه في الطب) لتوفير بمسب وغبطة للتجريب، والحفاظ على المستعمرات؛ وماريا ت. غونزاليس، سلفادور لوبيز ص، (وزارة الزراعة، جمعية الإغاثة اﻷرمنية، فورت بيرس، فلوريدا) وجاكي ل. متز (جامعة فلوريدا، فلوريدا، فورت بيرس) لصيانة مستعمرة وإعداد نماذج وتحليلات.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BMSB (H. halys) insects  USDA
ACP (D. citri) insects  USDA
organic green beans N/A
Citrus plants USDA
sodium hypochlorite solution J.T. Baker
green food coloring  McCormick & Co., Inc
Thermo Forma chambers  Thermo Fisher Scientific
Magenta vessel (Culture) Sigma
Primers  IDT DNA
SensiMix SYBR Bioline
qPCR ABI 7500 Applied Biosystems 
Spray bottle N/A
Parafilm American Can Company
TaKaRa Ex Taq Clontech
QIAquick Qiagen

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hoebeke, E. R., Carter, M. E. Halyomorpha halys (Stǻl)(Heteroptera: Pentatomidae): a polyphagous plant pest from Asia newly detected in North America. , (2003).
  2. Leskey, T. C., Hamilton, G. C., et al. Pest Status of the Brown Marmorated Stink Bug, Halyomorpha Halys in the USA. Outlooks on Pest Management. 23 (5), 218-226 (2012).
  3. Peiffer, M., Felton, G. W. Insights into the Saliva of the Brown Marmorated Stink Bug Halyomorpha halys (Hemiptera: Pentatomidae). PloS one. 9 (2), e88483 (2014).
  4. Anderson, B. E., Miller, J. J., Adams, D. R. Irritant contact dermatitis to the brown marmorated stink bug, Halyomorpha halys. Dermatitis : contact, atopic, occupational, drug. 23 (4), 170-172 (2012).
  5. Mertz, T. L., Jacobs, S. B., Craig, T. J., Ishmael, F. T. The brown marmorated stinkbug as a new aeroallergen. The Journal of allergy and clinical immunology. 130 (4), 999-1001 (2012).
  6. McClean, A. P. D., Schwarz, R. E. Greening or blotchy-mottle disease of citrus. Phytophylactica. 2 (3), 177-194 (2012).
  7. Bové, J. M. Huanglongbing: a destructive, newly-emerging, century-old disease of citrus. Journal of Plant Pathology. 88 (1), 7-37 (2006).
  8. Kuhar, T., Morrison, R., Leskey, T., Aigner, J. Integrated pest management for brown marmorated stink bug in vegetables. , (2016).
  9. Tiwari, S., Mann, R. S., Rogers, M. E., Stelinski, L. L. Insecticide resistance in field populations of Asian citrus psyllid in Florida. Pest management science. 67 (10), 1258-1268 (2011).
  10. Baum, J. A., Bogaert, T., et al. Control of coleopteran insect pests through RNA interference. Nature Biotechnology. 25 (11), 1322-1326 (2007).
  11. Hannon, G. J. RNA interference. Nature. 418 (6894), 244-251 (2002).
  12. Mello, C. C., Conte, D. Revealing the world of RNA interference. Nature. 431 (7006), 338-342 (2004).
  13. Macrae, I. J., Zhou, K., et al. Structural basis for double-stranded RNA processing by Dicer. Science(New York, N.Y.). 311 (5758), 195-198 (2006).
  14. Bernstein, E., Caudy, A. A., Hammond, S. M., Hannon, G. J. Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference. Nature. 409 (6818), 363-366 (2001).
  15. Ketting, R. F., Fischer, S. E., Bernstein, E., Sijen, T., Hannon, G. J., Plasterk, R. H. Dicer functions in RNA interference and in synthesis of small RNA involved in developmental timing in C. elegans. Genes & development. 15 (20), 2654-2659 (2001).
  16. Agrawal, N., Dasaradhi, P. V. N., Mohmmed, A., Malhotra, P., Bhatnagar, R. K., Mukherjee, S. K. RNA interference: biology, mechanism, and applications. Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 67 (4), 657-685 (2003).
  17. Martinez, J., Patkaniowska, A., Urlaub, H., Lührmann, R., Tuschl, T. Single-stranded antisense siRNAs guide target RNA cleavage in RNAi. Cell. 110 (5), 563-574 (2002).
  18. Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
  19. Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA. Nature. 395 (6705), 854 (1998).
  20. Clemens, J. C., Worby, C. A., et al. Use of double-stranded RNA interference in Drosophila cell lines to dissect signal transduction pathways. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (12), 6499-6503 (2000).
  21. Saleh, M. C., van Rij, R. P., et al. The endocytic pathway mediates cell entry of dsRNA to induce RNAi silencing. Nature cell biology. 8 (8), 793-802 (2006).
  22. Amdam, G. V., Simões, Z. L. P., Guidugli, K. R., Norberg, K., Omholt, S. W. Disruption of vitellogenin gene function in adult honeybees by intra-abdominal injection of double-stranded RNA. BMC biotechnology. 3, 1 (2003).
  23. Whyard, S., Singh, A. D., Wong, S. Ingested double-stranded RNAs can act as species-specific insecticides. Insect biochemistry and molecular biology. 39 (11), 824-832 (2009).
  24. Huvenne, H., Smagghe, G. Mechanisms of dsRNA uptake in insects and potential of RNAi for pest control: a review. Journal of Insect Physiology. 56 (3), 227-235 (2010).
  25. Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
  26. Kennerdell, J. R., Carthew, R. W. Use of dsRNA-mediated genetic interference to demonstrate that frizzled and frizzled 2 act in the wingless pathway. Cell. 95 (7), 1017-1026 (1998).
  27. Gatehouse, H. S., Gatehouse, L. N., Malone, L. A. Amylase activity in honey bee hypopharyngeal glands reduced by RNA interference. Journal of Apicultural. , (2004).
  28. Jaubert-Possamai, S., Le Trionnaire, G., Bonhomme, J., Christophides, G. K., Rispe, C., Tagu, D. Gene knockdown by RNAi in the pea aphid Acyrthosiphon pisum. BMC biotechnology. 7, 63 (2007).
  29. Martín, D., Maestro, O., Cruz, J., Mané-Padrós, D., Bellés, X. RNAi studies reveal a conserved role for RXR in molting in the cockroach Blattella germanica. Journal of Insect Physiology. 52 (4), 410-416 (2006).
  30. Bansal, R., Mittapelly, P., Chen, Y., Mamidala, P., Zhao, C., Michel, A. Quantitative RT-PCR Gene Evaluation and RNA Interference in the Brown Marmorated Stink Bug. PloS one. 11 (5), e0152730 (2016).
  31. Terenius, O., Papanicolaou, A., et al. RNA interference in Lepidoptera: an overview of successful and unsuccessful studies and implications for experimental design. Journal of Insect Physiology. 57 (2), 231-245 (2011).
  32. Sparks, M. E., Shelby, K. S., Kuhar, D., Gundersen-Rindal, D. E. Transcriptome of the Invasive Brown Marmorated Stink Bug, Halyomorpha halys (Stål) (Heteroptera: Pentatomidae). PloS one. 9 (11), e111646 (2014).
  33. Tabara, H., Grishok, A., Mello, C. C. RNAi in C. elegans: soaking in the genome sequence. Science (New York, N.Y.). 282 (5388), 430-431 (1998).
  34. Baum, J. A., Roberts, J. K. Chapter Five - Progress Towards RNAi-Mediated Insect Pest Management. Insect Midgut and Insecticidal Proteins. 47, 249-295 (2014).
  35. Walshe, D. P., Lehane, S. M., Lehane, M. J., Haines, L. R. Prolonged gene knockdown in the tsetse fly Glossina by feeding double stranded RNA. Insect Molecular Biology. 18 (1), 11-19 (2009).
  36. Turner, C. T., Davy, M. W., MacDiarmid, R. M., Plummer, K. M., Birch, N. P., Newcomb, R. D. RNA interference in the light brown apple moth, Epiphyas postvittana (Walker) induced by double-stranded RNA feeding. Insect Molecular Biology. 15 (3), 383-391 (2006).
  37. Bautista, M. A. M., Miyata, T., Miura, K., Tanaka, T. RNA interference-mediated knockdown of a cytochrome P450, CYP6BG1, from the diamondback moth, Plutella xylostella, reduces larval resistance to permethrin. Insect biochemistry and molecular biology. 39 (1), 38-46 (2009).
  38. Maori, E., Paldi, N., et al. IAPV, a bee-affecting virus associated with Colony Collapse Disorder can be silenced by dsRNA ingestion. Insect Molecular Biology. 18 (1), 55-60 (2009).
  39. Hunter, W., Ellis, J., Hayes, J., Westervelt, D., Glick, E. Large-scale field application of RNAi technology reducing Israeli acute paralysis virus disease in honey bees (Apis mellifera, Hymenoptera: Apidae). PLoS Pathogens. 6 (12), e1001160 (2010).
  40. Christiaens, O., Smagghe, G. The challenge of RNAi-mediated control of hemipterans. Current Opinion in Insect Science. 6, 15-21 (2014).
  41. Hunter, W. B., Hail, D., Tipping, C., Paldi, N. RNA interference to reduce sharpshooters, the glassy-winged sharpshooter, and the Asian citrus psyllid. Symposium. , 24-27 (2010).
  42. Hunter, W. B., Glick, E., Paldi, N., Bextine, B. R. Advances in RNA interference: dsRNA treatment in trees and grapevines for insect pest suppression. Southwestern Entomologist. , (2012).
  43. Hail, D. A., Dowd, S., Hunter, W. H., Bextine, B. R. Investigating the transcriptome of the potato psyllid (Bactericera cockerelli): toward an RNAi based management strategy. Proceed. 10th Annual Zebra Chip Reporting Session, San Antonio TX, , 183-186 (2010).
  44. de Andrade, E. C., Hunter, W. B. RNA Interference-Natural Gene-Based Technology for Highly Specific Pest Control (HiSPeC). RNA INTERFERENCE. , (2016).
  45. Taning, C. N. T., Andrade, E. C., Hunter, W. B., Christiaens, O., Smagghe, G. Asian Citrus Psyllid RNAi Pathway - RNAi evidence. Scientific reports. 6, 38082 (2016).
  46. Andrade, E. C., Hunter, W. B. RNAi feeding bioassay: development of a non-transgenic approach to control Asian citrus psyllid and other hemipterans. Entomologia Experimentalis et Applicata. 162 (3), 389-396 (2017).
  47. Joga, M. R., Zotti, M. J., Smagghe, G., Christiaens, O. RNAi Efficiency, Systemic Properties, and Novel Delivery Methods for Pest Insect Control: What We Know So Far. Frontiers in physiology. 7, 553 (2016).
  48. Zhang, X., Zhang, J., Zhu, K. Y. Chitosan/double-stranded RNA nanoparticle-mediated RNA interference to silence chitin synthase genes through larval feeding in the African malaria mosquito (Anopheles gambiae). Insect Molecular Biology. 19 (5), 683-693 (2010).
  49. Li-Byarlay, H., Li, Y., et al. RNA interference knockdown of DNA methyl-transferase 3 affects gene alternative splicing in the honey bee. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 12750-12755 (2013).
  50. Das, S., Debnath, N., Cui, Y., Unrine, J., Palli, S. R. Chitosan, Carbon Quantum Dot, and Silica Nanoparticle Mediated dsRNA Delivery for Gene Silencing in Aedes aegypti: A Comparative Analysis. ACS applied materials & interfaces. 7 (35), 19530-19535 (2015).
  51. Nimesh, S. Recent patents in siRNA delivery employing nanoparticles as delivery vectors. Recent patents on DNA & gene sequences. 6 (2), 91-97 (2012).
  52. Draz, M. S., Fang, B. A., et al. Nanoparticle-mediated systemic delivery of siRNA for treatment of cancers and viral infections. Theranostics. 4 (9), 872-892 (2014).
  53. Swevers, L., Raikhel, A. S., Sappington, T. W. Vitellogenesis and post-vitellogenic maturation of the insect ovarian follicle. Comprehensive. , (2005).
  54. Tufail, M., Takeda, M. Molecular characteristics of insect vitellogenins. Journal of Insect Physiology. 54 (12), 1447-1458 (2008).
  55. Hagedorn, H. H., Kunkel, J. G. Vitellogenin and vitellin in insects. Annual review of entomology. , (1979).
  56. Brandt, B. W., Zwaan, B. J., Beekman, M. Shuttling between species for pathways of lifespan regulation: a central role for the vitellogenin gene family? Bioessays. , (2005).
  57. Murphy, C. T., McCarroll, S. A., et al. Genes that act downstream of DAF-16 to influence the lifespan of Caenorhabditis elegans. Nature. 424 (6946), 277-283 (2003).
  58. Shinoda, T., Itoyama, K. Juvenile hormone acid methyltransferase: a key regulatory enzyme for insect metamorphosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (21), 11986-11991 (2003).
  59. Bellés, X. Beyond Drosophila: RNAi in vivo and functional genomics in insects. Annual review of entomology. 55, 111-128 (2010).
  60. Nouzova, M., Edwards, M. J., Mayoral, J. G., Noriega, F. G. A coordinated expression of biosynthetic enzymes controls the flux of juvenile hormone precursors in the corpora allata of mosquitoes. Insect biochemistry and molecular biology. 41 (9), 660-669 (2011).
  61. Huang, J., Marchal, E., Hult, E. F., Tobe, S. S. Characterization of the juvenile hormone pathway in the viviparous cockroach, Diploptera punctata. PloS one. 10 (2), e0117291 (2015).
  62. Ghosh, S. K. B., Hunter, W. B., Park, A. L., Gundersen-Rindal, D. E. Double strand RNA delivery system for plant-sap-feeding insects. PloS one. 12 (2), e0171861 (2017).
  63. Khrimian, A., Zhang, A., et al. Discovery of the aggregation pheromone of the brown marmorated stink bug (Halyomorpha halys) through the creation of stereoisomeric libraries of 1-bisabolen-3-ols. Journal of natural products. 77 (7), 1708-1717 (2014).
  64. Hall, D. G., Richardson, M. L., El-Desouky, A., Halbert, S. E. Asian citrus psyllid, Diaphorina citri, vector of citrus huanglongbing disease. Entomologia Experimentalis et Applicata. 146 (2), 207-223 (2012).
  65. Murphy, K. A., Tabuloc, C. A., Cervantes, K. R., Chiu, J. C. Ingestion of genetically modified yeast symbiont reduces fitness of an insect pest via RNA interference. Scientific reports. 6, 22587 (2016).
  66. San Miguel,, K,, Scott, J. G. The next generation of insecticides: dsRNA is stable as a foliar-applied insecticide. Pest management science. 72 (4), 801-809 (2016).
  67. Li, H., Guan, R., Guo, H., Miao, X. New insights into an RNAi approach for plant defence against piercing-sucking and stem-borer insect pests. Plant, cell & environment. 38 (11), 2277-2285 (2015).
  68. Hull, D., Timmons, L. Methods for delivery of double-stranded RNA into Caenorhabditis elegans. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). 265, 23-58 (2004).
  69. Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans. Gene. 263 (1-2), 103-112 (2001).
  70. Burand, J. P., Hunter, W. B. RNAi: future in insect management. Journal of Invertebrate Pathology. 112 Suppl, S68-S74 (2013).
  71. Rodrigues, T. B., Figueira, A. Management of Insect Pest by RNAi-A New Tool for Crop Protection. , (2016).
  72. Baumann, A. M. T., Bakkers, M. J. G., et al. 9-O-Acetylation of sialic acids is catalysed by CASD1 via a covalent acetyl-enzyme intermediate. Nature communications. 6, 7673 (2015).
  73. Araujo, R. N., Santos, A., Pinto, F. S., Gontijo, N. F., Lehane, M. J., Pereira, M. H. RNA interference of the salivary gland nitrophorin 2 in the triatomine bug Rhodnius prolixus (Hemiptera: Reduviidae) by dsRNA ingestion or injection. Insect biochemistry and molecular biology. 36 (9), 683-693 (2006).
  74. Wuriyanghan, H., Rosa, C., Falk, B. W. Oral Delivery of Double-Stranded RNAs and siRNAs Induces RNAi Effects in the Potato/Tomato Psyllid, Bactericerca cockerelli. PloS one. 6 (11), e27736 (2011).
  75. Kamath, R. S., Ahringer, J. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods (San Diego, Calif). 30 (4), 313-321 (2003).
  76. Yu, N., Christiaens, O., et al. Delivery of dsRNA for RNAi in insects: an overview and future directions). Insect Science. , (2012).
  77. Allen, M. L., Walker, W. B. Saliva of Lygus lineolaris digests double stranded ribonucleic acids. Journal of Insect Physiology. 58 (3), 391-396 (2012).
  78. Wynant, N., Santos, D., Verdonck, R., Spit, J., Van Wielendaele, P., Vanden Broeck, J. Identification, functional characterization and phylogenetic analysis of double stranded RNA degrading enzymes present in the gut of the desert locust, Schistocerca gregaria. Insect biochemistry and molecular biology. 46, 1-8 (2014).
  79. Ghosh, S. K. B., Gundersen-Rindal, D. E. Double strand RNA-mediated RNA interference through feeding in larval gypsy moth, Lymantria dispar (Lepidoptera: Erebidae). European Journal of Entomology. 114, 170-178 (2017).
  80. Baigude, H., Rana, T. M. Delivery of therapeutic RNAi by nanovehicles. Chembiochem : a European journal of chemical biology. 10 (15), 2449-2454 (2009).
  81. Mitter, N., Worrall, E. A., et al. Clay nanosheets for topical delivery of RNAi for sustained protection against plant viruses. Nature plants. 3, 16207 (2017).
  82. Dubelman, S., Fischer, J., et al. Environmental fate of double-stranded RNA in agricultural soils. PloS one. 9 (3), e93155 (2014).
  83. Kola, V. S. R., Renuka, P., Madhav, M. S., Mangrauthia, S. K. Key enzymes and proteins of crop insects as candidate for RNAi based gene silencing. Frontiers in physiology. 6, 119 (2015).

Tags

العلوم البيئية، 135 قضية، التسليم، وعلة نتن مارموراتيد براون، بسيليد الحمضيات الآسيوية، تدخل الجيش الملكي النيبالي، والابتلاع، هيميبتيرا
طرق التسليم الشفوي الحمض النووي الريبي مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل للحث على تدخل الجيش الملكي النيبالي في لحاء وتغذية النبات-ساب الحشرات هيميبتيران
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ghosh, S. K. B., Hunter, W. B.,… More

Ghosh, S. K. B., Hunter, W. B., Park, A. L., Gundersen-Rindal, D. E. Double-stranded RNA Oral Delivery Methods to Induce RNA Interference in Phloem and Plant-sap-feeding Hemipteran Insects. J. Vis. Exp. (135), e57390, doi:10.3791/57390 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter